Mirandos sukelto staufeno lokalizacijos struktūrinis pagrindas drosophila neuroblastų asimetrinio pasidalijimo metu | gamtos komunikacijos

Mirandos sukelto staufeno lokalizacijos struktūrinis pagrindas drosophila neuroblastų asimetrinio pasidalijimo metu | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių dalijimasis
  • Drosophila
  • Neuromokslas
  • Struktūrinė biologija

Anotacija

Asimetrinio Drosophila neuroblastų (NB) dalijimosi metu Miranda (Mira) koordinuoja ląstelių likimą lemiančių veiksnių, įskaitant Staufeną (Stau), tarpląstelinį pasiskirstymą ir atskiria juos į ganglinių motinines ląsteles (GMC). Čia parodytas penktasis Stau dvigubos grandinės RNR (dsRNR) surišantis domenas (dsRBD5) yra būtinas ir pakankamas, kad būtų galima prisijungti prie Mira krovinių rišimo srities (CBD) susukto ritės srities. „Mira514–595 / Stau dsRBD5“ komplekso kristalų struktūra iliustruoja, kad „Mira“ sudaro pailgą lygiagretų ričių ritės dimerį, o du „dsRBD5“ simetriškai jungiasi prie „Mira“ dimerio per jų paveiktus β lapo paviršius, atskleisdami anksčiau neatpažintą „dsRBD“ baltymų sąveikos režimą. Mes taip pat parodome, kad „Mira – Stau dsRBD5“ sąveika yra atsakinga už asimetrinę Stau lokalizaciją Drosophila NB asimetrinių padalijimų metu. Galiausiai, mes nustatėme, kad CBD tarpininkaujantis dimerų rinkinys yra įprastas Mira reikalavimas atpažinti ir perkelti kitus krovinius, įskaitant smegenų auglį (Brat).

Įvadas

Asimetrinis ląstelių dalijimasis (ACD) yra evoliuciškai išsaugotas dalijimosi būdas, kurį naudoja kamieninės ir progenitorinės ląstelės, kad būtų sukurtos dvi dukterinės ląstelės su skirtingais likimais 1, 2, 3, 4 . Paprastai viena dukterinė ląstelė yra motinos ląstelės, išlaikančios savarankiško atsinaujinimo galimybę, kopija, o kita dukterinė ląstelė patenka į 5 diferenciacijos kelią. Didžioji dalis mūsų supratimo apie ACD reguliuojančius molekulinius mechanizmus yra gauti iš NB, Drosophila centrinės nervų sistemos nervų kamieninių ląstelių, tyrimų 5 . Kiekvienas NB ACD sukuria savarankiškai atsinaujinantį NB ir mažesnį GMC, kuris inicijuoja diferenciaciją 6 . Šio proceso metu baltymų kompleksai, kuriuose yra ląstelių likimą lemiančių veiksnių, mitozės metu asimetriškai lokalizuojasi prie bazinių ląstelių žievės ir po citokinezės 7 yra pirmiausia atskirti į GMC dukterį. Ląstelių likimą lemiantys faktoriai apima transkripcijos faktorių Prospero (Pros) ir jo mRNR 8, 9, 10, 11, 12, 13, posttranskripcinį represorių Brat 14, 15, 16, Notch signalizacijos inhibitorių Numb 17 ir dsRNR jungiantį baltymą. Stau, kuris suriša 18, 19 privalumų mRNR 3′UTR. Asimetrinį šių ląstelių likimo veiksnių lokalizavimą palengvina du baltymai adapteriai, kurie kolokalizuojasi su jais bazinės ląstelės žievėje. Nors pagrindinį Pros, Brat ir Stau lokalizavimą palengvina jų prisijungimas prie pastolių baltymų Mira 16, 20, 21, 22, asimetrinę Numb lokalizaciją tarpininkauja jo adapteris Numb (Pon) 23 partneris .

Mira yra daugiadomenis pastolių baltymas, kuris koncentruojasi ties pagrindine žieve kartu su savo kroviniais Drosophila NB asimetrinio padalijimo 21, 22 mitozės metu. Atskyrus į GMC su krovininiais baltymais „Pros“, „Brat“ ir „Stau“, „Mira“ greitai skaidosi 20, 24, 25 . Siūloma, kad bazinė Mira lokalizacija metafazėje vyktų tiesioginio aPKC fosforilinimo metu N-galo žievės lokalizacijos srityje (aa 1–290) 26 . Įrodyta, kad C-terminalo „Mira“ dalis yra atsakinga už krovinių išleidimą ir degradavimą 27 . Nustatytas, kad centrinis Mira CBD (aa 460–668) yra jungiamasis regionas krovininiams baltymams „Pros“, „Brat“ ir „Stau“ 14, 20, 24, ir buvo prognozuojama, kad jis sudarys lygiagrečią ričių ritės dimerą per biocheminius ir biofizikinius požymius 28 . Anksčiau nustatyti privalomieji regionai „Pros“, „Brat“ ir „Stau“ iš esmės sutampa. 14, 20, 24 . Tačiau dėl pailgos „Mira CBD“ formos tikrose „Mira“ kontaktinėse sąsajose turėtų būti žymiai mažiau likučių nei nustatytuose regionuose. Be to, neaišku, ar šie kroviniai konkuruoja, ar kartu sąveikauja su pastoliais Mira. Todėl tikslios krovininių baltymų surišimo vietos dar nėra nustatytos.

DsRNR jungiančių baltymų Stau šeima atlieka išsaugotą funkciją mRNR transportavimo, lokalizacijos ir transliacijos kontrolės metu iš Drosophila į žinduolius 29 . Iš pradžių Stau buvo identifikuotas kaip faktorius, kuris įtvirtina oskar mRNR ir bicoid mRNR atitinkamai Drosophila oocito užpakalinėje ir priekinėje dalyje, todėl jis reikalingas teisingam priešinės smegenų ašies 30 formavimui. Tada jos funkcija buvo išplėsta į neurogenezę, nes Stau nukreipia pros mRNR ir palengvina jos asimetrinę lokalizaciją ir segregaciją Drosophila NB asimetrinių dalijimų metu 18, 19. Stau arba privalumų lokalizacijos praradimas mRNR keičia GMC vystymąsi 18, 19 . Žinduoliams buvo nustatyti du Stau šeimos nariai - STAU1 ir STAU2. Naujausios išvados, kad pelės STAU2 reguliuoja Prox1 ( pros homologas) mRNR ir Trim32 (Brat homologas) mRNR asimetrinę lokalizaciją, parodė stabilų Stau baltymų vaidmenį neurogenezėje 31, 32. Be to, tiek STAU1, tiek STAU2 yra pagrindiniai komponentai atskirose ribonukleoproteinų dalelėse, skirtose specifiniam dendritinės mRNR pernešimui, todėl jie vaidina skirtingą vaidmenį dendritų morfogenezėje, sinapsiniame plastiškume ir atminties formavime.

Stau šeima naudoja konservuotus dsRBDs, kad surištų dsRNR, ir Drosophila Stau buvo nustatyti penki dsRBD (1a pav.) 35 . 1, 3 ir 4 dsRBD jungiasi RNR in vitro , tačiau 2 ir 5 dsRBD neturi 35 . Tačiau bicoidinės mRNR inkaravimui reikalingi ir 2, ir 5 dsRBD , tuo tarpu dsRBD5 taip pat nurodo pros mRNR lokalizaciją nuo aktino priklausomai nuo sąveikos su Mira, atkreipdamas dėmesį į kitus 2 ir 5 dsRBD funkcinius vaidmenis, o ne RNR jungimąsi 20, 24, 25, 35 . „Drosophila Stau“ dsRBD 2 ir 5 priklauso netradiciniams (B tipo) dsRBD, kurie nesugeba surišti dsRNR, nors gali priimti tą patį α 1 –β 1 –β 2 –β 3 – α 2 kartus kaip kanoninis dsRBD 36 . Siūloma B tipo dsRBD funkcija tarpininkauti baltymų ir baltymų sąveikai, nors neseniai nustatyta, kad kai kurie kanoniniai dsRBD jungiasi ir su baltymais 36 . Tačiau dauguma dsRBD – baltymų sąveikų, parodytų didelės skiriamosios gebos struktūromis, yra intramolekulinės ( cis ) sąveikos, kai N ir (arba) C terminalai pridedami prie dsRBD pakuotės su dsRBD α1 – α2 spiralės paviršiumi 36 . Vienas iš nedaugelio žinomų tarpmolekulinių ( trans ) dsRBD – baltymų sąveikos pavyzdžių yra žmogaus STAU1 B tipo dsRBD5, kuris parodė, kad tarpininkaujant STAU1 dimerizuojasi per sąveiką tarp dsRBD5 α1 – α2 spiralinio paviršiaus ir N galinio priedėlio Stau-mainų. motyvas (SSM) keičiant domeną 37 . Kol kas visos žinomos dsRBD trans-baltymų sąveikos yra dsRBD – dsRBD sąveikos, kurias palengvina priedai. Neaišku, ar ir kaip dsRBD jungiasi su baltymais be priedų. Be to, dar nėra aiškios struktūros, iliustruojančios trans -dsRBD – baltymo sąveiką, išskyrus dsRBD – dsRBD dimerizaciją.

