Tiriant baltymų dinamikos vaidmenį sn2 fermento reakcijoje naudojant laisvosios energijos paviršius ir tirpiklio koordinates | gamtos chemija

Tiriant baltymų dinamikos vaidmenį sn2 fermento reakcijoje naudojant laisvosios energijos paviršius ir tirpiklio koordinates | gamtos chemija

Anonim

Dalykai

  • Biofizinė chemija
  • Fermentai
  • Teorinė chemija

Anotacija

Yra žinoma, kad konformacijos pokyčiai gali paskatinti fermentą per jo katalizinį ciklą, kad, pavyzdžiui, būtų galima surišti substratą arba atpalaiduoti produktą. Tačiau baltymų judesių įtaka cheminiam žingsniui yra ginčytina problema. Vienas pasiūlymas yra tas, kad paprastų pusiausvyros svyravimų, įtrauktų į pereinamosios būsenos teoriją, nepakanka, kad būtų galima įvertinti fermentų katalizinį poveikį, ir kad baltymų judesiai turėtų būti vertinami dinamiškai. Čia siūlome naudoti laisvosios energijos paviršius, gautus kaip cheminės ir aplinkos koordinačių funkcijas, kaip veiksmingą būdą išsiaiškinti baltymų struktūros ir judesių vaidmenį reakcijos metu. Mes parodome, kad baltymo struktūra suteikia tinkamą aplinką reakcijos eigai, nors norint pasiekti visišką katalizinį efektą, reikalingas tam tikras lankstumas. Tačiau šie judesiai nepateikia reikšmingų dinaminių greičio konstantos pataisų ir gali būti apibūdinami kaip pusiausvyros svyravimai.

Pagrindinis

Viena intriguojančių fermentų savybių yra jų lankstumas. Pabrėžta, kad fermentai, norėdami veikti, turi būti pakankamai stabilūs, kad išlaikytų savo trimatę (3D) struktūrą, tačiau pakankamai lankstūs, kad baltymas galėtų evoliucionuoti skirtingose ​​formose, svarbiose kiekviename viso katalizinio proceso etape 1, 2 . Pavyzdžiui, daugeliu atvejų žinoma, kad konformaciniai pokyčiai yra substrato surišimo ir produkto išsiskyrimo sąlyga. Tiesą sakant, daugiamatis laisvosios energijos paviršius, atitinkantis fermentinį procesą, yra labai tvirtas ir jame yra keli minimumai, išryškėjantys išilgai daugelio baltymo 3 formavimo koordinačių. Perėjimus tarp skirtingų makromolekulės konformacinių substratų ir jų populiacijos pasiskirstymą reguliuoja judesiai, vykstantys įvairiais laikotarpiais - nuo milisekundžių iki femtosekundžių 2, 4 .

Tačiau baltymų lankstumo poveikis cheminės pakopos greičio konstantai tebėra ilgalaikės diskusijos mokslinėje literatūroje tema 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 . Net jei aktyvioji vieta yra suprojektuota katalizuoti reakciją ir pritaikyti pereinamosios būsenos (TS) 16 krūvio pasiskirstymą, vis tiek reikia tam tikrų baltymų judesių, kad būtų galima pereiti iš reaktyviosios būsenos (RS) į TS 1, 5, 15, 17 . Kitaip tariant, norint pasiekti TS 15, reikalingas tam tikras baltymų pertvarkymas. Šis pertvarkymas vaidins panašų vaidmenį kaip tirpiklio poliarizacija pagal Marcuso teoriją, skirtą elektronų perdavimui 18 tirpale, nors fermentinėje katalizėje 12, 19 galėjo dalyvauti daug lėtesni konformaciniai komponentai. Apskritai koordinatė, apibūdinanti sistemos virsmą iš reagentų į produktus, yra kolektyvinė koordinatė, apimanti ne tik tirpiojo / substrato, bet ir aplinkos (tirpiklio ir (arba) fermento) laisvės laipsnius.

Teoriniai cheminių reakcijų aprašymai fermentinėje aplinkoje dažniausiai grindžiami skiriamosios reakcijos koordinatės, paprastai apibrėžtos pagal substrato ar tirpiojo paviršiaus koordinates (ty kai kurios valentinės koordinatės, susijusios su suskaidomomis ir (arba) formuojamomis jungtimis), pasirinkimu. Šiame aprašyme kai kurie baltymų judesiai gali būti susieti su sistemos eiga išilgai reakcijos koordinatės. Pavyzdžiui, koreliuoti baltymų judesiai skatina tunelių susidarymą hidrido perdavimo reakcijose 20, 21, o kompresiniai vietiniai judesiai aktyviojoje vietoje palengvina artėjimą tarp donoro ir akceptoriaus atomų pernešimo reakcijose 11, 22 . Taigi baltymų judesių dalyvavimas reakcijos eigoje yra gerai žinomas faktas, kuriuo remiamasi naudojant skirtingą terminiją: baltymo pertvarkymas 15, sujungti judesiai 9 arba skatinti virpesius 8, 22 . Labiau ginčytinas klausimas yra tai, kaip reikia apibūdinti šiuos judesius ir ar dabartinės teorinės struktūros yra pakankamos, ar ne, kad paaiškintų fermentinių reakcijų greitį 14, 22 .

