Bisbenzimidazolo ir karbonilcianido 3-chlorfenilhidrazono derinio sinergetinis veiksmingumas prieš mdr bakterijų padermes | mokslinės ataskaitos

Bisbenzimidazolo ir karbonilcianido 3-chlorfenilhidrazono derinio sinergetinis veiksmingumas prieš mdr bakterijų padermes | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Antibiotikai
  • Mažos molekulės

Anotacija

Ištekėjimo sistemų aktyvavimą ir bioplėvelės formavimąsi mikrobai dažniausiai prisitaiko priešintis antimikrobinėms medžiagoms. Pastebėta, kad PPEF (bisbenzimidazolas), nukreiptas į topoizomerazės IA, yra veiksmingas baktericidinis agentas tiek prieš gramteigiamus, tiek prie gramneigiamų bakterijų padermių, todėl gali būti sukurtas kaip stiprus plataus veikimo spektro antibiotikas prieš MDR padermes. Gydymas PPEF nesukėlė specifinės tikslinės mutacijos, o dėl to E. coli K12 buvo padidintas efflux geno, kaip atsparumo mechanizmo, reguliavimas. Mikroskopijos, fluorescencinės spektroskopijos ir srauto citometrijos rezultatas rodo didesnį PPEF kaupimąsi ištekėjusio geno deletuotuose E. coli K12 mutantuose, taip pat rodo, kad karbonilcianidas 3-chlorfenilhidrazonas (CCCP) priešinasi PPEF ištekėjimui ir taip padidina PPEF efektyvumą. Čia mes pranešame, kad PPEF ir CCCP sinergiškai žudo nuolatines bakterijų ląsteles, kurių nenužudo tik PPEF. Pirmiau minėti du junginiai kartu slopino biofilmų formavimąsi, išnaikino iš anksto suformuotas bioplėves ir žudo P. aeruginosa biofilmo ląsteles. PPEF ir CCCP kartu sumažino E. coli ATCC25922 bakterijų kiekį 6 log 10 balo / c pelių neutropeninės šlaunų infekcijos modelyje. Šis tyrimas rodo, kad kombinuotas gydymas gali būti perspektyvi antimikrobinė strategija kovojant su MDR patogeninėmis padermėmis.

Įvadas

Daugiems vaistams atsparių (MDR) bakterijų padermių atsiradimas ir greitas jų plitimas pasaulyje kelia grėsmę žmonių sveikatai 1, 2 . Ši krizė yra globali, kilusi dėl pakartotinio ir netinkamo narkotikų vartojimo visame pasaulyje 3, 4 . Šiai situacijai įveikti reikalingas naujas plataus spektro antibakterinis agentas su nauju taikiniu ir nauju metodu 5 . Antibiotikų kaupimąsi gramneigiamose bakterijose pirmiausia įtakoja du veiksniai: membranų pralaidumas ir išpūtimo aktyvumas 6 . Tyrimai pripažino, kad išpūtimo siurblių aktyvacija yra viena iš pagrindinių atsparumo daugeliui klasių antibiotikų priežasčių 7, 8 . Kitas iššūkis yra sunaikinti su plėvele susijusias ląsteles, kurios rodo aktyvuotą ištekėjimą ir pasižymi specifinėmis reakcijomis į stresą, kurios prisideda prie nuolatinių ląstelių atsiradimo 9, 10, 11, 12 . Klinikoje buvo pademonstruotas kombinuotas antibiotikų gydymas, kuris yra labiau vertinamas kaip projektavimo strategija. Sinergistinė sąveika yra naudinga, nes padidėjęs aktyvumas, todėl tam tikram vaisto kiekiui jie veiksmingiau slopina jautriems vaistams patogenų augimą 13, 14 . Dėl išpūtimo mechanizmų susiejimo su atsparumu antibiotikams, galima teigti, kad išpūtimo siurblio inhibitoriai (EPI) gali padėti sustiprinti antibakterinio vaisto poveikį. Ši hipotezė verčia mus ištirti bisbenzimidazolo, kartu su EPI, poveikį nukreipiant MDR bakterijų padermes, išliekančią populiaciją ir sėklines ląsteles, sudarančias bioplėvelę.

Mūsų grupė nustatė, kad bisbenzimidazoliai (BBZ) yra specifiniai topoizomerazės IA nuodų inhibitoriai, kurie neinhibuoja girazės, žmogaus topoizomerazės IB ir žmogaus topoizomerazės II fermentų 15 . Bakterinė topoizomerazė IA yra naujas vaisto taikinys ir manoma, kad inhibitoriai, sukurti šio fermento katalizinio aktyvumo skilimo relaliacijos pusiausvyrai palaikyti, yra baktericidiniai 16 . Mes pademonstravome 2- (3, 4-dimetoksifenil) -5- [5- (4-metilpiperazin-1-il) -1H-benzimidazol-2-il] -1H-benz-imidaz-oleo (DMA) ir 2 ′ - (4-propilpiperazin-1-il) -1H, 3′H-2, 5′-bibenzimidazolas (PPEF) kaip stiprus E. coli topoizomerazės IA nuodų inhibitorius 15 . Mūsų tyrimas parodė, kad PPEF sukelia Mg 2+ chelaciją, kurio IA topoizomerazė reikalauja suskaidytos DNR religacijai ir todėl veikia kaip baktericidinis agentas 17 .