Image

a ) Mirandos ir Staufeno domenų organizavimas. b ) SEK pagrįstos įvairių Mira ir Stau fragmentų sąveikos analizės. c ) „Trx-Mira514–595“ (mėlyna), „Trx-Stau951-1, 018“ (raudona) ir „Trx-Mira514–595 / Trx-Stau951-1, 018“ (juoda) SEC profiliai, parodantys ryškų komplekso eliuacijos tūrio pokytį. palyginti su vienu iš dviejų atskirų baltymų. mAU, miliabsorbcijos vienetai. Smailių eliuavimo tūriai ir molekulinės masės etalonai yra nurodyti skydelio viršuje. d ) išgrynintų Trx-Mira514–595 ir Trx-Stau951–1, 018 ITC, parodantis kompleksą, kurio disociacijos konstanta yra 1, 07 ± 0, 25 μM. e ) „Mira514–595 / Stau dsRBD5“ struktūros struktūros briaunų schema. „Mira“ ritės dimeris yra tamsiai mėlynos ir žalsvai mėlynos spalvos, „Stau dsRBD5“ - violetinės ir rožinės spalvos, o pilkoji dalis rodo likusį fragmentą po Trx-tag suskaidymo.

Visas dydis

Čia pateikiame išsamius Mira ir Stau sąveikos biocheminius apibūdinimus. „Mira“ / „Stau“ rišamosios vietos yra priskiriamos „Mira“ ir „Stau dsRBD5“ liekanoms 514–595 (aa 951–1 018). Mira514–595 / Stau dsRBD5 kristalų struktūra išspręsta esant 2, 5 Å. Nustatyta, kad kompleksas sudaro 2: 2 heterotetramerį, kuriame Mira suformuoja pailgą lygiagretų ritės dimerį, o du dsRBD jungiasi prie dviejų simetriškų paviršių Mira dimerio sąsajos N-galo gale. Kiek mums yra žinoma, tai yra pirmoji didelės skiriamosios gebos sudėtinga struktūra, apibūdinanti tarpmolekulinę dsRBD – baltymo sąveiką. Stau dsRBD5 naudoja neapsaugotą savo β lapo paviršių, kad galėtų sąveikauti su Mira, atskleisdamas naują dsRBD tikslinio surišimo būdą. Mes taip pat parodome, kad tiesioginė Mira ir Stau dsRBD5 sąveika yra esminė asimetrinei Stau lokalizacijai asimetriškai dalijant Drosophila lervos smegenų NB. Mes taip pat parodėme, kad „Mira CBD“ dimerizavimas yra būtinas norint koordinuoti jo krovinių „Stau“, „Brat“ ir „Pros“ poliarizuotą pasiskirstymą in vivo .

Rezultatai

Miros ir Stau sąveika

Ankstesni tyrimai parodė, kad Stau sąveikauja su Mira per C-galinį dsRBD5 domeną, o Stau surišimo vieta Mira buvo suskirstyta į liekanų segmentą 506–638 (nuoroda 20). Norėdami patikrinti šią sąveiką, mes išgryninome įvairius šių dviejų baltymų fragmentus ir atlikome surišimo testus in vitro . Pirmiausia mes išbandėme viso „Mira“ CBD surišimą (aa 460–668) su įvairiais C-galo Stau fragmentais, kuriuose yra dsRBD5, taip pat dsRBD3 ir dsRBD4 (1b pav.). Dydžio išskyrimo chromatografijos (SEC) eksperimentai parodė, kad Stau dsRBD5 (aa 951–1, 018) 68 aminorūgščių fragmentas yra pakankamas, kad susidarytų kompleksas su Mira, o N-galo prailginimai nėra būtini (1b pav. Ir papildomas pav. .1). Kaip tikėtasi, Stau „dsRBD3“ (aa 578–645) ir „dsRBD4“ (aa 711–781) negalėjo sąveikauti su „Mira CBD“. Tada mes išbandėme įvairius „Mira CBD“ C ir N galų sutrumpinimus ir nustatėme, kad Mira 514–595 aminorūgščių fragmentas (toliau nurodytas kaip Mira514–595) yra būtinas ir pakankamas, kad surištų Stau dsRBD5 (1b pav., c ir papildomas 1 pav.). Tolesnis izoterminės titravimo kalorimetrijos (ITC) eksperimentas parodė, kad Mira514–595 jungiasi su Stau dsRBD5 santykinai dideliu afinitetu ir disociacijos konstanta yra maždaug 1 μM (1 pav. D).

Bendra „Mira514–595 / Stau dsRBD5“ komplekso struktūra

Norėdami suprasti „Mira“ ir „Stau“ sąveikos molekulinius pagrindus, mes išgryninome „Mira514–595“ ir „Stau dsRBD5“ (aa 951–1 018) ir gavome gerus „Mira514–595“ / „Stau dsRBD5“ komplekso difrakcijos kokybės kristalus. Sudėtinga struktūra buvo išspręsta naudojant anomalią vienos bangos ilgio dispersiją, naudojant Se – Met darinius 2, 5 Å skiriamąja geba (1 lentelė). Visas „Mira514–595“ ir „Stau dsRBD5“ ilgis yra gerai išskaidytas, išskyrus paskutinius šešis liekanas „Mira514–595“ C gale. Konstrukcija atskleidė, kad kompleksas sudaro 2: 2 heterotetramerinę architektūrą, kurioje du „Stau dsRBD5“ simetriškai sąveikauja su „Mira“ ritės homodimerio N-galo galu (1e pav. Ir papildomas 2a pav.). Mira514–595 / Stau dsRBD5 komplekso 2: 2 stechiometrija tirpale dar buvo patvirtinta atliekant statinį šviesos sklaidos eksperimentą (papildomas 1h pav., Mėlyna linija). Stau dsRBD5 priima α 1 –β 1 –β 2 – β 3 – α 2 kartus, kaip ir žmogaus STAU1 dsRBD5 (nuoroda 37) ir daugelį kitų kanoninių dsRBD 36, 38. Pagal ankstesnę mažo kampo rentgeno spinduliuote išsibarsčiusios struktūros prognozę 28, du „Mira514–595“ fragmentai, sudaryti iš vienos gretimos α-spiralės, lygiagrečiai mažėja ir sudaro pailgą „strypo pavidalo“ struktūrą. (1e pav.). Netikėtai 13-fragmentų „GPGSEFELRRQAS“ N galinė dalis iki Mira514–595, likusi po etiketės skilimo, taip pat sudaro α-spiralę ir taip išplečia lygiagrečią Mira ritę. Tačiau nė vienas iš N-galo prailginimo likučių nėra tiesiogiai susijęs su Stau dsRBD jungtimi, o Mira514–595 N-prailginimas gali kažkaip stabilizuoti ritės ritės struktūrą (1e pav.).