Kaip pagrindinis metodas apibūdinti cheminių reakcijų reakcijos greitį, pereinamosios būsenos teorijoje (TST) pateikiamos fermentinių reakcijų greičio analizės priemonės 23 . Pagrindinė TST prielaida yra ta, kad pasirinkta reakcijos koordinatė ( ζ ) gali būti atskirta nuo likusių sistemos koordinačių taip, kad vidutinis dinaminių trajektorijų, kurios išsiskiria iš reagentų į produktus, elgesys gali būti parodytas kaip pusiausvyros srautas per dalijamasis paviršius. Tokiu atveju greičio konstanta gali būti susieta tiesiog su laisvosios energijos skirtumu tarp TS ir reagentų (Δ G ). Vienamolekuliam procesui

Image

kur k B, h ir R yra Boltzmann, Planck ir dujų konstantos, o T yra absoliuti temperatūra. Šis požiūris reiškia, kad likusius laisvės laipsnius galima laikyti pusiausvyroje esant bet kuriai reakcijos koordinatės vertei, apibūdinamai kaip Boltzmanno skirstinys. Jei reakcijos koordinatė yra apibrėžta tik pagal substrato laisvumo laipsnius (arba „tirpios koordinatės“), laikoma, kad baltymų laisvės laipsniai (arba „tirpiklio koordinatė“) yra pusiausvyros būsenos visuose proceso etapuose. reakcijos kelias. Akivaizdu, kad baltymų dinamika apima 2, 4, 10 intervalų hierarchiją ir tik tie judesiai, kurie yra daug greitesni už reakcijos koordinatę, gali būti laikomi pusiausvyroje. Taigi, šis požiūris nutrūksta judesiams, sujungtiems su nugalėta koordinate ir kurie vyksta panašiais ar lėtesniais laikotarpiais. Tokiu atveju gali reikėti aiškaus fermento vibracinės dinamikos gydymo. Tai siūloma kai kuriais atvejais, apimant tiek greitus virpesių judesius 22, tiek lėtus konformacijos pokyčius 19 . Tačiau kitos analizės pabrėžia, kad baltymų judesių vaidmuo gali būti tinkamai įtrauktas į cheminės stadijos aprašą, nes pusiausvyros svyravimai yra aiškūs, todėl aiškus dinamiškas baltymų judesių apdorojimas nėra būtinas fermentinės katalizės modeliavimui. 5, 9, 13, 14, 24 .

TST siūlo patogią struktūrą baltymų judesių statistiniam poveikiui įtraukti. Pralaidumo koeficientą ( κ ) galima apskaičiuoti pagal nuo laiko priklausomus modeliavimus ir įtraukti į TST išmatuotą greičio konstantą 25 :

Image

Kadangi perdavimo koeficientas gauna reikšmes, mažesnes už vienovę, pusiausvyros metodas (1 lygtis) suteikia viršutinę greičio konstantos ribą. Nėra vienareikšmio būdo atskirti fermento poveikį aktyvacijos laisvajai energijai (arba pusiausvyrai) nuo perdavimo perdavimo koeficiento (ne pusiausvyros efekto), nes abu veiksniai priklauso nuo to, kaip pasirenkama reakcijos koordinatė 23 . Jei tai apibrėžiama remiantis tik substrato koordinatėmis, nukrypimai nuo baltymų judesių pusiausvyros pasiskirstymo turėtų atsispindėti perdavimo koeficiente. Darant prielaidą, kad šie efektai yra svarbūs šalia dinaminės kliūties, perdavimo koeficientas gali būti įvertintas pagal trinties jėgą, veikiančią reakcijos koordinatę TS 26, arba retų įvykių modeliavimu, skaičiuojančiu pakartojimų skaičių per dalijamąją dalį. 27 paviršius. Iki šiol fermentinių reakcijų modeliavimas rodo, kad, norint pagrįstai pasirinkti reakcijos koordinatę, perdavimo koeficientas tik nedaug skiriasi nuo vienybės. Paprastai tipinės vertės svyruoja nuo 0, 5 iki 0, 9 (nuorodos 23, 24, 28), o tai atspindi nedidelį baltymų judesių dalyvavimą sistemos praėjime per barjero viršų.

