Symportin 1 chaperones 5s rnp surinkimas ribosomų biogenezės metu užimant esminę rrna jungimosi vietą | gamtos komunikacijos

Symportin 1 chaperones 5s rnp surinkimas ribosomų biogenezės metu užimant esminę rrna jungimosi vietą | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Membranos biofizika
  • Metabolizmas
  • Baltymų transportas
  • Struktūrinė biologija

Anotacija

60S biogenezės metu subrendęs 5S RNP, susidedantis iš 5S RNR, RpL5 ir RpL11, kaupiasi į dalelę iki 60S, kur jungimas priklauso nuo RpL11 sąveikos su 25S RNR spiralė 84 (H84). Kaip 5S RNP surenkamas įdarbinimui į pre-60S, nežinoma. Čia pateikiame trišakio simeportino Syo1 – RpL5-N – RpL11 komplekso kristalų struktūrą ir pateikiame biochemines bei struktūrines 5S RNP sąrankos įžvalgas. „Syo1“ saugo 25S RNR rišantį paviršių ant RpL11 ir konkuruoja su H84 dėl surišimo. Patraukti eksperimentai rodo, kad H84 išskiria RpL11 iš trišakio komplekso, bet ne esant 5S RNR. Skersinio susiejimo masių spektrometrija vizualizuoja struktūrinius 5S RNR inkorporavimo į Syo1 – RpL5 – RpL11 kompleksus pertvarkymus, palaikančius prieš 5S RNP susidarymą. Mūsų duomenys pabrėžia dvigubą Syo1 vaidmenį ribosomų baltymų pernešime ir kaip 5S RNP surinkimo platformą.

Įvadas

Ribosomos katalizuoja baltymų sintezę 1 citoplazmoje, tačiau eukariotinių ribosomų jungimasis vyrauja branduolyje ir apima daugiau nei 200 ikiribosominių faktorių. Ribosomų biogenezei reikia surūšiuoti ∼ 80 ribosomų baltymų (r-baltymų) ir keturių ribosomų RNR (rRNR) 2, 3, 4 . Šiuos r-baltymus reikia importuoti iš citoplazmos į branduolį, kur jie nuosekliai kaupsis ant prieširibosominių dalelių 5 . Daugelis r-baltymų formuoja funkcinius klasterius 6 ribosomoje 6 arba susiburia į atskirus įėjimo taškus ribosomų surinkimo 7 metu . Tipiški pavyzdžiai yra r-baltymai RpL5 ir RpL11, kurie kartu su 5S RNR sudaro 5S RNP. Branduolinis RpL5 ir RpL11 importas ir jų perkėlimas į 5S RNR sinchronizuojamas neseniai identifikuotu Symportin Syo1 (nuoroda 8). Jis kartu jungia RpL5 ir RpL11 citoplazmoje, praeina branduolio poras per importo receptorių Kap104 ir perkelia savo krovinį į 5S RNR. Syo1 formuoja pailgą α-solenoidą, atlikdamas neįprastą keturių pilnų ARM pakartojimų ir šešių HEAT pakartojimų derinį. Neseniai mes parodėme, kad Syo1 atpažįsta RpL5 per linijinį motyvą N gale, kuris 5S RNP sąveikauja su 5S RNR, panašiai kaip kiti branduolio pernešimo baltymai ir jų kroviniai (pavyzdžiui, Nup2 (nuoroda 9) ir importin α (nuoroda 10); nuoroda 5). Vis dėlto mįslinga išliko tai, kaip „Syo1“ pasiekia abiejų dviejų krovinių sujungimą ir tokiu būdu gali padėti 5S RNP surinkimui.

Iki šiol turima tik nedaug duomenų apie 5S RNP agregatą, kuris, regis, susijęs su daugybe veiksnių, prieš pradedant komplekso prijungimą prie didžiojo ribosomų subvienetų surinkimo tarpinio junginio (iki 60S) ankstyvajame 60S brendimo etape 8, 11 . Neseniai eukariotiniam pre-60S buvo būdinga krioelektroninė mikroskopija, ypač 5S RNP pasuktas maždaug 180 °, palyginti su jo padėtimi subrendusiame 60S. Jo prijungimas priklauso nuo RpL11 sąveikos su 25S RNR 12 spiralėmis 84 (H84). Kaip 5S RNP yra surenkamas įdarbinti į pre-60S, vis dar nežinoma.

Čia pateikiame Syo1 – RpL5 – RpL11 komplekso kristalų struktūrą, kuri parodo, kad abi Syo1 kroviniai tuo pačiu metu jungiasi priešingose ​​jo α-solenoidinės struktūros vietose. „Syo1“ chaperonai 5S RNP ir užmaskuoja pagrindinę RpL11 jungties vietą 60S ribosomų subvienetui. Patraukti eksperimentai ir masės spektrometrija (XL-MS) suteikia įžvalgą apie 5S RNP rinkinį ir pabrėžia dvigubą Syo1 vaidmenį r-baltymų pernešime ir ribosomų biogenezėje.