Pilno dydžio lentelė

„Mira“ ritės dimeris

Įdomu tai, kad „Mira“ ritės dimeris yra šiek tiek asimetriškas, o viena išlenkta spiralė A apvynioja aplink kitą beveik tiesią A ′ (1e ir 2a pav.). Dvi „Mira“ dimerio spiralės yra vienodos „Stau dsRBD5“ rišančioje srityje, apimančios ∼ 30 aa sritį pačiame Mira514–595 fragmento N galiniame gale, tarp Asn514 ir Tyr543. Už šio krašto spiralė A susisieja apie 23 laipsnius, palyginti su A ′ Mira ritės ritės dimerio C galinėje dalyje (2a pav.). Tačiau asimetrinio ritės dimerio susidarymas netrukdo reguliariems heptado kartojimams (papildomas 2b pav.). Visas lygiagretus „Mira514–595“ struktūros homodimeras yra-110 Å ilgio. Remdamiesi neapsaugotų ritinių architektūros paviršių analize, mes nustatėme tris galimus taikinių atpažinimo regionus šioje pastolių „Mira“ dalinio krovinių rišimo srityje (2b pav. Ir papildomas 2c pav.). I regionas apima 514–543 likučius, kurie yra užkraunami pakraunant „Stau dsRBD5“ krovinį. II ir III srities span likučiai yra atitinkamai 544–568 ir 569–589.

Image

a ) „Mira514–595“ sudaro asimetrinę ritės ritę, kurios viena spiralė yra išlenkta apie 23 laipsnius. ( b ) „Mira514–595“ ričių ritėje yra trys galimi taikinius rišantys regionai, o I regionas sąveikauja su „Stau dsRBD5“. c ) ritės „Mira“ dimerizacijos sąsaja. Likučių, dalyvaujančių dimerio sąsajos formavime, šoninės grandinės yra nupieštos lazdelės modelyje. Taškinės linijos žymi vandenilio ryšius ir druskos tilto sąveiką.

Visas dydis

Du „Mira514–595“ α-spiralės sudaro gana tankų superrutį, kurio vidutinis tarphelių atstumas ∼ 5, 8 Å, reikšmė yra daug mažesnė, nei tikėtasi kanoninės ritės ritė (∼ 9, 6 Å) 39 . Įtemptą „Mira“ ritės dimerizaciją sąlygoja hidrofobinė ir polinė sąveika. Dviejų α-spiralių a / d padėtys yra daugiausia hidrofobinės liekanos, kurios per savo alifatines šonines grandines sudaro didelę hidrofobinę sąveiką (2c pav. Ir papildomas 2b pav.). Tarp ritės susiformavęs druskos tiltas, esantis tarp Asp567 ir Arg572 ′, taip pat prisideda prie ritės-ritės susidarymo. Be to, keli šoniniai vandenilio ryšiai, suformuoti tarp dviejų α-spiralių, dar labiau stabilizuoja dimerą. Tiksliau sakant, Tyr515, Ser536 ir Asp537 sudaro vandenilio ryšius atitinkamai su Gln516 ′, Asp537 ′ ir Ser536 ′ iš kaimyninės α-spiralės. O Ser578 iš spiralės A sudaro vandenilio ryšius su Ser578 ′ ir Gln579 ′ iš spiralės A ′ (2c pav.). Nepaisant nedidelės asimetrijos, paviršiaus analizė atskleidžia, kad visi trys galimi „Mira514–595“ dimerio objektus rišantys paviršiai yra daugiau ar mažiau simetriški, tai rodo, kad „Mira“ taip pat gali sąveikauti su kitais taikiniais 2: 2 stichometrijoje per II ir III regionus (Papildomas 2c pav.). I ir II regionų tikslinį pripažinimą daugiausia gali lemti hidrofobinis pakavimas; kadangi tikslinį III regiono rišimą daugiausia gali paskatinti poliarinė sąveika.

„Mira514–595 / Stau dsRBD5“ sąsaja

Įdomus „Mira514–595 / Stau dsRBD5“ struktūros bruožas yra tas, kad „Stau dsRBD5“ jungiasi su „Mira“ per atvirą jo β lapo paviršių - režimą, kurio iki šio tyrimo niekada nebuvo pastebėta jokiuose kituose dsRBD 36 . Abiejų sandariai sumažintos „Mira“ ritės α-spiralių reikia dviem vienodams paviršiams I srityje suformuoti, esantiems „Stau dsRBD5“. „Mira-dsRBD5“ sąsajos struktūrinės detalės rodo, kad hidrofobinės sąveikos reikšmingai prisideda prie surišimo (3a, b pav.). Hidrofobinės liekanos, tokios kaip Tyr971 Stau ant β1, Leu980 Stau ir Ile982 Stau ant β2, Ile992 Stau ir Val996 Stau ant dsRBD5 β3, Ile528 Mira ir Leu529 Mira iš spiralės A, Val526 ′ Mira ir Mira, Met530′ iš spiralės A ′ susiformuoja hidrofobinė šerdis (3a, b pav.). Kita vertus, poliarinė sąveika formuojama visoje sąsajoje ir prisideda prie „Mira-dsRBD5“ surišimo. Pavyzdžiui, „Thr525 Mira“ šoninė grandinė iš spiralės A sąveikauja su pagrindine „Ile992 Stau“ deguonimi ir atitinkamai su dsRBD5 His994 Stau δ-amidu (3a, b pav.). Be β lakšto, „Mira“ surišime dalyvauja dvi „Stau dsRBD5“ kilpų sritys (L2 ir L3). „Arg532 Mira“ iš spiralės A sudaro platų vandenilio jungčių tinklą su „His976 Stau“ šonine grandine, o „Pro972 Stau“ ir „Glu978 Stau “ pagrindinės grandinės karbonilai yra dsRBD5 L2 (3a, b pav.). Šalia jo Asn975 Stau L2 gale sudaro vandenilio ryšius su Asp539 Mira ir Tyr543 Mira iš spiralės A. kadangi Pro989 Stau, Pro990 Stau ties L3 dsRBD5, Tyr515 Mira iš spiralės A ir Leu519 ′ Mira iš spiralės A ′ formos. hidrofobinė šerdis, kad būtų galima dar labiau stabilizuoti „Mira – Stau“ sąveiką (3a, b pav.).

Image

a ) Stereo vaizdas, parodantis „Mira514–595“ ir „Stau dsRBD5“ sąveikos detales. Taškinės linijos žymi vandenilio ryšius ir druskos tilto sąveiką. b ) „Mira514–595 / Stau dsRBD5“ komplekso vaizdas atviroje knygoje, parodantis paviršiaus komplektaciją tarp ritės dimerio ir dsRBD5. Šiame piešinyje hidrofobinės liekanos yra nudažytos geltonai, teigiamai įkrautos liekanos - mėlynai, neigiamai įkrautos liekanos - raudonai, o likusios aminorūgštys - pilkos spalvos. c ) Pririšimų tarp laukinio tipo ir įvairių Mira514–595 ir Stau dsRBD5 mutantų, gautų atlikus ITC analizę, santrauka. Taip pat žiūrėkite papildomą 3 pav. ( D - f ) HEK293T ląstelės buvo transfekuotos viso ilgio Flag-Mira ir HA-Stau, arba GFP-Brat. Neapdoroti taškeliai parodyti papildomame 6 pav. ( D ) „Mira WT“ galėtų nusodinti kartu su „Stau WT“, bet ne su „Stau H994E“ . ( e ) „Mira L529E“ ir „Mira L557E“ negalėjo nusėdėti kartu su „Stau WT“ . f ) L529E Mira arba L557E Mira mutacija panaikino arba labai pablogino Mira ir Brat sąveiką. g ) Konkurencijos tyrimas. HEK293T ląstelės buvo kotransfekuotos viso ilgio „Flag-Mira“ ir „GFP – Brat“. Lizatai buvo įpilti į anti-Flag M2 afinitetinį gelį ir toliau inkubuojami su 0, 8 mg išgryninto Trx-Stau dsRBD5 arba be jo. Esant per dideliam Trx-Stau dsRBD5 kiekiui, netrukdyta vėliavos-Miros ir GFP – Brat sąveika. ( h ) GST bandymas žemyn. GST pažymėtas Brat NHL domenas galėjo sudaryti kompleksą tik su laukinio tipo Stau dsRBD5 (bet ne su H994E mutantu), esant Mira CBDL. „Statu dsRBD5“, kurį nuplėšė „GST“ pažymėtas „Brat NHL“ per „Mira“ CBDL tiltelį, buvo pažymėta žvaigždute.