Patogus būdas kiekybiškai išanalizuoti baltymų judesių vaidmenį cheminės transformacijos metu yra projektuoti fermentinės reakcijos daugiamatį laisvosios energijos paviršių (FES) 2D modelyje, gautą kaip tirpios koordinatės ir tirpiklio koordinatės funkcija. 29, 30 . Tokia FES leidžia kiekybiškai įvertinti tirpios ir tirpiklio judesių trukmę ir susiejimą reakcijos kelyje. Be to, perdavimo koeficientas gali būti išvestas iš skirtumų tarp skiriamojo paviršiaus, apibrėžto FES, gauto pagal pusiausvyros tirpalo aproksimaciją, ir skirtumo tarp gaunamo 2D FES (kuris atspindi jungtį tarp tirpios ir tirpiklio koordinatės).

Prototipinis pavyzdys, kuriame tirpiklio poveikis gali vaidinti svarbų vaidmenį, yra S N2 reakcija. Vandeninio tirpalo tyrimai jau nustatė, kad reakcija vyksta daug keičiant vandens molekules aplink nukleofilą ir išeinančią grupę 30, 31 . Taigi, aplinkos sukurtas elektrostatinio potencialo pasikeitimas nukleofilui ir išeinančiai grupei yra gera koordinatė, kuria galima sekti aplinkos evoliuciją vykstant 32 reakcijos procesui, ir atstumus, susijusius su ryšiais, kuriuos reikia nutraukti ir formuoti pateikti tinkamą ryžtingą koordinatę. Šiame darbe mes ištyrėme S N2 nukleofilinę reakciją tarp dichloretano ir Asp124 DhlA, haloalkano dehalogenazės iš Xanthobacter autotrophicus (1 pav.) 33, 34, fermentinę reakciją, teoriškai išanalizuotą keliose grupėse 35, 36, 37, 38 . Mes taip pat modeliavome priešingą S N2 reakciją vandeniniame tirpale, kuriame kaip nukleofilas naudojama acetato molekulė. Fermentinio ir tirpalo proceso palyginimas suteikia puikią galimybę išanalizuoti aplinkos struktūros, lankstumo ir dinamikos įtaką pagrindinei cheminių reakcijų klasei.

Image

QM posistemis vaizduojamas atomais, pažymėtais mėlyna spalva.

Visas dydis

Rezultatai

PM3 / MM FES, atitinkantys nukleofilinį išpuolį vandeniniame tirpale ir aktyviojoje DhlA vietoje, atsekti kaip tirpios ( ξ ) ir tirpiklio ( -ų ) koordinatės, yra pateikti atitinkamai 2a, b pav. Tirpioji koordinatė ( ξ = d (CCl) - d (CO)) kinta nuo neigiamos iki teigiamos vertės, vykstant reakcijai. Tirpiklio koordinatė gaunama iš elektrostatinio potencialo, kurį sukuria aplinka išeinančioje grupėje ir nukleofilyje ( s = V Cl - V O ; žr. Metodus), ir gaunama iš neigiamų verčių RS (kur nukleofilo atomas, turintis neigiamą krūvį). stabilizuota elektrostatinės sąveikos su aplinka) iki teigiamos vertės produkto būsenoje (kai elektrostatinis potencialas užima didesnes teigiamas vertes išeinančioje grupėje, kuri dabar yra neigiamai įkrauta). Šis paveikslas taip pat rodo ištisines FES linijas kaip minimalius laisvosios energijos kelius (MFEP), gautus iš laisvosios energijos gradiento. Laisvosios energijos keliai, gauti naudojant tirpalo koordinatę ir darant prielaidą, kad tirpiklio koordinatė subalansuota kiekvienoje buvusios vertės vietoje (pusiausvyros laisvosios energijos keliai (EFEPs)), taip pat parodyti 2 pav. (Brūkšniuotos linijos).

Image

a, b, FES reakcijai vandeniniame tirpale ( a ) ir DhlA ( b ) aktyviojoje vietoje. A ir b dalims išskiriama koordinatė yra antisimetriška jungtį ribojančių ir formuojančių atstumų kombinacija ( ξ = d (ClC) - d (OC)); tirpiklio koordinatė yra antisimetriškas elektrostatinio potencialo, kurį sukuria aplinka išeinančioje grupėje, ir nukleofilinio deguonies ( s = V Cl - V O ) derinys. Izoenergetinės laisvosios energijos linijos žymi 3 kcal mol −1 žingsnius. Ištisinės raudonos ir mėlynos linijos žymi mažiausią laisvosios energijos kelią FES, o brūkšniuotos linijos atitinka kelią, gautą darant prielaidą, kad pusiausvyra išsisprendžia išilgai solidaus koordinatės. Balta rodyklė žymi reakcijos kelią iš fermento Michaelio komplekso visiškai nelanksčioje baltymų aplinkoje.

