Struktūrinis ir biocheminis krlb srities apibūdinimas insulino receptoriaus substrate-2 | gamtos struktūros ir molekulinė biologija

Struktūrinis ir biocheminis krlb srities apibūdinimas insulino receptoriaus substrate-2 | gamtos struktūros ir molekulinė biologija

Anonim

Anotacija

Insulino receptorių 1 ir 2 substratai (IRS1 ir -2) yra svarbiausi adapterio baltymai, tarpininkaujant metaboliniam ir mitogeniniam insulino ir į insuliną panašaus augimo faktoriaus 1 poveikiui. Šie baltymai susideda iš plekstrino homologinės srities, fosfotiroziną jungiančio domeno ir C- galinis regionas, kuriame yra daugybė tirozino, serino ir treonino fosforilinimo vietų. Ankstesni mielių dviejų hibridų tyrimai nustatė regioną, būdingą tik IRS2, vadinamą kinazės reguliavimo kilpą rišančiu (KRLB) regionu, kuris sąveikauja su insulino receptoriaus tirozinkinazės domenu. Čia pateikiame insulino receptoriaus kinazės kristalinę struktūrą komplekse su 15 liekanų peptidu iš KRLB srities. Struktūroje šis IRS2 segmentas yra sujungtas kinazės aktyviojoje vietoje su Tyr628, esančiu fosforilinti. Nors Tyr628 buvo fosforilintas insulino receptorių, jo katalizinė apykaita buvo silpna, todėl kinazė slopino. Mūsų tyrimai rodo, kad KRLB regionas riboja IRS2 tirozino fosforilinimą.

Pagrindinis

Hormonas insulinas suaktyvina tarpląstelinius signalizacijos kelius, kurie reguliuoja ląstelių augimą ir metabolizmą. Poliotropinį insulino poveikį skatina jo ląstelių paviršiaus receptoriai - α 2 β 2 receptorių tirozino kinazė. Po insulino prisijungimo ir receptorių autofosforilinimo (aktyvacijos), keli baltymai yra įdarbinami dviejuose citoplazminiuose (kinazę turinčiuose) receptoriaus domenuose signalo sklaidai pasroviui. Tarp jų yra IRS baltymai, tai yra šeima nuo keturių iki šešių adapterių baltymų, turinčių N-galo plecktrino homologijos (PH) domeną ir fosfotiroziną rišantį (PTB) domeną, po kurio eina daugiau kaip 900 liekanų, turinčių kelias tirozino vietas., serino ir treonino fosforilinimas 1 .

Pelių genų delecijos tyrimai rodo, kad Irs1 ir Irs2 yra būtini normaliam organizmo vystymuisi ir gliukozės homeostazei 1 . Nors IRS1 ir IRS2 turi daug bendrų bruožų baltymų lygyje ir sutampančius audinių raiškos modelius, Irs1 ir Irs2 nokauto pelių fenotipai yra skirtingi. Irs1 - / - pelės yra 40% mažesnės nei laukinio tipo pakratai ir rodo periferinių audinių atsparumą insulinui. 2, 3 . Irs2 - / - pelės yra tik šiek tiek mažesnės (10%) nei laukinio tipo pelės, tačiau yra atsparios insulinui ir išsivysto II tipo cukrinis diabetas, nes netenkama kasos beta ląstelių funkcijos 4 .

Daugelis tirozino fosforilinimo vietų, esančių IRS1 ir IRS2 C-terminale, yra YΦXM motyve (kur Φ žymi hidrofobinę liekaną (dažnai metioniną), o X žymi bet kurią liekaną), kuri fosforilėjant insulino receptoriui arba insulinui. kaip ir 1 augimo faktoriaus (IGF1) receptorius, naudojamas kaip fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) 5 Src homologijos 2 (SH2) domenų įdarbinimo vieta. Kad gliukozė įsisavintų ląstelėse, reaguojančiose į ląstelę, reikia aktyvinti PI3K, veikiant tirozinu fosforilintą IRS1 arba IRS2. Kitos tirozino fosforilinimo vietos IRS1 ir IRS2 įdarbina baltymą-adapterį GRB2 ir tirozino fosfatazės SHP2 (nuoroda 1). Be tirozino fosforilinimo vietų, IRS1 ir IRS2 yra daugybė serino ir treonino fosforilinimo vietų, kurios paprastai neigiamai reguliuoja tirozino fosforilinimą, vykstant normaliam neigiamam ryšiui arba esant patologiniam atsparumui insulinui 7 .

Tandeminiai PH-PTB domenai, esantys šių adapterių baltymų N-galo srityje, funkcionuoja įdarbindami IRS1 ir IRS2 į insulino receptorius fosforilinti. PTB domenas prisijungia prie fosforilinto Tyr972 (pTyr972) ir gretimų liekanų (NPXY motyvas) insulino receptoriaus juxtamembraninėje srityje 8, 9 . PH sritis taip pat svarbi, norint įdarbinti IRS1 ir IRS2 prie 10, 11 receptorių, nors nėra tiksliai nustatyta, ar tai įvyksta jungiantis prie fosfoinositido. Ankstesni mielių dviejų hibridų (Y2H) tyrimai pateikė įrodymų apie antrą (be PTB domeno) insulino receptorių sąveikaujantį regioną IRS2, kuris buvo pavadintas kinazės reguliuojančiosios kilpos rišamosios (KRLB) srities 12, 13 arba receptorių surišimo srities 2 (RBD2) 14 . Šis IRS2 regionas sąveikauja su insulino receptoriaus tirozinkinazės domenu (IRK), o sąveika priklauso nuo kinazės aktyvacijos kilpos fosforilinimo 12, 14 . KRLB regionas buvo apytiksliai apibrėžtas iš Y2H tyrimų, apimant 591–733 liekanas (nuorodos 12, 14), pradedant maždaug 300 liekanų C-galo į PTB domeną (1 pav.) Ir turinčios tris tirozino liekanas YΦXM motyve. Be to, šiame regione yra didelis glicino, serino ir prolino liekanų santykis, o antrinės struktūros prognozės rodo, kad jis nestruktūrizuotas. Nors atitinkamas IRS1 regionas pasižymi dideliu sekų panašumu, įskaitant tris YΦXM vietas, jis stabiliai nesąveikauja su IRK 13, 14 . Mutagenezės tyrimais KRLB regione buvo nustatyti du ne YΦXM tirozino likučiai - Tyr624 ir Tyr628 (pelių numeracija), kurie yra būtini norint prisijungti prie IRK 13 .

Image

Domenų organizacija ir tirozino fosforilinimo vietų vieta nubrėžta tiesine skalė (pelių numeracija, 1 321 likučiai). Tirozino fosforilinimo vietos, kurios yra PI3K įdarbinimo vietos (YΦXM motyvas), yra pažymėtos * ženklu, GRB2 vieta (Y911) yra pažymėta †, o dvi SHP2 vietos (Y1242 ir Y1303) yra pažymėtos §. KRLB sritis, nustatyta Y2H tyrimais (591–733 liekanos), parodyta punktyrinėmis linijomis, o 15 liekanų sritis, kuri buvo susikristalizavusi su IRK, parodyta pilkoje dėžutėje, sekos išskleistos žemiau, o Tyr628 pabrauktos. Taip pat parodyta atitinkama 15 liekanų seka IRS1 (pelė).