Visas dydis

„Mira – Stau“ sąveikos patvirtinimas in vitro

Norėdami patikrinti kristalų struktūroje pastebėtą „Mira – Stau“ sąveikos režimą, mutavome keletą liekanų jungties sąsajoje ir atlikome mutantų baltymų jungimosi testus in vitro . Sutikdami su išspręsta kristalų struktūra, SEC ir ITC eksperimentai parodė, kad Mira (L529E, M530E ir R532A) arba Stau (Y971K, H994E ir I982A) iš Mira – Stau pakavimo sąsajos mutacijos sutrikdė arba labai sutrikdė Mira514–595 sąveiką. ir dsRBD5 (3c pav., papildomas 3 pav.). Atkreipkite dėmesį, kad L529 taip pat yra „Mira“ ritės dimerio (2c pav.) Sąsajoje ir, kaip buvo galima tikėtis, „L529E Mira“ mutacija panaikino „Mira514–595“ dimerizaciją, priversdama ją eliuotis kaip monomeras SEC profilyje (papildomas 3a pav. ). Pagal „Mira514–595 / Stau dsRBD5“ sudėtinę struktūrą, abi „Mira“ ritės ritės dimerio α-spiralės turi sąveikauti su „Stau dsRBD5“ (3a pav.). Taigi, L529E „ Mira“ mutacijos poveikį gali sukelti tiesioginis „Mira – Stau“ pakavimo sąsajos sutrikimas ir (arba) „Mira CBD“ dimerio nutrūkimas. Norėdami patikrinti nepažeistos „Mira CBD“ dimerio reikšmę „Stau“ surišime, sukūrėme L557E „ Mira“ mutaciją, kuri sunaikino „Mira514–595“ dimerizaciją, bet yra už „Stau dsRBD5“ surišimo vietos (2c pav. Ir papildomas 3d pav.). Remiantis sudėtinga struktūra, taip pat nustatyta, kad L557E „ Mira“ mutacija sutrikdo „Mira – Stau“ sąveiką (papildomas 3d pav., K), parodydama, kad „Mira CBD“ dimerų sąranka yra esminė „Stau dsRBD5“ surišimui.

Be to, „Mira – Stau“ sąveika ir sudėtinga struktūra buvo patvirtinta viso ilgio baltymų kontekste, naudojant koimunoprecipitacijos (Co-IP) eksperimentus. Siekiant išvengti galimai konkuruojančios sąveikos su endogeniniais baltymais, ekspresuojamais Drosophila ląstelių linijose, pilno ilgio laukinio tipo (WT) arba mutavusi Mira buvo kotransfekuota WT arba mutanto Stau žmogaus HEK293T ląstelėse. Bendro IP rezultatai parodė, kad H994E Stau, L529E Mira ir L557E Mira mutacijos visiškai ar stipriai sutrikdė Mira – Stau sąveiką (3d pav., E). Taigi, Mira ir Stau pilno ilgio baltymų jungimąsi ląstelėje sąlygoja tik Mira514–595 dimerų ir Stau dsRBD5 sąveika. Remiantis ankstesne išvada, kad Bratui reikalinga „Mira CBD“, norint tinkamai nustatyti bazinę lokalizaciją 14, „L529E Mira“ ir „L557E Mira“ mutacijos ne tik panaikino „Mira – Stau“ sąveiką, bet ir žymiai susilpnino surišimą tarp viso ilgio „Mira“ ir „Brat“ (3f pav.), nurodant, kad kompaktiškas „Mira CBD“ dimerizavimas gali būti įprastas reikalavimas, kad kroviniai būtų atpažįstami per CBD.

Mira gali bendrauti su Stau ir Bratu vienu metu

Kadangi Stau ir Brat prisijungia prie „Mira CBD 14, 20, 24“, mes paklausėme, ar „Stau“ ir „Bratas“ konkuruoja, ar kartu sąveikauja su „Mira“. Pirmiausia parodėme, kad „Stau dsRBD5“ nekonkuruoja su „Brat“ dėl Mira surišimo (3g pav.). Nors buvo teigiama, kad Mira CBD (aa 460–668) yra būtinas Mira – Brat sąveikai jungiantis prie Brat NHL (NCL-1, HT2A ir LIN-41) 14 srities, mes radome CBD fragmentus, įskaitant Mira460–668 ir Mira514–. 595 negalėjo sudaryti komplekso su Brat NHL. Antrinės struktūros numatymas naudojant užmarštį (//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) atskleidžia, kad susukto ritės regionas Mira apima 30 530 aa regioną Miroje (aa 135–668; 1a pav.), atkreipia dėmesį į galimybę, kad anksčiau apibrėžtas „Mira CBD“ (aa 460–668) gali būti nepakankamas, kad galėtų prisijungti prie Brato. Kita vertus, šie duomenys taip pat leido manyti, kad potencialus Mira514–595 II ir III krovinius rišantis regionas gali nedalyvauti sąveikoje su Bratu (2b pav. Ir papildomas 2c pav.). Tada mes padarėme N terminalo išplėstinį „Mira CBD“ (aa 210–668, toliau vadinami „Mira CBDL“) ir pamatėme, kad pakanka (galbūt ne pats minimalus regionas) Brat NHL surišti (3 pav.). Kaip ir tikėtasi, „Mira CBDL“ tvirtai sąveikauja su „Stau dsRBD5“ (1b pav.). Svarbu tai, kad nors tiesioginės Brat NHL ir Stau dsRBD5 sąveikos nebuvo galima pastebėti, per gliutationo S-transferazės (GST) pažymėtą Brat NHL galima sudaryti kompleksą su laukinio tipo Stau dsRBD5 jungiant Mira CBDL (3h pav.). Priešingai, „Mira“ surišančio H994E mutanto negalėjo atsikratyti „GST“ pažymėtas „Brat NHL“ net esant „Mira CBDL“, o tai rodo, kad „Mira“ gali naudoti savo pailgintą ritės ritės struktūrą, kad tuo pačiu metu galėtų įdarbinti kelis krovinius.

Mira – Stau surišimas yra būtinas Stau lokalizavimui in vivo

Toliau mes panaudojome I tipo NB Drosophila lervos centrinėse smegenyse kaip in vivo modelį, siekdami išsiaiškinti, ar Mira – Stau dsRBD5 sąveika turi funkcinę reikšmę. Norėdami tai išbandyti, sukūrėme transgenines muses, išreiškiančias viso ilgio vėliava pažymėtą WT arba atitinkamai Mira ir Stau mutantų formas.

Atliekant NB dalijimąsi, Mira yra asimetriškai lokalizuota bazinėje smegenų žievėje nuo profazės ir, pasibaigus mitozei, yra geriau išskirta į GMC dukterį. Pirmiausia mes ištyrėme šių transgenų lokalizaciją WT fone ir sutelkėme dėmesį į mitozinius NB. Kaip ir tikėtasi, „Flag-Mira WT“ ( n = 22, 100%) parodė bazinę lokalizaciją NB metafazėse (papildomas 4a pav.). Įdomu tai, kad „Flag-Mira L529E“ ( n = 23, 100%) taip pat lokalizuota bazinėje žievėje (papildomas 4b pav.), Reiškia, kad dimerizacija per „Mira CBD“ nėra vienintelis būdas „Mira“ nukreipti į bazinę zoną WT fone ir atitinka ankstesnį radinys, rodantis, kad N-galo žievės lokalizacijos sritis (aa 1–290) vaidina svarbų vaidmenį „Mira“ lokalizacijoje 24, 25, 26, 27 . Atsižvelgiant į tai, endogeninių viršūninių kompleksinių komponentų ir bazinių ląstelių likimą lemiančių veiksnių lokalizavimas šiuose fonuose buvo normalus (papildomas 4a, b pav.). Numatoma, kad „Flag-Stau WT“ ( n = 14, 100%) taip pat parodė tikėtiną bazinį sodrumą NB metafazėse (4a pav.). Atvirkščiai, „Mira“ jungtyje, turinčioje trūkumą, „Flag-Stau H994E“ ( n = 21, 100%) negalėjo sudaryti bazinio pusmėnulio, o buvo lokalizuotas į citoplazmą (4b pav.), Palaikydamas mūsų struktūrinę analizę ir in vitro rezultatus bei parodydamas, kad tiesioginė Mira ir Stau sąveika dsRBD5 yra atsakinga už teisingą Stau lokalizaciją ACD metu.