Visas dydis

FES analizė

Laisvosios energijos skirtumai tarp balnelio taškų ir FES esančio reaktanto minimumo yra atitinkamai 27, 4 ir 37, 1 kcal mol- 1 katalizuojamiems ir nekatalizuotiems procesams. Aktyvacijos energija, išmatuota iš fermentinės reakcijos eksperimentinės greičio konstantos esant 298 K, yra 15, 3 kcal mol- 1 (nuoroda 34), o vandeniniam tirpalui apskaičiuoto proceso kliūtis yra 26 kcal mol- 1 (nuoroda 36) ( buvo pranešta apie 29, 9 kcal mol- 1 reikšmę reakcijai į tirpalą esant 373 K) 35, 39 . Mūsų teorinėse vertėse pastebėtas pervertinimas atsiranda naudojant PM3 Hamiltono 35, 37 . M06-2X pataisytos laisvosios energijos kliūtys (žr. Metodus) fermentiniams ir tirpale esantiems procesams yra atitinkamai 16, 5 ir 27, 4 kcal mol- 1, geriau kiekybiškai suderinant su eksperimentinėmis vertėmis. Bet kokiu atveju PM3 / MM skaičiavimai leidžia teisingai įvertinti katalizinį efektą, apibrėžtą kaip skirtumas tarp tirpale esančio ir fermentinių laisvosios energijos barjerų. PM3 / MM skirtumas yra 9, 7 kcal mol −1, gerai suderinus su skirtumu, gautu iš M06–2X verčių, 10, 9 kcal mol −1 ir iš eksperimentinių verčių, 10, 7 kcal mol −1 .

FES rodo pastebimus skirtumus tarp reakcijos tirpale ir fermente. RS baltymo struktūra sukuria kur kas tinkamesnę aplinką reakcijos eigai nei tirpalas. Tirpale RS yra tirpiklio koordinatės vertės maždaug –100 kcal mol –1 | e | −1, o fermentinis RS įvyksta maždaug esant –25 kcal mol –1 | e | −1 . Pastaroji tirpiklio koordinatės vertė yra daug artimesnė vertei, reikalingai TS pasiekti ( s ≈ –10 kcal mol –1 | e | −1 abiejose aplinkose). Michaelio komplekso baltymai jau yra organizuoti elektrostatiniu požiūriu palankiai reakcijai, tačiau vandeniniame tirpale aplinką iš esmės reikia pertvarkyti, kad reakcija būtų lengvesnė . 30, 31, 38 .

Nepaisant to, baltymų struktūra nesielgia kaip standus pastolis, kuriame vyksta reakcija. Reakcija būtų žymiai sunkesnė šaldytų baltymų aplinkoje, kurioje tirpiklio koordinatė nesikeičia nuo RS iki TS. Tiesi linija nuo fermento RS esant pastoviai tirpiklio koordinatės vertei rodo kietosios aplinkos kelią. Šis kelias (balta rodyklė 2b pav.) Rodo, kad KD3 / MM laisvosios energijos barjeras yra 31, 5 kcal mol −1, ∼ 4 kcal mol −1 didesnis už stebėtą lankstaus baltymo vertę. Greičio konstanta, atitinkanti hipotetinį standų baltymą, kambario temperatūroje būtų maždaug 10 kartų mažesnė nei tikrojo fermento. Tai reiškia, kad baltymų lankstumas vaidina svarbų vaidmenį katalizuojant ir norint pereiti nuo Michaelio komplekso iki TS reikia pertvarkyti aplinką, kad būtų maksimaliai sumažinta aktyvacijos energija.

Lankstumą galima išmatuoti naudojant jėgos konstantą, susietą su tirpiklio koordinatėmis. Jėgos konstantos, gautos pritaikius parabolinį laisvosios energijos pasikeitimą išilgai tirpiklio koordinatės tirpale ir DhlA, pateiktos 1 lentelėje. Fermento gaunama jėgos konstanta yra maždaug 4, 2 karto didesnė už tą, kuri gaunama tirpale. Baltymų struktūra yra standesnė nei vandens struktūros, o tai yra susiję su kovalentinių ryšių tinklo buvimu ankstesniuose. Tačiau, kaip minėta aukščiau, tirpiklio koordinatės pokyčiai, reikalingi pasiekti TS iš RS, fermente yra daug mažesni nei tirpale. Galutinis rezultatas yra tas, kad darbas su tirpiklio koordinatėmis, norint pasiekti TS, fermente yra žymiai mažesnis nei tirpale. Remiantis MFEP, nustatytu FES, laisvosios energijos skirtumas tarp TS ir RS gali būti parašytas maždaug