Rezultatai

Struktūros nustatymas

Pirmasis žingsnis norint suprasti, kaip RpL11 sąveikauja Syo1 – RpL5 – RpL11 komplekse, mes nustatėme Chaetomium thermophilum RpL11 (liekanos 15–167) kristalų struktūrą komplekse su RpL5-N (2–30 liekanos) ir Syo1 (26 liekanomis). –674; 1a, b paveikslai ir 1 lentelė). Šio termofilinio grybelio baltymai dažnai pasižymi pagerintomis biocheminėmis savybėmis, o nuoseklūs mutacijos keliai numato eukariotinio termostabilumo laipsnį 13, 14 . „Syo1 – RpL5-N – RpL11“ kompleksas buvo pagamintas Escherichia coli ir išgrynintas afiniteto chromatografija, po kurios seka dydžio pašalinimo chromatografija (SEC). Kristalizavimas buvo atliktas esant 291 K temperatūrai, naudojant sėdimojo lašo garų difuzijos metodą. Kristalai priklauso ortorombinei erdvės grupei P2 1 2 1 2 1, kurių vienetiniai ląstelių parametrai yra a = 60, 1, b = 106, 0 ir c = 147, 2 Å (1 lentelė). Kristalų asimetriniame vienete yra vienas Syo1 – RpL5-N – RpL11 kompleksas, atitinkantis Matowsko koeficientą 15, kuris yra 2, 1 Å 2 / Da, o tirpiklio kiekis ≈41%. Struktūra buvo išspręsta keičiant molekulę, naudojant Syo1 (nuoroda 8) ir RpL11 koordinates iš mielių ribosomos 16, ir patikslinta iki 3.4 Å skyros, kai R darbo / R vertės yra atitinkamai 24, 0 ir 29, 9% (lentelė). 1). „Syo1“ ir „RpL5-N“ struktūra yra aiškiai apibrėžta, o „RpL11“ atrodo lankstesnė tikriausiai dėl trūkstamų kristalų kontaktų. Didžioji rūgštinės kilpos dalis „Syo1“ (liekanos 328–384) ir pagrindinė kilpa „RpL11“ (liekanos 135–154) yra netvarkingos.

Image

a ) „Syo1“ (75 kDa), RpL5 (35 kDa) ir RpL11 (25 kDa) domeno architektūra. Domenai, esantys kristalų struktūroje, žymimi likučių skaičiumi ir yra paryškinti spalva. BL, pagrindinė kilpa; HS, spiralinis segmentas iš rūgštinės kilpos. ( b ) Bendroji Syo1 (pilka) struktūra komplekse su RpL5-N (žalia) ir RpL11 (mėlyna). Sutrikdyti regionai pateikiami brūkšniuotomis linijomis su likučių skaičiumi. Nurodyti N ir C galai. c ) „Syo1“ (pilka) ir „RpL11“ (mėlyna) sąveikos vaizdas iš arti (I ir II sąsaja). L3 kilpa paryškinta raudona spalva; HEAT pakartojimai 1 ir 2 yra pažymėti etiketėmis.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Syo1 – RpL5 – N – RpL11 komplekso kristalinė struktūra

Symportin Syo1 yra α-solenoidas, jungiantis RpL5 ir RpL11 priešingose ​​HEAT pakartojimų vietose, tuo tarpu ARM pakartojimai nedalyvauja krovinių rišime (1b pav.). RpL5-N (liekanos 2–30) sąveikauja kaip linijinis motyvas, turintis pailgą struktūrą ir trumpą spiralę (Tyr12 - Phe16). Trišaliame komplekse likučiai Phe3 iki Asn9 perkeliami iš 1 ir 2 pakartojimų į HEAT pakartojimus į 3 ir 4 pakartojimus, palyginti su ankstesne 8 struktūra (papildomas 1a pav.), Ir RpL5-N tampa labiau veikiamas tirpiklio. Nors perkėlimas gali atspindėti skirtingą kristalografinę aplinką, tai gali palengvinti RpL5 išsiskyrimą iš Syo1, kad surištų 5S RNR, ir tolesnį 5S RNP surinkimą. RpL11 lokalizuojasi išgaubtoje „Syo1“ pusėje su maždaug 1 160 Å2 palaidoto paviršiaus plotu (1b pav., C). RpL11 trimeriniame komplekse iš esmės yra identiška jo struktūrai kaip 80S ribosomos dalis, rodanti, kad RpL11 apvalioji dalis jungiasi kaip standus kūnas (papildomas 1b pav.). „Syo1 – RpL11“ sąsają sudaro dvi pagrindinės dalys. Pirmasis (I sąsaja) apima spiralinį segmentą rūgščioje Syo1 kilpoje (HS, aminorūgštys nuo Glu389 iki Gly399) ir rūgštinės kilpos C-galo karboksilo C galą, kuris buvo sutrikdytas Syo1 – RpL5-N struktūroje ( 1c pav., Kairėje). RpL11 β lapas sudaro griovelį, kuriame tilptų „Syo1-HS“ (1b pav., C). I sąsaja yra labai svarbi RpL11 prisijungimui, kaip rodo delecijos variantai ir HX-MS analizė 8 . Antrasis (II sąsaja) apima „Syo1 HEAT“ kartojimą nuo 1 iki 3 (1c pav., Dešinėje). Mutacinė analizė rodo, kad RpL11 kilpa L3 (ypač Asp112, Tyr117 ir Ile123) ir Glu89 šioje sąsajoje vaidina svarbius vaidmenis (1c pav.; 2 ir 3 papildomi paveikslai). Tačiau, kai I sąsaja nepažeista, Syo1 – RpL11 sąveikos negalima visiškai panaikinti pakeitus II sąsają. Apskritai parodome, kaip Syo1 jungiasi su dviem r-baltymais vienu metu ir kad sąsaja su RpL11 yra I sąsaja, kurioje naudojama Syo1-HS.

