Stipraus zika ir dengės karštligės viruso antikūnų kryžminio neutralizavimo struktūriniai pagrindai gamta

Stipraus zika ir dengės karštligės viruso antikūnų kryžminio neutralizavimo struktūriniai pagrindai gamta

Anonim

Dalykai

  • Baltymų vakcinos
  • Rentgeno kristalografija
  • Šio straipsnio „Erratum“ buvo paskelbtas 2016 m. Rugsėjo 14 d

Anotacija

Zikos virusas yra Flavivirus genties narys, kuris nebuvo susijęs su sunkia žmonių liga iki paskutinių protrūkių, kai jis buvo susijęs su mikrocefalija naujagimiams Brazilijoje ir su Guillain-Barré sindromu suaugusiesiems Prancūzijos Polinezijoje. Zikos virusas yra susijęs su dengės karštligės virusu, ir čia mes pranešame, kad antikūnų pogrupis, nukreiptas į konformacijos epitopą, išskirtą iš pacientų, sergančių dengės karštligės virusu, taip pat gali neutralizuoti Zikos virusą. Dviejų iš šių antikūnų kristalinė struktūra, susidedanti iš Zika viruso apvalkalo baltymo, atskleidžia konservuoto epitopo, kuris yra ir apvalkalo baltymo dimerio sąveikos su pirmtako membranos (prM) baltymu, viruso brendimo metu, detales. Zikos ir dengės dengės karštligės virusų imunokompleksų palyginimas suteikia pagrindą racionaliam, į epitopus nukreiptam universalios vakcinos, galinčios sukelti stiprius kryžmiškai neutralizuojančius antikūnus, dizainui, tuo pačiu apsaugant tiek nuo Zikos, tiek nuo dengės dengės karštligės viruso.

Pagrindinis

Zikos virusas (ZIKV) yra nariuotakojų platinamas apvalkalas, priklausantis Flaviviridae šeimai, priklausantis Flavivirus genčiai, kuriam taip pat priskiriami žmogaus patogeniniai geltonosios karštligės, dengės karštligės, Vakarų Nilo ir erkinio encefalito virusai 1 . Flavivirusai turi du struktūrinius glikoproteinus - prM ir E (atitinkamai - pirmtako membranos ir apvalkalo baltymams), kurie sudaro užkrėstos ląstelės endoplazminiame retikulume (ER) heterodimerį ir nukreipia dygliuotų nesubrendusių virionų pumpurus į ER spindį. Šios dalelės pereina per ląstelės sekrecinį kelią, kurio metu transGolgi rezidento proteazės furinas skaldo prM. Šis apdorojimas reikalingas užkrečiamumui, todėl prarandamas didelis prM fragmentas ir E viriono paviršiuje gali būti pertvarkoma. Subrendusios dalelės turi sklandų aspektą, o 90 E dimeriai yra organizuoti pagal ikosaedrinę simetriją „silkūnės“ modeliu 2, 3 .

Neseniai buvo pranešta, kad subrendusių ZIKV dalelių trimatės krioelektroninės mikroskopijos (krio-EM) struktūros yra beveik atomos (3, 8 Å) 4, 5, ir tai rodo, kad virusas iš esmės turi tokią pačią organizaciją kaip ir kiti žinomos struktūros flavivirusai., tokių kaip dengės karštligės virusas (DENV) 3 ir Vakarų Nilo virusas 6, 7 . E baltymas yra maždaug 500 aminorūgščių, o 400 N-galinių liekanų, sudarančių ektodomeną, iš esmės sulankstyti kaip β lakštus su trimis domenais, pavadintais I, II ir III, iš eilės suderintais su I domenu centre. Konservuota suliejimo kilpa yra II srities domeno lazdele, esančioje E dimerio sąsajoje. C gale po E ektodomeno eina „stiebas“, kurį sudaro dvi α-spiralės, gulinčios ant virusinės membranos (stiebo spiralės), kurios jungiasi su dviem C-galo transmembraniniais α-sraigtais. Pagrindinis skiriamasis ZIKV viriono bruožas yra intarpas glikozilintoje E kilpoje („150“ kilpa), kuri išsikiša iš subrendusio viriono paviršiaus 4, 5 .

Remiantis kryžminės neutralizacijos tyrimais su polikloniniais imuniniais serumais 8, flavivirusai buvo suskirstyti į serokompleksus. E baltymas yra pagrindinis neutralizuojančių antikūnų taikinys, taip pat virusinis fusogenas; skilimas prM leidžia E reaguoti į endosominį pH, vykstant didelio masto konformacijos pokyčiui, kuris katalizuoja membranos suliejimą ir atpalaiduoja viruso genomą į citozolį. Praradęs pirmtako prM fragmentą, E baltymas gali svyruoti nuo jo sandaraus pakavimo viriono paviršiuje, laikinai veikdamas kitaip palaidotus paviršius. Vienas paviršiaus, kurį veikia šis „kvėpavimas“, yra sulietos kilpos epitopas (FLE), kuris yra dominuojanti kryžmiškai reaguojanti antigeninė vieta 9 . Nors antikūnai šioje svetainėje gali apsaugoti komplemento tarpininkaujamais mechanizmais, kaip parodyta pelių modelyje dėl Vakarų Nilo viruso 10, jie silpnai neutralizuojasi ir sukelia antikūnų priklausomą sustiprėjimą 11, 12, 13, 14, 15, tuo apsunkindami Flaviviruso patogenezę. apsunkina saugių ir veiksmingų vakcinų kūrimą.