Image

kur aš žymi aplinką (fermentą arba vandens tirpalą). Pirmasis lygties (3) dešinės pusės paveikslas rodo darbą, kurį reikia atlikti tirpiklio koordinatėje, o antrasis - darbą, esantį tirpiosios koordinatės srityje. Tirpiklio koordinatę atitinkančios vertės yra atitinkamai apie 11 ir 3 kcal mol- 1 vandeniniame tirpale ir DhlA. Taigi laisvosios energijos sąnaudos, susijusios su fermento fermento tirpiklio koordinatės pasikeitimu, yra žymiai mažesnės nei tirpale, ir šis skirtumas sudaro 80% katalizinio efekto. Įdomu tai, kad fermente reakcijai laidžios aplinkos konfigūracijų pavyzdžių atrankos tikimybė yra daug didesnė nei tiriamosios koordinatės tinkamų verčių ( ξ ) mėginių ėmimo tikimybė. Darbas, susijęs su aplinkos pertvarkymu fermentiniame procese, sudaro tik 11% visos laisvosios energijos kliūties.

Pilno dydžio lentelė

Kitas svarbus analizuojamas aspektas yra laikas tarp tirpios ir tirpiklio judesių. Remiantis MFEP, gautais dviejose aplinkose, tirpiklio koordinatės pokytis vyksta prieš tirpiklio koordinatės pasikeitimą. Dinaminiu požiūriu tai reiškia, kad tirpiklio koordinatė yra lėtesnė už tirpiklio koordinatę. Didelis šių dviejų judesių trukmės skirtumas gali sukelti svarbų dinaminį poveikį dėl vėlavimo tarp jų. Apibūdindami aplinkos raidą laike, apskaičiavome charakteristinius dažnius, susijusius su judesiu išilgai tirpiklio koordinatės dviejose aplinkose, naudodamiesi jėgos konstantomis ir efektinėmis masėmis, išvestomis iš pusiausvyros principo. Šie dažniai pateikti 1 lentelėje. Kaip pastebėta, tiek jėgos konstanta, tiek efektinė masė, susijusi su tirpiklio koordinatėmis, yra didesni fermente nei tirpale. Abu efektai netenka galios, todėl dažnis, susijęs su judesiu išilgai tirpiklio koordinatės fermente (410 cm – 1 ), yra labai panašus į tirpale gautą vertę (480 cm – 1 ). Šios vertės iš esmės atitinka vandenilio jungčių donorų perorientavimą aplink nukleofilą ir išeinančią grupę, judesius, kurie atsiranda pikosekundėmis ar greičiau 38 . Taigi, dinaminiu požiūriu, reikšmingų aplinkos dalyvavimo skirtumų vykstant vandeniniam tirpalui ar DhlA, vykstant reakcijai, nėra. Anot MFEP, judesiai išilgai tirpiklio koordinatės, vandenilio jungčių suskaidymas į nukleofilą ir naujų susidarymas pasitraukiančiai grupei įvyksta prieš judesį išilgai solidaus koordinatės arba po jo, o su šiais judesiais susiję laiko grafikai yra labai panašūs. dvi žiniasklaidos priemonės. Įdomu tai, kad neradome jokių įrodymų, kad lėti baltymo konformaciniai judesiai paveikė cheminį žingsnį. Akivaizdu, kad šie judesiai gali egzistuoti, tačiau arba jie neturi pasekmių elektrostatinėms koordinatėms (taigi ir reakcijos energijai), arba jie neįvyksta artimoje Michaelio komplekso kaimynystėje laisvosios energijos peizaže.

