Stat3 vyksta nuo acetiliacijos priklausoma mitochondrijų translokacija, siekiant reguliuoti piruvato metabolizmą | mokslinės ataskaitos

Stat3 vyksta nuo acetiliacijos priklausoma mitochondrijų translokacija, siekiant reguliuoti piruvato metabolizmą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Acetilinimas
  • Cheminis modifikavimas

Anotacija

Citoplazminė STAT3, suaktyvinta augimo faktorių, persikelia į skirtingus tarpląstelinius skyrius, įskaitant branduolius ir mitochondrijas, kur ji atlieka skirtingas biologines funkcijas. Tačiau tikslus mechanizmas, kurio metu STAT3 patiria mitochondrijų translokaciją ir vėliau reguliuoja trikarboksirūgšties (TCA) ciklo elektronų pernešimo grandinę (ETC), vis dar menkai suprantamas. Čia paaiškiname šį procesą vizualizuodami STAT3 acetiliaciją badaujančiose ląstelėse po pakartotinio serumo įvedimo ar insulino stimuliavimo. CBP-acetiliuotas STAT3 yra mitochondrijų translokacija reaguojant į serumo įvedimą ar insulino stimuliavimą. Mitochondrijose STAT3 asocijuojasi su piruvato dehidrogenazės kompleksu E1 (PDC-E1) ir vėliau pagreitina piruvato virsmą acetil-CoA, padidina mitochondrijų membranos potencialą ir skatina ATP sintezę. SIRT5 deacetiliuoja STAT3, slopindamas jo funkcijas mitochondrijų piruvato metabolizme. A549 plaučių vėžio ląstelių linijoje konstituciškai acetilintas STAT3 lokalizuojasi mitochondrijose, kur palaiko mitochondrijų membranos potencialą ir ATP sintezę aktyvioje būsenoje.

Įvadas

Ramųjį signalo keitiklį ir 3 transkripcijos aktyvatorių (STAT3) citoplazmoje aktyvina citokinai arba augimo faktoriai, esantys ląstelių aplinkoje 1 . Citokinų arba augimo faktoriaus suaktyvinti STAT3 baltymai modifikuoti po transliacijos, įskaitant tirozino ir serino fosforilinimą, acetilinimą ir metilinimą. 2, 3, 4, 5 . Tyr705 / Ser727 fosforilinimas C-galiniame domene vaidina kritinį vaidmenį STAT3 promotoriaus surišime ir transkripcijos aktyvacijoje branduolyje 6, 7 . Genai, suaktyvinti fosfo-STAT3, dalyvauja įvairiuose procesuose, įskaitant kamieninių ląstelių atsinaujinimo augimą, T ląstelių diferenciaciją, ląstelių ciklą ir metastazes 8, 9, 10 .

Pranešama, kad Ser727 fosforilintas STAT3 persitvarko mitochondrijose 11 . Įtariama, kad mitochondrijose STAT3 sustiprina elektronų kvėpavimo grandinės aktyvumą ir ATP gamybą, sąveikaudamas su I ir II kompleksais ir atitinkamai padidindamas NADH 12 . Ląstelės, išreiškiančios mitochondrijų lokalizacijos signalą (MLS) -STAT3 su S727A pakaitų ekranu, sumažino I komplekso aktyvumą elektronų pernešimo grandinėje (ETC) ir padidino reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) kaupimąsi hipoksinėmis sąlygomis, palyginti su ląstelėmis, kurios išreiškia MLS- STAT3 13 . STAT3 gali būti susijęs su nuo Ras priklausoma ląstelių transformacija padidintos elektronų pernašos grandinės aktyvumo dėka. Tačiau siekiant optimalaus ATP susidarymo ar oksidacinio fosforilinimo in vivo , tiesioginė baltymų sąveika tarp STAT3 ir I / II kompleksų nėra būtina.

STAT3 persijungia tarp citoplazmos ir branduolio, reaguodamas į fosforilinimą, o DNR surišimas ir promotoriaus inicijavimas branduoliniu STAT3 nutraukiamas atliekant fosforilinimą 6, 15, 16, 17 . Tačiau mechanizmai, kuriais STAT3 persijungia tarp citoplazmos ir mitochondrijų, ir tai, kaip mitochondrijų STAT3 aktyvumas pasikeičia mitochondrijose, išlieka nežinomi. Įdomu tai, kad mitochondriniai fermentai, dalyvaujantys pašalinant pooperacines modifikacijas, katalizuoja deacetiliavimą 18, taigi galima daryti išvadą apie svarbų acetiliacijos vaidmenį mitochondrijų veikloje. Buvo pranešta, kad trys Sirt2 šeimos nariai (SIRT3, SIRT4 ir SIRT5) gyvena mitochondrijose 19, 20 . Todėl acetilinimas gali dalyvauti energijos apykaitoje, nes acetilinimas dažnai vaidina lemiamą vaidmenį ląstelių bado / išsiskyrimo metu.

Norėdami ištirti, ar STAT3 mitochondrijų translokacija vyksta badavimo ir išsiskyrimo metu, taip pat kaip STAT3 acetiliacijos vaidmuo mitochondrijų funkcijoje metabolizmo metu, išanalizavome STAT3 aktyvaciją atnaujindami serumą ar insuliną. Insulinas reguliuoja angliavandenių ir riebalų apykaitą skatindamas gliukozės virsmą piruvatu 21, 22 . Mes pranešame, kad tiek N-, tiek C-galo STAT3 domenai yra acetilinami CBP, histono acetiltransferazės (HAT), serumo ląstelėse, stimuliuojamose insulino. Mes nustatėme, kad insulino suaktyvinta STAT3 patiria nuo acetiliacijos priklausomą mitochondrijų translokaciją. Susidaręs kompleksas su piruvato dehidrogenazės kompleksu E1 (PDC E1), prieštaringu ETC komponentu, STAT3 padidina mitochondrijų membranos potencialą (MMP) ir ATP gamybą. SIRT5 deacetiliuoja STAT3, taip sutrikdydamas jo veiklą mitochondrijose. Vėžio ląstelėse, turinčiose silpną Warburgo efektą, STAT3 yra konstituciškai acetilinamas ir pastoviai persikelia į mitochondrijas, kur jis konstituciškai dalyvauja energijos apykaitoje.

Rezultatai

Insulino aktyvuotas STAT3 yra nukreiptas į mitochondrijas acetilinant

Mes ir kiti anksčiau pranešėme, kad STAT3 yra acetilinamas keliose vietose po IL-6 tipo citokinų stimuliavimo 3, 23, 24 . Serume badavusias serumo fibroblastines ląsteles serumu badavome ir vėl įvedėme arba gydome insulinu skirtingais laikotarpiais. Panašus STAT3 acetiliacijos indukcijos modelis buvo stebimas abiem sąlygomis (1a pav.). Anksčiau įvairios grupės pranešė apie daugybę konservuotų lizino liekanų, esančių šalia svarbiausio C-galo domeno fosfo-tirozino liekanų 25 . Atlikę STAT1, STAT3 ir STAT5b mutantų masės spektrometrijos analizę PC3 ląstelėse, mes patvirtinome tris svarbiausias acetiliacijos vietas - K685, K707 ir K709, apimančias fosfo-tiroziną 705 C-galo srityje (1b pav.). Mes paruošėme daugybę antikūnų prieš acetil-STAT3, įskaitant tuos, kurie nukreipti prieš acetil-K87, acetil-K707 ir acetil-K709 liekanas (papildomas 1a pav.). Nors serumo badas ir pakartotinai suaktyvintas STAT3 buvo vidutiniškai fosforilintas tiek Y705, tiek S727 vietose (1c pav., Kairėje), gydymas insulinu neturėjo jokio poveikio STAT3 Y705 ar S727 fosforilinimui (1c pav., Dešinėje). MEF atveju serumo badas ir pakartotinis įvedimas arba gydymas insulinu sukėlė KAT85, K707 ir K709 acetiliaciją STAT3, tai patvirtina naudojant šiuos antikūnus prieš acetil-STAT3 (1c pav.).

Image

a ) STAT3 acetiliacijos sukėlimo serume badavimo ir pakartotinio įvedimo (SSR) (kairėje) arba serumo bado ir gydymo insulinu (dešinėje) indukcijos laikas STAT3 transfekuotose PC3 ląstelėse. Visos acetil-lizino antikūnas buvo naudojamas acetil-STAT3 aptikti. ( b ) C-galo dimerizacijos domenų sekų suderinimas iš STAT1, STAT3 ir STAT5b. K685, K707 ir K709 yra acetilinimo vietos, identifikuotos atliekant STAT3, paruošto iš PC3 ląstelių, perkeltų STAT3, masės spektrometrijos analizę. Po apdorojimo citokinais Y705 fosforilinamas. c ) SSR 30 min. (kairėje) arba insulino (5 μg / ml) 15 min. (dešinėje) sukėlė STAT3 post-transliacijos modifikacijas, kaip nurodyta MEF, kurie serumo badavo (-) mažiausiai 6 valandas. ( d ) 293T ląstelės buvo transfekuotos STAT3 arba STAT3 ir CBP, o po to 6 valandas buvo apdorotas NAM (100 μM, 200 μM) arba TSA (1 μM, 5 μM). Paruošti ištisų ląstelių lizatai ir atliktas Western blot tyrimas su nurodytais antikūnais. Acetil-STAT3 buvo aptiktas su anti-pan acetil-lizino antikūnais. ( e ) 293T ląstelėse CBP buvo išeikvotas su siRNR. Po gydymo insulinu 30 minučių buvo paruošti WCL, o acetil-STAT3 nušveistas antipanpanilizino antikūnu. f ) 293T ląstelėse prieš derliaus nuėmimą CBP buvo transfekuotas 36 valandas. Citoplazminės, mitochondrinės ir branduolinės frakcijos buvo paruoštos CBP ir mitochondrijų žymeklio porinų analizei naudojant specifinius antikūnus, naudojant Western blot analizę. ( g ) MEF 30 minučių buvo gydomi insulinu arba buvo negydomi. CBP imuninis nusėdimas buvo atliktas ir atliktas užkrėtimas antiinsulino receptoriais arba anti-CBP antikūnais. ( h ) 293T ląstelėse CBP buvo transfekuotas 36 valandas prieš derliaus nuėmimą. STAT3 analizei buvo paruoštos citoplazminės, mitochondrinės ir branduolinės frakcijos.

