Bradyrhizobium diazoefficiens plaukimo savybės yra išryškėjantis dviejų jos žiedinių sistemų bruožas | mokslinės ataskaitos

Bradyrhizobium diazoefficiens plaukimo savybės yra išryškėjantis dviejų jos žiedinių sistemų bruožas | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelinis judrumas
  • Šakniastiebių simbiozė
  • Dirvožemio mikrobiologija

Anotacija

Daugelis bakterijų rūšių žvynelius naudoja savaeigėms vandeninėms terpėms. Dirvožemyje, kuris yra sudėtinga ir struktūrizuota aplinka, vanduo randamas mikroskopiniais kanalais, kur klampumas ir vandens potencialas priklauso nuo dirvožemio tirpalo sudėties ir dirvožemio prisotinimo laipsnio. Todėl dirvožemio bakterijų judrumui gali būti taikomi specialūs reikalavimai. Svarbi dirvožemio bakterijų gentis yra Bradyrhizobium , rūšių, turinčių vieną žiedlapių sistemą, o kitos - su dviem skirtingais žiedlapių sistemomis. Tarp pastarųjų yra B. diazoefficiens , kurie savo subpolinius ir šoninius žandikaulius gali vienu metu išreikšti skystoje terpėje, nors jo plaukimo elgsena dar nebuvo aprašyta. Šios dvi žiogelių sistemos buvo pastebėtos kaip funkcionaliai integruotos į plaukimo spektaklį, kuris atsirado kaip epistatinė sąveika tarp tų priedų. Be to, atrodė, kad kiekvienas žiogelis vykdo tam tikrą užduotį, kurios gali prireikti plaukiant į chemoterapinius vaistus šalia dirvožemio vidinių paviršių esant klampumui, kuris gali atsirasti praradus dirvožemio gravitacinį vandenį. Kadangi Bradyrhizobium ar giminingose ​​generacijose, egzistuojančiose toje pačioje aplinkoje, dviejų flagellar sistemų turėjimas nėra įprastas, šios skirtingos rūšys gali prisitaikyti prie energijos sąnaudų ir ekologinės naudos.

Įvadas

Ankstyvieji mikrobiologai buvo nustebinti, kai stebėjo bakterijų judrumą po savo pradiniu mikroskopu, nes šis bruožas jiems neabejotinai parodė, kad tokios mažos būtybės yra gyvos būtybės 1 . Nuo to laiko buvo aprašyti mažiausiai septyni skirtingi bakterijų judrumo tipai 2, tarp kurių plaukimas ir spardymas yra varomas žvyneline. Bakterijų plaukiojimo skystoje terpėje paradigma yra „run-tumble“ (RT) modelis, aprašytas Escherichia coli ir Salmonella 3 . Šiose bakterijose peritricho flagella jungiklis sukasi prieš laikrodžio rodyklę (CCW) į laikrodžio rodyklę (CW). Kai žvynelis sukasi CCW, gijos sudaro pluoštą, o ląstelė eina į priekį, kol nutrūksta keičiant flagellar sukimąsi CW prasme, o tai sutrikdo pluoštą ir sukuria būgną. Esant pritraukiančioms / atstumiančioms cheminėms medžiagoms, tokioms kaip maistinės medžiagos, toksinai ar aplinkos signalai, bakterijų plaukimas vadovaujasi chemotaksės sistema, kuri koncentracijos gradientų nustatymą sujungia su žvynelinės sukimosi dažnio pokyčiu arba greičiu, leidžiantį bakterijoms suvokti ir reaguoti į tokius nuolydžius realiu laiku 3, 4, 5 . Taigi bakterinis plaukimas yra būdingas šališkas atsitiktinis ėjimas su trumpa atmintimi apie ankstesnę judėjimo kryptį.

Naujausi tyrimai aprašė RT modelio alternatyvas 6 . Kai kurios dirvožemio bakterijos, tokios kaip Ensifer meliloti , Rhizobium lupini ir R. leguminosarum , turi peritrichous flagellas, kurios sukasi tik CW kryptimi. Šiose bakterijose išbėrimai gaminami, kai žvynelis sukasi koordinatėje pakelyje, o būgnelis įvyksta, kai atskiros žiuželės sustoja ar sulėtėja, todėl pluoštai subyrėja . 7, 8, 9 . „Caulobacter crescentus“ turi monotrichous poliarinį ar subpoliarinį žiovulį, o jo perėjimas nuo CW į CCW sukimosi pojūtį sukelia plaukimo pasikeitimą smarkiai keičiant kryptį, atsirandantį dėl Browno efektų 10 . Be šio plaukimo atvirkštiniu (RR) plaukimu, vandens bakterijose 11, 12 neseniai buvo aprašytas trijų pakopų elgesys, pavadintas „atbulinis atbulinis smūgis“ (RRF), kurio metu susidaro išilginių ląstelių kūno išilginės ašies sukimasis. pasukus atgal, perorientavimas maždaug stačiu kampu 12 .

Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110, dirvožemio alfa-proteobakterijus, fiksuojantis atmosferos N 2 simbiozėje su sojos pupelėmis, turi dvi skirtingas žiedų sistemas. Remiantis Salmonella 13 modeliu, šios sistemos yra apibūdinamos kaip subpoliniai žiogeliai, tačiau kruopštesni tyrimai su įvairiomis α-, β- ir γ-proteobakterijomis parodė, kad pirminė sistema yra susijusi su C. crescentus , Rhodopseudomonas palustris ir Rhodospirillum rubrum žiedlapiais. tuo tarpu antrinė sistema yra susijusi su E. meliloti , Mesorhizobium loti ir R. etli flagella 14 . Dvigubos žiogelių sistemos buvo rastos kelioms rūšims, t. Y. Vibrio spp. labiausiai tyrinėtas. Tačiau šios γ-proteobakterijos yra taksonomiškai tolimos nuo B. diazoefficiens , ir atrodo, kad jų žievės sistemos nėra susijusios 14 . Ankstesni pranešimai apie bakterijas, turinčias dvigubą žiuželių sistemą, rodo, kad iš esmės pirminė sistema yra skirta maudytis skystoje terpėje, o kita - dvišalė - spardytis ant šlapių paviršių 15, 16 . Tačiau B. diazoefficiens planktoninės ląstelės gali skystoje terpėje tuo pačiu metu gaminti abi žievės sistemas. 13, 17, 18, 19, o Shewanella putrefaciens yra vienintelis kitas žinomas pavyzdys, turintis tokią galimybę 20 .

B. diazoefficiens mutantų, neturinčių nei pirminio, nei antrinio, žiedinių gijų, tyrimai neleido kiekvienam iš jų aiškiai skirti aiškių funkcijų plaukiant, spiečiant ar varžantis dėl sojos pupelių 18 Ši padėtis yra šiek tiek mįslinga, nes žvyneliai yra sudėtingos struktūros, užkoduotos pagrindiniame 24 struktūrinių genų rinkinyje 21, kuriam reikalingas kitas panašaus dydžio rinkinys reguliavimui ir suvartojantis daug energijos. Todėl atrodo pateisinama tuo pačiu metu dviejų skirtingų žvakučių sistemų išraiška planktoninėje būsenoje, jei ji suteikia tam tikrą adaptacinį pranašumą. Siekdami išsiaiškinti dviejų čia esančių B. diazoefficiens žiedų sistemas, norėjome įvertinti jų indėlį į plaukimo efektyvumą skystoje ir pusiau kietoje terpėje, prisitvirtinimą prie stiklo ir chemotaksį.