Išanalizavę gautus rezultatus galime palyginti naudodamiesi tirpios ir tirpiklio koordinatėmis, su gautais darant prielaidą, kad pusiausvyra bus soliuota bet kurioje tirpios koordinatės vertėje. Tai yra įprastas derinimas, naudojamas analizuoti chemines reakcijas kondensuotoje aplinkoje. EFEP, taip pat parodyti 2 pav., Eina nuo reagento iki produkto minimumo per balno tašką. Kadangi laisvoji energija yra būsenos funkcija, 1D profiliai, atsekti ištirpusios koordinatės, suteikia beveik tas pačias aktyvacijos laisvas energijas, kaip ir 2D paviršiai, gauti kaip tirpiojo ir tirpiklio koordinatės (mažų skirtumų kilmė aptariama žemiau) ). Nepaisant to, kad laisvosios energijos skirtumai yra teisingi, pusiausvyros tirpinimo metodas negali tinkamai apibūdinti tirpios ir tirpiklio koordinatės laiko. Iš tikrųjų, kaip pastebėta 2 pav., Atliekant pusiausvyrą tirpalo koordinatė traukiasi išilgai TS ir staiga keičiasi tirpiklio koordinatė, tačiau DFEP, tiek tirpale, tiek fermente, tirpiklio judesiai vyksta prieš kinta išilgai solinės koordinatės. Bet kokiu atveju šis apribojimas neturi įtakos reakcijos greičio konstantos įvertinimui, nes tai daugiausia lemia laisvosios energijos skirtumas tarp TS ir RS.

Perdavimo koeficiento įvertinimas

Nors MFEP ir EFEP sutampa ties RS ir TS, aktyvacijos laisvosios energijos, įvertintos 2D (arba ne pusiausvyros) ir 1D (arba pusiausvyros) procedūromis, yra nedidelis skirtumas. Šis skirtumas kyla iš TS ansamblio, gauto kiekvieno apdorojimo metu, apibrėžimo. Kaip parodyta 3 pav., Dalijamasis paviršius 2D apraše turi balno tašką ir eina per keterus, kurie atskiria reagentą ir produkto slėnius. Apdorojant 1D, naudojama tik išskaidyta koordinatė, taigi skiriamasis paviršius apibrėžiamas tiesiog kaip ξ = ξ (3 pav. Pavaizduotas kaip punktyrinės linijos). Skirtumas atitinka dalijamojo paviršiaus sukimąsi keičiant TST 40 . Toliau išilgai pusiausvyros dalijamojo paviršiaus esantis TS yra siauresnis nei TS toliau išilgai pusiausvyros dalijamojo paviršiaus (žr. 3c pav.), Taigi dažniai, susiję su TS judėjimu išilgai buvusio dalijamojo paviršiaus ( ν s , ξ ), yra didesnės nei pastarosios ( ν ξ ). Tai gali būti paversta entropiniu skirtumu TS ansambliuose ir atitinkamai suaktyvinančiomis energijomis 29 :

Image

Image

a, Atskyrimo paviršiai reakcijai į tirpalą. Rodyklė rodo hipotetinę trajektoriją, kertančią pusiausvyrą skiriantį paviršių. b, Reakcijos paviršiaus dalijimas aktyviojoje DhlA vietoje. Kampas tarp pusiausvyros ir ne pusiausvyros plokštumos yra mažesnis nei kampas tirpale. c, pusiausvyros ir pusiausvyros nedalijančių paviršių projekcinių TS šulinių schematinis vaizdas su jiems būdingais dažniais ( ν ξ ir ν s , ξ ). A, b ir c ištisinės linijos atitinka skiriamąjį paviršių, apibrėžtą pagal FES, nubrėžtą pagal tirpiojo ir tirpiklio koordinates. Punktyrinės linijos atitinka padalijamąjį paviršių, gautą, kai manoma, kad tirpiklio koordinatė yra pusiausvyroje (pusiausvyros plokštuma tada apibrėžiama kaip ξ = ξ ).

Visas dydis

Iš savo FES apskaičiavome, kad dažnių santykis yra maždaug 1, 3 ir 1, 1; Naudodami šias vertes apskaičiavome, kad ΔΔ G esant 298 K yra maždaug 0, 2 kcal mol −1 ir 0, 1 kcal mol −1 tirpale ir fermente. Šie laisvosios energijos skirtumai yra gana maži, mažesni nei tipinio laisvosios energijos modeliavimo statistinis neapibrėžtumas, todėl ne pusiausvyros efektai labai mažai prisideda prie aktyvacijos laisvos energijos.

Akivaizdu, kad mažesnė aktyvacijos energija yra paverčiama didesnės spartos konstanta. Tada šis skirtumas turėtų būti kompensuotas atsižvelgiant į mažesnį nei vientisumo perdavimo koeficientą (žr. (2) lygtį). Šios vertės kilmė gali būti suprantama pagal dalijamuosius paviršius, gautus ne pusiausvyroje, ir pusiausvyros aprašymus. Padalijamasis paviršius, gautas apdorojant ne pusiausvyros būseną, yra apibrėžtas taip, kad bet kokia trajektorija, pasiekianti tą paviršių iš reaktyvinio paviršiaus, toliau eitų į produkto sritį, nes laisvoji energija nuolat mažėja ta kryptimi, todėl perdavimo koeficientas yra lygus vienetui. tas paviršius. Tačiau, naudojant pusiausvyros dalijamąjį paviršių, kai kurios trajektorijos, einančios iš reagentų į produktus, aplenkusios šį paviršių, suranda laisvosios energijos barjerą ir galėtų grįžti į reaktyvinio paviršiaus pusę (žr. 3a pav.). Tai reiškia, kad šiame aprašyme perdavimo koeficientas būtų mažesnis už vienetą. Akivaizdu, kad naudojant (2) lygtį, galutinis greičio konstantos, gautos iš pusiausvyros ir pusiausvyros metodų, apskaičiavimas būtų tas pats, jei perdavimo koeficientas būtų 29