Visas dydis

CBP perdėta ekspresija sukėlė STAT3 acetiliaciją, o nikotinamido (NAM) ir trikostatino A (TSA) gydymas sukėlė STAT3 acetiliaciją (1d pav.), Taigi galima daryti išvadą, kad tiek HDAC, tiek Sirtuin šeimos nariai katalizuoja STAT3 decetilinimą ląstelėse. CBP delecija panaikino insulino sukeltą STAT3 acetiliaciją MEF, taigi galima daryti išvadą, kad CBP yra labai svarbus STAT3 acetilinimui (1e pav.). Mes stebėjome CBP tiek citoplazminėje, tiek branduolinėje frakcijose, bet ne mitochondrijų frakcijoje 293T ląstelėse (1 pav. F). CBP buvo susijęs su insulino receptoriumi, o gydymas insulinu sustiprino MEF ryšį (1g pav.), Kaip tai padarė išoriškai išreikštas CBP ir insulino receptoriai 293T ląstelėse (papildomas 2a pav.). Įdomu tai, kad CBP perdėta ekspresija sukėlė STAT3 mitochondrijų translokaciją (1h pav.).

Tada mes palyginome STAT3 tarpląstelinę lokalizaciją, reaguodami į serumo badavimą, pakartotinį įvedimą ir gydymą insulinu. Serumo badas ir pakartotinis įvedimas suaktyvino STAT3 baltymus, perkeltus į mitochondrijas, ir mažą frakciją, perkeltą į branduolį (2a pav., Kairėje). STAT3 atlikta mitochondrijų translokacija, pirmiausia reaguojant į gydymą insulinu (2a pav., Dešinėje). Tiek badas serume, tiek pakartotinis įvedimas, tiek insulino aktyvuotas STAT3 buvo K685 acetiliuojami, tuo tarpu STAT3 S727 fosforilinimas buvo stebimas pirmiausia serumo badavimo ir pakartotinio įvedimo sąlygomis (2a pav.). Norėdami atmesti galimybę, kad STAT3 mitochondrijų kaupimasis įvyko dėl padidėjusios STAT3 baltymų sintezės ar stabilumo reaguojant į gydymą insulinu, mes gydydavome MEF insulinu, esant baltymų biosintezės inhibitoriui cikloheksimidui (CHX) arba proteasomų inhibitoriui MG132. Kaip ir tikėtasi, esant CHX, STAT3 baltymų lygis buvo vidutiniškai ir palaipsniui sumažėjęs, tuo tarpu esant MG132, padidėjęs STAT3 baltymo lygis nepaveikė ląstelių insulino gydymo (2b pav.).

Image

( a ) Visi MEF sergantys serumu 6 valandas prieš gydymą insulinu (dešinėje) arba SSR (kairėje) 30 min. STAT3 ir kitų tarpląstelinių frakcijų žymenų Western blot analizei buvo paruošti citoplazmos (Cyt), mitochondrijų (Mit) ir branduolių (Nuc) ląstelių lizatai. ( b ) MEF buvo iš anksto apdoroti cikloheksimidu arba MG132, po to nurodytu laiku apdoroti insulinu. STAT3 arba β-aktino lygiai buvo ištirti ląstelių lizatuose, naudojant Western blot analizę. c ) STAT3, nusodintų iš STAT3 ekspresuojančių 293T ląstelių, apdorotų insulinu arba nepaliktų be gydymo, masės spektrometrinė analizė. K87 buvo nustatytas kaip STAT3 lizino liekana, kuri buvo acetilinta po gydymo insulinu. ( d ) Mitochondrijų frakcija buvo gauta iš MEF, apdorotų insulinu arba paliktų negydytų. Mitochondrijos STAT3 buvo analizuojamos atliekant Western blot analizę. ( e ) Myc pažymėtas STAT3 buvo transfekuotas atskirai arba kartu su HDCA6 293T ląstelėse. Imuninės sistemos nusėdęs STAT3 buvo apibarstytas anti-aK87-STAT3 arba anti-STAT3 antikūnais, o HDAC6 buvo aptiktas įvestyje. ( f ) Imuniniu būdu nusėdęs STAT3 buvo tirpinamas anti-aK87-STAT3 arba anti-STAT3 mitochondrijų lizatuose iš aukščiau išvardytų 293T ląstelių tipų. ( g ) 293T ląstelės buvo transfekuotos EV, laukinio tipo Myc-STAT3, Myc-STAT3-Y705F ir S727A mutantais. Mitochondrijų lizatas buvo paruoštas SSR sąlygomis 30 min. STAT3 buvo analizuojamas atliekant Western blot analizę su anti-Myc antikūnais. ( h ) „Myc“ žymėti viso ilgio STAT3 arba skirtingi domenai, kaip nurodyta, buvo transfekuoti atskirai arba kartu su CBP 293T ląstelėse. Mitochondrijų lizatai buvo paruošti STAT3 ir porino blotinimo analizei. ( i ) PC3 ląstelės buvo transfekuotos EV, laukinio tipo „Myc-STAT3“ ar „Myc-STAT3-3KR“ mutantu ir 30 min. apdorotos SSR. STAT3 citoplazmos ir mitochondrijų lizatų frakcijose buvo analizuojamas atliekant Western blot tyrimą su anti-Myc antikūnu. ( j ) 293T ląstelės buvo transfekuotos laukinio tipo „Myc-STAT3“ ir „Myc-STAT3-K87R“ mutantais. Mitochondrijų lizatas buvo paruoštas SSR sąlygomis arba gydant insulinu 30 minučių.

Visas dydis

Toliau mes išgryninome STAT3 iš insulinu gydytų STAT3 ekspresuojančių 293T ir atlikome masių spektrometrijos analizę. Insulino suaktyvinta STAT3 buvo acetilinta K87, taip pat minėtose C-terminalo vietose (K685, K707 ir K709) (2c pav., Papildomas 1b pav.). Tirozino / serino fosforilinti peptidai nebuvo atstatomi. STAT3 buvo acetilinamas ne tik C-galiniame domene, kaip mes ir kiti jau pranešėme anksčiau, bet ir N-galiniame domene 3, 26 . Panaudodami specifinį STAT3 polikloninį antikūną prieš acetil-K87 (papildomas 1a pav.), Mes aiškiai nustatėme STAT3 K87 acetilinimą mitochondrijų lizatuose, paruoštuose iš insulinu apdorotų MEF (2d pav.) Arba iš CBP perkeltų 293T ląstelių (papildomas 2b pav.). ). HDAC6 STAT3 deacetilinimas K87 už mitochondrijų ribų (2e pav.) Sutiko su ankstesniais pranešimais, kad STAT3 deacetiliuoja HDAC 27 citoplazmoje, o HDAC6 susilpnino STAT3 mitochondrijų translokaciją, kurią sukėlė insulinas (2f pav.).

Norėdami nubrėžti mechanizmą, pagal kurį STAT3 persikelia į mitochondrijas po insulino stimuliacijos, mes sukūrėme ir C-galo, ir N-galo sutrumpintą STAT3. Tačiau nei N-galinis, nei C-galinis trynimas nepaveikė STAT3 mitochondrijų translokacijos (papildomas 2c pav.). Taigi šiuose galiniuose regionuose nėra mitochondrijų lokalizacijos signalo (MLS), skirto STAT3. Be to, fosforilinimas Y705 ir S727 dėl serumo bado ir pakartotinio įvedimo taip pat neturėjo akivaizdaus poveikio STAT3 mitochondrijų vietai (2g pav.). Norėdami apibrėžti, koks yra STAT3 sąveikos su CBP domenas, mes kartu transfekavome įvairius STAT3 domenus kartu su CBP. STAT3 N-galinis domenas (liekanos 1–320), bet ne STAT3 C-galinis domenas (liekanos 321–770), reaguojant į CBP, buvo sustiprintas mitochondrijų translokacija, tuo tarpu N-galo 321–770 apipjaustymas perkeltas į mitochondrijas nepriklausomai nuo CBP (2h pav.). Taigi, acetilinimas dramatiškai padidino STAT3 mitochondrijų translokaciją, o acetiliacijos motyvas N-galo srityje yra atsakingas už šią veiklą. STAT3 su K685R, K707R arba K709R mutacijomis (3KR) vis dar buvo mitochondrijų persodinimo reakcija į serumo atnaujinimą ar gydymą insulinu (2i pav.). Priešingai, STAT3 K87R mutantas, palyginti su laukinio tipo STAT3, parodė sumažėjusią mitochondrijų translokaciją (papildomas 2d pav.), Net ir po gydymo insulinu ar bado serume ir pakartotinio įvedimo (2j pav.). Šie rezultatai tvirtai rodo, kad STAT3 patiria tiek nuo acetiliacijos, tiek nuo acetiliacijos nepriklausomą mitochondrijų translokaciją.