Šis tyrimas parodo antibakterinį BBZ poveikį nosokomijos patogenams E. faecium, S. aureus, K. planticola, A. baumannii, P. aeruginosa ir Enterobacter sp. dažnai vadinamos „ESKAPE klaidomis“, kurios yra žinomos dėl didelio atsparumo daugelio vaistų 18, 19, 20 . Čia buvo tiriamas PPEF poveikis išpūtimo siurbliams, siekiant pašalinti atsparias padermes. Be to, buvo ištirtas svarbus PPEF ir išpūtimo siurblio inhibitoriaus CCCP sinergizmo aspektas ir atliktas šių molekulių poveikis kartu ir atskirai nuolatinėms populiacijoms, sėdimoms ląstelėms ir jų efektyvumas in vivo.

Šiame kontekste mes siekėme ištirti antibakterinį BBZ poveikį ir palyginome jo efektyvumą esant išpūtimo siurblio inhibitoriui CCCP. Svarbus PPEF ir CCCP sąveikos aspektas buvo įrodytas ir patvirtintas skirtingais in vitro ir in vivo tyrimais.

Rezultatai

Antibakterinis BBZ aktyvumas prieš MDR padermes

Šiame tyrime buvo įvertintas 6 galingų BBZ antibakterinis aktyvumas prieš įprastus MDR žmogaus patogeninius štamus Klebsiella sp., A. baumannii, S. typhimurium, Enterococcus sp., S. aureus, S. flexineri, P. aeruginosa, Enterobacter. sp. ir Providencia sp. (1 ir 2 lentelės). Visų surinktų bakterijų padermių atsparumo vaistams profiliavimas buvo nustatytas pagal CLSI rekomendacijas ir dauguma jų buvo stebimos kaip MDR padermės (papildomos lentelės S1 ir S2) 21 . Rezultatai rodo, kad tyrime naudojami BBZ nėra specialiai nukreipti į gramneigiamas bakterijas, bet taip pat pasižymi žymiai geru antibakteriniu aktyvumu prieš gramneigiamus bakterijų štamus, apimančius patogeninius Enterococcus sp., S. aureus ir meticilinui atsparų Staphylococcus aureus (MRSA). ) kamienai (2 lentelė). Be to, buvo nustatyta, kad šie šeši BBZ yra baktericidinio pobūdžio (papildomos S3 ir S4 lentelės). MIC vertės rodo, kad PPEF yra pats galingiausias plataus spektro antibakterinis agentas iš šešių tyrime naudojamų junginių.

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

De novo sukurtas atsparus E. coli K12 mutantas prieš PPEF rodo aktyvuotą ištekėjimą kaip atsparumo mechanizmą

Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti, ar atsparios PPEF mutacijos gali pasirodyti de novo ir perimti normalią bakterijų populiaciją. Ir toliau, jei buvo gauti atsparūs mutantai, tada atskirti atsparius mutantus apibūdinimui. De novo kartos mutantams E. coli K12 ląstelės buvo tiriamos su subtaltaline PPEF doze palaipsniui didinant dozę ir po ~ 900 kartų buvo sukurta populiacija atsparių E. coli K12 ląstelių, galinčių atsispirti 64 μg / ml. PPEF, atitinkančio 8XMIC jautrių E. coli K12 (MIK 8 μg / ml) štamų (papildoma S5 lentelė).

Iššifruoti tokiu būdu sukurtą pasipriešinimo mechanizmą; buvo tiriamos PPEF atsparios E. coli K12 ląstelės dėl tikslinės specifinės topoizomerazės IA mutacijos - strategija, kurią bakterijos paprastai pritaikė, kad sukurtų atsparumą specifiniam antibiotikui. Tačiau mes nepastebėjome topoizomerazės IA geno sekos mutacijos, įskaitant regioną, apimantį tris promotorius, esančius priešais topoizomerazės IA geną PPEF atspariuose E. coli K12 štamuose. Toliau tiriant atsparumo priežastį, buvo tiriami santykinės genų ekspresijos pokyčiai, lemiantys ištekėjimą, antplūdį ir stresą. Atsparus E. coli K12 parodė išpūstų genų tolC, acrA, acrB, emrA, emrB ir mdfA padidėjusį reguliavimą ir sumažino porų ompC ir ompF reguliavimą , palyginti su negydytu E. coli K12 štamu (kontrolė) (1a pav. ). Be to, taip pat pastebima, kad MDR E. coli padermės, turinčios didesnes MIK reikšmes, palyginti su PPEF (papildoma S6 lentelė), rodo per daug išreikštus genus, susijusius su ištekėjimu (1b pav.), Greičiausiai, jų pritaikytą atsparumą vaistams. Gydant poodinę mirtiną PPEF dozę (1 / 4XMIC), pastebimai padidėjo efflux geno ekspresija. Mūsų rezultatas rodo, kad trijų valandų trukmės PPEF poveikis padidina ištekėjimo genų ekspresiją, reikšmingai lydimą porino genų sumažėjusio reguliavimo (1c pav.). Taip pat buvo pastebėta, kad ciprofloxacinu gydomos E. coli K12 ląstelės rodo reikšmingą ištekėjimo geno acrA, acrB ir tolC reguliavimą (papildomas S1 pav.). Mūsų rezultatas rodo, kad PPEF buvo tiriamas MDR ištekėjimo pompa, nes buvo suaktyvinta dauguma genų, atsakingų už ištekėjimą, o tai buvo pastebėta ir ciprofloksacinu gydytų E. coli K12 ląstelių atveju.