Image

Naudojant aukščiau pateiktus laisvosios energijos skirtumus, reakcijos perdavimo koeficientas tirpale ir fermente, gautame naudojant solutinę koordinatę kaip skiriamąją reakcijos koordinatę, yra atitinkamai 0, 8 ir 0, 9. Akivaizdu, kad ši procedūra lemia labai neapdorotą perdavimo koeficiento vertinimą dėl statistinių klaidų, susijusių su laisvosiomis energijomis, ir dėl neapibrėžto visų laisvės laipsnių traktavimo. Tikslesnis įvertinimas rodo, kad šios reakcijos perdavimo koeficientai yra maždaug 0, 6 ir 0, 8 vandeniniame tirpale ir fermente, atitinkamai, 38 . Transmisijos koeficientai, įvertinti TS, priklauso nuo tirpiklio koordinatės dalyvavimo kliūties perėjimo renginyje, o tai yra gana maža šiai reakcijai. Tačiau reikia dar kartą pabrėžti, kad tai nereiškia, kad baltymai cheminės pakopos metu nepakito. Baltymų judesiai įvyksta pirmiausia ir palengvina judesį išilgai koordinatės koordinatės, tačiau esant TS, jie gali būti laikomi pusiausvyros pusėse. Kitaip tariant, nors reakcijose dalyvauja baltymų judesiai, sujungti su chemine transformacija, tikimybė, kad šie judesiai pritrauktų sistemą į TS, daugiausia nustatoma pagal aktyvacijos laisvą energiją 1, 5, 15 .

Diskusija

Aiškios tirpiklio koordinatės naudojimas gali būti naudinga strategija siekiant išskaidyti struktūros, lankstumo ir dinamikos vaidmenį katalizėje. Tirpalo ir fermento SES, gautų prototipinei S N2 reakcijai, palyginimas rodo, kad fermento katalizinis efektyvumas kyla dėl baltymo struktūros, sukuriančios tinkamą aplinką reakcijos eigai. Tačiau baltymai nėra visiškai standūs ir kai kurie judesiai padeda sumažinti laisvosios energijos barjerą. Šie judesiai, atsirandantys per pikosekundę ar greičiau, dinamiškai vyksta prieš tiriamos koordinatės pasikeitimą. Mes taip pat parodome, kad šie baltymų judesiai gali būti traktuojami kaip pusiausvyros svyravimai, kurių greičio konstanta daugiausia nustatoma pagal laisvosios energijos skirtumą tarp TS ir RS. Aktyvacijos laisvosios energijos, apskaičiuotos darant prielaidą, kad tirpiklio koordinatė yra pusiausvyroje su solveto koordinatė, yra tik šiek tiek neįvertintos, palyginti su energijomis, gautomis ne pusiausvyros aprašyme. Šiuos skirtumus galima paaiškinti įtraukiant perdavimo koeficientą į TST greičio konstantą.

Mes tikime, kad mūsų šios reakcijos analizė gali būti lengvai išplėsta į kitas fermentines sistemas, taigi sudarome tinkamą pagrindą kiekybinei diskusijai apie baltymų judesių vaidmenį katalizėje.

Metodai

Mes naudojome kvantinę mechaninę / molekulinę mechaniką (QM / MM) skaičiavimo schemą, kurioje dichloretanas ir liekanos Asp 124 šoninė grandinė aprašomi naudojant PM3 pusiau empirinį Hamiltono 41 . Likusi dalis fermento ir (arba) vandens molekulių sudaro MM posistemį, aprašytą naudojant visų atomų optimalų skysčio modeliavimo potencialą (OPLS) fermentui 42 ir lankstų TIP3P potencialą vandens molekulėms 43 . Lennardo ir Joneso QM / MM sąveikos parametrai taip pat paimti iš OPLS potencialo, išskyrus chloro atomus, kurie yra paimti iš Gao ir Xia 44 .