STAT3 sudaro kompleksą su PDC E1 ir yra labai svarbus konvertuojant piruvatą į acetil-CoA

Norėdami patvirtinti, kad STAT3 yra kvėpavimo komplekso komponentas, mes atlikome surišimo partnerių masės spektrometrijos analizes STAT3 imunoprecipitatuose, paruoštuose iš HeLa ląstelių mitochondrijų. Nors buvo pranešta, kad kompleksiniai I / II komponentai ir GRIM-19 yra STAT3 jungiantys baltymai mitochondrijose 11, 12, mūsų masės spektrometrinė analizė nenustatė šių baltymų kaip STAT3 surišimo faktorių. Daugybė mitochondrijų baltymų, įskaitant PDC E1, citochromą C ir SIRT5, buvo identifikuoti kaip STAT3 jungiantys baltymai. MEF atveju STAT3 ir PDC E1 sąveika buvo indukuota po gydymo insulinu (3a pav.). STAT3 - / - MEF, PDC komponentų ekspresijos lygis nepakito (3a pav.), Todėl galima daryti išvadą, kad STAT3 išmetimas nepaveikė PDC komponentų, įskaitant PDC E1, dihidrolipoilo transacetilazės (PDC E2) ir dihidrolipoilo dehidrogenazės ( PDC E3). 293T ląstelėse STAT3 C-galinis domenas dalyvavo PDC E1 sąveikoje (3b pav.).

Image

( a ) Laukinio tipo ir STAT3 - / - MEF buvo gydomi insulinu 30 min., o po to imponuota PDC E1. PDC E1 nuosėdos buvo tiriamos atliekant Western blot analizę, kad būtų galima kartu nusodinti STAT3. PDC E2 ir PDC E3 buvo aptikti ląstelių lizatuose. ( b ) „Myc-STAT3“ viso ilgio (FL) ir „Myc-STAT3“ domenai, kaip nurodyta, buvo kotransfekuoti PDC E1 293T ląstelėse, kurioms po to buvo atliktas imunoprecipitacija su „Myc“. STAT3 FL ir STAT3 685-770 nusodino STAT3. c ) PDC E1 aktyvumas buvo matuojamas WT ir STAT3 - / - MEF, kurie buvo gydomi insulinu arba liko negydomi. ( d ) 293T ląstelės buvo transfekuotos naudojant EV arba Myc pažymėtą STAT3, sulietą su Cox4 MLS (Cox4-STAT3). Citoplazminiai (cit) ir mitochondriniai lizatai (mit) buvo analizuojami atliekant Cox4-STAT3 acetiliavimą ir Cox4-STAT3 (anti-Myc), naudojant Western blot analizę. ( e ) Mitochondrijų PDC E1 aktyvumas buvo matuojamas STAT3 - / - MEF, transfekuotais EV, Myc-STAT3 arba Myc-Cox4-STAT3. ( f ) Mitochondrijų PDC E1 aktyvumas buvo matuojamas STAT3 - / - MEF, transfekuotais STAT3 WT, STAT3-3KR, STAT3-Y705F arba STAT3-S727A mutantais. ( g ) „Flag-STAT3 WT“ ir „Flag-STAT3“ mutantai, kaip nurodyta, buvo laikinai transfekuoti kartu su „Myc“ žymėtu PDC E1 293T ląstelėse. Buvo ištirti anti-Myc imunoprecipitai, nustatyti dėl Flag-STAT3. ( h ) Acetil-CoA kiekis buvo matuojamas WT arba STAT3 - / - MEF, gydytais insulinu.

Visas dydis

Atsižvelgiant į kritinį PDC E1 vaidmenį konvertuojant piruvatu į acetil-CoA, mes išanalizavome STAT3 poveikį PDC E1 aktyvumui MEF. STAT3 - / - MEF nesugebėjo sukelti PDC E1 aktyvumo reaguojant į insuliną (3c pav.). Norėdami įvertinti mitochondrijų STAT3 aktyvumą, mes sukūrėme Cox4-STAT3, suliedami MLS (mielių oksidazės komplekso IV nukleotido seką) prie STAT3 N-galo; tiek mitochondrijų lokalizacija, tiek acetilinimas Cox4-STAT3 buvo didesni nei stebimi citoplazmoje (3d pav.). Kai Cox4-STAT3 buvo perdėtai išreikštas STAT3 - / - MEF, Cox4-STAT3 buvo aktyvesnis nei laukinio tipo STAT3 sukeliant PDC E1 aktyvumą (3e pav.), Greičiausiai dėl efektyvesnės mitochondrijų translokacijos ir acetilinimo naudojant Cox4-STAT3 (Papildomas 2e pav.). Tarp STAT3 mutantų, kurių ekspozicija viršijo STAT3 - / - MEF, 3KR mutantas reikšmingai slopino PDH aktyvumą, palyginti su laukinio tipo STAT3 ir Y705F bei S727A mutantais (3f pav.). Šį slopinimą galima paaiškinti prasta 3KR STAT3 mutanto ir PDC E1 sąveika (3g pav.). STAT3 S727A mutacija taip pat paveikė sąveiką su PDC E1 (3f pav., G). Atsižvelgiant į tai, kad PDC E1 kompleksas yra atsakingas už piruvato į acetil-CoA konversiją, mes ištyrėme mitochondrijų acetil-CoA lygius. Kaip ir tikėtasi, acetil-CoA lygis neatsakė į gydymą insulinu, esant STAT3 - / - MEF (3h pav.). Taigi STAT3 greičiausiai daro įtaką mitochondrijų aktyvumui, vykstant piruvato į acetil-CoA konversijos etapui.

STAT3 yra deacetilinamas kelių SIRT mitochondrijose

Atsižvelgiant į teigiamą NAM poveikį STAT3 acetiliacijai 1d pav., Mes apžiūrėjome Sirtuin šeimos narius dėl STAT3 deacetiliavimo aktyvumo HeLa ląstelėse, atlikdami siRNR išeikvojimą. SIRT5 išeikvojimas ir mažesniu mastu SIRT3 išeikvojimas padidino STAT3 acetiliaciją ląstelėse (4a pav.), Taigi galima daryti išvadą, kad tiek SIRT3, tiek SIRT5 yra atsakingi už STAT3 deacetiliavimą HeLa ląstelių mitochondrijose. A549 ląstelėse acetil-STAT3 buvo aptiktas lizatuose, o SIRT5 išeikvojimas padidino STAT3 acetiliaciją citoplazmoje, mitochondrijose ir branduolyje (4b pav.). Norėdami nustatyti STAT3 sritis, kurios sąveikauja su SIRT5, sukūrėme STAT3 domenus ir išbandėme jų sąveiką su SIRT5. Nors STAT3 C-galinis domenas 465–770 stipriai sąveikavo su SIRT5, N-terminalas 1–130 taip pat parodė silpną sąveiką su STAT3 (4c pav.). CBP perdėtos ekspresijos sukeltas STAT3 acetilinimas buvo panaikintas laikinai transfekuojant SIRT5 (4d pav.). Insulino sukeltas STAT3 acetiliavimas MEF buvo visiškai slopinamas per daug eksploatuojant laukinio tipo SIRT5, bet ne mutantą SIRT3-H158Y (4e pav.). SIRT5 yra atsakingas už įvairių mitochondrijų baltymų 28, 29, 30, 31 deacetilinimą. Mūsų in vitro tyrimo rezultatai taip pat atskleidė, kad tiek SIRT3, tiek SIRT5 decetilino STAT3 K685 (4f pav.), Tuo tarpu SIRT3, skirtingai nei SIRT5, nesugebėjo decetiruoti STAT3 70 lizino 707 ir 709 (4 g pav.). STAT3 deatsacilino mitochondrijose tiek SIRT5, tiek daug mažiau - SIRT3. Taigi vėlesniuose tyrimuose mes ištyrėme SIRT5 STAT3 decetiliaciją mitochondrijose. Padarėme išvadą, kad STAT3 acetilinimas yra grįžtamasis procesas ir kad tiek SIRT5, tiek SIRT3 yra atsakingi už STAT3 deacetiliavimą mitochondrijose, net jei šie du SIRT šeimos nariai mitochondrijų metabolizme vaidina priešingai - 32, 33, 34, 35 . Šių dviejų SIRT šeimos narių STAT3 deacetiliacijos reikšmė iš esmės nežinoma. SIRT3 vaidmuo atliekant STAT3 deacetiliavimą vis dar tiriamas.

Image

( a ) HeLa ląstelėse SIRT3, SIRT4 ir SIRT5 buvo išeikvoti siRNR. Imunoprecipifuotas STAT3 buvo aptiktas naudojant anti-pan-acetil-lizino antikūnus, naudojant Western blot metodą. ( b ) A549 ląstelės buvo transfekuotos kontroline arba SIRT5 shRNR. Iš šių ląstelių paruoštų citoplazminių, mitochondrijų ir branduolinių frakcijų buvo aptiktas padidėjęs STAT3 acetilinimas. Tubulinas, porin ir histonas H3 buvo naudojami atitinkamai kaip citoplazminė, mitochondrinė ir branduolinė kontrolė. c ) 293T ląstelėse STAT3 viso ilgio, 1–130 ir 465–770 buvo kotransfekuotos „Flag-SIRT5“. STAT3 ryšys buvo aptiktas Flag-SIRT5 imuniteto nusėdimuose, naudojant Western blot metodą. ( d ) 293T ląstelėse Flag-STAT3 buvo kotransfekuotas EV, CBP, CBP ir SIRT3 arba CBP ir SIRT5. Tuomet buvo aptiktas imunosakuoto STAT3 acetilinimas, naudojant panacililizino antikūną. e ) MEF tirpaluose STAT3 buvo kotransfekuotas Flag-SIRT5 WT arba Flag-SIRT5 H158Y mutantais, po to 30 minučių buvo gydomas insulinu. Nurodytais antikūnais buvo nustatyta STAT3 acetiliacija arba fosforilinimas. ( f ) Sintetinis acetilpeptidas, apimantis STAT3 K685 vietą, buvo inkubuotas su Flag-SIRT5 arba Flag-SIRT3 baltymais, išvalytais iš 293T ląstelių ir NAD. Tada buvo atlikta masių spektrometrijos analizė. g ) MEF buvo laikinai perkraunami SIRT3 arba SIRT5. Kaip nurodyta, insulino sukeltas STAT3 C-galo acetilinimas buvo analizuojamas naudojant specifinius antikūnus prieš STAT3 acetilinimą, naudojant Western blot metodą. SIRT3 ir SIRT5 nudažyti anti-Flag; Įvestyje buvo aptiktas STAT3.