Image

Santykinė genų ekspresijos analizė ( a ) E. coli K12 (kontrolė) ir de novo sukūrė PPEF atsparų E. coli K12, išmatuotą qPCR. b ) E. coli K12 (kontrolinis) ir MDR E. coli izoliatai. c ) E. coli K12 (kontrolinis) ir E. coli K12, apdoroti ¼ XMIC PPEF 30 minučių, 1 h ir 3 h. Rezultatai pateikiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD (n = 3). Statistinis palyginimas tarp kontrolinės ir eksperimentinių sąlygų buvo statistiškai reikšmingas, kai * p <0, 01. Išsamios statistiškai reikšmingos kontrolinės p reikšmės vs. nurodomi eksperimentiniai.

Visas dydis

PPEF veikiami ištekėjimo siurbliai

Norėdami dar labiau patvirtinti savo pastebėjimą, mes ištyrėme PPEF kaupimosi kinetiką E. coli K12 ląstelėse ir PPEF atspariose E. coli K12 ląstelėse, esant arba neturint išpūtimo siurblio inhibitoriaus (CCCP). Kaupimosi kinetikai nustatyti buvo naudojama fluorescencinė spektroskopija, nes PPEF yra fluorescencinė aktyvioji molekulė, todėl jungdamasis su DNR, pasižymi dideliu fluorescenciniu intensyvumu, reiškiančiu didesnį PPEF kaupimąsi bakterijų ląstelėse. Pagal mūsų rezultatus, de novo sugeneruotas PPEF atsparus E. coli K12 parodė mažesnį PPEF kaupimąsi, palyginti su negydytomis E. coli K12 ląstelėmis. Be to, kai kartu buvo naudojamas ištekėjimo siurblio inhibitorius CCCP, ląstelėse PPEF kaupėsi daugiau (2a pav.). Iš E. coli K12 gaunami išstumti mutantai Δ tolC , Δ acrA ir em emrA taip pat parodė žymiai didesnį PPEF kaupimąsi ląstelėse (2b pav.).

Image

Nuo laiko priklausanti PPEF kaupimosi ir bakterijų ląstelių žūties analizė, atliekant fluorometrinę analizę, srauto citometriją ir laiko žūties analizę. a ) PPEF kaupiantis E. coli K12 ir de novo, susidarė PPEF atsparus E. coli K12, esant 30% inkubacijos laikotarpiui, kai nėra CCCP. ( b ) PPEF kaupimasis E. coli K12 ir Δ tolC , ΔompC, Δ acrA , Δ emrA ir Δomp F išvestų E. coli K12 mutantuose. c ) PI įsisavinimo procentas, apskaičiuotas srauto citometru E. coli K12 ir kituose išvestiniuose mutantuose, apdorotuose PPEF 5 ir 15, 30, 45 ir 60 minučių taškais. Rezultatai pateikiami trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu (± SD) (n = 3). d ) E. coli K12 ir gautų mutantų, apdorotų PPEF, procentas (%). Šie duomenys parodo trijų nepriklausomų eksperimentų (n = 3) vidurkį (± SD).

Visas dydis

Toliau stebėjome ląstelių žūties kinetiką, nustatydami propidium jodido (PI) sunaudojimą ląstelėse, apdorotose 1XMIC PPEF, skirtinguose laiko taškuose 0, 5, 15, 30, 45 ir 60 min., Taikant srauto citometriją. Didelis PI įsisavinimas rodo didesnį baktericidinį aktyvumą, kuris buvo patvirtintas skaičiuojant kolonijas apkaliant mėginius. Efflux išbraukti E. coli K12 mutantai Δ tolC , Δ acrA ir Δ emrA parodė didesnį PI įsisavinimą, tuo tarpu PPEF atsparios E. coli K12 ląstelės parodė mažesnį PI įsisavinimą (2c pav.). Laiko žudymo tyrimas buvo atliktas, norint patvirtinti E. coli K12 ir iš E. coli K12 gautų (Δ acrA , Δ emrA , Δ tolC , Δ ompC ir Δ ompF ) mutantų žudymo kinetiką, kuri buvo sekama 24 valandas. Jei PPEF buvo apdorotos E. coli K12 ląstelės, 0% gyvybingų ląstelių buvo gauta po 3 valandų gydymo, tuo tarpu iš eflukso geno išbraukti E. coli K12 mutantai Δ tolC , Δ acrA ir Δ emrA parodė 0% ląstelių atsistatymą per 1 h nuo PPEF gydymas. Tačiau PPEF atsparių E. coli K12 ląstelių atveju 0% gyvybingų ląstelių atsistatymas buvo pastebėtas 12 val. Po apdorojimo (2d pav.). Fluorescencinės mikroskopijos vaizdai patvirtina didesnį PPEF kaupimąsi ir lemia didesnę ląstelių mirtį. PPEF apdorotas E. coli K12 ir jo išvestiniai mutantai demonstravo mėlyną fluorescenciją, o negyvos ląstelės - raudonai fluorescenciškai tirdamos PI prieš dažymą. Sujungtame paveiksle purpurinės spalvos ląstelės rodo PPEF ir PI įsisavinimą. Ląstelės, kurios yra nudažytos PI, laikomos negyvomis ir buvo papildomai patvirtintos dedant mėginius. Mūsų rezultatas rodo, kad žymiai didesnis PPEF kaupimasis Δ tolC E. coli K12 mutantuose lemia didesnę ląstelių mirtį, tačiau mažesnis mėlynos fluorescencijos intensyvumas dėl PPEF įsisavinimo de novo sukurtuose PPEF atspariuose E. coli K12 štamuose rodo aktyvų ištekėjimą ir taigi mažesnė ląstelių mirtis šioje padermėje (3 pav.).