Sistemai vandeniniame tirpale mes įdėjome dichloretaną ir acetatą į iš anksto subalansuotą dėžę vandens molekulių, kurių kraštinė yra 55, 8 Å, ištrindami visas tas vandens molekules, kurių deguonies atomai yra <2, 8 Å, iš bet kokių tirpių fragmentų ne vandenilio atomų. Fermento-substrato sistemai rentgeno kristalų struktūros koordinatės buvo paimtos iš Baltymų duomenų banko (kodas 2DHC) 45 . Titruojamų likučių protonų būsena buvo nustatyta naudojant „PropKa“ programą 46 . Visa sistema buvo dedama į iš anksto subalansuotą kubinę dėžę vandens molekulių, kurių kraštinė 79, 5 Å. Baltymo krūviui neutralizuoti buvo įpilta 16 natrio jonų, kad tiek tirpale, tiek fermentinėje sistemoje bendras krūvis būtų −1. Pradinės TS koordinatės abiejose aplinkose yra paimtos iš ankstesnio mūsų darbo 37, 38 . Sistemos buvo dar labiau išbalansuotos naudojant 200 ps molekulinės dinamikos modeliavimą NVT ansamblyje esant etaloninei 298 K temperatūrai, naudojant Langevino integratorių, kurio laiko žingsnis buvo 1 fs, ir periodinėmis ribinėmis sąlygomis. Visų tipų sąveikai buvo taikomas ribinis spindulys, perjungtas nuo 12, 5 iki 15 Å.

Šiame darbe mes gavome FES, naudodamiesi dviem skirtingomis koordinatėmis: solidaus koordinatės ( ξ ) ir tirpiklio koordinatėmis. FES gali būti išreikšta kaip

Image

čia ρ ( x N ) yra tikimybės tankis ieškant sistemos esant konfigūracijai x N. Šiuo atveju solidi koordinatė ( ξ ) yra antisimetrinis išeinančio chlorido ir gaunamo deguonies atstumo iki anglies atomo derinys ( ξ = d (ClC) - d (OC)). Pasirinkta tirpiklio koordinatė buvo antisimetriška elektrostatinio potencialo, kurį sukuria aplinka išeinančio chloro atomo ir gaunamo deguonies atomo aplinka, elektrostatinio potencialo, kurį sukuria MM aplinka ant chloro atomo, derinys:

Image
kur sumos eina M aplinkos vietose su taškiniais užtaisais q j . Tai yra bendra koordinatė, apimanti visus MM atomus, turinčius elektrostatinę įtaką donoro ar akceptoriaus atomams.

FES, atitinkančios reakcijas vandeniniame tirpale, ir fermentas buvo gauti naudojant skėčio ėminį 47, paraboliniams apribojimams tirpioje medžiagoje ir tirpiklio koordinatėms:

Image

Molekulinė dinamika pirmiausia tiria labiausiai tikėtinas sistemos konfigūracijas aplink pamatines vertes ξ 0 ir s 0 . Abiejų koordinačių tikimybės pasiskirstymai buvo gauti naudojant svertinės histogramos analizės metodą (WHAM) 48 . Siekiant sutaupyti skaičiavimo išlaidas, modeliavimas buvo atliekamas su bet kokiu atšaldytu dichloro etano atomu, didesniu kaip 25 Å. FES tirpalui atsekti buvo panaudoti 5454 modeliavimo langai, sudaryti iš 5 ps pusiausvyros ir 50 ps produkcijos, o fermentui prireikė 3100 langų. Jėgos konstantos, naudojamos sistemai išlaikyti tirpiojo ir tirpiklio koordinačių atskaitos vertėse, buvo 2 500 kJ mol −1 Å −2 ir 0, 01 kJ −1 mol | e | 2, kuris gerai kontroliavo koordinates 32 .

Svarbu tai, kad Hamiltono PM3 / MM rezultatas yra sistemingai pervertintos energijos kliūtys, tačiau RS ir TS geometrija yra pakankamai gera, kad būtų galima pagrįstai įvertinti kinetinio izotopo poveikį 35 . Tuomet ištaisėme sisteminę aktyvinimo laisvųjų energijų paklaidą atlikdami vieno taško skaičiavimus aukštesniuose teoriniuose lygiuose. Tuo tikslu mes optimizavome dešimt TS struktūrų, pradėdami nuo skirtingų konfigūracijų, parinktų iš atitinkamo modeliavimo. Apskaičiavus vidines reakcijos koordinates, energijos barjeras buvo gautas PM3 / MM lygyje ir atliekant vieno taško skaičiavimus M06-2X / 6-311 + G (2df, 2p) / MM lygyje 49 . Pataisos energijos terminas buvo įvertintas kaip vidutinis skirtumas tarp pusiau empirinės ir M06-2X energijos barjerų.