Image

„ToPro3“ yra mėlynos spalvos a, b, g, h, o balta - c - f . ( a, b ) Vėliavos-Stau WT ir Flag - Stau H994E transgenų išraiška NB, varoma insc-gal4 . a ) Vėliava - Stau WT yra lokaliojo tipo NB pagrindinėje žievėje. ( b ) Flag-Stau H994E rodo citozolinę lokalizaciją laukinio tipo NB. ( c - h ) NB yra žymimi GFP, naudojant mozaikos analizę, naudojant represuojamų ląstelių žymeklio (MARCM) metodą (žr. metodus). ( c - f ) Įvairių viršūninių ir bazinių baltymų (raudonos arba mėlynos) ir GFP (žalios spalvos) dažymas lervų neuroblastuose, gautuose iš laukinio ( c ) tipo, Mira mutanto ( d ), Mira mutanto, išreiškiančio vėliavos-Mira WT transgeną ( e) ) ir „ Mira“ mutantas, ekspresuojantis „ Flag-Mira L529E“ transgeną ( f ). c ) Mira, Stau, Brat, Pros ir aPKC yra asimetriškai lokalizuotos laukinio tipo NB. d ) Mira nenustatytas Mira mutantų NB, tuo tarpu Stau, Brat ir Pros yra citoplazmos NB Mira mutantuose. aPKC paprastai yra lokalizuotas „ Mira“ mutante NB. e ) „Mira“ (aptinkamas naudojant „anti-Mira“ antikūnus arba „anti-Flag“ antikūnus), „Stau“, „Brat“, „Pros“ ir aPKC paprastai yra lokalizuojami „ Mira“ mutantų NB, išgelbėtiems naudojant „Flag-Mira WT“. Įdomu tai, kad „ Mira“ mutantų NB, išgelbėtiems naudojant „Flag-Mira L529E“, daugumoje NB yra pagrindinė „Mira L529E“ lokalizacijos lokalizacija ( f, aptinkama naudojant anti-Mira antikūnus arba anti-Flag antikūnus), 5, 3% šių NB rodo plačią žievės žievės lokalizaciją. „Mira L529E“ ( g ). Stau, Brat ir Pros išlieka citoplazmoje, o aPKC paprastai yra lokalizuotas šiuose NB. Baltos rodyklių galvutės paženklina bazinę žievę, o raudonos rodyklių galvutės nurodo viršūninę žievę. Svarstyklės, 5 μm. h ) „WT NB“ linijoje yra viena Dpn teigiama ląstelė, o „ Mira“ mutanto NB linijoje yra daugybė Dpn teigiamų ląstelių, kurios yra keičiamos vėliavos „Mira WT“ ekspresija, bet tik iš dalies panaudojamos vėliavos „Mira L529E“ variante. i ) h statistiniai duomenys.

Visas dydis

Taikant krovinius reikalingas nepažeistas „Mira CBD“ dimeris

Toliau aptarėme bazinio baltymo lokalizaciją „ Mira“ mutanto fone, išgelbėtą naudojant šiuos „Mira“ variantus. Kaip pranešta anksčiau, visi „Mira“ kroviniai, įskaitant „Stau“, „Brat“ ir „Pros“, iš esmės buvo bendrai lokalizuojami su „Mira“ WT NBs (4c pav., Stau, n = 21, 100%; Brat, n = 21, 100% ir „Pros“, n). = 28, 100%, taip pat žiūrėkite papildomą 4c pav.), Bet persikėlė į „ Mira“ mutantų NB (4d pav., Stau, n = 20, 100%; Bratas, n = 20, 100% ir „Pros“, n = 17, 100%)., taip pat žr. papildomą 4d pav.). „Flag-Mira WT“ išraiška „Mira“ mutantuose NB visiškai atkūrė bazinę šių krovinių (Stau ( n = 16, 100%), Brat ( n = 12, 100%) ir „Pros“ ( n = 12, 100%) lokalizaciją. dalijant NB (4e pav.), taip pat žiūrėkite papildomą 4e pav.) Panašiai kaip „Flag-Mira WT“, dauguma „Flag-Mira L529E“ (94, 7%, n = 19) taip pat sudarė bazinį pusmėnulį „Mira“ mutantuose NB (4f pav. Ir papildomas 4f pav.). Įdomu tai, kad 5, 3% tirtų NB rodė, kad vėliavos „Mira L529E“ žievė lokalizuota plačiai (4g pav.). Šie duomenys rodo, kad „Mira CBD“ dimeris vaidina veiksmingą bazinį „Mira“ taikymą. Nors „Flag-Mira L529E“ iš esmės lokalizuotas „ Mira“ mutante, endogeninis Stau ( n = 26, 100%), Bratas ( n = 22, 100%) ir „Pros“ ( n = 15, 93, 3%) šiame fone parodė citoplazminę lokalizaciją (pav. 4f ir papildomas 4f pav., Nurodantis nepažeisto CBD dimero svarbą lokalizuojant su Mira susijusius bazinius baltymus. Kaip vidinė kontrolė, aPKC paprastai buvo praturtintas viršūnės žieve Mira mutantų NB su arba be „Flag-Mira“ variantų išraiškos (4c – f pav.; 4d, n = 16, 100%; 4e, n = 21, 100%). ; 4f, n = 16, 100%; Papildomas 4c – f pav.

Norėdami dar labiau suprasti „Flag-Mira L529E“ varianto funkcijas, mes ištyrėme, ar jis galėtų išgelbėti „ Mira“ mutanto per dauginantį fenotipą. WT kiekvienoje WT NB giminėje yra viena ląstelė, išreiškianti NB žymeklį Dpn; tačiau dauguma „ Mira“ mutantų NB linijų dauginasi ir jose yra daugybė Dpn teigiamų ląstelių (4h pav., i). Atkuriant „Flag-Mira WT“ raišką „ Mira“ mutantuose NB, iš esmės buvo atkurtos negimdinių Dpn-teigiamų ląstelių formavimosi galimybės, tačiau „negimdinė“ Flag-Mira L529E išraiška tik iš dalies slopina šį fenotipą (4h pav., I), ir tai rodo, kad tinkamas krovinių rišimas / taikymas yra svarbus „Mira“ funkcijai. Kartu su biocheminiu tyrimu in vitro , mūsų duomenys aiškiai parodė, kad „Mira CBD“ dimerizavimas greičiausiai yra būtina sąlyga krovinio atpažinimui ir perkėlimui.

„Stau dsRBD5“ palyginimas su kitais „dsRBD“

Netipiškas Drosophila Stau dsRBD5 yra labai panašios struktūros kaip ir kanoninis Aquifex aeolicus RNase III (nuoroda 40) dsRBD (nuoroda 40), taip pat žmogaus STAU1 dsRBD5 (nuoroda 37; 5a pav.). Panašiai kaip žmogaus ortologas, „ Drosophila Stau dsRBD5“ struktūra atitinka jos nesugebėjimą prisijungti dsRNR 35, trūksta liekanų, svarbių RNR surišimui kanoniniuose dsRBD, pavyzdžiui, A. aeolicius RNase III RBD (5b pav.). Svarbu tai, kad pagrindiniai likučiai (ty Tyr971, Leu980, Ile982, Ile992, His994 ir Val996) ant Stau dsRBD5, atsakingo už „Mira“ sąveiką, neapsaugotame β lakšto paviršiuje evoliuciškai yra išsaugoti nuo bestuburių iki stuburinių Stam / STAU1 homologų dsRBD5. Labiausiai tikėtina, kad dsRBD5 kiti Stau / STAU1 homologai taip pat gali naudoti savo paveiktus β lakšto paviršius sąveikauti su dar nežinomais baltymais per hidrofobinę sąveiką kaip pagrindinę varomąją jėgą. Priešingai, sekos tapatumas kanoninio dsRBD A. aeolicius RNase III ir Drosophila Stau dsRBD1-4 (nuorodos 35, 41) β lapo pusėje yra gana žemos (5b pav.). Pavyzdžiui, Ile982 Drosophila Stau dsRBD5 yra neigiamai įkrautas A. aeolicius RNase III RBD ir Drosophila Stau dsRBD4, o Drosophila Stau dsRBD3 pakeistas į alaninu. Atkreipkite dėmesį, kad mūsų mutagenezės eksperimentas parodė, kad I982A mutacija sutrikdo Stau dsRBD5 / Mira sąveiką (3c pav. Ir papildomas 3e pav., K). Manoma, kad atitinkamai pakeitus Ile982 neigiamai įkrauta glutamo rūgštimi, bus sutrikdyta „Mira – Stau“ sąveika. Net Drosophila Stau dsRBD2, kuris nesugeba surišti RNR, pagrindiniai liekanos neapsaugotame β lakšto paviršiuje nėra išsaugoti (5b pav.). Nevertheless, these data are consistent with previous findings that only dsRBD5 is responsible for mediating Mira–Stau interaction 20 .