Image

Parodyti reprezentatyvūs E. coli K12 ir E. coli K12 (Δ tolC , Δ ompC ir Δ ompF ) mutantų, aptiktų junginio PPEF signalo emisijos bangų ilgių diapazone 450–500 nm, 610–750 nm, PI signalo, ir sujungtų vaizdų vaizdai. . Bakterijos, pasižyminčios mėlyna fluorescencija, rodo PPEF įsisavinimą, o raudona arba violetinė fluorescencija rodo pažeistą membraną ir yra laikomos negyvomis ląstelėmis.

Visas dydis

PPEF kartu su CCCP pasižymi sinergetiniu / adityviu poveikiu daugumai bakterijų padermių

In vitro PPEF ir CCCP poveikis deriniuose buvo tiriamas naudojant šaškių lentelės skiedimo metodą. Tarp derinių mes pastebėjome sinergetinį / priedinį poveikį daugumai šiame tyrime naudotų bakterijų padermių (3 lentelė). Pastebėta, kad PPEF, vartojamas kartu su išpūtimo siurblio inhibitoriumi CCCP, parodė MIC> 4 kartus mažesnį nei daugumos patogeninių bakterijų padermių MIK.

Pilno dydžio lentelė

Kombinuotas gydymas užmuša nuolatinių ląstelių subpopuliaciją ir slopina biofilmų formavimąsi

Ląstelių žudymo kinetika yra svarbus parametras norint suprasti antimikrobinių medžiagų veiksmingumą. Čia žudomi tik PPEF, CCCP ir PPEF bei CCCP deriniai su labai atspariais bakterijų štamais Providencia sp. (MCC2102), A. baumannii (MTCC1920), P. aeruginosa (MTCC1688), K. planticola (MTCC2272), E. coli (ATCC25922) ir Enterococcus sp. (MCC2105) buvo tiriamas esant ląstelių tankiui 10 4 CFU / ml (4 pav.). Tiek PPEF, tiek CCCP parodė baktericidinį poveikį tirtoms padermėms. Pastebėtas 3 log 10 kolonijų skaičiaus sumažėjimas visose bakterijų padermėse po 24 val., Kai buvo atskirai gydomas PPEF ir CCCP. Tačiau kartu vartojant, poveikis sumažėjo> 5log10 per 8 valandas po gydymo. Ląstelių procentas, išgautas po aukščiau aprašyto gydymo, buvo nustatytas kiekvienai deformacijai pagal laiko žudymo kreivę. Mes pastebėjome, kad kartu sumažėjo PPEF, CCCP ir PPEF, CCCP ir bakterijų padermių procentinis gyvybingumas (4 pav.). Išskyrus A. baumannii (MTCC1920), visos tyrime naudotos bakterijų rūšys parodė, kad ląstelių atsistatymas mažiau nei 30% per 1 valandą, kai buvo apdorotos PPEF ir CCCP kartu. Tačiau> 50% bakterijų ląstelių buvo atgautos, kai atskirai 1 val. Buvo apdorotos PPEF ir CCCP. Pastebėta ~ 0% ląstelių atsistatymo po 3 valandų gydymo, kai PPEF buvo naudojamas kartu su CCCP, daugeliu atvejų, išskyrus A. baumannii (MTCC 1920). A. baumannii (MTCC 1920) atveju 0% ląstelių atsistatymas buvo pastebėtas 8 val. Individualus gydymas PPEF parodė patvarių ląstelių pogrupio išgyvenimą (4 pav., Grafiko intarpas). Bet, jei buvo derinys, 0% ląstelių buvo atsigauta po 8 valandų gydymo, o tai rodo, kad PPEF ir CCCP derinys yra nuolatinė bakterijų populiacija.

Image

Laiku užmuštos bakterijų kreivės, kurių įdėtas procentas (%) KSV atsigauna po gydymo 1XMIC PPEF, ½XMIC CCCP ir 1XMIC PPEF + ½XMIC CCCP deriniu. Tam tikrais laikotarpiais po gydymo gyvos ląstelės buvo suskaičiuotos, naudojant plokštelių skaičiavimo metodą. a ) Providencia sp. MCC2102 ( b ) Pseudomonas aeruginosa MTCC1688 ( c ) Acinetobacter baumannii MTCC1920 ( d ) Enterococcus sp. MTCC2105 ( e ) Klebsiella planticola MTCC2272 ( f ) E. coli ATCC25922. Pradinė diagrama rodo, kiek procentų išgautų CFU yra trijų nepriklausomų eksperimentų (n = 3) vidurkis (± SD).