Neseniai pranešėme apie antikūnų grupės, išskirtos iš pacientų, sergančių dengės vėžiu, funkcinį ir struktūrinį apibūdinimą 13, 16 . Dauguma šių antikūnų nukreipti į FLE, tačiau kiti nukreipti į ketvirtinę vietą, prie kurios lengvai galima patekti viriono E baltymo paviršiuje, prie dviejų dimeryje esančių E subvienetų sąsajos. Šie plačiai neutralizuojantys antikūnai (bnAb), vadinami EE dimero epitopu EDE, galimai neutralizuoja visus keturis DENV serotipus. Jų jungimosi vieta yra išsaugota serotipų atžvilgiu, nes tai taip pat yra prM sąveikos vieta su E dimeriais, pernešant nesubrendusias viruso daleles per ląstelės Golgi aparatą. Buvo du EDE antikūnų pogrupiai, kuriems būdingas diferencinis reikalavimas glikozilinti 150 kilpų, kad surištų. EDE1 bnAb geriau jungiasi, kai nėra glikano, tuo tarpu EDE2 bnAb geriau jungiasi, kai yra glikano.

Šiame tyrime parodyta, kad EDE bnAb neutralizuoja ZIKV taip stipriai, kaip jie neutralizuoja DENV. Taip pat pastebime, kad FLE antikūnai, kurie neutralizuoja DENV, nors ir ne taip stipriai, kaip EDE bnAb, ne neutralizuoja ZIKV esant 1 μM koncentracijai, nepaisant didelio afiniteto rekombinantiniam ZIKV E baltymui. Toliau aprašome vien tik ZIKV E baltymo dimero kristalų struktūras, komplekse su EDE1 C8 ir EDE2 A11, nurodydami jų jungimosi veiksnius.

ZIKV – DENV super serogrupė

Pagrindinių žmogaus patogeninių flavivirusų filogenetinės analizės, naudojant virusinės RNR polimerazės NS5 aminorūgščių sekas, rodo ZIKV susibūrimą į uodų encefalitinių virusų grupę. Klasifikacija skiriasi, kai atsižvelgiama į E baltymo aminorūgščių sekas, kai ZIKV išsišakoja su DENV grupe (1a pav.). Jei sekų grupavimas tęsiasi iki antigeninio E paviršiaus, antikūnai, kryžmiškai reaguojantys su keliais DENV serotipais, taip pat turėtų surišti ZIKV E. Šiai hipotezei patikrinti mes panaudojome biologinio sluoksnio interferometriją, norėdami ištirti silpnai neutralizuojančio, kryžmiškai reaktyvaus FLE jungimosi savybes. antikūnas ir rekombinantinio tirpaus ZIKV E ektodomeno (ZIKV sE) antikūnai, gaminami vabzdžių ląstelėse (žr. metodus). FLE antikūnas (P6B10) surištas beveik 10 kartų sandariau nei EDE1 C8 (akivaizdi disociacijos konstantos ( K d ) reikšmė 1, 5 nM, palyginti su 9 nM) ir beveik 1000 kartų sandariau nei EDE2 A11 (1b pav. Ir išplėstiniai duomenys). 1a pav.). Remdamiesi jų giminingumu, mes galėtume išskirti ZIKV sE kompleksą su C8 Fab, naudodami dydžio pašalinimo chromatografiją, bet ne su A11 Fab (išplėstiniai duomenys, 1b pav.).

Image

a, Pagrindinių žmogaus patogeninių flavivirusų filogenetiniai medžiai, pagrįsti E baltymo (kairėje) ir polimerazės NS5 baltymo (dešinėje) aminorūgščių sekomis. Nariuotakojų vektoriai skiriasi pagal fono spalvą. JEV, japonų encefalito virusas; MVEV, Murray Valley encefalito virusas; POWV, Powassan virusas; SLEV, Sent Luiso encefalito virusas; TBEV, erkinio encefalito virusas; YFV, geltonosios karštinės virusas; WNV, Vakarų Nilo virusas. b, ZIKV sE reaktyvumas su žmogaus rekombinantiniais pilno ilgio antikūnais FLE P6B10, EDE1 C8 ir EDE2 A11. Kairėje esančios rišamosios savybės buvo stebimos naudojant Octet-Red (ForteBio) biologinio sluoksnio interferometriją (BLI). Normalizuotos atsako vertės, išreikštos jungimosi vietos užimtumo dalimi, nubrėžtos pagal ZIKV sE dimero koncentracijas, parodytas logaritminėje skalėje. Linijos žymi bendrąsias kreivės atitiktis, naudojamas Kd vertinimui (žr. Išplėstinius duomenis, 1a pav., Linijinis koncentracijos diapazonas, rodantis nuo koncentracijos priklausančias sodrumo dervas). Normalizuotos atsako vertės buvo išvestos iš atskirų jutiklių schemų, parodančių EDE1 C8 jungties savybes, išmatuotas skirtingomis ZIKV sE koncentracijomis.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Neutralizacijos tyrimai su afrikinių žaliųjų beždžionių inkstų (Vero) ląstelėmis, naudojant šiuos ir kitus trijų antikūnų pogrupių narius, parodė, kad EDE1 antikūnai stipriai neutralizuoja ZIKV, tuo tarpu EDE2 antikūnai buvo bent viena logine tvarka mažiau galingi. Nepaisant stipraus afiniteto, P6B10 nei neutralizavo ZIKV naudojamų koncentracijų diapazone, nei nei vienas iš dviejų kitų tirtų FLE antikūnų (2 pav.). EDE1 bnAb geriausiai neutralizavo ZIKV afrikietišką padermę HD78788, o pusės maksimali slopinamoji koncentracija (IC50) yra apie 0, 1 nM. Šis štamas per daugelį metų buvo pritaikytas ląstelių kultūrai ir praėjo žindomų pelių smegenyse ir jam trūko E glikozilinimo. IC50 prieš PF13 padermę, išskirtą 2013 m. Prancūzijos Polinezijoje ir kurioje E baltymas yra glikozilintas 154 padėtyje, buvo nanomolių diapazone ir panašus arba mažesnis nei keturių DENV serotipų (1 lentelė). EDE2 bnAb nerodė skirtumo tarp abiejų padermių neutralizacijos, o tai leidžia manyti, kad N154 glikano buvimas ZIKV E baltyme nepagerino sąveikos.