„Syo1“ yra dinamiškas α-solenoidas, o RpL5 ir RpL11 jungimasis skatina superheksija. Vien tik „Syo1“ rodo „uždarą“ struktūrą, kuri, sąveikaujant su RpL5-N 8, virsta „atvirąja“ forma (papildomas 4 pav., Viršutinė plokštė). Atidarymas atitinka maždaug 13 ° sukimąsi aplink vyrio ašį, beveik lygiagrečią RpL5-N spiralėms, įterptoms tarp ARM ir HEAT pakartojimų. „Syo1 – RpL5-N“ komplekso ir trišakės „Syo1 – RpL5-N – RpL11“ struktūros superpozicija atskleidžia nedidelius papildomus pakeitimus, atspindinčius tai, kad RpL11 jungiasi prie solenoido išorės (šaknies vidutinis kvadratinis nuokrypis, išreikštas kvadratu 0, 8 Å, kai 527 Cα atomai; 0, 8 Å); .4). RpL5 amino-N-galinių liekanų perkėlimas, stebimas dalyvaujant RpL11, yra intriguojantis ir gali būti susijęs su nedideliu Syo1 uždarymu trišakiame komplekse (papildomas 4 pav., Vidurinis skydelis). Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kaip dviejų krovinių rišimas daro įtaką Syo1 konformacijai ir pabrėžia vidinį lankstumą, žinomą kaip svarbią α-solenoidų struktūrų funkcinę savybę 17 .

„Syo1-HS“ užima 25S RNR rišančią vietą RpL11

5S RNP prijungimas prie 60S ribosomų subvieneto vyksta ribosomų biogenezės pradžioje ir apima sąveiką tarp RpL11 ir 25S RNR 12, 16 spiralės 84 (H84). Aukščiau išdėstyta mūsų trišalio Syo1 komplekso su 5S RNP, sujungto su 60S ribosominiu 16 subvienetu, superpozicija rodo, kad H84 ir Syo1-HS turi tą pačią RpL11 surišimo vietą (2a pav., Kairė ir vidurinė). Išsamesnė analizė rodo, kad „Syo1-HS“ ne tik užima H84 surišimo vietą, bet ir dalijasi molekulinėmis detalėmis su savo RNR atitikmeniu. Konkrečiai, superpozicija išryškina savitą „Syo1-HS“ išlinkimą, kuris atspindi nedidelį H84 griovelį ir paskesnius rūgščių kilpų likučius 401–407, uždėtus ant H84 galiuko (2a pav., Dešinė; papildomas 5 pav.). Apskritai, „Syo1-HS“ ir H84 forma ir krūvio pasiskirstymas yra labai panašūs. Tačiau duota abiejų struktūrų skiriamoji geba neleidžia išsamiau išanalizuoti jų sąveikos su RpL11 „molekulinės mimikos“. Mūsų rezultatai rodo sudėtingesnę „Syo1“ funkciją 5S RNP biogenezėje, nes ji apsaugo 25S RNR rišančią vietą RpL11, siūlydama struktūrinį vietos žymeklį H84. Tokiu būdu „Syo1“ apsaugo būtiną rišimosi vietą, reikalingą 5S RNP prijungimui prie dalelių iki 60S ankstyvos 60S brandos metu.

Image

( a ) RpL11 sąveika su Syo1 (šis tyrimas; vidurys), su spiralė 84 (kaip ribosomos dalis; kairė 16 ) yra lyginama abiejų kompleksų superpozicija (dešinė; pasukta 90 °). „Syo1-HS“ ir H84 jungiasi prie RpL11 surišimo vietos ir nuskaito jo raukšlę. ( b ) 5S RNR surišimas buvo patikrintas EMSA. Titravimas parodytas Syo1 – RpL5 – RpL11 (1 skydelis), Syo1 – RpL5 – RpL11ΔBL (2 skydelis), Syo1 – RpL5ΔC – RpL11ΔBL (3 skydas), Syo1 – RpL5-N – RpL11 (4 skydas), Syo1 – RpL11 (5 skydelis) ir Syo1 – RpL11ΔBL kompleksai (6 skydelis). „RNR“ juostose nėra baltymų, kad būtų užtikrinta pamatinė linija poslinkiui. Baltymų / RNR santykis pateiktas viršuje. c ) H84 sąveikos su Syo1 – RpL5 – RpL11 kompleksu (visi baltymai yra viso ilgio) nubraižyta analizė. Komplekso imobilizavimui GSTrap HP stulpelyje (I juosta) buvo naudojamas GST-RpL11 variantas. Plaunant H84, „GST-RpL11“ (E juosta) išskiria „Syo1 – RpL5“ (W juosta).

Visas dydis

5S RNR jungties analizė EMSA

Šiuo metu nėra žinoma, kaip vyksta 5S RNP surinkimas branduolyje ir kaip dalyvauja Syo1. 5S RNR susiejimas su trijų komponentų kompleksu neišlaisvina Syo1, bet sukuria tetramerinį 5S RNP tarpinį junginį (prieš 5S RNP), susidedantį iš Syo1 – RpL5 – RpL11 ir 5S RNR 8 . Syo1 – RpL5 – RpL11 komplekso 5S RNR jungimosi aktyvumas buvo stebimas naudojant elektroforezinius judrumo poslinkius (EMSA; 2b pav.). RNR buvo sulankstyta pagal nustatytą protokolą 18 . Tyrimai patvirtino, kad Syo1 nesieja 5S RNR (papildomas 6a pav.), Tuo tarpu esant RpL5 ir RpL11 susidaro išankstinis 5S RNP (2b pav., 1 skydelis). Norint ištirti individualų jų 5S RNR sąveikos vietų indėlį, buvo panaudota daugybė RpL5 ir RpL11 apipjaustymo variantų (2b pav., 1-6 skydai). Subrendusiame 5S RNP RpL5 N- ir C-galai užspaudžia RNR ir RpL11 daugiausia sąveikaudami per savo pagrindinę kilpą (apimančią liekanas nuo Arg142 iki Lys146). EMSA parodė, kad Syo1 – RpL11 kompleksas nesugeba įdarbinti 5S RNR, nors pagrindinė kilpa yra tirpiklyje. Efektyviam surišimui reikia ir RpL5, ir RpL11, RpL5 N-galas ir rutulinis domenas yra pagrindinė surišimo vieta (papildomas 6c pav.). Apskritai, šie duomenys leidžia manyti, kad RNL pre-5S RNP RNL riboja RpL5 N- ir C-galai, tikriausiai kaip subrendusiame 5S RNP.