Visas dydis

Taip pat buvo įvertinta sinergetinė kompozicija atliekant anti-biofilmų tyrimą prieš P. aeruginosa MTCC1688. Biofilmų biomasės kiekybinis įvertinimas parodė, kad PPEF ir CCCP deriniai buvo geresni už slopinant bioplėvelės formavimąsi ir ardo iš anksto suformuotas bioplėves, nei atskirai PPEF ar CCCP (5a ir b pav.). Šiame tyrime mes taip pat nustatėme gyvybingų biofilmų ląstelių procentinę dalį atlikdami MTT tyrimą. PPEF ir CCCP kartu parodė reikšmingą bioplėvelės ląstelių žudymą (90–95%), palyginti su neapdorota kontrole (5c ir d pav.).

Image

a ) Biofilmo slopinimo tyrimas esant (1XMIC) PPEF, (1XMIC) CCCP, derinyje su (1XMIC) PPEF ir (1 / 2XMIC) CCCP, derinyje su (1XMIC) CCCP ir (1 / 2XMIC) PPEF ir 1XMIC ciprofloksacinu . b ) Iš anksto suformuotas bioplėvelės naikinimo tyrimas, esant (1XMIC) PPEF, (1XMIC) CCCP, derinyje su (1XMIC) PPEF ir (1 / 2XMIC) CCCP, derinyje su (1XMIC) CCCP ir (1 / 2XMIC) PPEF ir 1XMIC ciprofloxacinas. c ) Biofilmą sudarančių gyvybingų ląstelių procentas, nustatytas MTT, atsižvelgiant į kontrolę esant (1XMIC) PPEF, (1XMIC) CCCP, derinant (1XMIC) PPEF ir (1 / 2XMIC) CCCP, derinyje su (1XMIC) CCCP ir (1 / 2XMIC) PPEF. d ) Gyvų gyvybingų ląstelių procentas, apdorotas po to, kai susidaro bioplėvelė, MTT sumažinant iki netirpios formazano, palyginti su kontroliniais mėginiais, esant (1XMIC) PPEF, (1XMIC) CCCP, kartu (1XMIC) PPEF ir (1 / 2XMIC). CCCP, kartu su (1XMIC) CCCP ir (1 / 2XMIC) PPEF. Pateikti trijų nepriklausomų eksperimentų (n = 3) rezultatai, pateikti kaip vidurkis ± SD. Statistinė analizė buvo atlikta vienpusiu ANOVA būdu, po kurio buvo atliktas du „ne“ testai. Žvaigždutės (*) rodo statistinį reikšmingumą, o (* P ≤ 0, 05) vertės laikomos reikšmingomis. Išsamios statistiškai reikšmingos kontrolinės p reikšmės vs. nurodomi eksperimentiniai.

Visas dydis

Individualus ir kombinuotas PPEF ir CCCP gydymo toksiškumas in vitro HEK293T ir NIH / 3T3 ląstelių linijoms

Tyrimui buvo pasirinktos transformuotos žmogaus embrioninės inkstų ląstelės (HEK-293T) ir pelių embriono fibroblastų ląstelės (NIH / 3T3). Mes atlikome abi ląstelių linijas ląstelių išgyvenimo tyrimui, kai koncentracija buvo 0, 0, 5, 2, 8 ir 32 μg / ml, 24 valandas ir stebėjome nuo dozės priklausomą citotoksiškumą (6a pav.). NIH / 3T3 ląstelių gydymas 0, 5 ir 2 μg / ml PPEF ir CCCP parodė atitinkamai 44, 97 ir 20, 74% ląstelių išgyvenamumą. Tačiau HEK293-T, 63, 81 ir 22, atitinkamai 32% PPEF ir CCCP ląstelių išgyvenamumo atvejų buvo nustatyta. Be to, norint įvertinti bendrą PPEF ir CCCP citotoksiškumą in vitro , buvo pasirinktos dvi PPEF + CCCP {(0, 5 + 0, 5 μg / ml) ir (2 + 2 μg / ml)} dozės. Pastebėjome 50 ir 5% gyvybingų ląstelių HEK293T ir 37 ir 10% NIH / 3T3 atitinkamai naudojant aukščiau minėtą kombinuotą PPEF ir CCCP dozę (6b pav.).

Image

a ) Reprezentatyvus plokštelių, kuriose yra nudažytos kolonijos, apdorotos tik PPEF ir CCCP ir kartu 24 valandas, vaizdas. ( b )% NIH / 3T3 ir HEK293T ląstelių gyvybingumas, esant nurodytoms PPEF, CCCP ir PPEF + CCCP koncentracijoms. Eksperimentai pateikiami kaip vidurkis ± SD (n = 3). Statistinė analizė buvo atlikta vienpusiu ANOVA būdu, po kurio buvo atliktas du „t“ testai. Žvaigždutės (*) rodo statistinį reikšmingumą, o (* P ≤ 0, 05) vertės laikomos reikšmingomis. Išsamios statistiškai reikšmingos kontrolinės p reikšmės vs. nurodomi eksperimentiniai. ( C ) 3 mg / kg kūno svorio PPEF, 3 mg / kg kūno svorio CCCP ir 3 mg / kg kūno svorio kūno svorio CCCP ir 3 mg / kg kūno svorio PPEF veiksmingumas in vivo pelių neutropeninės šlaunų infekcijos modelyje. Diagrama parodo Log 10 CFU / g šlaunies ir vaisto dozę Balb / c pelėms. Žvaigždutės (*) rodo statistinį reikšmingumą ir (* P ≤ 0, 05), kai n = 6 gyvūnai kiekvienoje grupėje. Išsamios statistiškai reikšmingos p vertės yra aprašytos žemiau: kontrolinis vs PPEF 0, 8204, kontrolinis vs CCCP 0, 0000126, kontrolinis vs PPEF + CCCP 0, 000000000603, CCCP vs PPEF + CCCP 0, 00000000243, PPEF vs PPEF + CCCP 0, 000000000120.