Visas dydis

Acetil-STAT3 veikia TCA-kvėpavimo grandinės funkciją

Kadangi mitochondrijos yra jėgos, turinčios lemiamą reikšmę TCA-ETC reguliavime, mes išanalizavome STAT3 poveikį mitochondrijų TCA-ETC funkcijai. Norėdami efektyviai stebėti mitochondrijų membranos potencialą, mes dažėme mitochondrijas mitochondrijų membranos potencialo dažais JC-1 ir apskaičiavome dažymo signalus. Mitochondrijų membranos potencialą nepaprastai padidino gydymas insulinu arba, kiek mažesniu mastu, gydymas NAM (5a pav.). STAT3 - / - MEF atveju mitochondrijų membranos potencialas tiek baziniame lygmenyje, tiek insulino reakcijoje buvo labai sumažėjęs (5a pav.). PC3 ląstelės yra prostatos vėžio ląstelių linija, turinti STAT3 viso geno delecijos mutaciją 17 36 chromosomoje. Šiose STAT3 neturinčiose ląstelėse palyginome STAT3 mutacijų poveikį mitochondrijų membranos potencialui. STAT3 su 3KR mutacija pastebimai paveikė mitochondrijų membranos potencialą, o STAT3 su S727A mutacija mažesniu mastu paveikė mitochondrijų membranos potencialų aktyvumą (5b pav.), Taigi galima daryti prielaidą, kad serino fosforilinimas vaidina mažiau svarbų vaidmenį nei acetilinimas STAT3 tarpininkaujant. mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai 13 . STAT3 sąlygotas mitochondrijų membranos potencialo padidėjimas atsakė į CBP transfekciją, tačiau jį slopino SIRT5 transfekcija (5c pav.). Kaip ir tikėtasi, CBP transfekcija padidino STAT3 sukeltą PDC aktyvumo indukciją, o SIRT5 kotransfekcija šį poveikį panaikino (5d pav.).

Image

a ) Laukinio tipo arba STAT3 - / - MEF buvo gydomi insulinu (5 μg / ml, 30 min.) arba NAM (100 μM, 6 val.) ir jiems atlikta mitochondrijų membranos potencialo analizė dažant JC-1. b ) Mitochondrijų membranos potencialas buvo matuojamas STAT3 - / - MEF, transfekuotomis STAT3 WT arba mutantais, kaip nurodyta. ( c ) STAT3 WT arba 3KR mutantiniai MEF buvo transfekuoti EV, CBP ir CBP kartu su SIRT5 ir išmatuotas mitochondrijų membranos potencialas. ( d ) PDC E1 aktyvumas (vienetas / 10 4 ląstelių) buvo matuojamas STAT3 - / - MEF, transfekuotais EV, CBP ir CBP kartu su SIRT5. e ) ATP gamyba buvo palyginta tarp STAT3 WT ir STAT3 - / - MEF, reaguojant į gydymą insulinu nurodytomis koncentracijomis. ( f ) STAT3 - / - MEF, įvairios STAT3 formos buvo laikinai transfekuotos ir išanalizuoti ATP lygiai.

Visas dydis

Teigiamas acetil-STAT3 poveikis mitochondrijų TCA-ETC funkcijai dar buvo patvirtintas ištyrus ATP generaciją ląstelėse. Buvo palyginta laukinio tipo ir STAT3 - / - MEF insulino sukelta ATP gamyba. STAT3 - / - MEF generuoja mažiau ATP, nei kontroliavo MEF (5e pav.). STAT3 - / - MEF nereagavo į insuliną (iki 1 μg / ml) ATP susidarymo atžvilgiu, net jei bazinis ATP gamybos lygis šiose ląstelėse buvo gana aukštas (5e pav.). Tada mes išreiškėme STAT3 mutantus STAT3 - / - MEF ir palyginome jų poveikį ATP kartai reaguojant į gydymą insulinu. Tuo tarpu, kai Y705F mutacija nepastebėjo jokio poveikio STAT3 tarpininkaujamam ATP generavimui, 3KR mutacija ir mažesniu mastu S727A mutacija panaikino STAT3 sustiprintą ATP gamybą (5f pav.). Todėl acetil-STAT3 daro įtaką ATP susidarymui ir membranos potencialui mitochondrijose, greičiausiai, paveikdamas PDC aktyvumą acetil-CoA konversijoje.

Didžiausias insulino poveikis ląstelių cukraus metabolizmui yra cukraus šalinimo ląstelėse pagreitėjimas. STAT3 buvo būtinas insulino reguliavimui cukraus ląstelėje, nes gliukozės kiekis ląstelėse greitai sumažėjo gydant insulinu laukinio tipo, bet ne STAT3 - / - MEF (6a pav.). Tačiau STAT3 išsiskyrimas neturėjo įtakos glikolizei, kaip tai parodo tarpląstelinio rūgštėjimo rodikliai (ECAR), aptikti naudojant Seahorse XF96 tarpląstelinio srauto analizatorių. Rezultatas atitinka mūsų išvadą, kad STAT3 reguliuoja gliukozės metabolizmą mitochondrijose (6b pav.). Deguonies sunaudojimo norma (OCR) buvo aiškiai didesnė plataus tipo MEF, gydomiems insulinu, nei STAT3 - / - MEF tuo pačiu eksperimentiniu procesu (6c pav.). Palyginti turėjo įtakos insulino sukeltas TCA reguliavimas, nes insulinas nepadidino α-ketoglutarino rūgšties (α-KG) lygio padidėjimo STAT3 - / - MEF (6c pav.). Insulino sukelta acetil-CoA gamyba žymiai padidėjo tiek citoplazmos, tiek mitochondrijų frakcijose (6d pav.). Mitochondrijų acetil-CoA pirmiausia dalyvauja paskesniuose metabolizmo keliuose, tokiuose kaip ląstelių kvėpavimas ir TCA ciklas. Į citoplazmą perkeltas acetil-CoA dalyvauja lipidų sintezėje. Tarpląsteliniai lipidai buvo įvertinti naudojant raudonąjį O dažymą. Laukinio tipo MEF metu insulinas sukėlė greitą alyvuogių raudonojo O kaupimąsi arba lipidų apvalkalo susidarymą, tuo tarpu STAT3 - / - MEF metu konstitucinio alyvmedžio raudonojo O kaupimosi ar lipidų apvalkalų susidarymo nebuvo nustatyta (6e, f pav.). Badavimas serume ir pakartotinis gydymas bei gydymas insulinu smarkiai padidino riebalų kaupimąsi, kai į STAT3 - / - MEF buvo įvesta laukinio tipo STAT3, bet ne STAT3 su 3KR mutacija (6g pav.). Taigi, nors STAT3 yra būtinas mitochondrijų veiklai skatinti TCA funkciją, STAT3 taip pat jautrina gliukozės virsmą riebalų rūgštimis, reaguodamas į gydymą insulinu ląstelėse.