Rezultatai

B. diazoefficiens flagellar sistemų struktūra ir taksonominiai ryšiai

Ląstelinis B. diazoefficiens žiedlapių išsidėstymas parodytas 1a pav., Kur stebima skystoje kultūroje esanti planktoninė ląstelė, vaizduojanti savo monotricho konstitucinius polinius žiedlapius su trumpu ir storu siūlu, ir jo indukuojamus šoninius žiedkočius su ilgesnėmis, plonesnėmis, banguotomis ir banguotomis gijomis. kartais siejamas su ryšuliais. Subpoliariniai flagellar siūlai yra sudaryti iš 68 kDa flagelinų FliC1, FliC2, FliC3 ir FliC4 (bll5843-bll5846), o šoniniai - 34 kDa flagellinų LafA1 (bll6866) ir LafA2 (bll6865 priedas) (papildoma informacija).

Image

a ) Skystoje AG terpėje išaugintos planktoninės ląstelės, turinčios subpoliarinį žiedelį ( rodyklę ) ir mažiausiai penkis šoninius žvynelius, iš kurių keletas dalinai susieti ( strėlės galvutė ), perdavimo perdavimo elektronų mikrografas. Kontrastas buvo padidintas, kad būtų galima geriau įvertinti žiedinius siūlus. Masto juosta: 0, 25 μm. ( b ) Kaimynus jungianti filogenija, pagrįsta sujungtų FlhA, FlhB, FliF, FliG ir FliP sekų pagrindinėmis Bradyrhizobium rūšimis, parodančiomis pirminę (I) ir antrinę (II) žiedų sistemas. Bagažinės vertės, didesnės nei 70, nurodomos mazguose. Mastelio juosta, 0, 01 aminorūgšties pakaitalai vienoje vietoje.

Visas dydis

Subpoliniai flagellar genai yra pasklidę įvairiuose genų klasteriuose, o jų taksonominiai ryšiai nėra tokie pat kaip šoninių flagellar genų, kurie yra sugrupuoti į vieną klasterį. Šie požymiai leidžia manyti, kad šoninė sistema buvo įgyta perduodant horizontalų geną 14 . Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes ieškojome besislepiančių įterpimo sekų ar reikšmingų skirtumų GC skevelyje 22 šoniniame flagellar geno klasteryje ar aplink jį, tačiau tokių įrodymų nepavyko rasti. Norėdami pereiti toliau prie šio taksonominio apibūdinimo, sukūrėme kladogramą su susietomis FlhA, FliG, FliP, FlhB ir FliF 14, naudodamiesi neseniai praneštomis pagrindinių soją puoselėjančių Bradyrhizobium rūšių genomo sekomis, taip pat iš R. palustris , C. crescentus , E. meliloti , Sinorhizobium fredii , Agrobacterium radiobacter , Mesorhizobium sp. ir M. loti . (1b pav.). Mes nustatėme, kad, kaip pranešta anksčiau, pirminės ir antrinės žvakutės sistemos buvo aiškiai atskirtos. Subpoliniai žiogeliai yra panašūs kaip C. crescentus , o šoniniai žiogeliai yra panašūs kaip S. fredii , E. meliloti , A. radiobacter ir M. loti . Labai glaudus ryšys buvo pastebėtas su R. palustris , kuriame BisB18 ir BisA53 štamai turi abi žiedų sistemas, tuo tarpu BisB5 kamienas turi tik pirminę žiedų sistemą. Kalbant apie Bradyrhizobium flagella, kladogramoje taip pat buvo sugrupuotos flagella, priklausančios skirtingoms šios genties rūšims, išskyrus B. japonicum USDA 4 rūšis, kurių pirminė ir antrinė sistemos buvo susimaišiusios tarp B. huanghuaihaiense , B. daqingense ir B. yuanmingense . Tačiau B. japonicum USDA 4 jau buvo pastebėtas nesusijęs su kitomis B. japonicum padermėmis 23 . Be to, vidutinės USDA 4 ir B. japonicum USDA 6 T genomų nukleotidų tapatumo (ANI) vertės buvo 90, 43, o tarp USDA 4 ir B. diazoefficiens USDA 110 T buvo 90, 59, kas rodo, kad USDA 4 neturėtų būti laikoma jokia šių rūšių.

Įdomu tai, kad sojų puokštes skleidžiančiame Bradyrhizobium nėra du paplitimo sistemos: B. elkanii USDA 76 ir USDA 94 neturi antrinės sistemos. Tačiau šios padermės buvo labiau susijusios su trimis R. palustris padermėmis, iš kurių dvi turi antrinę sistemą. Be to, B. liaoningense nerastume nei flhB , nei fliF , todėl šios rūšies nebuvo įmanoma įtraukti į kladogramą. Kaip ir B. diazoefficiens atveju , nei B. japonicum, nei R. palustris akivaizdžių antrinės sistemos genų perdavimo įrodymų nepastebėta.

B. diazoefficiens USDA 110 plaukimo charakteristikos yra sudėtingos ir skiriasi kiekvienoje žiogelių sistemoje

Iš viso 346 B. diazoefficiens plaukimo ląstelės, įskaitant laukinio tipo ir du darinius, turinčius mutantus, iš kurių vienas neturėjo šoninių žiogelių gijų (Δ lafA ), o kitoje, kuriai trūko subpoliarinio žievės siūlelio (Δ fliC ), buvo stebimos 30 kadrų greičiu - 1 vaizdo įrašuose, kurių trukmė 5–6 s. Kadangi bakterijų ląsteles buvo galima sekti tik likus židinio plokštumoje, vaizdo įrašų atskirų trajektorijų trukmė skyrėsi. Vidutinė kiekvieno kamieno trukmė (± patikimumo intervalai, α = 0, 05) buvo 3, 44 ± 0, 17 s ( n = 121) laukinio tipo, 3, 22 ± 0, 20 s ( n = 110) Δ lafA ir 4, 26 ± 0, 09 s ( n). = 115) Δ fliC . Taigi bendras užfiksuotas laikas buvo 6, 93 min laukinio tipo, 5, 90 min Δ lafA ir 8, 16 min Δ fliC .

Gautos trajektorijos formos buvo sudėtingos, ir visos jos pavaizduotos 2a – d pav., Kur galima pastebėti tam tikrus nukrypimus tarp skirtingų atmainų. Kai kurios trajektorijos buvo lygios, tarp jų uždari apskritimai (2e ir 4a pav.), Atviros kreivės ir tiesūs keliai, beveik neturintys kreivio (2f pav.). Kiti buvo netaisyklingi, pasikeitus krypčiai RT, RR ir RRF režimais (2g pav., H), taip pat esant griežtai RT Δ fliC (2i pav., J). Kai kuriais atvejais šios savybės buvo sujungtos į vieną trajektoriją, kaip parodyta 2h pav. Remiantis kitų rūšių aprašymais 24, 25, ši trajektorija galėjo prasidėti, kai bakterija plaukia atgal, važiuodama atbuline eiga, staigiai krisdama plaukimo greičiui (nuo 33, 1 iki 2, 4 μm · s −1 ), vėl pradėdama į priekį, o tai išprovokavo. „brūkštelėjimas“ mažu greičiu (15, 5–18, 7 μm · s – 1 ) ir pagaliau atnaujinamas plaukimas įprastu greičiu keičiant RR / RT kryptį. Vidutinis važiavimo greitis (μm · s −1 ± pasikliovimo intervalus, α = 0, 05) sklandiose trajektorijose buvo 28, 8 ± 1, 3 ( n = 48) laukinio tipo, 26, 9 ± 2, 0 ( n = 50) Δ lafA ir 17, 2 ± 0, 8 ( n = 28) Δ fliC .