Visas dydis

Šiame tyrime apibūdinome tikslų susiejimo būdą tarp IRS2 KRLB srities ir IRK, atlikdami IRK (žmogaus) kokristalizaciją su 15 liekanų KRLB peptidu (pele), apimančiu Tyr624 ir Tyr628. Biocheminiai eksperimentai in vitro ir ląstelėse parodė, kad KRLB sritis yra neigiamas reguliavimo elementas kontroliuojant tirozino fosforilinimo mastą IRS2. Šis reguliavimo elementas greičiausiai yra pagrindinė savybė, išskirianti IRS2 funkciją iš IRS1.

Rezultatai

KRLB Y628, sujungto su IRK, kristalinė struktūra

Mes susikristalizavome 15 liekanų peptidą, reprezentuojantį IRS2 liekanas 620–634 (AYNPYPEDY 628 GDIEIG), kuris bus vadinamas KRLB Y628, IRK fosforilinus ant aktyvacijos kilpos (pTyr1158, pTyr1162 ir pTyr1163). Monoklinikos kristalai asimetriniame vienete turėjo vieną KRLB Y628 –IRK kompleksą. Kristalų struktūrą (patobulintą 1, 65 Å skiriamąja geba) nustatėme molekuliniu pakeitimu, kaip paieškos modelį naudodami fosforilinto IRK kristalų struktūrą komplekse su YΦXM peptido substratu (IRS1 Tyr727) ir AMP-PNP 15 .

Komplekso kristalinėje struktūroje ši IRS2 sritis yra sujungta per priekinį kinazės domeno paviršių su Tyr628, esančiu aktyviojoje vietoje (2a pav.). Šios struktūros superpozicija su Tyr727 – IRK struktūra parodė, kad C tirpalo substratas tirozinas, KRLB Y628 ir Tyr727 peptidas jungiasi panašiai (2b pav.). Tačiau tirozino substrato N-galas KRLB Y628 daro daug daugiau sąveikos su kinazės domenu (2b pav., C). Struktūroje užsakoma keturiolika KRLB Y628 liekanų, tuo tarpu užsakomi tik šeši Tyr727 peptido likučiai (panaši skiriamoji geba: 1, 65 Å (KRLB Y628 ), palyginti su 1, 9 Å (Tyr727)). Bendras KRLB Y628 –IRK komplekso palaidoto paviršiaus plotas yra 2 121 Å 2, palyginti su 1 033 Å 2 tirpalui Tyr727 – IRK ir 1 256 Å 2 IGF1 receptoriaus kinazės (IGF1RK) komplekso su YΦXM peptidu (IRS1 Tyr896) 16 . Paskutiniame komplekse užsakomi dar du peptido C-galiniai likučiai.

Image

a ) IRK rodomas kaip molekulinis paviršius, kurio N skilties spalva yra tamsiai pilka, o C skilties yra šviesiai pilkos spalvos. Aktyvavimo kilpa (likučiai 1150–1171) yra žalios spalvos, o katalizinė kilpa (likučiai 1130–1137) - oranžinės spalvos. „IRS2 KRLB Y628 “ parodytas lazdele. Galutinis 2 F o - F c elektronų tankis (1, 65 Å skiriamoji geba, 1σ kontūras) parodytas mėlyname tinklelyje. N ir C peptido galai yra pažymėti. ( b ) KRLB Y628 ir IRS1 Tyr727 IRK surišimo režimų palyginimas (YΦXM motyvas). Ant KRLB Y628 –IRK struktūros (C-skilties liekanos 1080–1283) yra „Tyr727“ peptido substratas (rožinis) ir AMP-PNP (ANP) iš trišalės IRK struktūros (PDB kodas 1IR3) 15 . Sieros atomai yra žali, o fosforo atomai yra juodi. IRK molekulinis paviršius yra pusiau skaidrus. c ) KRLB Y628 jungties ir fosforilintos IRK aktyvacijos kilpos konformacijos palyginimas. Ant KRLB Y628 –IRK struktūros dedamos (katalizinės kilpos liekanos 1130–1137) yra fosforilintos aktyvacijos kilpos (tamsiai žalia) iš autoinhibuotos IRK struktūros (PBP kodas 1IRK) 17 . Pasirinktos vandenilio rišamosios sąveikos tarp KRLB Y628 ir IRK liekanų yra parodytos punktyrinėmis linijomis. ( d ) KRLB Y628, KRLB Y628 + ATP ir KRLB pY628, sujungtų su IRK, palyginimas . IRK molekulinis paviršius (pusiau permatomas) yra iš KRLB Y628 –IRK struktūros. KRLB Y628 iš struktūros su ATP yra spalvotos žalsvai melsvos spalvos, o KRLB pY628 - spalvotos rožės. Vaizdai buvo paruošti naudojant PyMOL (//pymol.org).

Visas dydis

Tyr628 (P liekana) KRLB Y628 –IRK struktūroje sukuria vandenilio ryšius su IRK kataliziniais likučiais Asp1132 ir Arg1136, tačiau yra pasislinkę 1, 5 Å (Cα padėtis), palyginti su YΦXM peptido Tyr727 (2b, c pav.). Šį poslinkį steriliškai įgalina glicinas (Gly629) peptido P + 1 padėtyje, netipiškas P + 1 liekana insulino receptoriaus substrate. Išsišakojusi „Ile631“ (P + 3) šoninė grandinė kompensuoja hidrofobinės šoninės grandinės trūkumą P + 1 padėtyje, perklijuodama P + 1 ir P + 3 rišamąsias kišenes kinazės peptidus rišančiame griovelyje (2b pav. ). Kaip ir jungiant YΦXM-peptidus, tarp peptido liekanų C-galo į Tyr628 ir IRK aktyvavimo kilpą yra sudarytos magistralinės vandenilio jungtys (penkios).

KRLB Y628 –IRK struktūros superpozicija su fosforilinto, autoinhibicijaus IRK 17 struktūra atskleidė ryškų KRLB Y628 prisijungimo prie IRK būdo ir IRK aktyvavimo kilpos stabilizacijos neaktyvios būklės panašumą (2c pav.). KRLB Y628 Tyr624 (liekana P – 4), Asp627 (P – 1) ir Tyr628 (P) imituoja sąveiką su atitinkamai Tyr1158, Asp1161 ir Tyr1162 kinazės domenu fosforilintoje aktyvacijos kilpoje. Aktyviojoje vietoje Tyr628 (KRLB Y628 ) ir Tyr1162 (aktyvacijos kilpa) yra supermaišomi, tai yra, nėra poslinkio. Akivaizdu, kad Tyr628 poslinkis, palyginti su Tyr727, YΦXM peptido atžvilgiu, kurį palengvina Gly629 (P + 1), yra reikalingas liekanoms N-gale iki Tyr628 (ty Tyr624 ir Asp627), kad jos galėtų sąveikauti su kinazės domenu. Stebimos Tyr624 ir Tyr628 sąveikos su IRK paaiškina ankstesnius šių dviejų tirozinų mutagenezės rezultatus 13 .