Image

Rezultatai rodo keturių nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais PF13 ir dviem egzemplioriais HD78788 padermėms, vidurkį ± sem. Dvi ZIKV padermės yra ryškių spalvų, atitinkamai mėlynos ir raudonos. Keturių DENV serotipų (punktyrinės linijos šviesiomis spalvomis) neutralizacijos duomenys paimti iš nuorodos. 13 ir pateikiami čia palyginimui. Atitinkamos IC 50 vertės yra pateiktos 1 lentelėje. Atkreipkite dėmesį, kad naudojamas DENV-4 štamas buvo natūralus izoliatas, neturintis N153 glikozilinimo vietos (N - ).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Pilno dydžio lentelė

ZIKV – EDE bnAbs imuniniai kompleksai

Mes išsikristalizavome nesuspaustus ZIKV sE ir ZIKV sE kompleksus atitinkamai su EDE1 C8 ir EDE2 A11 su vienos grandinės Fv (scFv) ir Fab fragmentais (išplėstinė duomenų lentelė 1). Nesusietos ZIKV sE struktūroje 150 kilpų yra užsakomos skirtingai nuo neglikozilinto 150 kilpų neseniai nustatytoje baltymo, pagaminto bakterijose ir sulankstyto in vitro, struktūroje 17 . Priešingai nei mūsų vabzdžių ląstelių išskiriamas baltymas, kuris yra dimeris (išplėstiniai duomenys, 1b pav.), Pranešta, kad pakartotinai sulankstytas baltymas yra monomerinis tirpale, kuris rodo, kad glikanas gali padėti suformuoti kilpą ir skatinti sE dimerizaciją.

Antikūnai atpažįsta ZIKV sE dimerio ketvirtinį epitopą taip pat, kaip atpažįsta anksčiau aprašytą DENV 2 serotipo (DENV-2) sE dimerą 16 . Kontaktuose dalyvaujančių aminorūgščių liekanos tiek ZIKV, tiek DENV-2 struktūroms yra parodytos išplėstinių duomenų pav. 2 pav. Kaip ir tikėtasi, modelis yra labai panašus, su keletu skirtumų, paryškintų raudonais rėmeliais išplėstinių duomenų pav. 2b. Abu epitopai sE dimeryje yra užimti komplekso su C8 atveju (3a pav.), Tuo tarpu A11 atveju yra užimtas tik vienas (4a pav.). Patikrinus kristalų aplinką paaiškėjo, kad šioje vietoje negalėtų būti pritvirtintas antrasis Fab, nesikišant į krištolo kaimyninius kompleksus. Šis stebėjimas rodo, kad kristalų augimas, pasirinktas norint sujungti sE dimerus su vienu Fab jungtimi, tai palengvina mažas A11 afinitetas.

Image

a ) bendras komplekso vaizdas, kuriame sE fragmentas yra nudažytas domenais (atitinkamai I, II ir III - atitinkamai raudona, geltona ir mėlyna); pilkos ir tamsiai žalios spalvos antikūnai atitinkamai atitinkamai šviesiosioms ir sunkiosioms grandinėms. CDR yra spalvotos (H1, šviesiai mėlyna; H2, smėlis; H3, rožinė; L1, šviesiai pilka; L2, rausvai raudona; L3, oranžinė). Įdėklas rodo palyginimą su atitinkamu DENV-2 kompleksu. Aiškumo sumetimais DENV-2 sE – C8 C8 Fab fragmento kintama sritis buvo uždėta ant C8 scFv komplekse su ZIKV sE, kad nubrėžtų Fab ašis ir parodytų geresnius doko kampus. b, ZIKV sE – C8 sąveikos mastelio keitimas, siekiant parodyti b krypties atpažinimą. Vandenilio jungtys parodytos punktyrinėmis linijomis, o imobilizuotos vandens molekulės - raudonais rutuliais. c, Tas pats regionas DENV-2 sE – C8 Fab komplekse. Atkreipkite dėmesį, kad N67 glikanas, esantis DENV, taip pat sąveikauja su antikūnu. d, EDE1 C8 pėdsakas yra parodytas ant ZIKV sE dimerio, pavaizduoto paviršiaus vaizduojant (žiūrint iš viriono išorės), nudažytu atsižvelgiant į paviršiaus paveiktų aminorūgščių išsaugojimą. Pagrindinės ir konservuotos šoninių grandinių atomai yra oranžiniai, labai panašios šoninės grandinės yra geltonos, o visos kitos yra baltos. e, f, EDE1 C8 pėdsakai ant ZIKV sE ( e ) ir DENV-2 sE ( f ) paviršiaus pavaizduotos purpurine spalva. FL, sintezės kilpa. Dvieji dimeryje esantys sE protomerai yra šviesiai ir tamsiai pilki. Atitinkami antigeniniai sE regionai yra paženklinti. Atkreipkite dėmesį, kad ZIKV sE dimeryje labiau ribojamas sąveikaujantis paviršius nei DENV-2, pvz., N67 glikano nėra ZIKV sE.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Image

Spalvų kodavimas yra toks, kaip 3 pav. A, bendras komplekso vaizdas, kuriame yra tik vienas Fab, surištas per sE dimerą, dėl kristalų įpakavimo. Brūkšniuota elipsė rodo trūkstamo A11 Fab vietą. Įdėklas lygina surišimo kampą su sE dimeriu ZIKV ir DENV-2. b, c, sąveikos su b styga ZIKV (kairėje) ir DENV-2 (dešinėje). Atkreipkite dėmesį į skirtingą b juostos kampą antikūno atžvilgiu (antikūnas abiejose plokštėse yra visiškai vienoda kryptimi). d, e, Glikano mastelio padidinimas ant 150 kilpų, skirtas ZIKV sE ( d ) ir DENV-2 sE ( e ), su cukraus likučių skaičiais, aprašytais rakte. CDR H3 spiralė yra per toli, kad būtų galima sąveikauti su glikanu, kaip tai daroma DENV-2 struktūroje (žr. Išplėstinius duomenis, 2b ir 5b pav.).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