Image

a ) Gliukozės kiekis ląstelėse buvo matuojamas kontroliuojamaisiais arba STAT3 - / - MEF, kurie buvo gydomi insulinu (5 μg / ml) 30 minučių arba nebuvo gydomi. ( b ) Jūrų arkliukų tarpląstelinio rūgštėjimo greitis (ECAR) buvo matuojamas keturiuose dubliuotuose šuliniuose, kuriuose yra lygus laukinio tipo arba STAT3 - / - MEF, apdorotų insulinu (5 μg / ml). c ) Seahorse deguonies suvartojimo greitis (OCR) buvo matuojamas keturiuose dubliuotuose šuliniuose, turinčiuose vienodą skaičių laukinio tipo arba STAT3 - / - MEF, apdorotų insulinu (5 μg / ml). ( d ) α-ketoglutarino rūgšties koncentracijos buvo matuojamos kontroliuojamaisiais arba STAT - / - MEF, gydomiems insulinu (5 μg / ml) 30 minučių arba be gydymo. ( e ) Citoplazminės ir mitochondrinės acetil-CoA koncentracijos vertės buvo matuojamos MEF, gydytais insulinu įvairų laiką, kaip nurodyta. f ) Kontrolinis MEF ir STAT3 - / - MEF dažymas alyvuogių raudonu O, apdorotas insulinu arba be jo (5 μg / ml, 30 min.). Lipidų lašelių kaupimasis buvo vizualizuotas mikroskopu. ( g ) lipidų lašelių IOD (integruotas optinis tankis) iš ( c ) buvo išmatuotas naudojant IPP programinę įrangą ( d ). ( h ) Lipidų lašelių IOD (integruotas optinis tankis) buvo matuojamas STAT3 - / - MEF, dažytais alyvos raudonuoju O po SSR (90% DMEM ir 10% FBS, 30 min.), insulinu (5 μg / ml, 30 min.). ) ir NAM (100 μM, 6 val.) apdorojimas.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme mitochondrijų STAT3 būklę vėžio ląstelėse. PC3 ląstelės pasižymėjo labai mažu mitochondrijų membranos potencialu, greičiausiai dėl STAT3 ekspresijos stokos (7a pav.). Kaip pažymėta anksčiau (7b pav.) 37, STAT3 pažymėjome Cox4 MLS peptidu, kuris padidino STAT3 mitochondrijų translokaciją. Mitochondrijų membranos potencialas padidėjo po transfekcijos su STAT3 ir pastebimai padidėjo po transfekcijos su Cox4-MLS pažymėtu STAT3 (7a pav.). PC3 ląstelėse, transfekuotose STAT3 arba Cox4-MLS pažymėtais STAT3, PDC aktyvumas ir ATP gamyba abu buvo padidėję (7c pav.). Anksčiau buvo pranešta, kad STAT3 blokuoja vėžinių ląstelių autofagiją 38, 39, 40, 41 . PC3 ląstelėse laukinio tipo STAT3, bet ne su 3KR mutavusiais STAT3, blokavo autofagiją, ką atspindi LC3-GFP puncta išnykimas (7d pav.). Tačiau STAT3 buvo konstituciškai acetilinamas A549 plaučių adenokarcinomos ląstelių linijoje (7e pav.), Ir buvo nustatyta, kad acetil-STAT3 yra lokalizuota mitochondrijose (7e pav.). Šiose ląstelėse pastebėtas padidėjęs PDC E1 aktyvumas (7f pav.). Kai kurios vėžio ląstelės pasižymi padidintu gliukozės virsmu laktatu per piruvatą, esant vadinamajam Warburgo efektui. Todėl mes ištyrėme laktato kiekį šiose vėžio ląstelėse. Laktato lygis PC3 ląstelėse buvo daug didesnis nei A549 ląstelėse (7g pav.). Tačiau STAT3 įvedimas į PC3 ląsteles labai sumažino Warburgo efektą, kurį atspindi sumažėjęs laktato kiekis (7g pav.) Ir padidėjęs gliukozės ir riebalų rūgščių metabolizmas (7h pav.). Imunohistocheminiai tyrimai parodė, kad K685-acetilintas STAT3 buvo plačiai paplitęs citoplazminiuose regionuose vėžio skyriuose, gautuose tiek iš nesmulkialąstelinės adenokarcinomos, tiek iš plaučių vėžinės plaučių vėžio pacientų (7i pav.). Priešingai, gretimame normaliame plaučių audinyje pastebėtas tik atsitiktinis K685-acetilinto STAT3 dažymas (7i pav.). Norėdami patvirtinti, kad citoplazminė K685-acetilinta STAT3 buvo lokalizuota mitochondrijose, mes atskyrėme mitochondrijų frakciją nuo citoplazmos vėžio ir gretimų normalių audinių mėginių, gautų iš plaučių vėžiu sergančių pacientų. Vėlesnis vakarų užkrėtimas atskleidė, kad K685-acetilinto STAT3 lygis yra didesnis vėžio audinių pjūvių mitochondrijose nei normaliuose audinių pjūviuose (7 pav. J). Priešingai, SIRT5 lygis buvo mažesnis vėžio audinių skyriuose nei gretimose normalių audinių dalyse (7 pav. J). Kaip tikėtasi, ATP gamyba taip pat buvo didesnė vėžio audinių skyriuose nei normalių audinių sekcijose (7k pav.). Todėl mitochondrijų metabolizmo aktyvinimas konstituciškai acetilintu STAT3 gali būti lemiamas vėžio vystymosi etape .

Image

( a ) PC3 ląstelės (STAT3-null) buvo transfekuotos EV, STAT3 arba Cox4-STAT3 ir vizualizuotos naudojant mitochondrijų membranos potencialo dažą JC-1. ( b ) Mitochondriniai lizatai iš aukščiau išvardytų trijų tipų PC3 ląstelių buvo paruošti STAT3 acetiliacijos analizei. ( c ) Mitochondrijų membranos potencialas (kairėje), mitochondrijų PDC E1 aktyvumas (viduryje) ir ATP produkcijos lygis (dešinėje) buvo išmatuoti aukščiau nurodytuose trijuose PC3 ląstelių tipuose. ( d ) Tėvų PC3 ląstelės (STAT3-null), PC3 ląstelės, ekspresuojančios STAT3 WT, arba PC3 ląstelės, ekspresuojančios STAT3-3KR mutantą, buvo transfekuotos GFP-LC3 (žalia), nudažytos DAPI (mėlyna), ir jiems atlikta konfokalinė mikroskopija. e ) A549 ląstelės buvo apdorotos insulinu arba be jo. STAT3 acetiliacija buvo nustatyta naudojant anti-pan-acetil-lizino antikūnus citoplazminėse ir mitochondrinėse frakcijose. ( f ) Mitochondrijų PDC E1 aktyvumas buvo išmatuotas A549 ląstelėse, transfekuotose EV arba Flag-SIRT5. Šiose ląstelėse buvo aptiktas „Western-blot“ metodu pažymėtas „Flag-SIRT5“ lygis (dešinėje). ( g ) Laktato lygis buvo matuojamas tėvų PC3 (žalia), PC3-STAT3 (mėlyna) arba A549 (raudona) ląstelėse po gydymo insulinu nurodytą laiką. ( h ) Riebalų raudonuoju O dažytų riebalinių lašelių absorbcija buvo matuojama pradinėse PC3 (žaliosiose), PC3-STAT3 (mėlynos) arba A549 ląstelėse (raudonos) 490 nm bangos ilgiu, ekstraktuose, paruoštuose su izopropanoliu. ( i ) Plaučių audinio mėginiai (vėžio pjūviai ir gretimi normalūs pjūviai), gauti iš nesmulkialąstelinės adenokarcinomos ir plaučių vėžinės plaučių vėžio pacientų, buvo imunizuoti, naudojant polikloninius antikūnus prieš K685-acetiliną STAT3. j ) Mitochondrijų ir citoplazmų frakcijos buvo paruoštos iš naviko audinių mėginių (T) ir gretimų normalių audinių mėginių (N) iš 4 plaučių vėžiu sergančių pacientų. aK685-STAT3, STAT3, SIRT5 ir porin buvo tiriami mitochondrijų frakcijoje (viršutinė panelė), aK685-STAT3, STAT3 ir tubulinas buvo analizuojami citoplazmos frakcijoje (apatinė panelė). ( k ) ATP produkcija buvo palyginta tarp 3 plaučių vėžiu sergančių pacientų naviko audinių (T) ir gretimų normalių audinių (N) mėginių.

Visas dydis

Diskusija

Nors STAT3 perkėlimas tarp citoplazmos ir branduolio priklauso tik nuo tirozino ir serino fosforilinimo 45, 46, STAT3 mitochondrijų translokacija gali būti priklausoma nuo acetiliacijos ir nuo acetiliacijos, kaip parodyta čia. Anksčiau buvo įrodyta, kad S727A mutacija sumažina mitochondrijų STAT3 kaupimąsi 11 . Mūsų rezultatai atskleidė, kad insulino suaktyvinta STAT3 daugiausia buvo acetilinta ir patiria mitochondrijų, o ne branduolinę translokaciją. Be to, STAT3 N-galinis regionas buvo atsakingas už nuo CBP acetiliacijos priklausomą mitochondrijų translokaciją. CBP-acetiliuoti baltymai dažnai dalyvauja baltymų judėjime tarp citoplazmos ir tarpląstelinių organelių, baltymų ir plazmos membranų susiejime ir disociacijoje bei baltymų ir baltymų sąveikoje 47, 48, 49 . Vienas iš patikimų paaiškinimų yra tas, kad acetilinimas neutralizuoja teigiamus baltymo lizino likučių krūvius, tokiu būdu sudarydamas sąlygas baltymams lanksčiau judėti per neigiamai įkrautą lipidų dvisluoksnį membraną. Nors buvo pranešta, kad GRIM19 ir MLS, neturinčių STAT3 baltymų, rodo mitochondrijų kolokalalizaciją 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, STAT3 ir GRIM19 Nustatyta, kad sudėtingas formavimasis nepriklauso nuo S727 fosforilinimo, ir nei STAT3, nei GRIM19 neturi tipiško MLS50.

Larnerio grupė pranešė, kad STAT3 modifikuoja I ir II kompleksus elektronų pernešimo grandinėje per nežinomą mechanizmą 12, 13 . GRIM-19 yra mitochondrijų NADPH: ubikinono oksidoreduktazės komplekso subvienetas. Tačiau GRIM19 didžiąja dalimi slopina STAT3 transkripciją, sutrikdydamas STAT3 ir DNR jungimosi aktyvumą, ir dar labiau slopina STAT3 sąlygotą ląstelių proliferaciją 50 . Anksčiau buvo pranešta, kad piruvato dehidrogenazės kompleksas-E2 (PDC-E2) sąveikauja su STAT šeimos nariais priklausomai nuo citokinų stimuliavimo 52 . CBP-acetilintas STAT3 virsta mitochondrijomis, kur STAT3 asocijuojasi su PDC E1 ir skatina piruvato oksidaciją. STAT3 N-galinis regionas yra susukto ritės domenas, kuris yra homologiškas tarp daugelio struktūrinių baltymų, fermentinių kofaktorių, taip pat transkripcijos faktorių 53, 54, 55 . Ypač sandarus ritės domeno pakavimas yra palankus tiksliai kontroliuoti fermentines reakcijas. Baltymai su STAT3 tipo linkerio-SH2 domenais buvo nustatyti augaluose ir C. elegans 56 . Šie baltymai nėra konservuoti savo DNR jungiančiuose domenuose, tai rodo, kad jie gali atlikti ir papildomus vaidmenis, ne tik kaip transkripcijos veiksniai. Taigi, formuodamas kompleksą su PDC, STAT3 gali palengvinti piruvato į acetil-CoA virsmą veikdamas kaip fermentinis kofaktorius.