Šoninė Tyr621 (P – 7) grandinė yra ATP rišamojoje kišenėje, kur adenino bazė prisijungtų, vandeniliu (kaip ir adeninas) prie Met1079 stuburo azoto jungtyje tarp N skilties ir C skilties (pav. 2c, d). Šis pastebėjimas kelia galimybę, kad Tyr621 gali konkuruoti su ATP dėl prisijungimo prie kinazės. Norėdami iš dalies tai išspręsti, mes mirkėme magnio-ATP į KRLB Y628 –IRK kristalus ir nustatėme trišakio komplekso struktūrą 2, 1 Å skiriamąja geba. Iš tikrųjų šioje struktūroje, kurioje yra ATP, Tyr621 yra išstumtas iš ATP rišamosios kišenės ir dabar yra netvarkingas kartu su gretimais likučiais (Ala620 ir Asn622; 2d pav.). ATP jungiasi plyšyje tarp dviejų kinazės skilčių, turinčių vieną Mg 2+ joną, koordinuojamą ATP α ir β-fosfato grupių, taip pat kinazės likučių Asp1150 (aktyvacijos kilpa) ir Asn1137 (katalizinė kilpa).

KRLB srities surišimas su IRK ir IGF1RK

Remiantis kristalų struktūra, daugybė likučių, esančių ties Tyr628 KRLB srityje, prisideda prie sąveikos su IRK. Norėdami nustatyti jų atitinkamą indėlį, mes įvedėme taškines mutacijas viso ilgio KRLB srityje (liekanos 591–733), kaip apibrėžta Y2H tyrimuose 12, 14, ir išmatuojome KRLB mutantų sugebėjimą prisijungti prie IRK per in vitro žemyn eksperimentai. Didelis IRK jungties praradimas įvyko dėl daugelio KRLB liekanų mutacijos su alaninu (arba fenilalaninu): Tyr621 (P – 7), Tyr624 (P – 4), Asp627 (P – 1), Tyr628 (P), Gly629 (P +). 1), Ile631 (P + 3) ir Ile633 (P + 5) (3 pav.). Ištrauktas G629A rezultatas patvirtino, kad Tyr628 1, 5 Å poslinkis YΦXM peptido Tyr727 atžvilgiu (2b pav.), Kurį suteikia Gly629, yra esminis KRLB rišimo būdo bruožas. Praradęs IRK surišimą Y621A, patvirtina hipotezę, kad šis tirozinas gali paveikti Tyr628 fosforilinimo kinetiką, konkuruodamas su ATP dėl prisijungimo prie kinazės srities (2d pav.).

Image

a ) Jo pažymėtas KRLB baltymas, laukinio tipo baltymas (WT) arba įvairūs mutantai, įskaitant delecijos mutantą (liekanos 602–637), buvo naudojami atliekant eksperimentus su fosforilintu IRK. Susitraukimai (aukščiau) buvo išspręsti SDS-PAGE metodu, o imunoblotai buvo atlikti naudojant anti-fosfotirozino antikūną (PY99). IRK ir KRLB baltymų lygis buvo parodytas atitinkamai naudojant PY99 imunoblotus (viduryje) ir Coomassie Blue dažymą (apačioje). ( b ) Jo pažymėtas KRLB baltymas, laukinio tipo baltymas arba Y628F mutantas (KRLB (YF)) buvo naudojami fosforilintam IRK arba fosforilintam IGF1RK paimti. Susitraukimai buvo išspręsti SDS-PAGE metodu, o imunoblotai buvo atlikti naudojant PY99 (aukščiau). Vidurinis taškas rodo fosforilinto IRK ir IGF1RK lygius mėginiuose. KRLB baltymų lygis parodytas apatiniame gelyje, dažytu Coomassie Blue.

Visas dydis

Mes taip pat išbandėme sutrumpintą KRLB regiono versiją, liekanos 602–637, atliekant išskleidžiamąjį eksperimentą kartu su viso ilgio KRLB regionu. Šiai trumpesnei formai trūksta trijų YΦXM fosforilinimo vietų, tačiau ji apima 15 liekanų, stebėtų kokristalų struktūroje. Ištraukiamasis eksperimentas parodė, kad trumpoji KRLB srities forma maždaug taip pat jungiasi su IRK kaip ir ilgesnioji forma (3a pav.), Rodanti, kad IRK sąveikaujančios srities apimtis tikriausiai apsiriboja likučiais, esančiais šalia Tyr628, žiūrint į kristalų struktūrą.

Sekos tapatumas tarp IRK ir IGF1RK yra 82%. Todėl mes ištyrėme KRLB regiono gebėjimą sąveikauti su IGF1RK. Pastebimas rezultatas buvo tas, kad KRLB sritis žymiai geriau jungiasi su IRK nei su IGF1RK (3b pav.), Nepaisant to, kad visi IRK likučiai, tiesiogiai sąveikaujantys su KRLB peptidu, yra išsaugoti IGF1RK.

KRLB peptido jungimosi prie fosforilinto IRK afinitetą matavome izoterminiu titravimo kalorimetrija ir nustatėme 1, 3 μM disociacijos konstantą ( K d ) (papildomas 1 pav. Internete), kuri yra žymiai mažesnė (didesnis afinitetas) nei nustatyta K d. atlikus YSXM peptido substrato (IRS1 Tyr939) viskozimetrinę analizę: 0, 2 mM ( K m = 0, 05 mM) 18 . Kaip kitas KRLB surišimo stiprumo palyginimas, išmatuotas IRS1 PTB domeno jungimosi su fosforilintu peptidu, reprezentuojančio insulino receptoriaus juxtamembrano sritį (pTyr972), Kd buvo 87 μM 19 (tai yra santykinai aukšta PTB domeno ir fosfopeptido sąveika). .

KRLB regiono fosforilinimas pagal IRK

Ankstesni biocheminiai tyrimai su 11 liekanų KRLB peptidu (623–633 liekanomis), kuriuose yra Tyr624 ir Tyr628, parodė, kad šis peptidas nebuvo 13 insulino receptoriaus substratas. Atsižvelgdami į KRLB Y628 –IRK kristalų struktūrą, kurioje Tyr628 yra surišti aktyviojoje vietoje, mes peržiūrėjome šią problemą, atlikdami in vitro kinazės reakciją su glutationo S-transferazės pažymėtu IRK (GST-IRK) kaip fermentu ir kaip substratas KRLB sritis (591–733 liekanos). Tirozino fosforilinimo vietų žemėlapiams naudoti buvo naudojami MALDI-Q-TOF ir LC-ESI-MS / MS Q-TOF. Duomenys (neparodyti) atskleidė, kad Tyr628 iš tiesų buvo fosforilintas, taip pat YΦXM vietos Tyr594, Tyr649 ir ​​Tyr671. Tyrimų Tyr621 ar Tyr624 fosforilinimo įrodymų nebuvo.