„BnAbs“ jungiasi prie ZIKV sE skirtingais kampais nei DENV-2 sE (žr. Intarpus 3a ir 4a pav.). C8 komplekso atveju doko skirtumą daugiausia lemia pakitęs sE dimerio kreivumas. Atkreipiame dėmesį, kad ZIKV sE formavimas komplekse su antikūnais yra labai panašus į tą, kurį jis priima ant viruso dalelių, su 790 Cα atomų apytiksliai 1, 5 Å šaknies kvadratinio nuokrypio (rmsd) (žr. 2 išplėstinių duomenų lentelę). Čia susikristalizavęs nesurištas ZIKV sE parodo tolimesnę konformaciją (2, 5 Å rmsd, palyginti su abiem viriono ZIKV E ir bet kuriuo iš sE antikūnų kompleksais), kas rodo, kad antikūnai stabilizuoja artimą viruso dalelių konformacijai. Priešingai, tie patys palyginimai, atlikti tik su DENV-2 sE, atskirai arba kompleksiškai su bnAb, lemia 5–7 Ås rmsd vertes, atsižvelgiant į krio-EM 3 stebėtą DENV viriono E konformaciją. Palyginimui, viriono E ektodomeno superpozicija iš ZIKV 5 ir DENV-2 (3 nuoroda) lemia panašią 1, 5 Å rmsd vertę, rodančią, kad jie pateikiami maždaug tokiu pačiu būdu, tačiau DENV sE labiau deformuojasi sprendimas. Šis gedimas gali atspindėti DENV E 18 nurodytą kvėpavimo formą. Vietoj to, ZIKV sE išlieka panašios struktūros, nesant virionui sąveikos su pamatiniais stiebo α-spiralėmis ir M baltymu (membranoje įtvirtintu prM likučiu po furino skilimo), atsižvelgiant į didesnį viriono stabilumą. neseniai aprašytos ZIKV dalelės 4 .

EDE1 C8 kompleksas

Bendras EDE1 C8 palaidoto paviršiaus plotas komplekse su ZIKV sE yra apie 900 Å 2, palyginti su maždaug 1300 Å 2 DENV-2 sE komplekse (išplėstinė duomenų lentelė 3). 3d paveiksle pavaizduotas epitopo išsaugojimas, o 3e ir f pav. Lyginti C8 pėdsaką ZIKV ir DENV-2 sE. DENV specifinis glikanas, esantis N67 padėtyje, nurodytas DENV-2 sE struktūroje (3c pav.), Sudaro maždaug du trečdalius bendro pėdsakų skirtumo. N67 glikanas sąveikauja su sunkiosios grandinės (FRH2) 2 karkaso sritimi, o jo nebuvimas ZIKV sE rodo, kad šie kontaktai nėra būtini jungiantis. Pagrindinė palaikoma sąveikos grupė yra sutelkta į II domeno β-sruogą, kurios komplementarumą nustatančių regionų (CDR) H2, H3 ir L3 šoninės grandinės atpažįsta visus turimus vandenilio jungčių donorus (pagrindinės grandinės karbonilus) ir receptorius ( bdc β lapo briaunos pagrindinės grandinės karbonilai) (3b pav., c). Be to, sintezės kilpos pagrindinė grandinė (kurioje yra keli glicino liekanos) ir disulfidinis ryšys tarp Cys74 ir Cys105 yra įrėminti CDR L1 ir L3 aromatinėmis šoninėmis grandinėmis (taip pat žr. Išplėstinių duomenų 3 pav.). Likučiai iš šių dviejų CDR taip pat atpažįsta griežtai konservuotas sintezės kilpos šonines grandines (Arg99) arba netoliese esančias liekanas (Gln77).

Visoje dimerio sąsajoje, kaip ir komplekse su DENV-2, 150 kilpa yra iš dalies netvarkinga, o N154 glikano tankio negalima aptikti (3a pav. Ir išplėstiniai duomenys, 3d pav.). Kaip parodyta išplėstinių duomenų 3 pav., Sąveikaujantys likučiai per dimerio sąsają yra skirtingi, atspindintys ribotą sekos išsaugojimą šiuose E baltymo regionuose: DENV-2 sE komplekse šie kontaktai yra su liekanomis iš β-gijų III domeno A ir B, tačiau ZIKV jie daugiausia įtraukia Lys373 iš β-krypties E, sąveikaudami su CDR L1 ir L2, per tiesioginių arba vandens tarpininkaujamų vandenilinių ryšių tinklą (išplėstiniai duomenys, 3b, c pav.). Panašiai, keli įkrauti likučiai I domene ir iš netoliese esančio II domeno kilpos per sąsają prisideda prie surišimo ir sąveikauja su sunkiųjų grandinių CDR H2 ir H3 (išplėstiniai duomenys, 3e pav., F). Visos polinės sąveikos tarp C8 ir ZIKV sE yra išvardytos išplėstinėse duomenų lentelėse 4 ir 5, o elektrostatinis epitopo paviršius parodytas išplėstinių duomenų 4 pav., Kairiajame skydelyje. Apibendrinant, šie stebėjimai identifikuoja konservuotą kontaktų su b sritimi ir suliejimo kilpa II srityje domeną kaip pagrindinius C8 rišančius veiksnius, o papildomi kontaktai per dimerio sąsają arba iš N67 glikano, esančio DENV, toliau stabilizuojasi, bet nenustatant sąveikos.