RpL11 sąveikos analizė

Kadangi Syo1-HS ir H84 naudoja tą pačią RpL11 surišimo vietą, mes pirmiausia panaudojome EMSA, kad išanalizuotume H84 sąveiką su trijų komponentų kompleksu (papildomas 6b pav.). H84 nesiriša tik su Syo1, bet sąveikauja su trišaliu kompleksu, nors ir mažiau efektyvus, palyginti su 5S RNR. Norėdami patikrinti, ar H84 konkuruoja su Syo1 dėl RpL11 prisijungimo, mes panaudojome glutationo S- transferazės (GST) pažymėtą RpL11 variantą in vitro traukimo metodu (2c pav.). Pridėjus H84, trišalis kompleksas išsiskiria į Syo1 – RpL5 ir H84, sujungtus su GST-RpL11 (2c pav., Papildomas 7 pav.). RpL11 išleidimas H84 rodo, kad I sąsaja trišaliame komplekse (1c pav.) Suteikia pagrindinį ryšį tarp Syo1 ir RpL11 ir kad nėra reikšmingos sąveikos tarp RpL5 ir RpL11. „Syo1-HS“ ir H84 konkuruoja dėl tos pačios RpL11 surišimo vietos, o „Syo1“ prisijungimas prie RpL11 gali užtikrinti nepaliestą H84 surišimo vietą, kad būtų galima sėkmingai įdarbinti 5S RNP į ankstesnį 60S.

Norėdami patikrinti, ar 5S RNP surinkimas vyksta esant Syo1 (kaip nurodo EMSA), mes atlikome konkurencinį eksperimentą su H84 dabar, esant 5S RNR. Subrendusiame 5S RNP RpL11 sąveikauja su 5S RNR, taip pat su RpL5 (nuoroda 16). Todėl H84 neturėtų turėti galimybės paleisti RpL11, jei šie kontaktai užmegzti jau prieš 5S RNP. Iš tikrųjų, naudodamiesi Syo1-FLAG variantu, mes pastebėjome, kad H84 pridėjimas prie tetramerinio komplekso RpL11 neišsiskyrė (papildomas 8 pav.). Vietoj to, H84 dabar įdarbintas į RNP iki 5S. RpL11 tikriausiai jungiasi prie 5S RNR savo pagrindine kilpa ir likučiais iš savo kamuolinio domeno, kaip aprašyta 16, 19 . Apskritai, mūsų duomenys rodo, kad 5S RNP surinkimas vyksta esant Syo1.

XL-MS eksperimentai

Norėdami gauti įžvalgos apie struktūrinius pertvarkymus, pagrindžiančius prieš 5S RNP sudarytą rinkinį, mes atlikome XL-MS eksperimentus su Syo1 – RpL5 – RpL11 kompleksu su 5S RNR ir be jos. Išgryninti kompleksai buvo susieti su lizinui specifiniu reagentu disukcimidilo suberate, o susieti peptidai buvo identifikuoti didelės skiriamosios gebos tandeminės masės spektrometrija, naudojant xQuest ir xProphet programinę įrangą 20, 21, 22 . Mėginiai su RNR ir be jos buvo apdoroti lygiagrečiai ir analizuojami atskirai. Iš viso mes nustatėme 67 vidinius ryšius (kryžminius ryšius tame pačiame polipeptide) ir 35 tarpusavio ryšius (kryžminius ryšius tarp dviejų polipeptidų), atitinkamai atitinkamai 32 ir 23 unikalius apribojimus (2 lentelė). Atrinkti kryžminiai ryšiai buvo kiekybiškai palyginti tarp mėginių ir kiekybiškai įvertinti etiketes, remiantis rankiniu smailių ekstrakcija (žr. Papildomą 9 pav. Ir 2 lentelę).

Pilno dydžio lentelė

Syo1 – RpL5-N – RpL11 komplekso (šis tyrimas) ir subrendusio 5S RNP iš 80S ribosomos 16 struktūra riboja išsamią kryžminio ryšio rezultatų analizę. Trūkstant RNR, trinarinio komplekso struktūra tirpale atitinka kristalų struktūrą, kaip rodo specifinių kryžminių jungčių tarp RpL5 ir RpL11 susidarymas su Syo1, tuo tarpu kryžminių ryšių tarp RpL5 ir RpL11 nebuvo pastebėta (2 lentelė, 1 pav. 3a, žr. Papildomą 10 pav.). Daugybė kryžminių jungčių (Syo1 (K66) –Syo1 (K35), RpL11 (K76) –RpL11 (K88), Syo1 (K294) –RpL11 (K36)) gerai koreliuoja su kristalo struktūra, išskyrus vieną tarpusavio kryžminį ryšį. tai gali sudaryti klaidingai teigiamas identifikavimas. Naudodami viso ilgio RpL5 „XL-MS“, galime lokalizuoti RpL5 rutulinę dalį (45–255 liekanos), kurios nėra mūsų kristalų struktūroje (Syo1 (K66) –RpL5 (K112); 2 lentelė; 3a pav.). RpL5 rutulinis domenas lokalizuojasi arti Syo1 N-galo srities. Nors specifinių kryžminių ryšių tarp RpL5 ir RpL11 nebuvimas nereiškia, kad abu baltymai nesąveikauja, remiantis tiesioginių eksperimentų rezultatais, galima atmesti tiesioginę sąveiką (2c pav.). Apskritai šie duomenys leidžia mums gauti išsamesnį trišalio komplekso modelį.