Aukščiau aprašytas in vitro fosforilinimo eksperimentas buvo atliekamas esant aukštai ATP koncentracijai (5 mM), tuo tarpu ankstesniame tyrime 13 11 liekanų peptidas nebuvo fosforilintas esant 30 μM ATP. Išmatuojome K6 (ATP) Tyr628 IRK fosforilinimui 15 liekanų KRLB peptide (KRLB Y628 ), naudodami MALDI-TOF (papildomas 2 pav. Internete) ir nustatėme 1, 7 mM K m (ATP), kuris iš esmės yra didesnis nei 40 μM K m (ATP) tipinėje YΦXM vietoje 18 . Taikant tą patį MS metodą, mes išmatuojome 80 μM K m (ATP) IRS1 Tyr983 (YΦXM) (duomenys nepateikti).

Norėdami nustatyti, ar Tyr621 prisideda prie didelio K m (ATP), kaip rodo kristalų struktūra (2d pav.), Mes palyginome KRLB Y621A mutanto IRK fosforilinimą su laukinio tipo fosforilinimu esant įvairioms ATP koncentracijoms. Laukinio tipo KRLB regiono fosforilinimas, kai ATP koncentracija yra ∼ 1, 6 mM, atsižvelgiant į kiekybinį KRL (ATP) 15-liekanų KRLB peptido nustatymą, tuo tarpu Y621A mutanto fosforilinimas, kurio plokštelė artima 0, 4 mM ATP ( 4 pav.). Taigi didelis K m (ATP) Tyr628 fosforilinimas, bent iš dalies, yra sąlygotas Tyr621.

Image

Laukinio tipo KRLB baltymas arba Y621A mutantas buvo fosforilintas IRK nurodytoje ATP koncentracijoje. Reakcijos komponentai buvo išspręsti SDS-PAGE metodu, o imunoblotai buvo atlikti naudojant anti-fosfotirozino antikūną PY99. IRK lygis parodytas dviejuose viduriniuose anti-pTyr blotuose, o KRLB baltymo lygis parodytas žemiau dviejuose Coomassie mėlynos spalvos dažytuose geluose. Y628F mutanto bandymas tokiomis tyrimo sąlygomis rodo, kad tik Tyr628 (ne bet kuri iš trijų YΦXM vietų) yra pastebimai fosforilinamas dėl laukinio tipo baltymų ir Y621A (duomenys nepateikti).

Visas dydis

IRK substrato fosforilinimo slopinimas KRLB Y628

Iš pradžių bandėme išmatuoti pastovios būklės KRLB 15 liekanų peptido kinetines vertes, naudodamiesi nenutrūkstamu spektrofotometriniu tyrimu, kuriame fosforilinimo greitis apskaičiuojamas pagal ADP gamybos greitį 20 . Tipiško YΦXM peptido substrato pridėjimas prie IRK, esant magnio-ATP, padidina ADP susidarymo greitį (kaip substrato fosforilinimo pasekmę), viršijantį bazinį IRK ATPazės aktyvumo greitį (5 pav., 3 ir 4 reakcijos, palyginti su 2 reakcija). ). Naudodami KRLB Y628 kaip substratą (esant 2 mM ATP), mes nustebome pastebėję, kad ADP susidarymo greitis smarkiai sumažėjo, gerokai žemiau bazinės ATPazės normos (5 pav., 5 ir 6 reakcijos, palyginti su 2 reakcija). Tai leido manyti, kad peptidas jungiasi su IRK ir nėra fosforilinamas, ty veikia kaip pseudo substrato inhibitorius, arba yra fosforilinamas, bet turi mažą apykaitą (bet kuriuo atveju slopinant bazinę ATPazės normą). MALDI-TOF, atliktas po reagavimo mėginio, parodė, kad KRLB peptidas fosforilinamas Tyr628, laikantis pastarojo paaiškinimo.

Image

a ) Peptidų KRLB Y628 (Y628) ir KRLB pY628 (pY628) poveikis IRS1 Tyr983 (Y983) IRK fosforilinimui, naudojant nenutrūkstamą spektrofotometrinį tyrimą. Neigiamas linijinės kreivės dalies nuolydis (pritaikymo intervalas 20–120 s) yra proporcingas ADP susidarymo greičiui, atsižvelgiant į IRK substrato fosforilinimą ir IRK ATPazės aktyvumą (2 reakcija, be peptido). Aiškumo dėlei pateikiami pirminiai reakcijų pogrupio pirminiai duomenys, kurie visi pateikti b punkte . ( b ) Santykinės ADP gamybos normos, gautos iš duomenų a, nubraižomos, normalizuojamos iki bazinės IRK ATPazės greičio (2 reakcija). 1 reakcijoje yra 2 mM ATP ir 20 mM MgCl2, bet nėra IRK ar peptido substrato (nerodyta a punkte). 2 reakcija taip pat apima 200 nM fosforilinto IRK. 3–10 reakcijos taip pat apima nurodytas peptido koncentracijas. Klaidų juostos reiškia sd už reakcijas, atliktas trimis egzemplioriais. Histogramos juostos nuspalvinamos atsižvelgiant į reakcijos turinį: pavyzdžiui, šviesiai pilka, IRK + Y983 (100 μM arba 200 μM); juoda, IRK + Y983 (100 μM) + pY628 (50 μM, 100 μM arba 200 μM).

Visas dydis

Kadangi KRLB peptidas jungiasi su santykinai dideliu afinitetu (palyginti su YΦXM peptidu) ir, kaip substratas, yra blogai apverčiamas, mes išbandėme KRLB Y628 ir Tyr628 fosforilintos peptido formos (KRLB pY628 ) gebėjimą slopinti IRK. substratų fosforilinimas. KRLB Y628 pridėjimas prie reakcijos, kurioje yra IRK ir IRS1 Tyr983 peptidas (YΦXM), sumažino ADP susidarymo greitį priklausomai nuo dozės (5b pav., 7–9 reakcijos, palyginti su 3 reakcija), parodydamas, kad KRLB peptidas gali slopinti YΦXM peptido fosforilinimas. Fosforilintas KRLB peptidas taip pat slopino IRS1 Tyr983 fosforilinimą (5b pav., 10–12 reakcijos, palyginti su 3 reakcija), tačiau ne taip efektyviai, kaip galima tikėtis (produkto afinitetas yra mažesnis nei reaktyviniojo). KRLB Y628, naudodamas kitokį testą, GST-IRK, ​​kaip ir KRLB pY628, slopino kinazėje mirusio IRK aktyvacijos ciklo fosforilinimą, kaip ir KRLB pY628, tuo tarpu IRS1 Tyr983 peptidas neturėjo slopinamojo poveikio (papildomas 3 pav. Internete). Kai tirpalo kinazės domenas iš Src buvo pakeistas IRK, KRLB peptidas veikė kaip normalus tirozino substratas (tai yra, padidėjo ADP gamybos greitis; duomenys nepateikti), parodydami, kad lėta KRLB substrato apykaita yra būdinga IRK .