EDE2 A11 kompleksas

Išplėstiniai duomenys. 4 pav. Palyginamas C8 ir A11 pėdsakai ZIKV sE, taip pat su paviršiaus elektrostatiniu potencialu kompleksuose, parodantis stiprų pagrindinį sE tašką C8 komplekse dėl sutrikusios 150 kilpos. Kaip parodyta išplėstinių duomenų pav. 5, C8 susidurs su glikanu, jei kilpa išliks vietoje, kaip buvo daroma komplekse su DENV-2 sE 16 . A11 komplekse 150 kilpų išlieka tokios pačios struktūros kaip viriono krio-EM struktūrose (išplėstiniai duomenys, 5a pav.) Ir glikozilinto nesujungto SE rentgeno struktūroje. DENV-2 sE – A11 komplekse glikanas atpažįstamas α-spiralės ilgoje CDR H3 kilpoje (4e pav.). Ilgos skirtumas ZIKV 150 E kilpoje, palyginti su DENV, glikano padėtį keičia maždaug 6–7 Å, kad jis negalėtų daryti tokios pačios sąveikos su CDR H3 α-spiralėmis (4d, e pav. Ir išplėstiniai duomenys). 5b pav.). Dėl to A11 antikūnas ZIKV sE kampu nukrypsta kitu kampu nei DENV-2 sE, net ir įvertindamas sE dimerio kreivės skirtumą (4a pav., Įdėklas). Išsaugomi kontaktai palei b sruogą (4b, c pav.). Palyginti su C8, b juosta atpažįstama tik išilgai jos ilgio (liekanos 71 ir 73), o C8 atpažįsta ją išilgai - iš 68 liekanų (arba iš 67 DENV).

Diskusija

Mūsų rezultatai nustato ketvirčio epitopo, kuris pateikia anksčiau nepripažintą ryšį su stipriu kryžminiu neutralizavimu tarp Zikos ir dengės karštligės virusų, struktūrinius duomenis ir taip identifikuoja antigeninį Flaviviruso klasterį, esantį už tradicinių serokompleksų ribų. Šis ryšys apibūdina super serogrupę remiantis stipria kryžmine neutralizacija per konservuotą epitopą, kuris nebuvo atpažintas naudojant 8 polikloninius serumus. Šis atradimas suteikia galimybę sukurti universalią vakciną, saugančią nuo visų šios grupės virusų.

Vakcinų nuo dengės karštligės viruso sukūrimą apsunkino DENV dalelių nevienalytiškumas ir poreikis imunizuoti nuo visų keturių 19, 20 serotipų naudoti daugiavalentes formules. Vienas DENV bruožas yra tas, kad daugelio tipų ląstelėse prM neskaidomas furinas subręsta, todėl susidaro nevienalytės mozaikos dalelės, kurių vienoje pusėje yra nesubrendęs panašus dygliuotas pleistras, o kitoje pusėje lygus subrendęs, panašus į subrendimą 21 . Šios dalelės yra užkrečiamos, nes jos gali sulieti su ląstelės membrana per lygią, subrendusią pusę. Kadangi FLE paveiktas nesubrendusiuose 22 regionuose, didžioji dalis DENV infekuotų pacientų antikūnų atsako yra nukreipti į jį 23 . Šie kryžmiškai reaguojantys antikūnai padengia daleles nesubrendusioje 22 pusėje, tačiau neutralizuoja tik silpnai, nes subrendusią pusę jie gali surišti tik tada, kai E baltymas „kvėpuoja“ 24, 25, 26 . Neseniai paskelbta monomerinio ZIKV sE struktūra komplekse su FLE specifiniu monokloniniu pelių antikūnu, pasižyminčiu mažu neutralizuojančiu aktyvumu, iš tikrųjų rodo, kad jo surišimo vieta būtų uždengta dimeriniame E baltyme subrendusiems infekciniams virionams 17 . Pastebėjimas, kad P6B10 ir kiti FLE antikūnai vis dar neutralizuoja DENV 13, rodo, kad brandžiuose DENV pleistruose E praleidžia daugiau laiko, kai išsivysto FLE, nei E, padarytas tais ZIKV pleistrais. Ši išvada atitinka didesnį ZIKV šiluminį stabilumą, apie kurį neseniai pranešta 4 .

Mūsų rezultatai rodo, kad epitopas, nukreiptas į EDE1 bnAb, yra geriau pritaikytas epitopams pritaikytai virusų vakcinai sukurti ZIKV / DENV super serogrupėje, nei FLE, kuris sukelia silpnai neutralizuojančius ir stipriai infekciją stiprinančius antikūnus 12, 13, 14 . EDE1 taip pat yra geriau pritaikytas nei susijęs EDE2 epitopas: nors EDE1 bnAb prisijungimui reikalingas E dimeris, faktiniai jungimosi veiksniai yra sutelkti ties b grandine ir ant labai konservuotų, E-dimerų veiktų sintezės kilpos elementų, kaip parodyta palyginus jų prisijungimą prie DENV-2 ir ZIKV sE. Tai, kad EDE2 bnAb labai priklauso nuo jų kontaktinių taškų gretimame subvienete - ant kintamos 150 kilpos, kurioje ne visada vyksta glikozilinimas -, yra trūkumas, kurį parodo jų silpnas afinitetas (1 pav.) Ir stiprus antikūnų indukcija. -priklausomas stiprinimas 12 .