Image

Visos trajektorijos, kurios buvo analizuotos šiame tyrime, parodytos laukinio tipo ( a ) n = 121, mėlyna ), Δ lafA ( b ) n = 110, raudona ) ir Δ fliC ( c ) n = 115, žalia ). Juodai pažymėtos trajektorijos, kurios buvo parinktos 2e – j, 4a, d, g paveiksluose ir sunumeruotos pagal figūros numerį, kuriame jos yra. ( D ) punkte visos trajektorijos, gautos atliekant 11 skirtingų stebėjimų iš 7 nepriklausomų kultūrų, yra parodytos kartu su tais pačiais spalvų kodais kaip ir skydeliuose ( ac ). Trajektorijos formų pavyzdžiai pavaizduoti ( e - j ): apskrito ( e ) laukinio tipo), linijinio ( f ) Δ lafA ), netaisyklingo su RR krypties pokyčiais ( g ) laukinio tipo), netaisyklingo su RR ir RRF krypties pokyčiai (( h ) Δ lafA ), šiurkštūs (( i ) Δ fliC ) ir difuziniai (( j ) Δ fliC ). Skydelio ( e ) įdėkle parodytas padidintas „atbulinės eigos“ vaizdas, ląstelės padėtis kas 33 ms nurodoma taškais, o plaukimo kryptis nurodoma rodyklėmis. Koordinačių ašių vertės ( e - j ) atitinka ( a - d ) reikšmes. Skaičiai šalia trajektorijų rodo vidutinį greitį mikrometrais per sekundę (μm · s −1 ).

Visas dydis

Image

( A, d ) yra lyginamos dvi trajektorijos su mažu NGDR . a ) Sklandi apskrito trajektorija (laukinio tipo, NGDR = 0, 12). d ) Netaisyklinga trajektorija (Δ lafA , NGDR = 0, 13). Kiekviename iš jų NGDR kitimo greitis laikui bėgant yra skirtingas: švelnus sklandžia trajektorija ( b ) arba kietas netaisyklingos trajektorijos atžvilgiu ( e ), todėl žemos ( c ) arba didelės ( f ) absoliučiosios maksimalus nuolydis ( -iai ). g ) Δ lafA trajektorija su RRF, rodančia du krypties pokyčius ( žalios rodyklės ), kurie buvo teisingai numatyti kaip RCDI > 1 000 ( h ), nors padėtyse, kurių RCDI > 1 000, buvo 8 klaidingi teigiami rezultatai, tačiau akivaizdaus pokyčio kryptis ( raudonos rodyklės ). i ) Bendras traukinio variantas. Grafike reikšmės x , jie taip pat gali parodyti, kaip kinta TRAIN a, d, g ) atitinka 2a – d pav.

Visas dydis

Nepaisant sudėtingumo, trajektorijos formos atrodė skirtingai pasiskirstančios tarp laukinio tipo ir mutantų (2a – d pav.). Mes ketinome suskirstyti trajektorijas į linijines, apskritas, išlenktas ir netaisyklingas (3a pav.) Ir pastebėjome, kad Δ fliC netaisyklingos trajektorijos buvo daug dažnesnės. Be to, dažnio histograma parodė, kad išlenktų ir netaisyklingų trajektorijų dažnis tarp laukinio tipo ir Δ lafA buvo panašus, tačiau laukinių tipų žiedinės trajektorijos ir Δ lafA linijinės trajektorijos buvo aiškios . Nereguliarias trajektorijas rūšiavome pagal vyraujančius jų krypties pokyčius RR, RRF ir RT laukinio tipo ir Δ lafA bei sandarią RT Δ fliC , kurias mes dar padalijome į šiurkščias (2i pav.) Ir difuzines (2j pav.). . Vėlgi, radome skirtingus šališkumus, vyraujančius RR laukinio tipo, RRF Δ lafA ir šiurkščius bei difuzinius Δ fliC (3b pav.). Šie poslinkiai sutinka su kiekvieno mutanto žiogelio tipu, nes RR ir RRF krypčių pokyčiai aprašomi rūšims, turinčioms vienpolę ar subpoliarinę žiuželę 10, 11, 12, tuo tarpu RT krypties pokyčiai labiau būdingi bakterijoms, turinčioms pilvaplėvės žiuželius 3, 4, 7, 8, 9 . Tai, kad laukinio tipo turi daugiau RR / RRF nei RT krypties pokyčių, gali būti paaiškinta mažu šoninių žiogelių efektyvumu plaukiant skystoje terpėje. Tačiau buvo nevienareikšmiškų atvejų, nes plačiai atviros kreivės arba apskritimai, suskaidyti RR ar RRF krypties pokyčiais (papildomas S2 pav.), Įvedę savivalę į 3 pav. Rūšiavimą.

Image

a ) Rūšiavimas linijiniu, apskrito, išlenkto ar netaisyklingo pavidalo. b ) Netaisyklingų trajektorijų rūšiavimas pagal vyraujantį krypties režimo pasikeitimą.

Visas dydis

Trajektorijos rodyklė

Norėdami rasti objektyvią ir kiekybinę trajektorijų klasifikaciją, mes sukūrėme trajektorijos indeksą ( TRAIN ) pagal žinomus kelio formos kiekybinius aprašus. Lygų trajektorijų kreivę galima įvertinti pagal jų kreivio spindulį arba gali atsispindėti grynojo ir bruto poslinkio santykis ( NGDR ) 26, kuris grynąjį atstumą tarp dviejų taškų x - y koordinatės erdvėje nurodo santykį su bruto atstumu. tai iš tikrųjų keliauja tarp tų pačių taškų, remiantis išraiška:

Image

kur x ir y yra padėties koordinatės, i žymi i -ąją poziciją, 0 žymi pradinę padėtį, o n yra iš eilės einančių pozicijų skaičius. Todėl ištisai apskritos trajektorijos turi NGDR reikšmes tarp pradžios ir pabaigos taškų ties 0, o linijinių trajektorijų NGDR reikšmės yra artimos 1. Taikydami šį kriterijų, 3 pav., Sklandžias trajektorijas mes klasifikavome kaip apskritas, kai jų NGDR buvo <0, 25, tiesinis, kai jų NGDR buvo> 0, 75, ir išlenktas, kai jų NGDR buvo tarp tų verčių. NGDR pranašumas, palyginti su kreivio spinduliu, yra tas, kad jį galima naudoti su bet kokia trajektorijos forma, išlenkta ar ne. Be žiedinių trajektorijų, tie, kurių reikšmingas krypčių pokytis (mažas patvarumas), NGDR reikšmes taip pat gali suteikti ties 0 tarp pradžios ir pabaigos taškų. Trajektorijų patvarumą galima įvertinti atsižvelgiant į NGDR pokyčio greitį , kurio sklandiose trajektorijose mažai. Priešingai, trajektorijose, kuriose yra mažas patvarumas, staigūs krypties pokyčiai atsispindi didelėse absoliučiose NGDR nuolydžio vertėse, atsižvelgiant į vienas po kito einančių padėčių laiką (4a – f pav.). Taigi didžiausia absoliuti NGDR ( -ų ) nuolydžio vertė:

Image

registruota trajektorija yra geras jos atkaklumo rodiklis.