Kadangi fosforiluotas KRLB peptidas galėjo slopinti substrato fosforilinimą, mes KDRB pY628 susikristalizavome IRK ir gavome komplekso struktūrą 1, 95 Å skiriamąja geba. KRLB pY628 jungiasi su IRK panašiai kaip KRLB Y628 (2d pav.), Įskaitant Tyr621 išdėstymą ATP rišimo plyšyje. PTyr628 fosfato grupė yra Asp1132 ir Asn1137 jungimosi vandeniliu katalitinėje kilpoje atstumu. Tai, kad KRLB pY628 gali būti kristalizuota su IRK, yra dar vienas požymis, kad fosforilinto peptido afinitetas IRK yra pastebimas; ankstesnės pastangos fosforilinto YΦXM peptido koekristalizavimui su IRK pasirodė nesėkmingos.

IRS2 fosforilinimas ląstelėje pagal insulino receptorius

Norėdami suprasti funkcinį KRLB regiono vaidmenį IRS2 signalizavimui, mes perkėlėme viso ilgio IRS2, arba laukinio tipo, arba KRLB (dvigubą) mutantą Y624F-Y628F, į Kinijos žiurkėno kiaušidžių ląsteles, stabiliai transfekuotas insulino receptoriumi (CHO- IR). Transfekuotos ląstelės buvo stimuliuojamos įvairiomis insulino dozėmis, o IRS2 fosforilinimo lygis buvo stebimas imunodeficituojant anti-IRS2 imunoprecipikatus. Praradęs KRLB prisijungimą prie insulino receptorių (per mutaciją Tyr624 ir Tyr628), iš esmės padidino IRS2 insulino stimuliuojamą tirozino fosforilinimą (6a pav.).

Image

a ) Lizatai iš insulino stimuliuojamų (arba nestimuliuotų) CHO-IR ląstelių, perkrautų laukinio tipo IRS2 (WT) arba dvigubu mutantu Y624F, Y628F, buvo imuninės sistemos nusodinti anti-IRS2 antikūnais, o imuniniai nusėdimai išsiskyrė SDS-PAGE . Imunoblotai buvo atlikti naudojant anti-fosfotirozino antikūnus (4G10; anti-pTyr, aukščiau) arba anti-IRS2 antikūnus (žemiau), kad būtų parodyta maždaug vienoda IRS2 koncentracija imuniniuose produktuose. ( b ) Lizatai iš insulino stimuliuojamų (arba nestimuliuotų) CHO-IR ląstelių, perpiltų laukinio tipo IRS2 arba Y628F, buvo imuniniu būdu nusodinti anti-IRS2 antikūnais, o imuniniai nusėdimai išsiskyrė SDS-PAGE. Imunoblotai buvo atlikti naudojant fosfospecifinius antikūnus prieš žmogaus IRS1 pTyr612 (pelės IRS2 pTyr649; PI3K vieta), pTyr896 iš žmogaus IRS1 (pTyr911 pelės IRS2; GRB2 vieta) arba anti-IRS2 antikūną, kad IRS2 būtų maždaug lygus. imuniniai nusėdimai. ( c ) Insulino stimuliuojamų (arba nestimuliuotų) CHO-IR ląstelių, perkeltų laukinio tipo IRS2 arba KRLB mutantais Y628F arba Y621A, lizatai buvo imuniniu būdu nusodinti anti-IRS2 antikūnu, o imuniniai nusėdimai išsiskyrė SDS-PAGE. Imunoblotai buvo atlikti naudojant anti-fosfotyrosino antikūną (PY99) arba anti-IRS2 antikūną, kad būtų parodyta maždaug vienoda IRS2 koncentracija imuniniuose produktuose. Pirmieji trys anti-IRS2 blot juostos (žemiau) yra identiški juostoms, esančioms anti-IRS2 blot b punkte, nes mėginiai yra gauti iš to paties eksperimento. Nestimuliuoti Y628F ir Y621A fosforilinimo lygiai nedaug skiriasi nuo laukinio tipo IRS (duomenys nepateikti).

Visas dydis

Nors bendras laukinio tipo IRS2 tirozino fosforilinimo lygis yra žemesnis nei KRLB mutanto, įsivaizduojama, kad per trans- fosforilinimą kitu kinazės domenu receptoriaus dimere, tam tikros tirozino vietos IRS2 gali būti fosforilintos į labiau dėl KRLB surišimo kinazės aktyviojoje vietoje. Norėdami suprasti, ar toks palengvinimas gali įvykti, mes panaudojome du IRS1 fosfotirozinui specifinius antikūnus, kurie kryžmiškai reaguoja su atitinkamomis IRS2 vietomis. Vienas iš antikūnų atpažįsta PI3K surišimo vietą IRS1 (pTyr612) ir IRS2 (pY649; 21 liekana C-galo į Tyr628), o kitas atpažįsta GRB2 surišimo vietą IRS1 (pTyr896) ir IRS2 (pY911; 283 liekanas C- terminalas iki Tyr628). Taip pat buvo tiriamas trečiasis fosfotirozinui specifinis antikūnas, nukreiptas į SHP2 surišimo vietą IRS1 (pTyr1179), tačiau nenustatyta, kad jis kryžmiškai reaguoja su IRS2 (pTyr1242) (duomenys nepateikti). Laukinio tipo IRS2 insulino stimuliuojami fosforilinimo lygiai tiek pTyr649, tiek pTyr911 buvo mažesni nei KRLB vieno mutanto Y628F (6b pav.).

Norėdami nustatyti, ar Tyr621 turi reikšmės IRS2 fosforilinimo ląstelėse moduliavimui, kaip tai daroma in vitro , nustatydami aukštą K m (ATP) ∼ 1, 7 mM Tyr628 fosforilinimui (4 pav.), Palyginome IRS2 Y621A insulino stimuliuojamą fosforilinimą. su laukinio tipo ir Y628F. Tyr621 mutacija paskatino IRS2 fosforilėjimo padidėjimą iki tokio paties lygio kaip Y628F (6c pav.). Šie duomenys rodo, kad ląstelių ATP lygiu Tyr621 ir ATP konkurencija dėl prisijungimo prie IRK (2b pav.) Yra svarbi slopinant IRS2 fosforilinimąsi KRLB srityje.