Taikymas b- krypčiai ir su E-dimeru paveiktiems sintezės kontūro elementams atrodo kaip galinga alternatyva imunogeniniams metodams prieš DENV klasterį, kurių klinikinių tyrimų rezultatai buvo riboti 27 . Kadangi E baltymo polipeptido grandinė neparodo nei intarpų, nei delecijų b- sijos srityje jokiam mediciniškai reikšmingam flavivirusui, šis regionas kelia mažą pabėgimo mutacijų sukėlimo riziką, greičiausiai todėl, kad tai taip pat yra sąveikaujanti vieta su prM viruso brendimo metu. Galiausiai, kaip greitesnis pritaikymas, mūsų tyrimas taip pat rodo, kad EDE1 antikūnai, galbūt turintys 'LALA' mutaciją 28, jei reikia išvengti efektorinių funkcijų, galėtų būti naudingi imuninei profilaktikai nėščioms moterims, kurioms gresia užsikrėsti ZIKV.

Metodai

Mėginio dydžiui nustatyti nebuvo naudojami statistiniai metodai. Eksperimentai nebuvo atsitiktinės atrankos būdu, o tyrėjai nebuvo aklai paskirstomi eksperimentų ir rezultatų vertinimo metu.

Rekombinantinis ZIKV sE baltymo gaminimas

Rekombinantinis Zikos viruso sE baltymas (padermė H / PF / 2013, „GenBank“ registracijos numeris KJ776791) buvo pagamintas tandeminiu strep-tag'u Drosophila ekspresijos sistemoje (Invitrogen), kaip aprašyta anksčiau 29, 30 . Chemiškai susintetintas DNR fragmentas (GeneArt), kuriame yra Zika sE seka (1–408 aminorūgštys), buvo klonuotas į ekspresijos vektorių pT389 (nuoroda 31), kuris koduoja eksporto signalo seką BIP, enterokinazės skilimo vietą ir strep-žymą. Drosophila Schneider 2 (S2) ląstelės buvo stabiliai transfekuotos, naudojant selekciją blasticidinu. Baltymų ekspresija buvo indukuota pridedant CuSO4, o supernatantai buvo surinkti 7–10 dienų po indukcijos. Antigenai buvo išgryninti afiniteto chromatografijos būdu su Streptactin kolonomis (IBA) pagal gamintojo instrukcijas. Paskutiniame gryninimo gelio filtravimo etape naudota „Superdex“ padidinimo 200 10/300 GL kolonėlė, subalansuota 50 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl.

BnAb antigenus surišančių (Fab) ir scFv fragmentų gamyba

BnAb fragmentai buvo klonuoti į plazmides, kad jie būtų ekspresuojami kaip Fab 32 ir scFv 33 Drosophila S2 ląstelėse. Konstrukcijose yra tandemo strep-tag, sulietas C gale (Fab atveju - tik sunkiosios grandinės) afinitetiniam gryninimui. Į gryninimo protokolą buvo įtraukta Streptactin afiniteto kolonėlė, po kurios buvo filtruojamas gelis, kaip aprašyta aukščiau.

Žmogaus monokloninių anti-DENV E antikūnų ekspresija

Visiški IgG antikūnai buvo gaminami 293T ląstelėse (C. Lee dovana), kuriose nebuvo užteršimo mikoplazma, patikrinta Lookout Mycoplasma PCR aptikimo rinkiniu (Sigma MP0035). Šios ląstelės buvo kartu transfekuotos su plazmidėmis, turinčiomis sunkias ir lengvas imunoglobulino G1 grandines, kaip aprašyta anksčiau 13 .

Imuninio komplekso formavimasis ir izoliacija

Išgrynintas ZIKV sE baltymas buvo sumaišytas su Fab A11 arba scFv C8 (maždaug dvigubai moliniu pertekliumi) standartiniame buferiniame tirpale (500 mM NaCl, Tris 50 mM, pH 8, 0). Tūris buvo padidintas iki 0, 5 ml, centrifuguojant Vivaspin 10 kDa ribotine; po 30 minučių inkubacijos 4 ° C temperatūroje, kompleksas buvo atskirtas nuo Fab arba scFv pertekliaus, naudojant ZIKV sE ir scFv C8 dydžio išskyrimo chromatografiją. Tiriant ZIKV sE ir Fab A11, matomojo chromatografijos metu akivaizdaus komplekso susidarymo nebuvo galima pastebėti; todėl kristalizavimui buvo tiesiogiai naudojamas tirpalas, kurio sE koncentracija buvo 1, 5 mg ml –1, o Fab A11 - 3 mg ml – 1 (atitinka molinį santykį ~ 1: 2 antigenas: antikūnas). Visais atvejais buferis buvo iškeistas į 150 mM NaCl, 15 mM Tris, pH 8, kad būtų atlikti kristalizacijos bandymai. Kristalizacijai naudojamos baltymų koncentracijos, nustatytos matuojant absorbciją esant 280 nm ir naudojant ekstinkcijos koeficientą, apskaičiuotą pagal aminorūgščių sekas, yra išvardytos išplėstinėje duomenų lentelėje 1.