Image

( a ) Superimposition of Stau dsRBD5 with human STAU1 dsRBD5 37 (PDB ID: 4DKK) and A. aeolicus RNase III dsRBD 40 (PDB ID: 2NUG). Stau dsRBD5 is coloured in purple, STAU1 dsRBD5 in orange and RNase III dsRBD in grey. ( b ) Structure-based (when known) and sequence-based sequence alignment of Drosophila Stau dsRBD5 with other dsRBD5s of Stau/STAU1 homologues (upper part), and with Drosophila Stau dsRBD1-4, canonical dsRBD A. aeolicus RNase III, and human L44mt dsRBDL 45 (PDB ID: 3J7Y) (lower part). Secondary structures of Drosophila Stau dsRBD5 are shown at the top of the panel. The residues of Stau dsRBD5 involved in Mira binding are indicated with black dots. Conservation of these Mira interacting residues is highlighted. Identical residues or residues with similar polarity or hydrophobicity from invertebrate to vertebrate are coloured in red, those only identical in higher order species in green, and others in black. Three dsRNA-binding regions are indicated by dashed frames. The key residues for dsRNA-binding are highlighted in cyan. ( c ) Superimposition of Mira514–595/Stau dsRBD5 complex and human STAU1 SSM–dsRBD5 dimer structures showing that the β-sheet face mediated protein binding of dsRBD5 does not conflict with the dimerization through the α1–α2 interface. STAU1 SSM–dsRBD5 dimer is coloured in beige and green, Stau dsRBD5s are coloured in purple and pink, and Mira dimer is coloured in navy blue and cyan. ( d ) Superimposition of Stau dsRBD5, human STAU1 dsRBD5 and A. aeolicus RNase III dsRBD with Mira (navy blue and cyan), SSM (dark green) and dsRNA (orange) in surface representations, showing that there is no steric hindrance among dsRNA binding and protein binding through β-sheet and α1–α2 interfaces.

Visas dydis

The most prominent structural differences between Drosophila Stau dsRBD5 and human STAU1 dsRBD5 locate at the L2 and L3 loops (Fig. 5a). The crystal structure of the Mira514–595/Stau dsRBD5 complex shows that both loops are involved in the interaction with Mira (Figs 1e and 3a). It is noticeable that the sequence and length of L2 and L3 loops are highly variable in different dsRBDs (Fig. 5b). The large ( ∼ 100 aa) insertion of L2 in Drosophila Stau dsRBD2 was suggested to preclude dsRNA binding, but to contribute to microtubule-dependent mRNA localization 35 . Therefore, the conformational flexibility of the two loops might facilitate the protein interactions of dsRBDs.

dsRBDs might interact with proteins and dsRNA simultaneously

In human STAU1 dsRBD5, the SSM motif interacts with the α1–α2 helical face of another STAU1 dsRBD5 to facilitate the dimerization of hSTAU1 (ref. 37). Drosophila Stau dsRBD5, however, lacks the conserved SSM motif crucial for dimerization in vertebrate Stau dsRBD5 (ref. 37). Our biochemical data showed that the isolated Drosophila Stau dsRBD5 aggregates to some extent in solution, but does not form homogeneous oligomer state. By binding to Mira, a homogeneous 2:2 complex was formed as shown in the crystal structure and static light-scattering experiment (Supplementary Fig. 1h, blue line). To test if the N-terminal extension can promote dimerization of Drosophila Stau dsRBD5, we purified a longer fragment of Stau (aa 861–1, 018) by extending the N-terminal boundary of dsRBD5. Isolated Stau861–1, 018 also showed heterogeneous oligomer states in solution as dsRBD5, and the stoichiometry of the Mira514–595/Stau861–1, 018 complex is between 2:2 and 2:4 (Supplementary Fig. 1h, magenta line). Therefore, unlike human STAU1, the N-terminal extension of dsRBD5 is not sufficient for stable dimerization of Stau. However, partial formation of a 2:4 complex indicates that the interaction with Mira does not prevent Stau dimerization. By comparison of the crystal structures of Mira514–595/Stau dsRBD5 complex and hSTAU1 SSM–dsRBD5 dimer, we can clearly see that the β-sheet face-mediated protein interaction would not sterically hinder the dimerization of hSTAU1 dsRBD5 (Fig. 5c). On the other hand, by further superimposing the A. aeolicius RNase III RBD/dsRNA complex structure onto the Stau dsRBD5 and hSTAU1 dsRBD5, we found that the dsRNA binding, the β-sheet face mediated protein binding and the α1–α2 face-mediated dimerization are not mutually exclusive (Fig. 5d). This suggests that a canonical dsRBD may use its different faces to bind to dsRNA and proteins simultaneously.

Diskusija

Mira is a key adaptor protein that directs several cell fate determinants to basal cortex during the asymmetric division of Drosophila NB. The detailed molecular mechanism and the direct interactions between Mira and its cargos, however, have not been characterized biochemically. Here we characterize the interaction between Mira and dsRNA-binding protein Stau. The crystal structure of the Mira514–595/Stau dsRBD5 complex demonstrates that Mira forms a parallel coiled-coil dimer and two molecules of Stau dsRBD5 symmetrically bind to Mira514–595 through their exposed β-sheet faces. Structural based point mutations (H994E Stau and L529E Mira ) verified that the direct interaction between Mira and Stau dsRBD5. Two lines of evidence support the functional importance of this interaction. First, the Mira-binding-deficient Stau mutant H994E, when ectopically expressed in NB, exhibited a diffused subcellular distribution during NB ACD. Second, endogenous Stau is defectively localized in Mira mutant NB expressing Mira L529E, a Mira variant that does not bind Stau.

The finding that Mira514–595 forms an elongated parallel coiled-coil dimer suggests that the full-length Mira most likely forms a stable homodimer. Moreover, the compact dimerization of Mira (at least the CBD region) seems to be crucial for cargo binding and transport, as the Mira L529E mutant with impaired CBD dimer assembly could not rescue the localization of Mira-dependant basal proteins in Mira mutant larval NBs (Fig. 4f), and only partially rescue the over-proliferation phenotype observed in Mira mutant brains (Fig. 4h, i). It further points to the possibility that destabilization and unwinding of the Mira CBD coiled-coil through protein modifications (for example, phosphorylation) could be a mechanism for cargo release, which is the final step of Mira-mediated protein transport. On the other hand, the observation that Stau and Brat do not compete with each other for Mira binding (Fig. 3f, g) indicates that Mira acts as an elongated scaffold, which can simultaneously recognize multiple cargos.