Image

( a ) Tarp (oranžinės) ir baltymų (mėlynos linijos) kryžminiai ryšiai, aptikti Syo1 komplekse, kai nėra (kairėje) arba nėra (dešinėje) 5S RNR. Kiekybiškai įvertinti kryžminiai ryšiai parodyti 2 lentelėje ir papildomame 9 pav. ( B ) Syo1 vaidmens 5S RNP rinkinyje modelis (kairysis ir vidurinis skydai). H84 yra įdarbinamas į tetramerinį pre-5S RNP (dešinysis skydelis, viršuje) sąveikaujant su RpL11, kaip naudojamas 5S RNP prijungime prie dalelių iki 60S (dešinysis skydas, apačia) 12 . Baltymų, kurių nėra ar nėra trikampio komplekse, dalys pažymėtos punktyrinėmis linijomis. Baltymų vyrių taškai (pavaizduoti kaip stori apskritimai) leidžia pertvarkyti (pažymėtus rodyklėmis). Syo1 (pilka), RpL5 (žalia), RpL11 (mėlyna), 5S RNR (raudona) ir spiralė 84 (H84, oranžinė). Modelis yra pagrįstas trijų komponentų kompleksu (šis tyrimas) ir 5S RNP kaip mielių ribosomos dalis (PBP kodai: 3U5E, 3U5D) 16 . Tuo pačiu būdu H84 sąveikauja su 5S RNP pre-60S ir subrendusioje ribosomoje.

Visas dydis

Esant 5S RNR, kryžminio ryšio schema yra tokia pati, tačiau parodo tam tikrus specifinius pokyčius. Vidinių nuorodų skaičius Syo1 N-galiniame regione padidėjo, tai rodo, kad RpL5 rutulinis domenas prisijungė prie 5S RNR ir kad visi anksčiau ekranuoti lizino likučiai toje srityje dabar yra laisvi būti kryžminami (papildomas 10a pav. b). RpL5 rutulinio domeno perkėlimą taip pat rodo vieno kryžminio ryšio praradimas (Syo1 (K66) –RpL5 (K112)). Sąveika su 5S RNR taip pat skatina RpL5 N-galo pokyčius Syo1 atžvilgiu ir susidaro naujas kryžminis ryšys (RpL5 (K8) –Syo1 (K642)), kuris rodo pertvarkymą, kuris galėtų palengvinti RpL5 išsiskyrimą iš Syo1. Tik esant 5S RNR, pastebimi RpL5 C-galo vidiniai ryšiai, kurie rodo, kad šis regionas įveda apibrėžtą 5S RNR jungties struktūrą (RpL5 (K276) –RpL5 (K265), RpL5 (K276) –RpL5 (K267). ). RpL5 C-galo sritis artėja prie Syo1 C-galo (Syo1 (K642) –RpL5 (K294)), o RpL11 juda Syo1 atžvilgiu, esant 5S RNR, kaip rodo vieno kryžminio ryšio praradimas (Syo1 ( K294) –RpL11 (76)). Apibendrinant, specifiniai pokyčiai, pastebėti esant 5S RNR, rodo pre-5S RNP susidarymą esant Syo1.

Diskusija

„Syo1“ buvo identifikuotas kaip branduolinio importo adapteris, kuris leidžia tuo pačiu metu importuoti RpL5 ir RpL11 (nuoroda 8). Anksčiau mes parodėme, kad vien Syo1 praeina per branduolio porų kompleksą sąveikaudamas su FG pasikartojimais, o trišaliam kompleksui reikia importo Kap104 ir RanGTP. Kap104 jungiasi prie branduolio lokalizacijos sekos Syo1 N gale, o pridėjus RanGTP, išsiskiria trišalis Syo1 kompleksas, galintis surišti 5S RNR 8 . RpL5 N-galas sąveikauja su Syo1 kaip linijinis motyvas ir mes pateikėme įrodymų, kad RpL11 jungiantis prie Syo1 yra rūgštinė kilpa. Dabartiniame tyrime parodyta, kaip „Syo1“ savo du importinius krovinius telpa į priešingas α-solenoido vietas. Palyginus tris dabar turimas „Syo1“ struktūras („Syo1“, „Syo1 – RpL5-N“, „Syo1 – RpL5-N – RpL11“), vizualizuojamas įgimtas „Syo1“ superhelixo lankstumas, panašus į pastebėtus karioferinus, kuriuose skirtingi rišamieji partneriai prisitaiko dėl sukeltos formos 17 mechanizmo. RpL5-N jungimasis prie „Syo1“ paviršiaus griovelio gali apsaugoti FG pakartotinio surišimo vietą arba blokuoti surišimui būtinus pakeitimus. Rūgštinės kilpos gale esantis „Syo1-HS“ apsaugo 25S RNR rišančią vietą RpL11 ir gali būti varžomas H84. Įdomu tai, kad daugelyje karioferinų yra rūgštinė kilpa, kuri vaidina svarbų vaidmenį rišant ir išleidžiant krovinius 17 .