Visas dydis

In vivo veiksmingumas patvirtina kombinuotą PPEF ir CCCP terapiją neutropeninės šlaunų infekcijos modelyje Balb / c pelėms

Žadantys in vitro tyrimų rezultatai paskatino ištirti PPEF ir CCCP sinergetinės sudėties veiksmingumą in vivo . Neutrapeninės šlaunų infekcijos modelyje PPEF buvo galingesnis už ciprofloksaciną nei E. coli ATCC25922 (papildomas S4 pav.). Sinergetinė kompozicija buvo patikrinta naudojant neutropenijos šlaunies modelio infekciją E. coli ATCC25922. Šiame tyrime mes vartojome tą pačią 3 mg / kg kūno svorio CCCP ir PPEF 21 dozę. Abiem atvejais stebėjome bakterijų apkrovos sumažėjimą 1 log. Tačiau kai mes vartojome 3 mg / kg kūno svorio PPEF kartu su 3 mg / kg kūno svorio CCCP, stebėjome, kad bakterijų skaičius sumažėjo 6 log 10 (6c pav.). Sukurtas modelis patvirtina sustiprintą antibakterinį kombinuotos terapijos aktyvumą.

Diskusija

Ankstesniame tyrime mes apžiūrėjome 24 BBZ antibakterinį aktyvumą prieš vandenyje esančius ir klinikinius E. coli izoliatus, surinktus iš UTI pacientų mėginių, ir stebėjome šešis junginius, būtent PPEF, PPVF, NNEF, PYRVF, PYMVF ir EPEF struktūras, pavaizduotas paveiksle (6 pav.). 7) būti stipriausiam 17 . Pastebėta, kad šie šeši junginiai yra stiprus E. coli topoizomerazės IA inhibitorius. Taigi mes nusprendėme toliau tikrinti šiuos šešis junginius nuo įprastų plataus spektro patogeninių bakterijų padermių. Antibakterinio aktyvumo rezultatai parodė, kad PPEF yra stipriausias plataus veikimo spektro antibakterinis agentas. Mūsų rezultatas rodo, kad propilo grandinė PPEF piperazino gale suteikia hidrofobiškumą molekulėms, reikalingoms prasiskverbti į bakterijų ląstelių membranos LPS barjerą. Kita vertus, PPEF fenilo žiedo para-etoksigrupė prisideda prie padidėjusio katijoninio junginio pobūdžio, kuris padeda junginiui sąveikauti su neigiamai įkrautomis bakterijos ląstelių sienelėmis. Nedaug kamienų, tokių kaip A. baumannii, Klebsiella spp. ir P. aeruginosa rodo palyginti aukštesnį šių junginių MIK. Ataskaita rodo, kad šių kamienų išorinis membranos pralaidumas yra mažesnis ir didesnė pašalinimo riba, rodanti atsparumo priežastį 22 . Šiame tyrime mes bandėme suprasti, kaip PPEF galėtų prisidėti kuriant mutantus. Gydydami padermes 2x, 5X ir 10XMIC iš PPEF, mes negavome S. aureus ir E. coli atsparių PPEF mutantų (papildomas S2 pav.). Bet, nuosekliai einant E. coli K12 padermę su sub-MIC PPEF doze, buvo gauta E. coli K12 ląstelių populiacija, kuri galėjo atsispirti ~ 8XMIC PPEF, palyginti su negydyta. Tačiau PPEF atsparios E. coli K12 ląstelės neparodė tikslinės specifinės topoizomerazės IA mutacijos. Tačiau buvo pastebėta, kad šios ląstelės per daug ekspresuoja ištekėjimo genus, kurie taip pat buvo stebimi MDR E. coli padermėse. Tolesnė sub-MIC dozės ekspozicija taip pat lemia reikšmingą padidėjusį efflux geno ekspresijos reguliavimą, kas rodo, kad PPEF yra išleidžiamas. Bakterijų išpūtimo sistemoms MFS, SMR, RND ir MATE reikalingas transmembraninis protono-judančiosios jėgos (PMF) elektrocheminis gradientas, kad būtų galima suaktyvinti narkotikų eksportą iš ląstelės 23 . CCCP veikia kaip protonoforas, dėl kurio sumažėja transmembraninis potencialas, kurį reikia išlaikyti ištekėjimo aktyvumui. Kadangi CCCP veikia kaip oksidacinio fosforilinimo cheminiai inhibitoriai, o tai, savo ruožtu, slopina ATP sintazės aktyvumą; todėl CCCP daro įtaką „ABC super-pump“ pompoms, kurioms taip pat reikalingas ATP, norint ištekėti. Ankstesnės ataskaitos rodo, kad CCCP išsklaido membranos protono varomąją jėgą, modifikuodamas transmembraninį elektrocheminį potencialą, sukeldamas didelį toksiškumą ląstelei 25, 26 . Kai bakterijų ištekėjimo aktyvumas buvo užginčytas ištekėjimo siurblio inhibitoriumi CCCP, buvo pastebėtas padidėjęs PPEF kaupimasis ir padidėjusi ląstelių žūtis. Panašus rezultatas buvo pastebėtas ir iš ištuštėjusių E. coli 12 gautų mutantų Δ acrA , Δ emrA ir Δ tolC atveju, kurie rodo, kad ištekėjimas bus inaktyvuotas. Tai padidina PPEF antibakterinį efektyvumą (papildoma S7 lentelė). Mūsų rezultatas rodo, kad PPEF kartu su CCCP rodo sinergetinį poveikį daugumai MDR patogeninių bakterijų padermių (7 pav.). Taip pat buvo pastebėta, kad ši sinergetinė kompozicija sunaikina patvarumus, kurie išauga iki viršutinės mutacijų atrankos lango ribos 27, 28, 29, 30. Šiuos nuolatinius gyventojus nenužudė vien tik PPEF, todėl jie greičiausiai galėjo prisidėti kuriant pasipriešinimą. Pastebėta, kad kai kurie iš štamų, tokių kaip A. baumannii, P. aeruginosa ir S. aureus , formuoja bioplėveles, kad būtų atsparūs antibakteriniams agentams. Šiame tyrime mes pademonstravome, kad sinergetinė kompozicija taip pat gali nukreipti bioplėvelės formavimąsi ir gali išnaikinti P. aeruginosa (MTCC1688) suformuotą bioplėvelę. Be to, abu vaistai kartu gali žymiai sunaikinti biofilmą sudarančias ląsteles. Ankstesnėje mūsų ataskaitoje buvo įrodytas PPEF veiksmingumas pelėms, auginančioms Balb / c. Tai rodo, kad E. coli ATCC25922 užkrėstos pelės buvo gydomos 5 mg / kg kūno svorio PPEF, todėl 50% pelių išgyveno ir rodo, kad ED 50 yra 5 mg. / kg / kg, dar 5 mg / kg kūno svorio PPEF nustatyta, kad neutropeninės šlaunų infekcijos modelyje sumažėjo bakterijų skaičius 3 log 10 . Šiame tyrime šlaunų infekcijos modelis patvirtina kombinuotą PPEF ir CCCP terapiją pelėms, užkrėstoms E. coli ATCC25922, labai efektyviu, reikšmingai sumažindamas bakterijų kolonijas sudarančių vienetų 6 log10.