Visos trajektorijos, lygios arba netaisyklingos, rodė krypties pokyčius kiekvienam kadrui. Dauguma šių krypčių pokyčių įvyko dėl transliacijos ir sukimosi difuzijos, kai vidutinis kampas buvo 18 ± 3 °, tačiau kai kurie iš jų atsirado dėl aktyvaus bakterijų judesio perjungimo ir turėjo didesnius kampus. Todėl apskaičiavome kampo ( α i ) kosinuso kosinusą:

Image

ir gavo jos vidurkį, išplėstą visose tam tikros trajektorijos vietose ( 26 . Mes pastebėjome, kad apskritai RCDI vertės, didesnės nei 1000, atitiko xy pozicijas, kuriose cos α i buvo mažesnis nei 27 krypties pokyčius. Vis dėlto, kai ketinome patvirtinti šį kriterijų vizualiai apžiūrėdami kiekvieną trajektoriją, mes nustatėme keletą klaidingų teigiamų rezultatų, kuriuos turėjome pašalinti prieš įvertindami tikrąjį reikšmingų krypties pokyčių skaičių c (4g pav., H). Kartu,

Visais šiais aprašais trajektorijos indeksą ( TRAIN ) apibrėžėme taip:

Image

Pirmasis terminas, kurio reikšmės gali būti nuo 0 iki 1, nes 0≤ NGDR ≤1 ir s ≥ 0, žymi trajektorijos apskritumą / tiesiškumą ir patvarumą, o antrasis terminas, kurio panašus skirtumas yra nuo 0 iki 1, nes 0 ≤

Taigi 0 ≤ TRAIN ≤ 2 artėja prie 0 labai netaisyklingų trajektorijų, 1 - žiedinių trajektorijų arba 2 - tiesinių trajektorijų. Taigi, vidutinės ± standartinio nuokrypio (SD) TRAIN reikšmės išskiria netaisyklingas trajektorijas, kai RRF krypties kitimo būdas (0, 53 ± 0, 38; n = 40) yra nuo sklandaus apskrito (1, 04 ± 0, 11; n = 40) ir tiesinio (1, 79 ± 0, 23; n = 58), be skirtumų tarp laukinio tipo ir Δ lafA . Plaukimas Δ fliC buvo skirtingas, turint dvi pagrindines trajektorijos formas: šiurkštus (2i pav.), Su labai trumpais važiavimais ir dideliu patvarumu ( TRAIN = 0, 43 ± 0, 29; n = 60) ir difuzinis (2 j pav.), Su labai mažas patvarumas ( TRAIN = 0, 05 ± 0, 12; n = 18) - taip pat žiūrėkite 2d ir 3 paveikslus. Nors išlenktos (ne žiedinės) trajektorijos ar netaisyklingos trajektorijos, nedaug keičiant kryptį, turėjo tarpines TRAIN reikšmes, mes manėme, kad TRAIN dažnio pasiskirstymas vertės yra objektyvesnis kiekvienos deformacijos trajektorijos formų tendencijų įvertinimas nei klasifikacija, kuri atliekama akimi arba padedama NGDR (taip pat žr. papildomą S2 pav.).

TRAUKINIO dažnio histogramos apibūdino laukinio tipo ir mutantų plaukimo elgesį

Įvairių atmainų TRAIN dažnio histogramos parodytos 5a pav. Laukinio tipo TRAIN dažnio histograma turėjo varpo formos pasiskirstymą, kurio viduryje buvo vidurinės vertės, suderinant su aukštu žiedinių trajektorijų dažniu. Mutantuose TRAIN dažnio histogramos buvo pakreiptos iki ribų: link viršutinės (tiesinės trajektorijos) Δ lafA ir link žemutinės (labai netaisyklingos trajektorijos) Δ fliC . Be to, laukinio tipo trajektorijos buvo panašesnės į kitas nei Δ lafA arba Δ fliC mutantai, kaip rodo jų variacijos koeficientai (atitinkamai 37, 2%, 46, 0% ir 97, 7%).

Image

a ) Nepataisytos TRAIN vertės. ( b ) TRAIN vertės, pataisytos pagal tendencijų linijų lygtis (plg. 6 pav.), kad visos trukmės būtų 6 s (daugiau informacijos rasite tekste). Standartiniai nuokrypiai: laukinio tipo, nepataisyti: 0, 42; pataisyta: 0, 41. Δ lafA , nepataisytas: 0, 59; pataisyta: 0, 57. Δ fliC , nekoreguotas : 0, 57; pataisyta: 0, 53.

Visas dydis

Kadangi ir apskritimas, ir tikimybė surasti reikšmingus krypties pokyčius tam tikru būdu priklauso nuo analizuojamos trajektorijos trukmės, todėl ieškojome koreliacijos tarp TRAIN reikšmių ir trajektorijos trukmės (6 pav.). Mes nustatėme neigiamas koreliacijas (laukinio tipo, Δ lafA ir Δ fliC , atitinkamai r reikšmės −0, 24, −0, 28 ir −0, 36, visos reikšmingos, kai α = 0, 05), ir tai verčia mus suabejoti jo įtaka traukinio pasiskirstymui. reikšmės dažnio histogramose. Visų pirma, Δ lafA linijinės trajektorijos atrodė trumpesnės nei kitos (žr. Taškų kaupimąsi viršutiniame kairiajame kampe Δ lafA skydelyje, 6 pav.). Taigi, gali būti pervertinta sklandžių tiesinių trajektorijų dalis, o tendencijos, kurias siūlo dažnio histogramos (5a pav.), Gali būti artefaktas. Norėdami įvertinti šią galimybę, mes panaudojome linijinių tendencijų nuolydį, kad būtų ekstrapoliuotos visos TRAIN vertės iki 6, 0 s, ty ilgiausios trajektorijos trukmės. Šios pataisytos TRAIN vertės iš esmės buvo mažesnės nei pradinės, tačiau nubraižę kiekvieno dažnio jų dažnius, mes pastebėjome, kad aukščiau gautos tendencijos ir SD nebuvo modifikuoti (5b pav.), Rodantys, kad nebuvo dirbtinių paklaidų. Šie rezultatai sutampa su ankstesniais S. putrefaciens CN-32 stebėjimais, kai šoniniai žiogeliai stabilizuoja plaukimą, o mutantas, kuriam trūksta polinių žiedų, juda nereguliariai 20 .

Image

Parodytos individualios trajektorijos vertės ( atviri deimantai ) ir tendencijų linijos ( juoda ).

Visas dydis

Skirtingi TRAIN poslinkiai tarp trijų padermių ir mažesnis laukinio tipo variacijos koeficientas rodo epistatinį ryšį tarp fliC1234 ir lafA12 genų grupių. Norėdami nustatyti jų sąveiką, mes suformavome 10 rinkinių, kurių kiekviename yra 20 atsitiktinai parinktų kiekvieno kamieno trajektorijų, ir atlikome faktorinę dispersijos analizę. FliC - lafA sąveikai gauti vidutinė F 1, 57 reikšmė 12, 59, 8, 5–26, 67, intervale, visi statistiškai reikšmingi, kai α = 0, 01.