Skirtingai nuo defosforilinimo, deacetilinimas gali būti lengvai atliekamas mitochondrijose, o mitochondrijose randama daugybė deacetilazių. Mitochondrijose SIRT3, SIRT4 ir SIRT5 yra atsakingos už skirtingų substratų deacetiliavimą, o jų veiklos nutraukimas yra susijęs su skirtingais TCA-ETC kelio 34, 57, 58 etapais . STAT3 yra tiesioginis SIRT5 substratas, todėl galima teigti, kad STAT3 iš tikrųjų gali dalyvauti keliuose TCA-ETC keliuose. Vėžiu ar kitais medžiagų apykaitos sutrikimais, kai mitochondrijų SIRT aktyvumas yra nepakankamai sureguliuotas, mitochondrijų baltymai gali turėti konstitucinį arba hiperacetilinimą. Iš esmės acetiliuotas STAT3 virsta mitochondrijomis, kur palaiko pakitusią TCA-ETC funkciją glikolitinėms ir oksidacinėms fosforilinimo reakcijoms. Nuo STAT3 priklausomas piruvatų virsmo metabolinis reguliavimas mitochondrijose palaiko nuo Ras priklausomą piktybinę transformaciją 59 .

Apskritai, nuo acetilinimo priklausančio STAT3 aktyvumo galima lengviau manipuliuoti nei fosforilinimu mitochondrijose, nes yra galingų deacetilinimo fermentų. Šis tyrimas pabrėžia acetil-STAT3 vaidmenį reguliuojant piruvatų metabolizmą TCA-ETC funkcijai mitochondrijose. STAT3 dalyvavimas energijos metabolizme acetilinant rodo, kad STAT3 gali atlikti įvairius naviko mechanizmus.

Medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra ir reagentai

PC3, A549, HeLa ir 239T ląstelės buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos ir išaugintos pagal Amerikos tipo kultūros kolekcijos rekomendacijas. Visos aukščiau išvardytos ląstelių linijos, taip pat STAT3 - / - ir kontroliniai MEF (gauti iš XY Fu) buvo kultivuojamos 90% DMEM, 10% FBS (Gibco, # 10099-141), 100 μg / ml penicilino (Life Technologies, # 15140-155) ir 100 μg / ml streptomicino (Life Technologies, # 15140–122), esant 37 ° C ir 5% CO 2 .

Chemikalai, įskaitant NAM (A2984), TSA (T1952), DAPI (5D8417), aliejinis raudonasis O (O0625), insulinas (I3536), gliukozės tyrimų rinkinys (GAGO20), α-ketoglutarino rūgšties tyrimo rinkinys (MAK054), acetilas. -CoA tyrimo rinkinys (MAK039) ir laktato tyrimo rinkinys (MAK064) buvo gauti iš bendrovės „Sigma“. „Mito-Tracker Green“ (C1048), JC-1 - mitochondrijų membranų potencialo aptikimo rinkinys (C2006), citozolinių baltymų ekstrahavimo rinkinys (P0027), mitochondrijų ekstrahavimo rinkinys (C3601) ir ATP tyrimo rinkinys (S2006) buvo įsigyti iš „Beyotime“ ( Šanchajus). Piruvato dehidrogenazės aktyvumo tyrimo rinkinys buvo įsigytas iš YoYongBio (Šanchajus). ELISA acetil-CoA tyrimo rinkinys buvo įsigytas iš „Xinfan Biotechnology Co., Ltd.“ (Šanchajus).

Anti-VDAC1 / Porin (ab 14734) antikūnas buvo įsigytas iš Abcam. Anti-H3 antikūnas (3638), anti-pS727-STAT3 antikūnas (9136) ir anti-acK685-STAT3 antikūnas (2523) buvo iš „Cell Signaling Technology“ (Bostonas). Anti-STAT3 antikūnas (SC-482), anti-pY705-STAT3 antikūnas (SC-7993) ir IgG (SC-3888, SC-3877) buvo iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Santa Cruz). Anti-Flag antikūnas (F9291), anti-tubulino antikūnas (T2200) ir IgG (15381) buvo iš „Sigma“. Polikloninius antikūnus prieš acetil-STAT3 (acK87, acK707, acK709) paruošė „AB-land Biotech“ (Hangdžou). IgG kontrolė visiems imunoprecipitacijos ir papildomiems imunoprecipitacijos eksperimentams pateikiama papildomame 1c pav.

Žmogaus audinių gavimas

Žmogaus plaučių vėžio audinių ir gretimų normalių audinių mėginiai buvo paimti iš Šanchajaus krūtinės ligoninės Transliacinio medicinos centro. Eksperimentinius protokolus patvirtino ir Šanchajaus Jiaotongo universitetas, ir Shandongo universiteto instituciniai apžvalginiai komitetai (IRB). Šiame skyriuje aprašyti metodai buvo atlikti laikantis visų tyrimų su žmonėmis gairių ir taisyklių. Iš visų šio tyrimo dalyvių buvo gautas informuotas sutikimas.

Branduolinių, citozolinių ir mitochondrijų baltymų ekstraktų paruošimas

Įprasti ląstelių lizatai, taip pat citoplazminės ir branduolinės frakcijos buvo paruošti, kaip aprašyta anksčiau 60 . Mitochondrijų ekstraktai buvo paruošti naudojant mitochondrijų ekstrahavimo rinkinį (Beyotime, # C3601) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, 5x106 ląstelės buvo reguliariai sumalamos stikliniu homogenizatoriumi (KIMBLE CHASE, # 885302) ledo vonioje 22 potėpiams. Citoplazmos, mitochondrijos ir branduolinės frakcijos buvo atskirtos diferenciniu centrifugavimu (600 g, 10 min., 4 ° C ir 10 000 g, 10 min., 4 ° C). Supernatantas (citozolinė frakcija) ir nuosėdos (mitochondrijų frakcija) buvo surinkti, o nuosėdos toliau lizuojamos, kad gautųsi galutinis mitochondrijų lizatas. Norint patvirtinti, kad gauti gryni ekstraktai, mitochondrijų, branduolinės ir citoplazminės frakcijos buvo atskirtos SDS-PAGE, ir mitochondrijų porienos, branduolinio H3 ar citoplazminio tubulino buvimas buvo įrodytas Western blot analize, naudojant monokloninius antikūnus.

Audinių mitochondrijų ekstrahavimui buvo paruoštos keturios naviko grupės ir normalūs mėginiai, naudojant audinių mitochondrijų ekstrahavimo rinkinį (Beyotime, # C3606). Trumpai tariant, 300 mg naviko ir normalus audinys buvo tris kartus plaunami PBS, kiek įmanoma nukirpta ir sumalama 15 stiklo homogenizatoriaus smūgių ledo vonioje. Citoplazmos ir mitochondrijos frakcijos buvo atskirtos diferenciniu centrifugavimu (600 g, 5 min., 4 ° C ir 10 000 g, 10 min., 4 ° C). Supernatantas (citozolinė frakcija) ir nuosėdos (mitochondrijų frakcija) buvo surinkti, o nuosėdos toliau lizuojamos, kad gautųsi galutinis mitochondrijų lizatas. Ekstrahuoti baltymai buvo paruošti vėlesnei Western blot analizei.

Western blot analizė

Ląstelės, veikiamos skirtingomis sąlygomis, buvo lizuojamos vakariniame ir IP lizatų buferyje (Beyotime, # P0013J), turinčiuose 20 mM Tris (pH 7, 5), 150 mM NaCl ir 1% Triton X-100 ir papildytos proteazės ir fosfatazės inhibitoriaus kokteiliu („Thermo Scientific“)., # 78440). Baltymai buvo atskirti SDS-PAGE ir perkelti į nitroceliuliozės membraną (Millipore, # HATF00010). Membranos buvo užblokuotos 5% BSA tirpalu su Tris buferiniu tirpalu ir inkubuojamos su pirminiais antikūnais per naktį. Blotai buvo sukurti su peroksidaze konjuguotu fluorescenciniu antriniu antikūnu 1 val., Po to vakariniai blotai buvo nuskaityti ir išanalizuoti naudojant LI-COR sistemą (Odisėja). Visų paveikslėlių vakarinių taškų nuskaitymas pateiktas papildomame 3 pav.

SiRNR transfekcija

Mažos trukdančios RNR (siRNR) prieš PR, STAT3, SIRT3, SIRT4 ir SIRT5 mRNR buvo susintetintos „Dharmacon, Inc.“ (Lafayette, CO). Kaip neigiama kontrolė buvo naudojamas neslopinantis „Dharmacon“ siRNR oligonukleotidas, kuris netaikomas jokiems žinomiems žinduolių genams. SiRNR dupleksų transfekcija buvo atlikta naudojant lipofectamine 2000 (Invitrogen, # 11668-027) transfekcijos reagentą pagal gamintojo nurodymus.