Another key finding of this study is that Stau dsRBD5, which belongs to the degenerate type B dsRBDs lacking the dsRNA-binding feature 36, interacts with proteins through its exposed β-sheet face. The type B dsRBDs are proposed to be important for protein–protein interactions 36 . Taking the Stau family as an example, the RNA-binding deficient dsRBDs 2 and 5 of Stau are essential for the localization of mRNAs encoding cell fate determinants in Drosophila eggs and NBs 20, 24, 25, 35 . Similarly, human STAU1 interacts with the 60S subunit of cytoplasmic ribosomes independent of dsRBDs 3 and 4 that bind dsRNA 42, 43, 44 . Previous structural studies revealed that the dsRBD–protein interaction often requires N- or C-terminal appendages, which interact with the dsRBD α 1 –α 2 interface mostly in cis , and the known trans -protein interactions of dsRBDs are dsRBD–dsRBD interactions facilitated by appendages, such as the human STAU1 dsRBD5 homodimer 36 . The crystal structure of Mira514–595/Stau dsRBD5 complex solved here is the first high-resolution structure illustrating the trans dsRBD–protein interaction. It clearly demonstrates that dsRBDs can bind proteins without N- or C-terminal appendages. Thereby, dsRBD itself can serve as an independent protein–protein interaction module. Furthermore, dsRBD fold can also use the β-sheet face to interact with proteins, revealing a novel protein interaction mode of dsRBDs so far. We have identified a few residues on the β-sheet face important for Mira binding, although these residues are only conserved among Stau/STAU1 dsRBD5 homologues (Fig. 5b). Whether the conserved β-sheet of STAU1 dsRBD5 is indeed important for mediating protein interactions with physiological relevance, for example, for ribonucleoprotein particle formation, is an interesting prospect that warrants further investigation.

While this manuscript was in preparation, Brown et al . provided the 3.4 Å resolution cryoelectron microscopy structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria 45 . Surprisingly, we found that a fragment of the RNase III-like L44mt (protein L44 of the mitochondrial 39S ribosomal subunit) adopts a dsRBD-like (referred to as dsRBDL hereafter) fold, and might bind to ribosomal proteins but not RNA through the exposed β-sheet face and L2 loop (Supplementary Fig. 5a). Even though it is not clear whether the β-sheet face (or together with L2) of L44mt dsRBDL is sufficient to mediate specific protein interactions in the isolated state rather than in a large complex with multiple components, it suggests that the β-sheet face might be a common site to mediate dsRBD–protein interaction. Interestingly, although key residues on the exposed β-sheet faces from L44mt dsRBDL and Stau dsRBD5 share little similarity, both of them are capable of protein binding (Fig. 5b and Supplementary Fig. 5a, b). Specifically, six residues (Tyr971, Leu980, Ile982, Ile992, His994 and Val996) from the β-sheet face of Stau dsRBD5 form a hydrophobic surface to interact with Mira. Whereas in L44mt dsRBDL, only two of the above six residues are hydrophobic (Phe271 and Leu280, corresponding to Leu980 and Ile992 in Stau dsRBD5). Nevertheless, L44mt dsRBDL utilizes its exposed β-sheet face to form two protein-binding patches that might interact with two ribosomal proteins simultaneously. Further structure-based sequence alignment of other canonical or type B dsRBDs and dsRBDLs with known structures revealed that residues from the exposed β-sheet faces are highly variable (Supplementary Fig. 5c). Together with the finding that L44mt dsRBDL might use a flexible β-sheet face (compared with that of Stau dsRBD5) to interact with ribosomal proteins, our results imply that dsRBDs may function as versatile protein-binding domains through their exposed β-sheet faces. Moreover, structural comparison shows that protein binding at the β-sheet face does not sterically hinder the dsRNA binding or the interaction at the α 1 –α 2 interface (Fig. 5d). Other multifunctional dsRBDs are expected to exist, and these dsRBDs may be capable of simultaneously interacting with dsRNA and proteins.

Metodai

Baltymų paruošimas

Various Drosophila Stau and Mira fragments (Fig. 1b), and mutants (Fig. 3c), Brat NHL (aa 756–1, 037) were individually cloned into a modified version of pET32a vector in which the thrombin cutting site was replaced by a protease 3C cutting site, and the S-tag was removed. Each of the resulting proteins contained a Trx tag in its N termini. All the mutations were generated using the standard PCR-based method (Supplementary Table 1) and confirmed by DNA sequencing. Recombinant proteins were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) host cells at 16 °C and were purified by using a Ni 2+ –NTA agarose affinity chromatography followed by SEC. The N-terminal Trx-tagged fragments of Mira and Stau were cleaved by digesting fusion proteins with protease 3C, and the proteins were purified by another step of SEC.

Size-exclusion chromatography

SEC eksperimentai buvo atlikti su AKTA FPLC sistema (GE Healthcare). Baltymai, kurių koncentracija 10–20 μM, kai tūris 100 μl, buvo įpilti į „Superose 12 10/300 GL“ 20 koloną („GE Healthcare“), subalansuotą buferiu, kuriame yra 50 mM Tris (pH 8, 0), 100 mM NaCl, 1 mM DTT. ir 1 mM EDTA. Baltymų eliuavimas buvo aptiktas absorbcija esant 280 nm.

Izoterminė titravimo kalorimetrija

ITC matavimai buvo atlikti naudojant ITC200 mikrokalorimetrą (MicroCal) 25 ° C temperatūroje. Visi baltymų mėginiai buvo 50 mM Tris (pH 8, 0), 100 mM NaCl ir 1 mM EDTA buferio. Titravimas buvo atliktas įšvirkščiant 40 μl „Mira“ fragmentų į „Stau“ fragmentus 2 minučių intervalais, siekiant užtikrinti, kad titravimo smailė grįžtų į pradinę liniją. Titravimo duomenys buvo analizuojami naudojant programą „Origin7.0“ iš „MicroCal“.

Kristalografija

Mira514–595 / Stau dsRBD5 baltymo komplekso „Se – Met“ darinio kristalai buvo gauti garuojančiosios garų difuzijos metodu 16 ° C temperatūroje. Optimizuoti Mira / Stau komplekso kristalai buvo auginami maišant 1 μl Mira / Stau komplekso tirpalą, 0, 8 μl rezervuaro tirpalą, kuriame yra 0, 1 M natrio acetato (pH 4, 8), 0, 7 M 1, 6-heksaandiolio, 0, 02 M kalcio chlorido ir 0, 2 μl 0, 1 M. magnio chloridas. Kristalai buvo mirkomi kristalizacijos tirpale, kuriame yra 20% glicerolio. Se-SAD duomenys buvo surinkti SSRF (Šanchajaus Synchrotron radiacijos įrenginyje Kinijoje) pluošto linijoje BL17U, kurio bangos ilgis buvo 0, 9792 Å. Duomenys buvo indeksuojami, integruoti ir keičiami naudojant HKL2000. Iš pradžių seleno atomai buvo SHELXC / D. Eksperimentinį fazavimą, tankio modifikavimą ir automatinį modelio sudarymą atliko „PHENIX 46“ „ AutoSol“. Pradinis modelis buvo toliau pertvarkytas ir rankiniu būdu sureguliuotas naudojant COOT 47 ir buvo patobulintas naudojant PHENIX 46 fenix.refine programą. Galutiniame modelyje yra 99% liekanų Ramachandrano sklypo palankiame regione, be pašalinių reikšmių. Galutinė patikslinimo statistika yra apibendrinta 1 lentelėje.

Bendri nusėdimai ir imunoblotai

Žmogaus HEK293T ląstelės buvo laikinai kotransfekuotos viso ilgio „Flag-Mira“ ir „HA-Stau“ arba žaliuoju fluorescenciniu baltymu (GFP) –Brat WT baltymais arba įvairiais mutantais, naudojant polietilenimino transfekcijos reagentą. Laikinajam transfekavimui 6 μg Mira WT, Mira L529E arba 8 μg Mira L557E buvo kotransfekuoti atitinkamai 20 μg Stau WT arba 13 μg Stau H994E ; ir 4 μg Mira WT arba 20 μg Mira L529E, Mira L557E buvo kotransfekuoti atitinkamai 4 μg Brat. Ląstelės buvo surinktos 24 valandas po transfekcijos ir lizuotos buferiniame tirpale, kuriame yra 50 mM Tris (PH 7, 4), 150 mM natrio chlorato, 0, 5% nonidet P-40, 10 mM natrio fluorido, 1 mM natrio metavanadato, 1 mM DTT, 10 mM PMSF. ir proteazės inhibitoriai. Kiekvienas lizatas per naktį buvo inkubuotas su anti-Flag M2 afiniteto geliu (Sigma). Konkurencijos tyrimui, lizatas, kuriame buvo kotransfekuoti viso ilgio „Flag-Mira“ ir GFP – Brat, buvo inkubuojami su anti-flag M2 afiniteto geliu per naktį, esant arba neturint 0, 8 mg išgryninto Trx-Stau dsRBD5.