Pritvirtinimą prie stiklinių skaidrių trukdo šoniniai žvyneliai

Pastebėjimas, kad laukinio tipo plaukė daugiausia apskritimais, o Δ lafA trajektorijos daugiausia buvo tiesinės, paskatino mus išnagrinėti, ar šie skirtumai gali būti lygiagretūs skirtumams, pritvirtintiems prie stebėjimui naudojamų stiklinių stiklelių paviršiaus. Tam tikslui 1 valandą inkubuodavome bakterijų ląsteles ant stiklinių stiklelių, nuplaudame neprilipusias ląsteles ir įvertindavome vidutinį pritvirtintų ląstelių skaičių (± pasikliautinųjų intervalų reikšmes, α = 0, 05), kaip aprašyta skyriuje Metodai. . Šie skaičiai buvo 47, 4 ± 12, 1 laukinio tipo, 144, 2 ± 52, 9 Δ lafA , 11, 5 ± 5, 6 Δ fliC ir 12, 6 ± 9, 1 Δ fliC / Δ lafA . Taigi, šoniniai žiogeliai nebuvo reikalingi, tačiau atrodė, kad jie trukdo subpoliniam žiedlapiui prisitvirtinti prie stiklo.

Tik subpoliariniai žieveliai chemiškai reagavo į glutamatą ir sukcinaciją

Anksčiau bradyrhizobialinių štamų USDA 110, 10 K ir 643 b chemotaksis buvo tiriamas naudojant daugybę įvairių patraukliųjų medžiagų (chemoattraktantų), kurios, kaip spėjama, yra maistinės medžiagos ir signalai, esantys sojos šaknies eksudatuose 28, 29 . Abu pranešimai sutampa tuo, kad glutamatas ir sukcinatas yra stipriausi chemoattraktantai. Be to, manitolis ir arabinozė buvo apibūdinti kaip prasti chemoattractants USDA 110 28, bet kaip stiprūs chemoattractants 10 K ir 643 b 29 . Nepaisant to, mes susidomėjome šiais dviem cukrumi, nes anksčiau pastebėjome, kad jie sąlygoja šoninės žiuželės išraišką 19 . Taigi, chemoattraktanto-kapiliarų tyrime mes išmatuojome keturių junginių chemotaksę 27 .

Sutikus su USDA 110 28 duomenimis, sukcinatas ir glutamatas buvo stiprios laukinio tipo padermės chemoattraktantai, o mannitolis ir arabinozė buvo silpni. Be to, Δ lafA elgėsi panašiai kaip laukinis tipas, tuo tarpu Δ fliC nereagavo nei į vieną iš keturių tirtų chemoterapinių medžiagų (7a pav.). Kadangi visos padermės į kapiliarus pateko be chemoatraktanto tokiu pat greičiu, žemos ota fliC chemotaksinio santykio ( R ) vertės negali būti priskirtos tik mažesniam jo plaukimo greičiui. Kartu šie rezultatai rodo, kad subpoliarinio žiedkočio pakanka chemotaksiniam atsakui atlikti šiame tyrime.

Image

a ) Chemotaksis sukcinato ( suc ), glutamato ( glu ), arabinozės ( ara ) ir manitolio ( žmogaus ) atžvilgiu. Virš poros strypų, atitinkančių cheminio tirpiklio ir kontrolinės medžiagos ( C ) derinį, yra nurodytas chemotaksio santykis ( R ), kuris yra kolonijas sudarančių vienetų kapiliarų viduje su chemoattractant ir kolonijas sudarančių vienetų santykis kapiliarų viduje be chemoattractant. Rezultatai yra vidutinis ± pasikliautinasis intervalas (95%). b, c ) Subpolinių (FliC) ir šoninių (LafA) flagellinų gamyba Götz terpėje, naudojant vienintelį anglies šaltinį manitolį esant nurodytam klampumui. b ) laukinio tipo (WT) ir Δ lafA minkštame agare. c ) WT skystoje terpėje. d ) Klampumo poveikis plaukiojimui Götz minkštame agare, kurio vienintelis anglies šaltinis yra manitolis kaip B. diazoefficiens laukinio tipo, Δ lafA , Δ fliC ir Δ lafA / Δ fliC , taip pat B. japonicum USDA 6 ( B). jap ), B. liaoningense 2281 ( B lia ), B. elkanii USDA 76 ( B briedis ) ir B. yuanmingense CCBAU 10071 ( B yua ). ( e, f ) B. diazoefficiens ląstelių, gautų iš Götz minkšto agaro, kurio vienintelis anglies šaltinis yra pridėtas PVP K-90, perdavimo elektronų mikrografai, gaunant 80 mPa s klampumą. e ) Δ lafA, rodantis prie ląstelės kūno pritvirtintą subpoliarinį žievelį ( rodyklė ). Žiedlapis apibūdina kreivę ir eina per langelį, tiesdamas įterpimo vietą. f ) penkios laukinio tipo ląstelės, turinčios poliarinius ( strėlės ) ir šoninius ( strėlių galvutės ) žiedlapius, pritvirtintus prie ląstelių kūnų. Kai kurie šoniniai žiogeliai yra susieti su daugiau nei dviejų gijų ( dvigubų rodyklių galvučių ) ryšuliais, kiti - viengubiomis ( viengubos rodyklės galiukai ). Masto juosta: 0, 5 μm.

Visas dydis

Minkštas agaras sužadina šoninį žiovulį, kurio reikia judrumui didėjant klampumui

Anksčiau pastebėjome, kad Δ lafA plaukimas minkštame agare (0, 3% m / t) su manitoliu, kaip vieninteliu anglies šaltiniu, buvo lėtesnis nei laukinio tipo ir panašus į Δ fliC 18 . Kadangi „LafA“ nėra gaminami skystoje terpėje, kurioje vienintelis anglies šaltinis yra manitolis - 17, 18, 19, mes pasidomėjome, ar sąlytis su agaro tinklu gali sukelti LafA gamybą. Norėdami įvertinti šią galimybę, mes ekstrahuodavome tarpląstelinius bakterijų, auginamų Götz minkštame agare (0, 3% m / V), baltymus, turinčius manitolį kaip vienintelį anglies šaltinį, ir pastebėjome, kad tokiu būdu gaminamas LafA (7b pav.). Mes taip pat išbandėme, ar padidėjęs klampumas gali paskatinti LafA 15 gamybą, ir pastebėjome, kad šis baltymas gaminamas tiek skystame, tiek minkštame agare esant 10 ir 80 mPa s (7b, c pav.). Be to, 10 mPa s klampumas minkštame agare sumažino Δ lafA, bet ne Δ fliC judrumą , tuo tarpu esant 80 mPa s, Δ lafA buvo visiškai sustabdytas, panašiai kaip Δ fliC / Δ lafA nemotilinis mutantas (pav. . 7d). Kadangi esant visoms šioms sąlygoms FliC buvo sintetinamas panašiais lygiais (7b pav.), O subpoliniai žiogeliai buvo pritvirtinti prie ląstelių (7e, f pav.), Δ lafA paralyžius nepriskiriamas subpolinių žiogelių susidarymo slopinimui (papildomi pavyzdžiai) Δ lafA ląstelių minkštame agare esant 80 mPa, pateiktos papildomame S3 pav.). Priešingai, laukinio tipo ir Δ fliC kamienai išliko judrūs, tai rodo, kad šoniniai žiogeliai visada buvo funkcionalūs. Mes taip pat įvertinome, ar toks elgesys pakartojamas sojos pupelių mazguotose Bradyrhizobium laukinio tipo padermėse, turinčiose natūralius jų žiedkočių sistemų skirtumus (1b pav.). Taigi, mes pastebėjome, kad B. japonicum USDA 6 ir B. yuanmingense CCBAU 10071 klampos minkštame agare nepaveikė, B. elkanii USDA 76 paveikė 10 mPa s ir negalėjo judėti esant 80 mPa s, o B. liaoningense 2281 visai nejudėjo (7d pav.), sutinkant su flhB ir fliF stoka CCBAU 05525 ir CCBAU 83689 kamienuose.