Masės spektrometrijos analizė (tirpalo tirpinimas tirpale)

Maždaug 2 × 10 7 293T ląstelės, 48 ​​valandas transfekuotos STAT3 ar kitomis plazmidėmis, buvo lizuotos RIPA lizatų tirpale (50 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 1% NP-40, 0, 5% natrio deoksicholato, 0, 1% SDS). 150 mM NaCl). Baltymų mėginiai buvo sureguliuoti iki žinomos koncentracijos 100 mM NH4HCO3 buferyje, o pH sureguliuotas iki 8, 0 naudojant 1 M Tri-HCl buferį (pH 8, 0). Į baltymų mėginius (1:25) buvo įpiltas tripsino tirpalas (m / m, Sigma, # T6567) ir inkubuotas per naktį 37 ° C temperatūroje. Trypino lizatai buvo įpilti į „Amicon Ultra-0, 5 ml“ išcentrinį filtrą (Ultracel-10K) ir centrifuguoti esant 13 000 aps./min. Esant 4 ° C 10 minučių, o granulės išdžiovintos „Speed ​​Vac“. Mėginiai buvo suspenduoti buferiniame tirpale A (dejonizuotas vanduo su 0, 1% skruzdžių rūgšties); buvo išmatuota peptido koncentracija ir mėginiai buvo naudojami LC-MS / MS analizei.

cDNR rekonstrukcija

Mes rekonstruoti STAT3 N-gale kondensuotas su mielių citochromo C oksidazės 4 mitochondrijų lokalizacijos sekos (MLS), kurio nukleotidų seka yra ATGTTGTCTAGATATCTGCTTCGTCATTGTTCTCGTTCCCTTTCTTCCT TGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCATACAATCAA GGAATTCACAATGTTGTCTAGATATCTGCTTCAGCAAAAACCCGTGGT GAAAACTGCCCAAAACTTAGCAGAAGTTAATGGTCCAGAAACTTTGAT TGGTCCTGGTGCTAAAGAGGGTACCGTTCCAACAGACCTAGATCAAG AAACTGGTTTAGCTAGGTTAGAATTATTGGGTAAATTAGAGGGTATCGAT.

Imunofluorescencinis dažymas ir konfokalinė mikroskopija

PC3 ląstelės buvo kotransfekuotos GFP-LC3 naudojant tuščią vektorių, laukinio tipo STAT3 arba STAT3 3KR mutantą, 24 valandas, o po to 12 val. Badaujamos serume RPMI-1640. DAPI dažymas buvo atliekamas PC3 ląstelėmis ant stiklinių dangtelių dangtelių 5 minutes, ir ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu 30 minučių kambario temperatūroje. Po tris kartus plaunamo PBS, dangteliai buvo sumontuoti Citifluor (Amersham Biosciences) ir nudažytos ląstelės buvo analizuotos Zeiss LSM 700 konfokaliniame mikroskopu.

Audinių matricos imuninis dažymas

Parafinu įterptų audinių mikrotraumų blokai buvo suskirstyti į 4 mm storio dalis, deparafinuoti ksilenu ir rehidratuoti diferencijuotame etanolio tirpale, o endogeninis peroksidazės aktyvumas buvo užblokuotas inkubuojant su 3% H2O2 30 minučių kambario temperatūroje. Tada sekcijos buvo panardintos į citrato-NaOH buferį (10 mM natrio citrato, pH 7, 0) 40 minučių 92 ° C temperatūroje, kad būtų atstatytas antigeniškumas. Rehidratuotos sekcijos buvo inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje su anti-Lys685 (1:20, Abcam). Skyriai, inkubuoti su pirmuoju antikūnu, buvo plaunami Tris buferiniu druskos tirpalu, po to inkubuojami su „MaxVision HRP-Polymer Anti-Rabbit IHC Kit“ (Maxin, Fuzhou) 20 minučių kambario temperatūroje. Skyriai buvo vizualizuoti naudojant DAB Detection Kit (Maxin, Fuzhou) reakciją, po kurios sekė dažymas hematoksilinu. Neigiami kontroliniai eksperimentai buvo atlikti praleidžiant pirminį antikūną.

Mitochondrijų PDC E1 aktyvumo analizė

Mitochondrijų PDC E1 aktyvumas buvo tiriamas naudojant PDC E1 tyrimo rinkinį pagal gamintojo protokolą (YoYongBio). Trumpai tariant, 5 × 106 ląstelės, apdorotos kaip nurodyta, buvo paruoštos mitochondrijų ekstrakcijai. Ląstelės buvo fiksuotos 1 ml reagento-1 ir 10 μl reagento-3, sumalamos stikliniu homogenizatoriumi (KIMBLE CHASE, # 885302) 16 kartų ledo vonioje ir centrifuguojamos 600 g, 4 ° C temperatūroje 5 minutes. . Supernatantas perpilamas į kitą 1, 5 ml centrifugos mėgintuvėlį ir 10 minučių centrifuguojamas 10000 g, 4 ° C temperatūroje. Iš viso į nuosėdas (mitochondrijos) buvo įpilta 200 μl reagento-2 ir 2 μl reagento-3; ultragarsinis suskaidymas buvo atliktas ledo vonioje (20% galios, 30 ciklų po 3 sek. įjungimą ir 10 sek. išjungimą); ir tada PDC E1 aktyvumas buvo aptiktas mikrobangų plokštelių skaitytuve esant 605 nm. Trumpai tariant, 50 μl mėginio buvo įpilta į 90 μl darbinio tirpalo į kiuvetę ir sumaišyta muša. Pradinė absorbcijos vertė A1 esant 605 nm buvo užregistruota nedelsiant, o absorbcijos vertė A2 buvo užregistruota po 1 min., Kai ΔA = A1 - A2. PDC E1 katalizuoja piruvato dehidrogenavimą ir tuo pat metu deoksiduoja 2, 6-DCPIP, todėl sumažėja absorbcija esant 605 nm. U žymi vieną PDH aktyvumo vienetą, kuris apibūdinamas kaip 1 nmolio 2, 6-DCPIP sunaudojimas per 1 minutę 1 × 10 4 ląstelėse.

Skaičiavimo formulė: PDH aktyvumas (U / 10 4 ląstelė) = [ΔA × Vtr ÷ (ε × d) × 10 9 ] ÷ (500 × Vs ÷ Vts) ÷ T = 0, 366 × ΔA (Vtr: bendras reakcijos tūris, ε: 2, 6-dviejų dichlorindofenolio molinio ekstinkcijos koeficientas, d: kiuvetės šviesos kelias, Vs: mėginio tūris, Vts: bendras mėginio tūris).

Mitochondrijų membranų potencialo nustatymas

MEF ir PC3 ląstelės, pasėtos į 12 šulinėlių ląstelių kultūros plokšteles, buvo apdorotos, kaip aprašyta, ir po to dažytos JC-1 pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, 6 × 105 ląstelės buvo surinktos, pritvirtintos 0, 5 ml ląstelių kultūros terpės ir 0, 5 ml JC-1 dažymo darbinio tirpalo ir inkubuotos ląstelių kultūros spintoje 20 min., Švelniai pakratant. Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant 600 g, 4 ° C temperatūroje 3 minutes, po to 3 kartus plaunamos 1x JC-1 buferiniu tirpalu. Ląstelių fluorescencijos intensyvumas buvo išmatuotas mikroplokštelių skaitytuvu 96 šulinėlių plokštelėse, po to, kai ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos 100 μl 1x JC-1 buferiniame tirpale. Mikro plokštelių skaitytuve buvo išmatuoti raudonos (λex = 529 nm, λem = 590 nm) ir žalios (λex = 470 nm, λem = 529 nm) vidutiniai fluorescencijos intensyvumai.

Dažymas riebaliniais lašais

MEF, A549 ląstelės ir PC3 ląstelės, pasėtos 12 šulinėlių ląstelių kultūros plokštelėse, buvo apdorotos vaistais ir nudažytos aliejine raudona O pagal gamintojo instrukcijas (Sigma, # O0625). Trumpai tariant, pašalinus auginimo terpę, ląstelės buvo du kartus praplaunamos PBS, po to įpilama 1 ml fiksavimo tirpalo (10% formaldehido), kad ląstelės būtų uždengtos mažiausiai 1 valandą kambario temperatūroje. Po dviejų švelnių plovimų 60% izopropanoliu, buvo pridėtas šviežiai paruoštas aliejinio raudonojo O tirpalas (60% aliejinis raudonasis O, sumaišytas su 40% dejonizuoto vandens) ir inkubuotas 20 minučių kambario temperatūroje po to, kai izopropanolis buvo visiškai išdžiūvęs. Dažymo tirpalas buvo pašalintas, o ląstelės buvo nedelsiant keturis kartus plaunamos dejonizuotu vandeniu. Šiame etape buvo surinkti mikroskopijos vaizdai, kad ląstelėse būtų rausvos iki raudonos spalvos aliejaus lašeliai. Į kiekvieną šulinėlį 5 min. Įpilama 100 μl dažų ekstrahavimo tirpalo (100% izopropanolio), o absorbcija buvo nuskaityta 490 nm bangos ilgyje 96 šulinėlių plokštelėje, naudojant mikroteklių plokštelių skaitytuvą.

ATP lygiai

MEF arba PC3 ląstelės, pasėtos 12 šulinėlių lėkštelėse, buvo 48 valandas transfekuotos tuščiu vektoriu (EV), STAT3 WT, Cox4-STAT3 arba STAT3 mutantais arba apdorotos skirtingais vaistais. Ląstelinis ATP kiekis buvo matuojamas pagal reagento naudojimo vadovą (Beyotime, # S2006). Ląstelės buvo lizuotos 100 μl lizės buferiu iš tyrimo rinkinio. Supernatantas buvo surinktas po centrifugavimo 12000 g, 4 ° C 5 minutes ir panaudotas ATP lygiams aptikti; 50 μl ATP aptikimo darbinio tirpalo buvo dedama į kiekvieną mėgintuvėlį prieš aptikimą 5 minutes, kad būtų visiškai sunaudotas originalus ATP. Kiekvieno mėginio židinio liuciferazės aktyvumas, išreikštas RLU (santykinis šviesos vienetas), buvo matuojamas mažiausiai 2 sekundes GLOMA liuminometru iš Promegos, į kiekvieną mėgintuvėlį įpilant 20 μl ląstelių lizato. Buvo sudaryta standartinė kreivė, naudojant 0, 01, 0, 03, 0, 1, 0, 3, 1, 0, 3, 0 ir 10 μM ATP.