Po to, kai granulės buvo plaunamos lizės buferiu, užfiksuoti baltymai buvo virinami SDS – PAGE įkrovimo buferyje ir paveikti SDS – PAGE. Baltymai buvo perkelti į 0, 45 μM nitroceliuliozės membraną (Millipore), o nitroceliuliozės membrana užblokuota naudojant 3% BSA TBST (20 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 137 mM NaCl ir 0, 1% Tween-20) buferio kambario temperatūroje. 1 val., Po to inkubuojama su šiais antikūnais: Flag (ABclonal), HA (ABclonal), GFP (ABclonal), praskiedžiant 1 / 2, 000, esant 4 ° C per naktį. Membranos tris kartus plaunamos TBST buferiu, inkubuojamos su krienų peroksidaze (HRP) konjuguotu ožkos anti-triušiu arba prieš pelę antikūnu (ABclonal) ir vizualizuojamos naudojant LAS3000 chemiliuminescencinę vaizdo sistemą.

GST ištraukiamasis tyrimas

Atliekant GST ištraukiamąjį testą, GST arba GST pažymėtas Brat NHL (8 μM galutinei koncentracijai) pirmiausia buvo įpilti į 40 μl GSH-Sepharose 4B suspensijos granules į 500 μl tyrimo buferį, kuriame yra 50 mM Tris (pH 8, 0). 100 mM NaCl, 1 mM DTT ir 1 mM EDTA. Tada į GST sulieti baltymus įpilti rutuliukai buvo sumaišyti su potencialiais rišančiaisiais partneriais (kiekvienam po 24 μM galutinei koncentracijai), ir mišiniai buvo inkubuojami 1 valandą 4 ° C temperatūroje. Po keturių kartų plovimo baltymai, surinkti iš afinitetinių granulių, buvo išplaunami verdant, išskaidomi 15% SDS – PAGE ir aptinkami dažant Coomassie mėlyna spalva.

Drosophila S2 ląstelių kultūra

„Mira“ („Flag-Mira WT“ ir „Flag-Mira L529E“) ir „Stau“ („Flag-Stau WT“ bei „Flag-Stau H994E“) variantai buvo subklonuoti į UASt.attB vektorių (Konrado Baslerio dovana).

Drosophila S2 ląstelės buvo auginamos 25 ° C temperatūroje Schneider terpėje (Invitrogen), papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo. Visi perpylimai buvo atlikti naudojant Effectene Reagent (Qiagen) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, S2 ląstelės buvo kotransfekuotos 0, 5 μg dominančiomis plazmidėmis (Mira arba Stau) kartu su act-gal4 plazmidėmis. Ląstelės buvo surinktos po 48 val. Ir lizuotos Nonidet P-40 lizės buferiu, kuriame yra 50 mM Tris, pH 8, 0, 250 mM NaCl, 0, 5% Nonidet P-40, 0, 2 mM EDTA, proteazės inhibitoriaus kokteilis (pilnas, Roche) ir fosfatazės inhibitorius. . Lizatas buvo surinktas ir išvalytas centrifuguojant 13 000 aps./min. 5 minutes 4 ° C temperatūroje. Mėginiai buvo atskirti 10% poliakrilamido SDS – PAGE geliais, po to perpilant į PVDF membranas (Millipore). Pelės anti-Flag antikūnas (Sigma, 1/2 000), triušio anti-Mira antikūnas (sukurtas mūsų laboratorijoje, 1/1000) ir triušio anti-Stau antikūnas (Daniel St Johnston, 1/1000) buvo praskiestas TBST 5% neriebus sausas pienas.

Musių genetika

Informacija apie šiame tyrime naudojamas musių dėmes buvo aprašyta tekste arba „FlyBase“ (www.flybase.org). Atsargos (jei nenurodyta žemiau) buvo gautos iš žydinčių atsargų centro ir kryžiai buvo palaikomi 25 ° C temperatūroje standartinėje terpėje. Naudotos atsargos buvo FRT82B , elav -gal4 , insc-gal4 , Tub-gal80 , hs-flp , UAS-CD8 :: GFP , Miranda [L44] (Fumio Matsuzaki), UAS-Flag-Mira WT, UAS-Flag-Mira L529E ir UAS-Flag-Stau WT ir UAS-Flag-Stau H994E buvo sukurti šiame tyrime.

„Mira“ („Flag-Mira WT“ ir „Flag-Mira L529E“) ir „Stau“ („Flag-Stau WT“ bei „Flag-Stau H994E“) variantai buvo subklonuoti į UASt.attB vektorių (Konrado Baslerio dovana) ir transgenines linijas sukūrė „BestGene, Inc.“. (ChinoHills, CA), naudojant attP nusileidimo vietą II chromosomoje (geriausios geno eilutė 9723).

Norėdami išspręsti šios „Mira“ varianto lokalizaciją ir funkciją „ Mira“ mutantiniame fone, šie transgenai vėliau buvo perkeisti į FRT82B arba FRT82B.Mira [L44] foną, kad būtų gautos šios atsargos.

UASt – Vėliava – Mira WT / Sm6.cyo; FRT82B / Tm3.tb

UASt – Vėliava – Mira WT / Sm6.cyo; FRT82B.Mira [L44] /Tm3.tb

UASt – Vėliava – Mira L529E / Sm6.cyo; FRT82B / Tm3.tb

UASt – Vėliava – Mira L529E / Sm6.cyo; FRT82B.Mira [L44] /Tm3.tb

Mozaikų analizė, naudojant represuojamų ląstelių žymeklio metodą, buvo panaudota norint teigiamai pažymėti mutantinius klonus GFP signalu pagal paskelbtą 48 protokolą. Trumpai tariant, embrionai buvo surinkti per 6 valandas, o lervos (24 val. Po lervų perėjimo, ALH) buvo veikiamos 1 val. Šilumos smūgio 37 ° C temperatūroje, o lervos su norimais genotipais buvo išpjaustytos ir ištirtos.

Imunohistochemija ir vaizdavimas

Norimo genotipo lervos buvo išpjaustytos esant 96 h ALH, o smegenys 15 min buvo fiksuotos 3, 7% formaldehide PBS su 0, 1% Triton-X ir vėliau apdorotos imunocheminei analizei. Buvo naudojami šie antikūnai: pelės anti-Mira (Fumio Matsuzaki), 1/30; pelės anti-vėliava (Sigma), 1 / 2, 000; triušis anti-Mira 49 (sukurtas mūsų laboratorijoje), 1/1000; triušis anti-Stau (Danielis St Johnstonas), 1/2 000; žiurkės anti-Brat 50 (Yongqing Zhang), 1/500; pelės priešpriešai (DSHB), 1/20; jūrų kiaulytės anti-Dpn (generuojamos mūsų laboratorijoje), 1/1000; triušis anti-Pon (sukurtas mūsų laboratorijoje), 1/2 000; triušis anti-aPKCζ C20 („Santa Cruz Biotechnologies“), 1/1000; vištienos anti-GFP (Abcam), 1/5 000. Antriniai antikūnai buvo konjuguoti su Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555 arba Alexa Fluor 633 (molekuliniai zondai) ir buvo naudojami atitinkamai 1/500, 1/1000 ir 1/250. DNR dažymui buvo naudojamas TO-PRO-3 (Invitrogen) santykiu 1/5000 ir mėginiai buvo sumontuoti Vectashield (Vector Laboratories). Vaizdai buvo gauti naudojant „Zeiss LSM 510“ vertikalų arba „Leica SP II“ vertikalų mikroskopą ir apdoroti „Adobe Photoshop CS6“ ir „Adobe Illustrator CS6“.

Prisijungimai

Baltymų duomenų bankas

  • 5CFF
  • 5CFF 3D vaizdas

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    1–6 papildomi paveikslai, 1 papildoma lentelė

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.