Atlikus 310-RNR ir RanGTP priklausomo trišakio komplekso importą į branduolį, 5S RNR gali surišti. 5S RNR sąveikos su trišakiu kompleksu analizė atliekant eksperimentus, EMSA ir kryžminį ryšį MS rodo, kad 5S RNR jungimasis prie RpL5 ir RpL11 sukelia pertvarkymus, tai rodo, kad susidaro pre-5S RNP. Šie duomenys patvirtina mintį, kad „Syo1“ taip pat naudojama kaip 5S RNP surinkimo platforma, ir mes siūlome šį 5S RNP biogenezės darbo modelį (3c pav.): „Syo1“ du savo krovinius vienu metu suriša priešingose ​​α-solenoido pusėse, ir mūsų duomenys rodo, kad tarp RpL5 ir RpL11 (kairiajame skydelyje) nėra tiesioginės sąveikos. RpL5 N-galas yra įmontuotas Syo1 griovelyje, o RpL11 yra įdarbinamas per Syo1-HS. RpL5 rutulinis domenas yra arti Syo1 N-galo, tačiau neprisideda prie sąveikos, nes RpL5-N delecija panaikina dimerų susidarymą 8 . 5S RNR gali sąveikauti su trišaliu kompleksu, o atlikus eksperimentus su RpL5 delecijos variantais, 5S RNR tikriausiai yra užfiksuota RpL5 N- ir C-galais panašiai, kaip ir subrendusiame 5S RNP (vidurinis skydelis). Kryžminio ryšio duomenys rodo, kad RpL5 rutulinis domenas juda Syo1 N-galo atžvilgiu, o RpL5 C-galas artėja prie Syo1 C-galo. RpL11 persikelia ir prisijungia prie 5S RNR per savo pagrindinę kilpą. Pre-5S RNP yra pastatytas esant Syo1, kuris gali būti ankstyvasis tarpinis produktas 5S RNP biogenezėje. Ar jis bus nukreiptas į ribosominį subvienetą iki 60S, ar norint subręsti, reikalingi papildomi veiksniai (pavyzdžiui, Rpf2 ir Rrs1 (nuoroda 11)) ir (arba) pertvarkymai, vis dar nežinoma. Neseniai aprašytoje ribosominio subvieneto, esančio prieš 60S, struktūroje yra subrendęs, surinktas 5S RNP, tačiau susuktas, pasuktas į išorę (dešinysis skydas, apačia) 12 . Šiame prieš 60S RpL11 jau yra sujungtas su H84 iš 25S RNR tokiu pačiu būdu, kaip ir subrendusiame 60S, išryškindamas H84 kaip pirminę 5S RNP prijungimo vietą 12 . Mūsų duomenys nusako naują „Syo1“ vaidmenį specialiai apsaugoti H84 sąveikos vietą RpL11. H84 konkuruoja su Syo1 dėl prisijungimo prie RpL11 (dešinysis skydelis, viršuje), tačiau neišlaisvina Syo1 iš pre-5S RNP. Karioferinams buvo pasiūlyta, kad energija, kaupiama deformuojant α-solenoidą, rišantį krovinius, galėtų išardyti transporto kompleksus 17 . Nors spekuliatyvi, energija, kaupiama iškraipant Syo1, rišant RpL5, gali prisidėti prie Syo1 išleidimo. Tačiau norint parodyti, kurioje vietoje „Syo1“ išleidžiamas, reikia papildomų eksperimentų.

Mūsų duomenys rodo, kad Syo1, ne tik kaip importo adapteris, veikia ir kaip molekulinis chaperonas ribosomų surinkimo kelyje, kuris užmaskuoja pagrindinę 60S subvienetą rišančią vietą ir užkerta kelią nespecifinei ir (arba) priešlaikinei RNR sąveikai. „Syo1“ kopijuoja H84 sąveiką su RpL11 ir tokiu būdu jau citozolyje gali įsitikinti, kad tik tinkamai sulankstytas RpL11 yra importuotas 5S RNP biogenezei ir yra kompetentingas prijungti prie ankstesnio 60S. R-baltymų kokybės kontrolė prieš branduolio importą ir prieš pradedant ribosomų biogenezę ir brendimą gali būti elegantiškas būdas išvengti švaistomų tarpinių produktų.

Iš esmės mūsų tyrimas iliustruoja svarbos, bet „paprasto“ RNP, turinčio tik tris komponentus, surinkimo sudėtingumą. Tai gali būti naudojamas kaip pagalbos ribonukleoproteinų surinkimo supratimo pavyzdys. Mes tikimės, kad panašūs kokybės kontrolės mechanizmai egzistuoja ir kitiems r-baltymams, kad būtų išvengta branduolinio importo ar netinkamų ribosomų komponentų įdarbinimo.

Metodai

Klonavimas

Visi rekombinantinės DNR metodai buvo atlikti laikantis nustatytų procedūrų, naudojant Escherichia coli DH5α klonavimui ir plazmidės dauginimui. Visi klonuotų DNR fragmentai, sukurti PGR amplifikacijos būdu, buvo patikrinti sekos būdu. Šiame tyrime naudojamos plazmidės išvardytos 1 papildomoje lentelėje.

Baltymų paruošimas ir kristalizavimas

„Syo1 – RpL5-N – RpL11“ kompleksas ir „Syo1 / RpL5 / RpL11“ kompleksas buvo pagaminti kaip aprašyta 8 ir išgryninti Ni-jonų afiniteto chromatografija, po kurios seka SEC (S200–26 / 60, „GE Healthcare“) buferyje, kuriame yra 20 mM HEPES. -Na (pH 7, 5), 200 mM NaCl, 20 mM KCl, 20 mM MgCl2. Kristalizavimas buvo atliktas esant 291 K temperatūrai, naudojant sėdimojo lašo garų difuzijos metodą, maišant vienodus kiekius (0, 3 μl) baltymo tirpalo (23 mg ml −1 ) ir kristalizacijos buferį su 100 μl rezervuaro tūriu. Kristalai atsirado per 2 valandas 0, 1 M natrio acetato, 8% (V / V) PEG 4000.