Gliukozės suvartojimas

Gliukozės sunaudojimas ląstelėse buvo patikrintas pagal gamintojo protokolus („Sigma“, # GAGO-20). Gliukozė buvo ekstrahuota iš maždaug 1 × 0, 7 MEF 2 ml dejonizuoto vandens. Tirpalas pašildomas (<75 ° C), kad būtų galima ekstrahuoti. Laiku nulio, reakcija buvo pradėta pridedant 2, 0 ml tyrimo reagento į pirmą mėgintuvėlį (kuriame yra 1 ml mėginio tirpalo) ir sumaišius. Tarp kiekvieno reagento įdėjimo į kiekvieną sekantį mėgintuvėlį buvo leidžiamas 30–60 sekundžių intervalas. Kiekvieno mėgintuvėlio reakcijos vyko tiksliai 30 minučių 37 ° C temperatūroje ir buvo sustabdomos 30–60 sekundžių intervalu, pridedant 2, 0 ml 12 NH2SO4 (Sigma, # 258105), ir tada kiekvienas mėgintuvėlis buvo gerai sumaišytas. Kiekvieno mėgintuvėlio absorbcija buvo matuojama pagal reagento ruošinį, esant 540 nm, naudojant mikroteklių plokštelių skaitytuvą. Etaloninei kreivei suformuoti naudojamo gliukozės etaloninio tirpalo tūriai buvo 0, 0, 02, 0, 04, 0, 06 ir 0, 08 ml.

α-KG kiekis

α-KG kiekis buvo patikrintas pagal gamintojo protokolus (Sigma, # MAK054). Trumpai tariant, 2 × 106 MEF buvo homogenizuota 100 ml ledo šalto α-KG buferio. Mėginiai buvo centrifuguoti 13 000 g 10 minučių, kad būtų pašalinta netirpi medžiaga, sureguliuota iki 50 ml tūrio, naudojant α-KG analizės buferį, ir, prieš pridedant reakciją, deproteinizuoti 10 kDa MWCO (Millipore) filtru, kad būtų išvengta trukdžių. iš mėginių fermentų. Reakcijas sudarė 20 μl mėginio tirpalo, 24 μl α-KG tyrimo buferio, 2 μl α-KG konvertuojančio fermento, 2 μl α-KG vystymosi fermento mišinio ir 2 μl fluorescencinės peroksidazės substrato ir buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 30 min. Kiekvienos reakcijos sistemos absorbcija buvo matuojama esant 540 nm (A 570 ), naudojant mikroteklių plokštelių skaitytuvą. Iš viso 10 μl 100 mM α-KG tirpalo buvo praskiestas 990 μl vandens, kad būtų gautas 1 mM standartinis tirpalas. Standartinei kreivei sudaryti buvo naudojami 1 mM α-KG tirpalo tūriai: 0, 2, 4, 6, 8 ir 10 μl.

Acetil-CoA kiekis

Fluorescencinio analizės metodui acetil-CoA kiekis buvo patikrintas pagal gamintojo protokolus (Sigma, # MAK039). Trumpai tariant, 1 × 107 MEF buvo greitai užšaldytas (skystas N2) ir susmulkintas. Mėginiams buvo pašalinti baltymai, nusodinant PCA; Kol mėginys buvo laikomas šaltai, į mėginį buvo įpilama 2 ml 1 N perchloro rūgšties (PCA) (Sigma, # 34288). Tada mėginys kruopščiai homogenizuotas ir 10 minučių centrifuguojamas esant 13 000 g, kad būtų pašalinta netirpi medžiaga. Supernatantas buvo neutralizuotas 3 M kalio bikarbonato tirpalu (Sigma, # 60339), pridedant 1 ml / 10 ml supernatanto alikvotėmis virinant, kol burbulų vystymasis nutrūko (2–5 alikvotinės dalys). Tada mėginiai 5 minutes buvo aušinami ant ledo ir buvo patikrinta, ar pH yra 6–8 intervale 1 ml mėginio. Mėginiai 2 min. Buvo suveržiami, kad susikauptų kalio bikarbonatas. Reakcijas sudarė 20 μl mėginio tirpalo, 21 μl acetil-CoA tyrimo buferių, 2 μl acetil-CoA substrato mišinio, 1 μl konversijos fermento, 5 μl acetil-CoA fermento mišinio ir 2 μl fluorescencinio zondo ir buvo inkubuojami kambario temperatūroje 10 min. . Buvo išmatuotas fluorescencijos intensyvumas (λex = 535 / λem = 587 nm) juodose, 96 šulinėlių plokščio dugno plokštelėse su skaidriais dugnais. Iš viso 10 μl 10 mM α-KG tirpalo buvo praskiedžiamas 990 μl vandens, kad būtų gautas 0, 1 mM etaloninis tirpalas, o 100 μl 0, 1 mM etaloninio tirpalo buvo praskiedžiamas 400 μl vandens, kad būtų gautas 0, 02 mM etaloninis tirpalas. . 0, 02 mM acetil-CoA tirpalo tūriai, naudojami standartinei kreivei sudaryti, buvo 0, 10, 20, 30, 40 ir 50 μl.

ELISA metodu, 1 × 107 MEF, gydomi insulinu 0, 15, 30, 60 min., Buvo padalinti į citoplazmines ir mitochondrines frakcijas. Iš viso 40 μl mėginio praskiedimo ir 10 μl mėginio buvo dedama į ELISA plokšteles, paruoštas pagal rinkinio instrukcijas, švelniai sumaišomos ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje po to, kai plokštelės buvo uždaromos sandarinimo membrana. Skystis buvo išmestas, ir kiekvienas šulinys buvo plaunamas 5 kartus 30 sekundžių, kiekvieną kartą po 1x skalbimo skysčio. Po to į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 50 μl fermento ženklinimo reagento, o po to inkubuojama, kaip aprašyta aukščiau. Tada pridedama 50 μl chromogeninio agento A ir 50 μl chromogeninio agento B ir švelniai sumaišoma, o ELISA plokštelės dedamos 15 minučių 37 ° C temperatūroje tamsoje. Į kiekvieną reakciją buvo įpilta 50 μl sustabdymo reagento, kad reakcija būtų nutraukta. Absorbcija buvo matuojama esant 450 nm bangos ilgiui 96 šulinėlių plokščio dugno plokštelėse. Etaloninio tirpalo koncentracijos, naudojamos generuoti standartinę kreivę, buvo 25 pmol / L, 50 pmol / L, 100 pmol / L, 200 pmol / L ir 400 pmol / L.

Laktato koncentracija

Laktato koncentracijos buvo aptiktos pagal gamintojo protokolus (MAK064). Trumpai tariant, 2 × 106 PC3 arba A549 ląstelės buvo homogenizuotos 4 tūriuose laktato tyrimo buferio ir centrifuguotos 13 000 g 10 min., Kad būtų pašalinta netirpi medžiaga. Pridedamas pagrindinis reakcijos mišinys, kuriame yra 20 μl mėginio tirpalo, 26 μl laktato analizės buferio, 2 μl laktato fermento mišinio ir 2 μl laktato zondo, ir reakcijos buvo inkubuojamos RT 30 min. Mėginio absorbcija buvo matuojama esant 570 nm (A 570 ) ant mikro plokštelių skaitytuvo. Iš viso 10 μl 100 nmola / μl laktato etalono buvo praskiesta 990 μl laktato tyrimo buferiu, kad būtų gautas 1 nmole / μl etaloninis tirpalas. Standartiniam kreivei sugeneruoti naudojamo standartinio 1 mmol / μl laktato tirpalo tūriai buvo 0, 2, 4, 6, 8 ir 10 μl.

Jūrų arkliukas

Tarpląstelinio rūgštėjimo greitis (ECAR) buvo išmatuotas taip, kaip aprašyta anksčiau, naudojant Seahorse XF96 tarpląstelinio srauto analizatorių (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Dvi MEF ląstelių linijos buvo išmatuotos vienu metu su keturiais kartotiniais šulinėliais kiekvienoje ląstelių linijoje. Tada visas eksperimentas buvo pakartotas. Siekiant užtikrinti vienodą ląstelių skaičių abiejose ląstelių linijose, ląstelės buvo pasėtos į XF96 ląstelių kultūros plokšteles, padengtas Cell-Tak („BD Biosciences“, San Chosė, CA) 8 × 103 ląstelių / duobutėje ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 1 val. prieš analizę paruoštoje terpėje (99% bazinės ląstelių kultūros terpės ir 1% glutamino). Insulino buvo pridėta iki galutinės 5 μg / ml koncentracijos. Bioenergetinis profiliavimas buvo atliktas stebint, po to sekančiai švirkščiant šiuos inhibitorius, kurių galutinės koncentracijos buvo nurodytos skliausteliuose: gliukozė (10 mM), oligomicinas (1 μM) ir 2-deoksigliukozė (50 mM) 61 .

Statistinė analizė

Išvadų pakartojamumas buvo patvirtintas atliekant visus eksperimentus mažiausiai tris kartus. Ištisinės vertės pateikiamos kaip vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (SD). Statistinė analizė buvo atlikta naudojant „Microsoft Excel 2007“ versiją. „IBM SPSS“ statistinės programinės įrangos versija 21 buvo naudojama atliekant vienpusę ANOVA analizuoti skirtumus tarp grupių. p <0, 05 (*) ir p <0, 01 (**) rodo atitinkamai statistiškai reikšmingą Fand labai statistiškai reikšmingą skirtumą.

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį : Xu, YS ir kt . Norint reguliuoti piruvatų metabolizmą, STAT3 atliekamas nuo acetilinimo priklausančios mitochondrijų translokacijos. Mokslas. Rep. 6, 39517; „doi“: 10.1038 / srep39517 (2016).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.