Diskusija

Biologinės sistemos gali būti laikomos dinamiškomis visumomis, kurių veikimą lemia jų vidinė sudėtinga organizmo sąveika su aplinka 30, 31 . Taigi atlikimas buvo nurodytas kaip gebėjimas atlikti ekologiškai svarbų uždavinį 32, ty žvynelių sukeliamas plaukimo judėjimas yra vienas svarbiausių ir daug energijos sunaudojančių bakterijų ląstelių. B. diazoefficiens yra intriguojantis, nes dėl skirtumo tarp daugelio rūšių, turinčių dvigubas žiogelių sistemas, skystoje terpėje jis vienu metu gali išreikšti dvi savo žiedlapių sistemas, taigi kyla klausimas apie jų ekologines funkcijas ir adaptacines vertes. Mūsų sukauptas 6–8 min. Laukinio tipo, Δ lafA ir Δ fliC stebėjimas parodė, kad mutantinių ląstelių, kurioms buvo suteikta viena ar kita žievės sistema , plaukimo elgsena turėjo skirtingus bruožus, atsižvelgiant į kiekvienos sistemos savybes. Be to, Δ fliC trajektorijų nestabilumas rodo, kad šoniniai žvyneliai nesudaro stabilių pluoštų. Tačiau kai abi žiedų sistemos buvo kartu, atsirado didelis žiedinių trajektorijų formų dažnis, kuris, remiantis statistine TRAIN reikšmių analize, atsirado ne dėl kiekvienos žiedlapių sistemos papildomo poveikio, o dėl jų sąveikos. Taigi laukinio tipo ląstelių maudymasis yra ypatybė, kuri sujungia abiejų žvynelių sistemų funkcijas, kartu naudojamas atliekant vieną plaukimo užduotį 33 . Tokios išryškėjančios savybės anksčiau nebuvo galima pastebėti kitoms rūšims, turinčioms dvigubą žiedinę sistemą, nes dauguma jų neišreiškia savo šoninių žiogelių planktoninėse ląstelėse.

Plaukimo elementai buvo stebimi šalia stiklo paviršiaus, kaip rodo pririštos ląstelės, dažnai aptinkamos besisukančios aplink tam tikrą tašką toje pačioje židinio plokštumoje. Todėl bent dalis trajektorijų turėtų baigtis, kai ląstelės pritvirtinamos prie stiklo paviršiaus 34 . Taigi, norint geriau suprasti plaukimo ir paviršiaus sąveikos ryšį, gali būti naudinga palyginti trajektorijos trukmę ir prisirišimą prie stiklo tarp mutantų ir laukinio tipo. Viena vertus, Δ fliC trajektorijų trukmė buvo žymiai ilgesnė nei kitų padermių, jos pritvirtinimas prie stiklo paviršiaus buvo menkas ir nesiskyrė nuo Δ fliC / Δ lafA , tai rodo, kad dėl skirtumų su tokiomis modelių sistemomis kaip „ Vibrio“ ir „ Aeromonas 15“., B. diazoefficiens šoniniai žiogeliai yra menki adhezinai. Kita vertus, Δ lafA linijinių trajektorijų trukmė buvo trumpiausia, ir šis kamienas turėjo tris kartus didesnį prisirišimą prie stiklo paviršiaus nei laukinis. Kadangi laukinio tipo ir Δ lafA plaukimo greičiai buvo panašūs, jų skirtumas prisitvirtinant prie stiklo gali būti susijęs su šoninės žiogelės 35 poveikiu. Žiedinės trajektorijos dažniausiai susidaro, kai bakterijos nuolatos plaukioja šalia paviršiaus, tuo tarpu priešingą sukimo momentą sukuria žievė ir ląstelės kūnas 36, 37 . Taigi, ląstelės kūno, veikiančio stiklo paviršių, hidrodinaminės jėgos, tokios kaip trintis ir tempimas 34, 38, turėtų skirtis, jei ląstelės kūną supa šoniniai žiogeliai, ar ne. Taigi, darant prielaidą, kad šoniniai žiogeliai yra blogi adhezinai, jie gali pakenkti priešlaikiniam dokų sujungimui ir laukinio tipo prisitvirtinimui. Tokiu būdu šoniniai žiuželiai gali palaikyti nuolatinį plaukimą šalia stiklo paviršiaus, kaip rodo laukinio tipo trajektorijos formos, tuo tarpu subpoliniai žiuželiai gali būti atsakingi už varymą ir kryptį, kaip rodo laukinio tipo plaukimo greitis, vyraujantys krypties pokyčiai RR ir RRF modeliai ir reakcija į chemotaksį. Atrodo, kad šoninių žiuželių vaidmuo variklyje yra tik klampus.

Įdomu tai, kad LafA buvo indukuotas minkštame agare (0, 3% m / t), nepridedant klampių agentų, skirtumu nuo V. parahaemolyticus ir Plesiomonas shigelloides , kuriems švirkščiant flagellar genus indukuoti reikia kietesnio agaro, 39, 40, 41 . Agaro koncentracija dažnai nulemia, ar bakterinės ląstelės plaukia vandens užpildytose agaro vietose (0, 2–0, 4% m / V), ar spiečia agaro paviršių (daugiau kaip 0, 5% m / v), ir padeda paviršinio aktyvumo medžiagos, kurias išskiria bakterinės ląstelės 42 . Aukščiau paminėtose rūšyse, taip pat daugumoje rūšių, turinčių dvigubą žiogelių sistemą, mechaniniai šoninės žiogelio indukcijos signalai yra kontaktas su paviršiais ir klampumas. Rezultatai rodo, kad B. diazoefficiens atveju kliūčių buvimas (pvz., Agaro tinklelis) gali būti mechaninis signalas šoninei žiogelio indukcijai, kuris atrodo tinkamas dirvožemyje.

Skirtingi šoninių žiogelių vaidmenys adhezijoje ir plaukime, atsižvelgiant į modelines sistemas, gali būti susiję su skirtinga šoninių žiogelių veikimu spiečius. Būdamas Vibrio spp. ir Aeromonas spp. šoniniai žiogeliai yra naudojami gaudymui ant paviršių 15, 16, 42, B. diazoefficiens bangavimas nėra toks akivaizdus, ​​o šių žiuželių reikalavimas spiečiui nėra toks konkretus 19 . Todėl šioms bakterijų rūšims tepinėlių vaidmenį paviršiuose gali pakeisti ilgalaikis plaukimas šalia paviršių, o tai gali paaiškinti, kodėl šoniniai žiogeliai yra išreikšti planktonine būsena ir veikia sąveikaujant su poliais. Be to, spiečius yra socialinis judėjimas, o plaukimas apsiriboja atskiromis ląstelėmis 16, taigi, norint nuolat plaukti šalia paviršiaus, nereikia jungti daug ląstelių. Ar šis elgesys bus pritaikytas prie B. diazoefficiens dirvožemio populiacijų dydžio, ar pagal specialias dirvožemio vidinių paviršių savybes, yra ateities tyrimų klausimas.