Diskusija

KRLB susiejimo su IRK mechanizmas ir specifiškumas

KRLB liekanų 620–634 kristalų struktūra komplekse su fosforilintu (aktyvuotu) IRK atskleidė, kad ši IRS2 sritis jungiasi aktyvioje kinazės domeno vietoje su Tyr628, paruoštu fosforilinti (2a pav.). Jungdamasis prie IRK, Tyr628 sritis imituoja YΦXM peptido substrato C-galo jungtį prie Tyr628 (2b pav.) Ir nefosforilinto IRK aktyvavimo kilpos N-galo jungtį prie Tyr628 (2c pav.). Paskutinis pastebėjimas paaiškina, kodėl KRLB jungimasis priklauso nuo ankstesnio aktyvavimo kontūro autofosforilinimo ir kartu vykstančio struktūrinio pertvarkymo 15 . Pažymėtina, kad natūraliai pasireiškusi mutacija insulino receptoriaus (R1152Q) aktyvacijos kilpoje, nustatyta keliems II tipo cukriniu diabetu sergantiems pacientams, sąlygoja nuo insulino nepriklausomą KRLB srities jungimąsi su mutanto 21 receptoriumi. Šis argininas nėra gerai išdėstytas nefosforilinto IRK 17 struktūroje, tačiau darome prielaidą, kad R1152Q mutacija iš dalies destabilizuoja aktyvacijos kilpos autoinhibiciją, palengvindama KRLB srities jungimąsi kinazės aktyviojoje vietoje.

Nors ankstesniuose Y2H tyrimuose 12, 14 KRLB sritis buvo apytiksliai apibrėžta kaip 591–733 liekanos, mūsų kristalografiniai ir in vitro tyrimai (2 ir 3 pav.) Rodo, kad šis antrasis insulino receptorių sąveikaujantis regionas IRS2 yra apribota maždaug 15 liekanų, apimančių Tyr628 (liekanos 620–634). Šiame regione (1 pav.) IRS1 trūksta ne tik Tyr628 (Gly582) ekvivalento, bet ir Asp627 (P – 1), Gly629 (P + 1) ir Ile633 (P + 5) ekvivalentų, kurie visi yra: svarbus didelio afiniteto prisijungimui prie IRK (3a pav.). Tai paaiškina, kodėl norint pakeisti KRLB funkcionalumą IRS1 nepakako vien GRS582 pakeitimo tirozinu IRS1 (nuoroda 13). Duomenų bazės modelio paieška parodė, kad IRS2 greičiausiai yra vienintelis baltymas su KRLB tipo seka, jungiantis prie insulino receptorių. Ar yra ribotos struktūrinės informacijos apie peptido substrato ir kinazės sąveiką, ypač dėl sekos, turinčios panašių funkcijų kitoms baltymų tirozino kinazėms, sunku numatyti dėl ribotos struktūros informacijos, ypač dėl tirozino substrato N-galo liekanų.

Nepaisant aukšto sekos išsaugojimo (82% tapatumo) insulino ir IGF1 receptorių kinazės domenuose, KRLB sritis parodė stiprią IRK jungimosi pirmenybę (3b pav.), Kas atitinka ankstesnius stebėjimus 22 . Molekuliniai determinantai, kuriais grindžiama ši diskriminacija, nėra aiškūs, nes IRK liekanos, susijusios su KRLB peptido surišimu, yra išsaugotos IGF1RK. Manoma, kad šis diferencinis surišimas gali kilti dėl dviejų aminorūgščių skirtumų 16 kinazių vyrių srityje, nes KRLB peptido N galas kristalų struktūroje yra artimas vyrio sričiai. Kaip alternatyva, abiejose kinazėse (pavyzdžiui, peptidą rišančiame griovelyje) gali būti subtilių aktyviosios būsenos konformacijos skirtumų, kurie atspindi afinitetų skirtumą.

Funkcinis KRLB regiono vaidmuo IRS2

IRS1 ir IRS2 savo N-galo regionuose turi tandeminius PH-PTB domenus, kurių funkcija yra pritraukti šiuos baltymus į aktyvuoto insulino ir IGF receptorius, kad būtų galima efektyviai fosforilinti daugybinius tirozino likučius plačiajame C-galiniame regione 1 . Atradus antrąjį insulino receptorių sąveikaujantį regioną (KRLB) IRS2 (nuoroda 12, 14), buvo pagrįsta manyti, kad šis regionas veiks sustiprindamas receptorių sujungimą ir, galbūt, fosforilindamas IRS2, palyginti su IRS1, kurio tokio nėra. įrišimo modalumas.

KRLB likučio Tyr628 prisijungimas prie IRK aktyviosios vietos buvo netikėtas, nes nebuvo žinoma, kad šis tirozinas yra insulino receptoriaus fosforilinimo vieta. Taigi šis antrasis IRS2 sujungimo mechanizmas apima aktyviąją kinazės vietą, o ne distalinę vietą, kaip dažniausiai naudojamas substrato įdarbinimui tirozinkinazės receptoriaus receptoriais (pavyzdžiui, PTB domeno jungimosi prie juxtamembraninės srities). Originalūs Y2H tyrimai 12, 13, 14 pateikė įrodymų, kad sąveika tarp 15 liekanų KRLB sekos ir IRK nėra tipiška substrato ir kinazės sąveika. Įprasti tirozino insulino receptorių (YΦXM) ir kitų tirozino kinazių substratai trumpalaikėje sąveikoje aktyvioje vietoje - jie fosforilinami ir atpalaiduojami - ir regionai, kuriuose yra tokių vietų, Y2H eksperimente nėra teigiami (pavyzdžiui, atitinkamas IRS1 regionas) (nuoroda 13, 23)). Mūsų biocheminiai tyrimai in vitro parodė, kad Tyr628 fosforilinimo Km (ATP) yra žymiai didesnis nei YΦXM substrato (∼ 1, 7 mM, palyginti su ∼ 40 μM; papildomas 2 pav.), Kad Tyr628 sritis jungiasi su santykinai dideliu afinitetu IRK. ( Kd = 1, 3 μM; papildomas 1 pav.) Ir kad fosforilintas peptidas išlaiko pastebimą surišimo afinitetą (5b pav. Ir papildomas 3 pav.). Šios savybės lemia mažą substrato apyvartą, o tai tikriausiai paaiškina teigiamą Y2H rezultatą KRLB regione.