Image

a ) PPEF ir CCCP derinio terapijos sustiprinto antibakterinio aktyvumo ir efektyvumo schema. b ) Bisbenzimidazolių cheminės struktūros.

Visas dydis

Išvados

Šis tyrimas rodo antibakterinį BBZ poveikį tiek gramneigiamoms, tiek gramneigiamoms bakterijoms. Pastebėta, kad PPEF yra pats galingiausias antibakterinis agentas. Be to, PPEF nesukelia tikslinės topoizomerazės IA mutacijos, bet yra veikiamas ištekėjimo. Rezultatas rodo, kad blokuojamas ištekėjimo siurblys padidintu PPEF antibakteriniu veiksmingumu prieš MDR bakterijų padermę. Abu junginiai kartu naikina nuolatinę populiaciją ir bakterijų ląsteles su aktyvuotu ištekėjimu. Pastebėta, kad sinergetinė kompozicija slopina biofilmo formavimąsi ir gali išnaikinti P. aeruginosa suformuotą bioplėvelę. Be to, PPEF ir CCCP kartu gali žymiai sunaikinti bioplėvelės ląsteles. Padidėjęs kombinuotos terapijos veiksmingumas in vivo rodo, kad siekiant sukurti antibakterinius vaistus nuo mirtinų MDR bakterijų padermių, gali būti naudojama BBZ derinio su išpūtimo pumpuramaisiais strategija.

Metodai

Medžiagos

E. coli (ATCC25922) buvo įsigytos iš „Himedia ltd“, „ Acinetobacter baumannii“ (MTCC1920), „ Pseudomonas aeruginosa“ (MTCC1688), „ Klebsiella planticola“ (MTCC2272), „ Salmonella typhimurium“ (MTCC1251), „ Shigella flexner Cha“ ir „MTCC1412“. Enterococcus sp. (MCC2105) buvo įsigytas iš NCCS, Pune. MDR klinikiniai gramneigiami štamai Staphylococcus sp. (S1016 ir S976) pateikė dr. Rajni Gaind, Vardhman Mahavir medicinos koledžo Mikrobiologijos katedra, Naujasis Delis. MDR klinikinės gramneigiamos padermės A. baumannii (AB387), P. aeruginosa (PS162), Klebsiella sp. (K1164), S. typhimurium (ST412) buvo gautos iš Patologijos instituto, Safdarjung ligoninės, Naujajame Delyje, nacionalinės įstaigos. Govt. Indijos. Naujasis Delis, dr. S. Chowdhury, CSIR-IGIB, mūsų tyrimui padovanojo S. aureus MCC 740 ir MRSA ATCC43300 padermes. Iš E. coli K12 išvestų mutantų Δ ompC (CGSC 9781), Δ ompF (CGSC 8925), Δ emrA (CGSC 10098), Δ acrA (CGSC 11843), Δ tolC (CGSC 11430) ir E. coli K12 (CGSC 5073) buvo. gautas iš E. coli genetinių išteklių centro, Jeilio universitete, JAV. Antibiotikai (ampicilinas, kanamicinas, chloramfenikolis, ciprofloksacinas, gentamicinas, nalidikso rūgštis, tetraciklinas, trimetoprimas ir streptomicinas) buvo įsigyti iš „Sigma“, o Muellerio Hintono sultinys ir agaras buvo įsigyti iš „Hi Media“. Balb / c pelės buvo įsigytos iš Nacionalinio mitybos instituto, Hyderabad. Jawaharlal Nehru universiteto gyvūnų laikymo patalpoje gyvūnai buvo prižiūrimi kontroliuojamomis sąlygomis ir turėjo galimybę nemokamai gauti maisto bei vandens. Visus eksperimentus su gyvūnais patvirtino Jawaharlal Nehru universiteto (Naujasis Delis, Indija) IAEC, atliktus naudojant etines ir ARRIVE rekomendacijas.