Ši išpjaustymas, atliktas su deleciniais mutantais tame pačiame genomo fone, gali leisti mums įsivaizduoti kiekvienos žievės židinio sistemos vaidmenį dirvožemyje, kuris yra nepermatomas matrica, kur gyvas plaukimo bakterijų stebėjimas yra dar neišspręstas techninis iššūkis. Dirvožemio poros (8a pav.) Sudaro aplinką, kurioje staigiai pasikeičia vandens kiekis, vandens potencialas, klampumas ir cheminė sudėtis, todėl erdvėje ir laike susidaro nevienalytiškumas, priklausantis nuo porų skersmens ir vandens patekimo į dirvožemį. Kai vanduo yra prisotintas, visi dirvožemio kanalai yra užpildyti vandeniu, o Bradyrhizobium bakterijos gali laisvai plaukti makroporų viduje, šalia kanalo paviršių arba dideliame skystyje (8b pav.). Kai gravitacinis vanduo pradeda nutekėti, makroporos sulaiko tik vandens sluoksnį. Esant tokioms sąlygoms, dvigubų žvakučių sistemų išraiška gali leisti nuolatos plaukti tinkamu atstumu nuo paviršiaus, orientuota į chemoterapinius šaltinius tvirto tyrinėjimo strategijoje. Tuo tarpu, kai ląstelės, neturinčios šoninių žiogelių, yra priverstos plaukti šalia paviršiaus, nes netenka gravitacinio vandens, jos greitai atsitrenkia į dirvožemio kanalų vidines sienas, todėl ląstelės prisitvirtina ir susidaro mikrokolonija (8c pav.). Todėl ląstelės, turinčios nejudamą šoninę žiuželių sistemą, turėtų pasinaudoti trumpais vandens prisotinimo atvejais, kad būtų galima greitai pasiskirstyti ir toliau pritvirtinti bei kolonizuoti paviršius 43 .

Image

Viršutinė plokštė : pavaizduotas sauso dumblo priemolio dirvožemis su makropora ( žvaigždutėmis ) ir dviem mikroporomis ( kryžiais ). Vidurinė plokštė : tas pats dirvožemis, prisotintas vandens. Parodytos dviejų bakterijų trajektorijos: viena bakterija plaukia šalia paviršiaus ( raudona ), o kita - dideliame skystyje ( geltona ). Apatinis skydelis : dalis gravitacinio vandens buvo pamesta, o makroporoje likęs vanduo sudaro sluoksnius ant sienų; Dabar geltona trajektorija vaizduojama bakterija negali laisvai plaukti ir atsitrenkia į vieną iš sienų. Masto juosta: 10 μm.

Visas dydis

Šios dvi pasklidimo strategijos gali egzistuoti dirvožemiuose, kuriuose gyvena Bradyrhizobium rūšys, turinčios vienkartinę ar dvigubą žiedinę sistemą. B. diazoefficiens , B. japonicum ir B. elkanii yra gausiai aptinkami Brazilijos, Kinijos, Indijos ir Paragvajaus sojos pupelių dirvožemiuose 44, 45, 46, 47 . Panašiai ir artimai susijusioje R. palustris padermės, turinčios dvigubą ar vienkartinę žiedinę sistemą, buvo išskirtos iš to paties 0, 5 g gėlo vandens nuosėdų mėginio 48 . Galiausiai, sojų pupeles sukelianti B. liaoningense, kuriai trūksta flhB ir fliF , nėra judri minkštame agare. Todėl kyla pagunda spėlioti, kad plaukimo elgesio įvairovė gali būti daugiapakopė adaptacija prie tokios sudėtingos ir struktūriškos aplinkos. Tai, kad antrinė žvakutės sistema pakartotinai atsiranda skirtingose ​​giminose, ir nesėkmė, ieškant įrodymų apie šoninį žiogelio horizontalųjį genų perkėlimą tiek Bradyrhizobium, tiek Rhodopseudomonas, patvirtina hipotezę, kad šių bakterijų genčių protėvis turėjo abi žievės sistemas, o šoninė yra netekę kai kurių palikuonių 14 . Genų praradimas gali būti naudingas net laisvai gyvenantiems mikroorganizmams, jei prarasta funkcija yra brangi ir ją gali suteikti kiti bendruomenės nariai („pagalbininkai“), net jei nauda, ​​kurią gauna nariai, taupantys funkcija kompensuojama išlaidomis, kurios atsirastų, jei trūktų pagalbininkų 49 . Nors mūsų žiniomis, apie padermių bendradarbiavimą dėl varnalėšos sukelto judrumo dar nebuvo pranešta, yra žinoma, kad besiplečiančių Bacillus subtilis kolonijų pakraščiuose flagelifikuotos ląstelės asocijuojasi su nepripučiamomis ląstelėmis 50, 51, o socialiniame judrume. iš Myxococcus xanthus , buvo užfiksuotas natūralių izoliatų, turinčių aukštą ir žemą judėjimo įgūdžius , bendradarbiavimas 52 . Be to, dirbtinės evoliucijos metu laboratorijoje buvo lengvai gautos padermės, pasižyminčios puikiu plaukimo ir spiečiaus judėjimu, taip pat atšaukimas gaminant žiuželius. 17, 19, 53, tai rodo, kad pūkų raiščių judrumas ir reguliavimas nebūtinai atitinka jų savybes. maksimumai, bet iki tokio lygio, kuris yra optimalus plastiškumui, norint pasirinkti judrumą ir kolonizacijos strategijas aplinkoje. Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad žiedlapių funkcijos integracija sąveikoje su aplinka gali įvykti tiek ląstelių, tiek bendruomenės lygmeniu, kaip bendras prisitaikymas prie struktūrizuotų sudėtingų buveinių.

Metodai

Padermės ir augimo sąlygos

B. diazoefficiens LP 3004, LP 6865, LP 5843 ir LP 6543 buvo aprašytos kitur 18 . LP 3004 yra laukinio tipo darinys iš USDA 110 T, spontaniškai atsparus streptomicinui. LP 6865 (Δ lafA ) yra darinys iš LP 3004, kuriame 97, 8% lafA12 koduojančių sekų (bazės 7561160–7563387) buvo pakeistos streptomicino-spektinomicino atsparumo kasete. LP 5843 (Δ fliC ) yra darinys iš LP 3004, kuriame 75, 6% fliC1234 koduojančių sekų (bazės 6410728–6418519) buvo pakeistos atsparia kanamicinui kasete. LP 6543 (Δ fliC1234 / Δ lafA12 ) yra nemotyvuotas darinys iš LP 6865, turintis tą pačią LP 5843 mutaciją. B. japonicum USDA 6 T, B. elkanii USDA 76 T, B. liaoningense 2281 T ir B. yuanmingense CCBAU. 10071 T maloniai parūpino dr. Esperanza Martínez-Romero, UNAM, Meksika. Jei nenurodyta, kamienai buvo auginami skystoje AG terpėje 54, esant 30 ° C, sukant purtant 180 aps./min.

Bioinforminės analizės

FlhA, FlhB, FliF, FliG ir FliP sekos iš kiekvieno organizmo buvo gautos iš //img.jgi.doe.gov arba //www.ncbi.nlm.nih.gov. Šios sekos buvo sujungtos rankomis, ir daugybė sekų suderinimų buvo atlikta naudojant „Clustal W 55“ ir „MEGA6“ programinę įrangą 56, naudojant kaimyno sujungimo metodą su 1000 įkrovos atkarpų.