Kokias KRLB jungimosi funkcines pasekmes turi insulino receptoriaus aktyvioji vieta? Mūsų duomenys CHO-IR ląstelėse rodo, kad KRLB sritis slopina IRS2 tirozino fosforilinimą. Kai Tyr624 ir Tyr628 buvo mutavę į fenilalaniną, prisijungimas prie aktyvios kinazės vietos žymiai sumažėjo (3a pav.), Tačiau IRS2 tirozino fosforilinimo lygis žymiai padidėjo (6a pav.). Mechanizmas, kuriuo KRLB sritis slopina IRS2 tirozino fosforilinimą insulino receptoriais, akivaizdžiai apima kinazės aktyviosios vietos užėmimą ir užblokavimą tiek prieš, tiek po fosforilinimo. Pažymėtina, kad IRS2 yra maždaug 330 liekanų (numatoma, kad jos nebus struktūrizuotos) tarp PTB domeno C-galo ir Tyr628. Atrodo, kad šis rišiklis yra pakankamai ilgas, kad PTB domenas ir KRLB sritis galėtų prisijungti prie insulino receptorių cis , tame pačiame citoplazminiame domene arba trans , sujungdami abu citoplazminius domenus. Kadangi KRLB sąlygotas IRS2 fosforilinimo slopinimas buvo didesnis nei du kartus (6a pav.), Tyr628 prijungimas prie vienos kinazės domeno aktyviosios vietos gali apriboti kitų IRS2 tirozinų galimybes pasiekti kitos kinazės aktyviąją vietą. domenas (nors tarp Tyr628 ir daugiau C-galo fosforilinimo vietų yra daugybė įsiterpusių liekanų). KRLB sritis taip pat galėtų slopinti kitų insulino receptorių substratų fosforilinimąsi, pavyzdžiui, adapterio baltymo APS, kuris gali būti įdarbinamas į receptorius kartu su IRS2; APS jungiasi su fosforilinta aktyvacijos kilpa, o ne su jukstamembranu 24 .

Kai KRLB sritis buvo per daug išreikšta skeleto raumenų ląstelių linijoje, stabiliai išreiškiančioje insulino receptorius, endogeninio IRS2 įdarbinimas insulino receptoriumi sumažėjo, kaip ir IRS2 tirozino fosforilinimas 25 . Per daug ekspresuotas KRLB regionas konkuruoja su endogenine IRS2 dėl prisijungimo prie insulino receptorių. Pažymėtina, kad endogeninio IRS1 įdarbinimas insulino receptoriumi padidėjo KRLB viršijančiose ląstelėse25. Akivaizdu, kad dėl sumažėjusios endogeninio IRS2 PTB srities konkurencijos prisijungti prie juxtamembraninės vietos receptoriuje. Tai, kad IRS1 fosforilinimas taip pat padidėjo, rodo, kad padidėjęs IRS1 įdarbinimas receptoriuose nusveria KRLB tarpininkaujamą kinazės domeno slopinimą.

3T3-L1 adipocitų proteomikos tyrimas parodė, kad IRS2 (endogeninio) Tyr628 fosforilinimo lygis padidėja 6, 4 karto po 5 minučių insulino stimuliacijos 26 . Šiame tyrime buvo aptiktos dar šešios IRS2 tirozino fosforilinimo vietos, kai insulino stimuliuojamas fosforilinimo lygis padidėjo nuo 1, 2 iki 4, 9 karto. Palyginimui, keturios tirozino fosforilinimo vietos, aptiktos IRS1, parodė didesnį insulino stimuliuojamą padidėjimą - nuo 5, 6 iki 29 kartų. Nors šie duomenys nėra išsamūs - trūksta informacijos apie daugelį IRS1 ir IRS2 svetainių, jie vis dėlto atitinka hipotezę, kad KRLB regionas veikia slopindamas IRS2 tirozino fosforilinimą.

Galimas fiziologinis IRS2 tirozino fosforilinimo slopinimas, kurį KRLB sąlygoja insulino receptorius, gali būti diferencinio IRS2 signalo slenksčio nustatymas. IRS2 yra devynios YΦXM svetainės, į kurias potencialiai galėtų būti verbuojamas PI3K, tačiau yra tik viena GRB2 svetainė (panašiai kaip IRS1) (1 pav.). Tikėtina, kad sumažėjęs tirozino fosforilinimo lygis IRS2 vis tiek gali būti pakankamas, kad PI3K būtų aktyvuotas metaboliniam signalizavimui, bet nepakankamas Raso suaktyvinimui (per GRB2) mitogeniniam signalizavimui. Šis mechanizmas leistų IRS2 selektyviai susieti su metaboliniais signalizacijos keliais, kai stimuliuojama insulinas, tačiau suaktyvintų mitogeninius signalizacijos kelius, stimuliuojant IGF1. IRS1 galėtų prisijungti tiek prie metabolizmo, tiek dėl mitogeninių kelių pasroviui po insulino ir IGF1. Irs1 (augimo ir metabolinių fenotipų) ir Irs2 (metabolinių ir IGF1 sąlygotų beta ląstelių augimo fenotipų) išnaikinimo tyrimai iš esmės atitinka šį scenarijų 2, 3 . Galiausiai, milimoliarinis Tyr628 fosforilinimo K m (ATP) ir tvirtesnis Tyr628, palyginti su pTyr628, surišimas kinazės aktyviojoje vietoje galėtų būti naudojamas kaip reguliavimo mechanizmas, kai IRS2 insulino stimuliuojamos tirozino fosforilinimo laipsnis priklauso nuo ląstelės. ATP lygiai. Norint galutinai nustatyti IRS2 KRLB srities fiziologinį vaidmenį, prireiks tolesnių pelių Irs1 ir Irs2 bei iš jų išgautų ląstelių linijų Irs1 ir Irs2 tyrimų.

Metodai

Baltymų išraiška ir gryninimas.

Žmogaus IRK (liekanos 978–1283) buvo ekspresuojamas bakulovirusu užkrėstose Sf9 vabzdžių ląstelėse, išvalytas ir autofosforilintas in vitro, kaip aprašyta anksčiau 15 . GST pažymėta (N-galinė) IRK versija buvo sukurta subklonuojant žmogaus insulino receptorių 956–1283 likučius į bakuloviruso pernešimo vektorių pAcG2T (BD Biosciences). Sulietas baltymas buvo ekspresuotas bakulovirusu užkrėstose Sf9 ląstelėse ir išgrynintas naudojant GSTrap kolonėlę (GE Healthcare) ir Superdex-75 (GE Healthcare) dydžio išskyrimo kolonėlę.

6 × His pažymėto (C-galo) ir GST pažymėto (N-galo) KRLB konstrukcija buvo gauta subklonuojant cDNR, koduojančius pelės IRS2 likučius 591–733, į vektorių pET41 (Novagen). Taip pat buvo sukurtas trumpesnis konstruktas, koduojantis 602–637 liekanas. Vietos nukreipta mutagenezė buvo atlikta naudojant „QuikChange“ sistemą (Stratagene). Visos konstrukcijos buvo transformuotos į E. coli kamieną Rosetta (DE3) (Novagen). Bakterijos buvo auginamos LB, papildytame 50 mg l- 1 kanamicino ir 35 mg l- 1 chloramfenikolio 37 ° C temperatūroje iki OD600 0, 7. Ekspresija buvo indukuota naudojant 1 mM IPTG 30 ° C temperatūroje 5 valandas. Norėdami gauti išsamesnės informacijos, žiūrėkite papildomus metodus internete.

Kristalizacija.