Biolayer interferometrijos surišimo realiuoju laiku tyrimai

Išgryninto ZIKV E baltymo sąveika su IgG FLE P6B10, IgG EDE1 C8, IgG EDE2 A11 ir kontroliniu IgG 28C (anti-gripo virusu) buvo stebima realiuoju laiku, naudojant biologinio sluoksnio interferometrijos prietaisą Octet-Red384 (Pall ForteBio). ). Antižmoginiai IgG Fc surinkimo biosensoriai (Pall ForteBio) 10 minučių buvo pakraunami 1000 aps / min kratymo greičiu, naudojant antikūnus 5 μg ml −1 bandymo buferyje (PBS plius 0, 2 mg ml −1 BSA ir tarp 0, 01%). Nesurišti antikūnai 1 minutę buvo plaunami tyrimo buferyje. Tada IgG pakrauti jutikliai buvo inkubuojami 15 min., Esant 1 000 aps./min., Nesant bandymo buferyje dvigubai nuosekliai praskiestų ZIKV sE baltymų koncentracijų. Buvo apskaičiuotos dimerinės sE baltymo molinės koncentracijos. Antikūnams FLE P6B10, EDE1 C8 ir EDE2 A11 buvo naudojamos šios ZIKV sE koncentracijos: atitinkamai 0, 78–50 nM, 3, 125–200 nM ir 50–3 200 nM. Etaloniniai surišimo eksperimentai buvo atlikti lygiagrečiai su jutikliais, įtaisytais kontroliniu IgG 28C. Tada susidariusių kompleksų disociacija buvo stebima 10 min., Panardinant jutiklius tik analizės buferyje. Darbinė temperatūra buvo palaikoma 25 ° C. Realiojo laiko duomenys buvo analizuojami naudojant „Scrubber 2.0“ („Biologic Software“) ir „Biaevaluation 4.1“ („GE Healthcare“). Specifiniai signalai buvo gauti dvigubai nurodant, tai yra atimant nespecifinius signalus, išmatuotus ant nespecifinių IgG pakrautų jutiklių, ir buferinius signalus ant konkrečių IgG pakrautų jutiklių. Asociacijos ir disociacijos profiliai, taip pat pastoviosios būsenos signalo ir koncentracijos kreivės buvo pritaikytos darant prielaidą, kad jungimosi modelis yra 1: 1.

Kristalizavimas ir rentgeno struktūros nustatymas

Kristalizacijos ir šaldymo sąlygos difrakcijos duomenims surinkti yra išvardytos 1 išplėstinėje duomenų lentelėje. Kristalizacijos bandymai buvo atlikti sėdint 400 nl lašais. Lašai buvo suformuoti sumaišant vienodus baltymų ir rezervuaro tirpalų kiekius 96 šulinėlių Greinerio plokštelėse, naudojant robotą „Mosquito“ ir stebint „Rock-Imager“. Kristalai buvo optimizuoti naudojant robotizuotą Matrix Maker ir Mosquito nustatymus ant 400 nl sėdimų ar kabamų lašų arba rankiniu būdu 24 šulinėlių plokštelėse, naudojant 2–3 μl kabančius lašus.

Dėl stiprios kristalų anizotropijos (žr. 1 išplėstinių duomenų lentelės anizotropijos rezultatus), svarbus skaičius kristalų buvo išbandytas keliose pluošto linijose skirtinguose sinchronotronuose (SOLEIL, St Aubin, Prancūzija; ESRF, Grenoblis, Prancūzija; SLS, Villigenas, Šveicarija). Kristalų, turinčių mažiau anizotropinės difrakcijos duomenis, struktūros buvo naudojamos. Duomenų rinkiniai buvo indeksuoti, integruoti, pakeista ir sujungta naudojant XDS 34 ir AIMLESS 35 . Preliminarus ZIKV sE baltymo modelis buvo sudarytas iš DENV-2 sE (4UTA) struktūros, naudojant struktūros homologijos modeliavimo serverį SWISS-MODEL 36 . Tada kompleksų struktūros buvo nustatytos molekuliniu pakeitimu naudojant PHASER 37, naudojant paieškos modelius, išvardytus 1 išplėstinėje duomenų lentelėje. AIMLESS ir PHASER programos buvo naudojamos CCP4 rinkinyje 38 .

„DEBYE“ ir „STARANISO“ programos, kurias sukūrė „Global Phasing Ltd“, buvo pritaikytos duomenims, masteliams keičiant AIMLESS, netaikant skyros ribos, naudojant STARANISO serverį (//staraniso.globalphasing.org/). Šios programos atlieka anizotropinį sujungtų intensyvumo duomenų atskyrimą, remdamosi vietinio I / σ ( I ) analize, apskaičiuoja Bajeso struktūros amplitudės įverčius, atsižvelgdamos į jų anisotropinį kritimą, ir taiko anizotropinę korekciją. duomenys. Šios pakoreguotos anizotropinės amplitudės buvo panaudotos tolesniam struktūrų tobulinimui naudojant BUSTER / TNT 39 . Atkreipkite dėmesį, kad 1 išplėstinių duomenų lentelėje pateikiama patikslinimo statistika atsižvelgiant į visus atspindžių rinkinius, apipjaustytus geriausios skiriamosios gebos palei h , k ar l ašį.

Tada modeliai buvo pataisyti rankiniu būdu ir užpildyti naudojant COOT 40 ir patikslinti naudojant BUSTER / TNT, palyginti su amplitudėmis, pataisytomis atsižvelgiant į anizotropiją. Patikslinimai buvo suvaržyti naudojant ne kristalografinę simetriją. Patobulintos konstrukcijos turi šias galutines R darbo / R laisvas (%) reikšmes: ZIKV sE – EDE1 C8 scFv (19, 5 / 22, 1), ZIKV sE – EDE2 A11 Fab (22, 3 / 23, 7) ir nesujungtos ZIKV sE (20, 8 / 23, 6). (žr. išplėstinę duomenų lentelę 1).

Atomų modelių analizė ir iliustracijos

Kiekvienas kompleksas buvo išanalizuotas naudojant CCP4 programų rinkinį, o poliniai kontaktai buvo apskaičiuoti PISA svetainėje 41 . Tarpmolekulinėms sąveikoms, parodytoms išplėstinių duomenų 2 ir 3 paveiksluose bei 4 ir 5 išplėstinių duomenų lentelėse, maksimalūs ribiniai atstumai buvo atitinkamai 4 Å ir 4, 75 Å poliaraus ir van der Waals kontaktams. Kelių sekų suderinimai buvo apskaičiuoti naudojant „Clustal W“ ir „Clustal X“ 2 versiją (nuoroda 42) EBI serveryje 43 . Paveikslai, iliustruojantys struktūrinius modelius, buvo parengti naudojant ESPript 44 ir PyMOL molekulinės grafikos sistemą, 1.5.0.4 versiją (Schrödinger) (//pymol.sourceforge.net).