Plaukimo apibūdinimas

Bakterijos buvo surinktos esant optiniam tankiui esant 500 nm (OD 500 ) 1, 0 ir praskiedžiamos minimalioje Götz terpėje be anglies šaltinio 57 . Ląstelės buvo laikomos 30 ° C temperatūroje nemaišomos 24 valandas, o tada stebimos ir registruojamos, kaip aprašyta 27 . Trumpai tariant, kiekvieno kamieno plaukimo ląstelės buvo stebimos 30 kadrų s – 1 dažnio vaizdo įrašuose, kurių trukmė 5–6 s, su fazinio kontrasto „Axioscope 2 Carl Zeiss“ šviesos mikroskopu (Jena, Vokietija), kuris buvo prijungtas prie „Sony Exwave HD“ vaizdo kameros ( Tokijas, Japonija). Kompiuterizuota skaitmenintų vaizdų judesių analizė buvo atlikta naudojant „CellTrak“ (1.5 versija, judesių analizės korporacija, Santa Rosa, CA, JAV). Iš šių vaizdo įrašų mes nustatėme kiekvieno langelio koordinatinę vietą x - y erdvėje.

Pritvirtinimas prie stiklinių skaidrių

Bakterijų suspensijos, inkubuotos taip, kaip aprašyta plaukimo stebėjimui, buvo praskiestos santykiu 1:10 minimalioje Götz terpėje be anglies šaltinio 57, o 200 μl buvo pasėjama ant kiekvienos stiklinės stiklelio paviršiaus. Tuo pačiu metu Neubauerio kameroje buvo suskaičiuotas bakterijų skaičius suspensijoje. Skaidrės buvo inkubuojamos 1 valandą kambario temperatūroje, nemaišant, po to buvo plaunamos keturis kartus po 1 minutę 100 aps./min. Su 15 ml distiliuoto vandens. Tada skaidrės buvo pritvirtintos, nudažytos krištolo violetiniu tirpalu ir nuplaunamos vandeniu, o nudažytos ląstelės buvo suskaičiuotos mikroskopu 400x padidinimu. Buvo suskaičiuota ir susumuota dešimt laukų kiekvienoje skaidrėje ir apskaičiuotas trijų sumų vidurkis. Prisirišimas buvo išreikštas kaip šie vidurkiai, padalyti iš inokuliuotų ląstelių skaičiaus, atsižvelgiant į skaičių Neubauerio kameroje.

Chemotaksis ir plaukimas minkštoje agaro plokštelėje

Šie eksperimentai buvo atlikti su ląstelėmis, paruoštomis taip, kaip aprašyta aukščiau, plaukimo ir tvirtinimo eksperimentams, ir po to suspenduotos minimalioje terpėje „Götz“ su 10 mM patikrinta anglies šaltiniu. Adlerio cheminiai kapiliarų tyrimai su kai kuriomis modifikacijomis buvo atlikti taip, kaip aprašyta su keturiais kapiliarais kiekvienam nustatymui 27 . Plokštelių tyrimai buvo atlikti su 0, 3% m / v agaro, kaip aprašyta 17 . Kad padidėtų vidutinis klampumas, polivinilpirolidonas (PVP) K-90 buvo pridėtas 2% m / v arba 5% m / v, gaunant atitinkamai 10 arba 80 mPa s, pagal ankstesnius matavimus 58 .

Flagellino atskyrimas ir analizė

Bakterijos buvo auginamos Götz terpėje, naudojant vien tik anglies šaltinį manitolį, skystą arba minkštą agarą (0, 3% m / t). Bakterijos buvo surinktos iš skystų kultūrų, kai jų OD (500 nm) pasiekė 1, 0. Norėdami surinkti bakterijas iš minkštų agaro plokštelių, 8 dienų amžiaus 10–110 bakterijų kolonijos (pagal jų skersmenį, kuris svyravo 0, 3–3, 5 cm) buvo perkeltos į vieną 50 ml centrifugos mėgintuvėlį ir įpilta vieno tūrio sterilo distiliuoto vandens. Po to mėgintuvėliai buvo laikomi 15 min ant ledo, 5 minutes buvo maišomi virpeliais ir centrifuguojami 10 000 x g 30 min 4 ° C temperatūroje. Supernatantai arba aukščiau paminėtos skystos kultūros sudarė pradines flagellino sodrinimo medžiagas. Šios frakcijos buvo inkubuotos su 1, 3% m / v polietilenglikolio 6000 ir 166 mM NaCl 2 valandas 4 ° C temperatūroje. Ši suspensija buvo centrifuguota 11 000 x g 40 minučių 4 ° C temperatūroje, o nuosėdos buvo resuspenduotos 59 Laemmli buferyje. Analizei mėginiai virinami 10 min., Po to atskirti natrio dodecilsulfato poliakrilamido (12, 5% m / t) gelio elektroforeze 59 . Polipeptidų juostos buvo atskleistos dažant sidabru.

Perdavimo elektronų mikroskopija

Bakterijos buvo gautos iš skystų kultūrų arba iš po plaukimo agaro (0, 3%) plokštelių paviršiaus. Stebėjimai buvo atlikti UNLP Mikroskopijos tarnyboje, Veterinarinių mokslų fakultete, kaip aprašyta 17 . Trumpai tariant, alikvotinės dalys buvo perkeltos į tinklelį, uždengtą kolodiono plėvele, per kurią anglis anksčiau buvo sluoksniuota garinant vakuume. Po 30 sekundžių perteklinis skystis buvo pašalintas filtravimo popieriumi ir mėginys buvo nudažytas 2% kalio fosfotungfatatu (pH 5, 2; 2% m / t KOH). Naudotas mikroskopas buvo JEM 1200 EX (JEOL, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.).

Statistika

Norint įvertinti TRAIN verčių variacijos mastą mėginiuose, TRAIN buvo išreikštas kaip vidurkis ± SD. Visos kitos vertės, pateiktos norint įvertinti skirtumus tarp eksperimentinių vidurkių, pateikiamos kaip vidurkis ± pasikliautinasis intervalas. Pasitikėjimo intervalai buvo gauti padauginus standartines vidutines paklaidas iš Studento vertės su α = 0, 05. Faktorinė analizė buvo atlikta naudojant 20 atsitiktinių trajektorijų rinkinius, atsitiktinai parinktus ir patikrintus jų normalumą naudojant Andersono-Darlingo testą, kai α = 0, 05. Rinkiniai, kurie išlaikė Andersono-Darlingo testą, buvo išanalizuoti 2 × 2 faktoriniu modeliu, siekiant nustatyti subpoliarinių žiogelių, šoninių žiogelių poveikį ir jų sąveiką TRAIN reikšmėms. Kadangi nemotyvuotas dvigubas mutantas Δ fliC / Δ lafA buvo nejudrus po mikroskopu ir todėl negalėjo būti stebimas programinės įrangos, mes jam priskyrėme TRAIN = 0 su vienu laisvės laipsniu. Manome, kad šią prielaidą patvirtina Δ fliC difuzinių trajektorijų vidutinis TRAIN = 0, 05, nes Δ fliC / Δ lafA vidutinis traukinys turėtų būti būtinai mažesnis.

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį : Quelas, JI et al . Bradyrhizobium diazoefficiens plaukimo charakteristikos yra išryškėjanti jo dviejų žiedinių sistemų savybė. Mokslas. Atstovas 6, 23841; „doi“: 10.1038 / srep23841 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.