Duomenų rinkimas ir struktūros nustatymas

Siekiant sumažinti radiacijos žalą renkant rentgeno duomenis, kristalai buvo užšaldyti skystu azotu po krioapsaugo, perpilant į kriosoliuciją, kuriame yra motininio skysčio ir 20% (tūrio / t) glicerolio. Difrakcijos duomenys buvo išmatuoti naudojant pluošto liniją ID23eh2 Europos sinchroninio spinduliuotės įrenginyje (ESRF, Grenoblyje), esant 0, 8726 Å, kriogeninėmis sąlygomis (100 K; Oxford Cryosystems Cryostream), naudojant CCD detektorių (MAR Research), ir apdoroti naudojant rentgeno detektorių programinę įrangą. 23 paketas. Struktūra buvo išspręsta atliekant molekulinį pakeitimą PHASER 24 iš CCP4 25 paketo, kaip paieškos modelius naudojant Syo1 (PDB: 4GMO 8 ) ir RpL11 (kaip mielių ribosomos dalį, PDB: 3U5E, grandinė J 16 ) struktūras. Modelio kūrimas ir tobulinimas buvo atliekamas naudojant COOT 26 ir PHENIX suite 27 . Duomenų rinkimo ir patikslinimo statistika yra apibendrinta 1 papildomoje lentelėje. Modelio kokybė buvo analizuojama naudojant PROCHECK 28 ir MOLPROBITY 29 . Ramachandrano statistiniai duomenys apie galutinį „Syo1 / RpL5-N / RpL11“ modelį rodo 93, 23% likučių palankiausiuose regionuose, 5, 62% papildomai leidžiamų regionų ir 1, 15% dosniai leidžiamuose ar neleidžiamuose regionuose pagal PROCHECK 28 . Paveikslai buvo paruošti naudojant PyMOL programą (Molecular Graphics System, 1.5.0.4 versija, Schrödinger, LLC; //www.pymol.org).

RNR paruošimas

Mielių 25S RNR sintetinis DNR šablonas, koduojantis spiralę 84 (nukleotidai 2, 666–2, 686, 5′-GGGAGAACAGAAATCTCCC-3 ’), klonuotas į pEX-A vektorių per EcoRI ir HindIII restrikcijos vietas, buvo nupirktas iš„ Eurofins “(MWG Operon). 5S RNR ir spiralės 84 paruošimas buvo atliktas, kaip aprašyta 8 . Po transkripcijos baltymai buvo pašalinti ekstrahuojant fenoliu / chloroformu ir RNR buvo išgryninta SEC.

Elektroforetinio judėjimo poslinkio tyrimai

EMSA stebėjo Syo1 – RpL5 – RpL11 komplekso RNR jungimosi aktyvumą. RNR buvo sulankstyta pagal nustatytą protokolą 18 . Į RNR (5S RNR arba H84) buvo pridėtas 0, 5 karto molinis santykis arba ekvimoliarus kiekis Syo1 – RpL5 – RpL11 komplekso; tada druskos koncentracija buvo sureguliuota, kad būtų išlaikytos lankstymo buferio sąlygos, ir inkubuojamos 25 ° C temperatūroje 10 min. Mėginiai buvo analizuojami elektroforeze naudojant Tris-boro agarozės 0, 5x Tris-boro buferį (pH 8, 2) 20 min. Esant 20 mA kambario temperatūroje ir dažant etidžio bromidu.

In vitro ištraukiamieji tyrimai

(His) 6 žymėtais baltymais iš E. coli išgryninti buvo naudojami standartiniai metodai. SEC išgrynintas Syo1-FLAG– (His) 6 -RpL5 – RpL11 kompleksas buvo imobilizuotas ant anti-FLAG-M2 magnetinių granulių (Sigma). Į imobilizuotą kompleksą ant granulių pridedama ekvimolinės sulankstyto H84 koncentracijos ir inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje. Išplovus trimis kolonų tūriais surišančio buferio, kuriame yra 20 mM HEPES-Na (pH 7, 5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, eliucija buvo atlikta inkubuojant su 0, 1 mg ml – 1 FLAG peptido. Coomassie dažytos SDS – poliakrilamido gelio elektroforezė atskleidė baltymus kiekviename etape, o RNR buvo stebima 0, 8% agarozės elektroforezės ir etidžio bromido dažymo metu. Panašus metodas buvo naudojamas SEC išgrynintame Syo1-FLAG– (His) 6 -RpL5 – RpL11–5S RNR komplekse. Kaip neigiama kontrolė vietoj H84 buvo naudojamas buferis.

Imobilizuotas jonų afiniteto chromatografijos būdu išgrynintas Syo1 – RpL5 (His) 6 –GST-RpL11 kompleksas buvo imobilizuotas ant GSTrap (GE Healthcare). Į kolonėlę buvo įpilta ekvimoliarinė sulankstyto H84 koncentracija ir per naktį inkubuota 4 ° C temperatūroje. Po plovimo rišamuoju buferiu (20 mM HEPES-Na (pH 7, 5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2), eliucija buvo atlikta su eliuvimo buferiu (50 mM Tris-HCl, 10 mM redukuoto glutationo, pH 8, 0). ).