Filogeniniai medžiai

Didžiausia filogenetinių medžių tikimybė buvo nustatyta naudojant 12 reprezentacinių Flavivirus apvalkalo baltymo E arba RNR polimerazės NS5 baltymų aminorūgščių sekų, naudojant LG modelį, kurį galima rasti PhyML 45, ir SPR + NNI šakų apsikeitimo derinį. Bootstrap reikšmės buvo apskaičiuotos iš 100 pakartotinių įkrovos taškų. Medžiai buvo vizualizuoti naudojant „Figtree“ (//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Medyje naudojamų sekų prisijungimo kodai: Zikos virusas (ZIKV, KJ776791, padermė H-PF-2013_French_Polynesia); dengės karštligės viruso 1 serotipas (DENV-1, NC_001477); dengės karštligės viruso 2 serotipas (DENV-2, NC_001474); 3 dengės karštligės viruso serotipas (DENV-3, NC_001475); dengės karštligės viruso 4 serotipas (DENV-4, NC_002640); Sent Luiso encefalito virusas (SLEV, NC_007580); Japonijos encefalito virusas (JEV, NC_001437; Murray Valley encefalito virusas (MVEV, NC_000943); Vakarų Nilo virusas (WNV, NC_001563); geltonosios karštinės virusas (YFV, NC_002031); erkinio encefalito virusas (TBEV, NC_001672) ir Powassan virusas. (POWV, NC_003687).

Virusinės atsargos

Afrikos padermė „Zika HD78788“ buvo gauta iš kolekcijos „Institut Pasteur“, o Azijos padermė „Zika PF13“, izoliuota nuo paciento per ZIKV protrūkį Prancūzijos Polinezijoje 2013 m., Buvo gauta per DENFREE (FP7 / 2007–2013) konsorciumą. Virusų atsargos buvo paruoštos iš užkrėstų C6 / 36 ląstelių supernatanto (ATCC CRL-1660), praskaidrinamos centrifuguojant 3000 g 4 ° C temperatūroje ir titruojamos Vero ląstelėse (ATCC CRL-1586) atliekant fokusavimo formavimo testą. Atsargos buvo laikomos –80 ° C temperatūroje iki naudojimo. Visose ląstelių linijose neužteršta mikoplazma.

Neutralizacijos testai

Viruso neutralizacija tirtais žmogaus antikūnais buvo įvertinta naudojant fokusavimo mažinimo neutralizacijos testą (FRNT). Apie 100 fokusavimo vienetų iš virusų atsargų buvo inkubuojami serijiniu antikūno praskiedimu 1 valandą 37 ° C temperatūroje. Po to mišinys buvo pridėtas prie Vero ląstelių ir židiniai buvo paliekami vystytis esant 1, 5% metilceliuliozei 2 dienas. Po to, fiksavus 4% formaldehidu, Foci dažyti naudojant anti-E 4G2 antikūną (ATCC HB-112) ir su pelių krienų peroksidaze (HRP) konjuguotą antrinį antikūną (ThermoFisher 31430). Židiniai buvo vizualizuoti diaminobenzidino (DAB) (Sigma D5905) dažymu ir plokštelės buvo suskaičiuotos naudojant „ImmunoSpot S6“ analizatorių (Cellular Technology Limited, CTL). Neutralizacijos kreivės ir 50% FRNT vertės buvo apskaičiuotos netiesine regresijos analize, naudojant „Prism 6“, „GraphPad“ programinę įrangą.

Prisijungimai

Pirminės prieigos

Baltymų duomenų bankas

  • 5LBS
  • 3LBS 3D vaizdas
  • 5LBV
  • 3D vaizdas 5LBV
  • 5LCV
  • 5LCV 3D vaizdas

Nurodytos prieigos

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • KJ776791

Duomenų indėliai

Atomų koordinačių ir struktūros veiksnių amplitudės buvo dedamos į baltymų duomenų banką (PDB), kurių prisijungimo numeriai yra 5LBS (sudėtiniam ZIKV sE – EDE1 C8 scFv), 5LCV (sudėtiniam ZIKV sE – EDE2) ir 5LBV (A11 Fab ir nesujungtam ZIKV). sE).

Išplėsti duomenys

Išplėstiniai duomenų skaičiai

  1. 1.

    Antikūnų prisijungimas prie rekombinantinio ZIKV baltymo.

  2. 2.

    Likučiai, susiję su bnAb ir antigeno sąveika.

  3. 3.

    Informacija apie EDE1 C8 bnAb kontaktą per dimerio sąsają.

  4. 4.

    Paviršinis elektrostatinis potencialas atviroje knygoje parodant imunokompleksus.

  5. 5.

    Išsami informacija apie A11 sąveiką su glikanu 150 kilpoje.

Išplėstinės duomenų lentelės

  1. 1.

    Kristalizacijos sąlygos, duomenų rinkimas ir tobulinimo statistika

  2. 2.

    RMSD vertės tarp sE dimerų įvairiose ZIKV ir DENV-2 struktūrose

  3. 3.

    Palaidoti paviršiaus plotai ir paviršiaus papildomumas ZIKV sE dimero – EDE ir DENV – 2 sE dimer – EDE kompleksuose

  4. 4.

    Polinių ir druskos tiltų sąveika ZIKV sE-EDE2 A11 Fab, DENV-2 sE – EDE2 A11 Fab, ZIKV sE – EDE1 C8 scFv ir DENV-2 sE – EDE1 C8 Fab

  5. 5.

    Polinių ir druskos tiltų sąveika ZIKV sE-EDE2 A11 Fab, DENV-2 sE – EDE2 A11 Fab, ZIKV sE – EDE1 C8 scFv ir DENV-2 sE – EDE1 C8 Fab

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.