KRLB Y628 (AYNPYPEDYGDIEIG) ir KRLB pY628 (AYNPYPEDpYGDIEIG) buvo susintetinti (GeneMed Synthesis) ir ištirpinti 200 mM Tris-HCl (pH 7, 5). Tris-fosforilintas IRK (pTyr1158 / 1162/1163) ir KRLB Y628 arba KRLB pY628 buvo sumaišyti santykiu 1: 3. KRLB Y628 –IRK ir KRLB pY628 –IRK kristalai buvo gauti 4 ° C temperatūroje garų difuzijos būdu pakabinamuose lašeliuose, kuriuose yra 1 μl baltymo tirpalo (7 mg ml –1 IRK, 1 mg ml – 1 KRLB Y628 arba KRLB pY628, 20–20) . mM Tris-HCl (pH 7, 5), 180 mM NaCl ir 1 mM DTT) ir 1 μl rezervuaro buferio (28% (m / t) PEG 8000 ir 0, 1 M HEPES (pH 7, 5)). Kristalų kokybei pagerinti buvo naudojamas mikrosegimas. KRLB Y628 –IRK – ATP kristalai buvo gauti mirkant KRLB Y628 –IRK kristalus per naktį kriostirpiklyje (28% (m / t) PEG 8000, 0, 1 M HEPES (pH 7, 5) ir 20% (m / t) etilenglikolio). turinčios 10 mM ATP ir 20 mM MgCl2. KRLB Y628 –IRK arba KRLB pY628 –IRK kristalai buvo trumpai perkelti į tą patį kriosolventą ir greitai užšaldyti skystame azote. Visi trijų kompleksų kristalai priklauso monoklininės erdvės grupei P2 1, turintys vieną kompleksą asimetriniame vienete ir turintys 53% tirpiklio. Duomenų rinkimo ir patikslinimo statistika yra apibendrinta 1 lentelėje. Žr. Papildomus internetinius duomenų rinkimo, struktūros nustatymo ir modelio sudarymo metodus.

Pilno dydžio lentelė

In vitro eksperimentai.

150 μg išgryninto laukinio tipo arba mutantinio KRLB baltymo (591–733 liekanos, His-pažymėti) buvo sumaišyti su 15 μg tris-fosforilinto IRK arba tris-fosforilinto IGF1RK 300 μl rišančiame buferyje (150 mM NaCl ir 50 mM Tris- HCl (pH 7, 5). 20 μl were taken from each pull-down mixture for SDS-PAGE to show approximately equal amounts of IRK or IGF1RK, and immunoblotting was carried out with anti-phosphotyrosine antibody PY99 (Santa Cruz). 100 μl of a His-Select bead slurry (Sigma-Aldrich) were equilibrated with the binding buffer, and the pull-down mixtures were incubated with the beads for 1 h at 4 °C. The beads were then loaded into a spin filter column (Pierce), spun in a microcentrifuge at 100 g for 1 min to remove any unbound protein, and washed three times with binding buffer plus 20 mM imidazole in the spin filter column. The washing buffer was removed by spinning at 100 g . Bound proteins were eluted with elution buffer (150 mM NaCl, 500 mM imidazole and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)), boiled with Laemmli sample buffer and resolved by SDS-PAGE (14%). Gels were either stained with Coomassie Brilliant Blue to monitor the amount of KRLB protein, or transferred to a nitrocellulose membrane (Millipore) for immunoblotting with PY99 to detect the amount of IRK or IGF1RK in the pull-down.

In vitro phosphorylation of the KRLB region.

The GST tag of wild-type or Y621A KRLB (residues 591–733) was removed by tobacco etch virus (TEV) protease. 1 μM of purified KRLB or Y621A was incubated with 30 nM of tris-phosphorylated IRK in the reaction buffer (50 mM MgCl 2, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl and 50 μM Na 3 VO 4 ) containing various concentrations of ATP at 25 °C for 2 min. Reactions were stopped by adding Laemmli sample buffer and boiling. The samples were separated by SDS-PAGE (14%) and transferred to a nitrocellulose membrane. The phosphorylation levels of KRLB and Y621 were detected by immunoblotting with anti-phosphotyrosine antibody PY99.

In vitro inhibition of IRK phosphorylation.

Continuous spectrophotometric assays were carried out as previously described 27, using a SpectraMax 190 microplate reader (Molecular Devices). Along with the coupling reagents 27, reactions contained 200 nM tris-phosphorylated IRK, 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM ATP, 20 mM MgCl 2 and various concentrations of IRS1 Tyr983 peptide (KKSRGDYMTMQIG), KRLB Y628 and KRLB pY628 . Rates of ATP consumption were calculated between 20 s and 120 s.

Cell transfection, immunoprecipitation and immunoblotting.

Mouse Irs2 cDNA was cloned into the pcDNA3 vector. Point mutations in Irs2 were generated by using QuikChange II XL (Stratagene) and confirmed by DNA sequencing. CHO-IR cells were cultured in α-MEM containing 10% FBS plus gentamicin. The cells were seeded in 10-cm tissue culture dishes and transfected at 60% confluence. 60 μl of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 24 μg of Irs2 DNA or empty vector were used for transfection at 37 °C for 6 h. After 24 h, the cells were serum-starved for 3 h in Ham's F-12 medium (Invitrogen). Cells were stimulated with insulin at the desired dosage for 10 min. Each dish was washed twice with ice-cold PBS.

Cells were lysed by adding 1 ml of ice-cold lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 135 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na 3 VO 4, 10 mM NaF and protease inhibitors cocktail (Roche)) and incubating on ice for 30 min. Cell lysates were clarified by centrifugation. For IRS2 immunoprecipitation, the clarified lysates were incubated overnight with anti-IRS2 antibody (M-19, Santa Cruz) at 4 °C. Protein G–agarose (Roche) was used to precipitate the antibody and bound proteins by incubating for 2 h at 4 °C. Protein G–agarose was washed extensively with lysis buffer and solubilized in SDS-PAGE sample buffer. The bound proteins or cell lysates were resolved by SDS-PAGE (8.8%) gels, transferred to nitrocellulose membrane, and detected by immunoblotting with anti-IRS2 antibody, anti-phosphotyrosine antibody (PY99), anti-IRS1, 2 pTyr612 (Santa Cruz), anti-IRS1 pTyr896 (Millipore) and anti-IRS1 pTyr1179 (Santa Cruz). For the dose-dependent insulin-stimulation experiments (Fig. 6a), FuGENE 6 transfection reagent (Roche) was used for transfection, and IRS2 immunoprecipitation was carried out by overnight incubation with anti-IRS2 antibody, followed by 1 h incubation with Protein G–Sepharose (Amersham) and washing three times with lysis buffer.

Prisijungimo kodai.

Atomic coordinates and structure factors have been deposited in the Protein Data Bank with accession codes as follows: KRLB Y628 –IRK, 3BU3; KRLB Y628 –IRK+ATP, 3BU5; KRLB pY628 –IRK, 3BU6.

Note: Supplementary information is available on the Nature Structural & Molecular Biology website .

Prisijungimai

Pirminės prieigos

Baltymų duomenų bankas

  • 3BU3
  • 3BU3 3d view
  • 3BU5
  • 3BU5 3d view
  • 3BU6
  • 3BU6 3d view

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas tekstas ir figūros

    Supplementary Figures 1–3 and Supplementary Methods