XL-MS eksperimentai

Vien tik „Syo1 – RpL5 – RpL11“ kompleksas ir su 5S RNR buvo 30 minučių 35 ° C temperatūroje kratant (850 aps./min.) Sukryžiavus su 0, 5 mM H12 / D12 izotopu pažymėtu disukcimidilo suberate („Creative Molecules“). Norėdami sugeneruoti XL-MS duomenų rinkinį, kuris gali būti apdorotas kaip visuma įvertinus iš esmės pastovų klaidingo atradimo dažnio (FDR) vertinimą, viso tyrimo metu nusprendėme pasikliauti izotopų koduotais kryžminiais jungikliais. Reakcija buvo užgesinta pridedant NH4HCO3 iki 0, 1 M 10 minučių 35 ° C temperatūroje. Tinkliniai baltymai denatūruoti 4 M karbamidu ir 0, 1% (m / t) RapiGest Surfactant (Waters), redukuoti naudojant 10 mM DTT (30 min. 37 ° C), o cisteinai buvo karbamidometilinti 15 mM jodocetamidu (30 min. Tamsoje). . Baltymų skaidymas pirmiausia atliekamas naudojant 1: 100 (m / m) LysC (Wako) 4 valandas 37 ° C temperatūroje, o po to užbaigiamas 1:50 (m / m) tripsinu (Promega) per naktį 37 ° C temperatūroje po karbamido. koncentracija praskiedžiama iki 1, 5 M. Tada mėginiai parūgštinami 10% (v / v) trifluoracto rūgšties ir, naudojant standartines procedūras, nudruskinami naudojant MicroSpin kolonėles (Harvardo aparatūra). Susieti peptidai buvo praturtinti naudojant SEC, kaip aprašyta ref. 20. Trumpai tariant, gėlinti peptidai buvo ištirpinti SEC buferiu (30% (t / t) ACN 0, 1% (t / t) trifluoracto rūgštyje) ir frakcionuoti naudojant „Superdex Peptide PC 3.2 / 30“ koloną (GE) „Ettan LC“. sistema (GE), kai srautas 50 μl min −1 . Frakcijos, išsiskiriančios nuo 0, 9 iki 1, 3 ml, paprastai buvo sujungtos, išgarintos iki sausumo ir ištirpintos 20–50 μl 5% (v / v) ACN 0, 1% (v / v) FA pagal 215 nm absorbciją. Nuo 2 iki 10% surinktų frakcijų buvo supilama į BEH300 C18 (75 μm × 250 mm, 1, 7 μm) nanoAcquity UPLC kolonėlę, pritvirtintą ant nanoAcquity UPLC sistemos (Waters) ir palaipsniui išplaunant 3–85% (v / v). ) ACN 0, 1% (v / v) skruzdžių rūgšties gradiente, sujungtas internetu su LTQ-Orbitrap Velos Pro masių spektrometru (Thermo). Duomenys buvo renkami naudojant TOP-20 strategiją, kai orbitos juostoje buvo gauti apklausos ms nuskaitymai ( m / z diapazonas nuo 375 iki 1 600) ( R = 30 000), o iki 20 gausiausių jonų per visą skenavimą buvo suskaidyti susidūrimo metu. -sukeltas disociacija (normalizuota susidūrimo energija = 40, aktyvacija Q = 0, 250) ir išanalizuota LTQ. Norint sutelkti dėmesį į didesnius susietus peptidus, 1, 2 ir nežinomos įkrovos būsenos buvo atmestos. Dinaminis išskyrimas buvo įgalintas, kai pakartojimų skaičius = 1, pašalinimo trukmė = 60 s, sąrašo dydis = 500 ir masės langas ± 15 ppm Jonų tikslinės vertės buvo 1 000 000 (arba didžiausia 500 ms užpildymo trukmė) viso nuskaitymo metu ir 10 000 (arba 50 ms maksimalus užpildymas). laikas) ms / ms nuskaitymui. Visi mėginiai buvo analizuojami techniniais egzemplioriais.

Neapdoroti failai buvo konvertuoti į centroid mzXML, naudojant „MassMatrix“ failų konvertavimą taip pat 30, ir išanalizuoti naudojant „xQuest 21“, remiantis FASTA duomenų baze, kurioje yra susisiejusių baltymų sekos. Užpakalinės tikimybės ir FDR buvo apskaičiuoti naudojant xProphet 22 ir rezultatai buvo filtruojami naudojant šiuos parametrus: FDR = 0, 05, min delta = 0, 95, MS1 tolerancijos langas ± 3 ppm

Kiekybiniam kryžminimui įvertinti smailės, atitinkančios susietų peptidų jonus, buvo rankiniu būdu išgaunamos iš neapdorotų failų naudojant „Xcalibur“ („Thermo“). Neapdoroti duomenys buvo klausiami naudojant xQuest nustatyto peptido jonų m / z , naudojant masės toleranciją ± 20 ppm. Viršūnės buvo vienareikšmiškai identifikuotos pagal jų sulaikymo laiką, įkrovos būseną ir tiek lengvųjų, tiek sunkiųjų peptidų jonų buvimą. Viršūnių integracija buvo atlikta naudojant Xcalibur ir patikrinta rankiniu būdu. Po to kiekvieno smailės integruotasis plotas buvo normalizuotas iki vidutinio mėginio intensyvumo ir naudojamas kiekybiniam įvertinimui. Kiekybinis įvertinimas buvo atliktas abiems techniniams replikatams (pakartotinis to paties pavyzdžio įpurškimas) ir buvo naudojama vidutinė vertė. Paprastai pastebėjome gerą techninių kopijų atkuriamumą (vidutinis sd <12%). Keliais atvejais skersai sujungtų peptidų jonų buvo galima aptikti virš triukšmo lygio tik esant vienai iš dviejų tirtų sąlygų. Taigi tokie atvejai buvo nedviprasmiškai priskirti tik vienai sąlygai. Kai abipusiai susieti peptidai buvo kiekybiškai įvertinti, mes panaudojome savavališką dvigubo pokyčio normalizuoto smailės srityje ribą, kad nustatytume, ar kryžminį ryšį paveikė 5S RNR.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi 1-10 paveikslai, 1 papildoma lentelė ir papildomos nuorodos

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.