Antibakterinio jautrumo testas

Minimali slopinanti koncentracija (MIC) ir minimali baktericidinė koncentracija (MBC) buvo nustatyta, kaip rekomenduojama CLSI 31 gairėse. Bakterijų suspensijos po 1, 0 × 106 KSV / šulinyje buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles (Corning® 96 šulinėlių skaidraus polistireno mikrotinklines plokšteles), esant BBZ ir tyrime naudojamiems antibiotikams, esant 0, 25, 0, 5, 1, 2, 4 koncentracijai., 8, 16, 32, 64, 128 μg / ml ir inkubuojami 37 ° C temperatūroje 24 valandas. MIC vertės buvo įvertintos kaip minimali koncentracija, kurioje nebuvo pastebėtas matomas bakterijos augimas ir kurios buvo aptiktos „Tecan“ mikrolėkštės skaitytuvu, esant 600 nm bangos ilgiui.

MBC reikšmės buvo nustatomos dengiant 100 μL kiekvieno skaidraus šulinio iš MIC mikro sultinio plokštelės, kuri buvo inkubuota 24 valandas 37 ° C temperatūroje Mueller - Hinton agaro plokštelėse be antibakterinio junginio per naktį 37 ° C. MBC galutiniai taškai buvo apibrėžti kaip mažiausias junginio praskiedimas, dėl kurio 99, 9% bakterijų ląstelės buvo užmuštos iš pradinio 32 inokulio.

De novo atsparių mutantų generacija

PPEF atsparūs E. coli K12 mutantai buvo sukurti pagal ankstesnį metodą su nedideliais pakeitimais, kaip aprašyta žemiau 33 . Iš vienos nakties kultūrų iš nepriklausomų kolonijų buvo pradėtos trys eilutės, naudojant pradinį skaičių ~ 10 4 E. coli K12 ląstelių. Ląstelės buvo serijiniu būdu praeinamos 1000 kartų skiedžiant 1 ml serijos kultūromis kas 24 valandas 900 kartų Mueller-Hinton terpėje, kurioje yra PPEF. Šių ląstelių pogrupiai buvo restauruojami Mueller-Hinton agare, kuriame buvo tokios pat koncentracijos PPEF, kad būtų patvirtinta, kad jie yra atsparūs. Po 900 kartų buvo gauta E. coli K12 ląstelių populiacija, galinti atsispirti 64 μg / ml PPEF, tai yra lygu 8XMIC jautriam E. coli K12 štamui.

Mutacijos nustatymas nustatant topoizomerazės IA geno DNR seką

Genominė DNR iš de novo sukurtų atsparių E. coli K12 mutantų buvo išskirta iš 5 ml per naktį išaugintos kultūros, naudojant QIAGEN rinkinį pagal gamintojo protokolą. Visas E. coli topoizomerazės IA genas buvo amplifikuotas naudojant PGR. Amplifikuoti DNR produktai buvo išskaidyti elektroforezės būdu 1% agarozės gelių, turinčių etidžio bromido. Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) produktai buvo išgryninti naudojant QIAGEN gelio ekstrahavimo rinkinį (papildomas S3 pav.). Išgryninti amplikonai buvo apdoroti sekos nustatymui, naudojant automatizuotą sekavimo įrenginį (Applied Biosystems; Lab India, Gurgaon, India). Neapdorotas E. coli K12 mėginys buvo naudojamas kaip kontrolinis. Sekos buvo lyginamos su mutacijų tikrinimu naudojant EMBOSS vandenų internetinę programinę įrangą. Pradmenų, naudojamų topoizomerazės geno sekai, sąrašas pateiktas (papildoma S8 lentelė) ir buvo suprojektuotas pagal seką, apie kurią pranešta anksčiau.

Genų ekspresijos kiekybinis įvertinimas naudojant realiojo laiko kiekybinį PGR (qPCR)

Visa RNR buvo ekstrahuota iš E. coli ląstelių, naudojant RNeasy Mini Kit (Qiagen). Atlikta atvirkštinė transkripcija, norint gauti cDNR, naudojant „Accuscript“ cDNR sintezės rinkinį (Agilent Technologies) su atsitiktiniais pradmenimis pagal standartinį protokolą. Tikslinio geno ekspresijos lygis buvo išmatuotas kiekybiniu PGR Brilliant II SYBR Green QPCR pagrindiniu rinkiniu (Agilent Technologies) 7500 realaus laiko PGR sistemoje (taikoma biosistema). Santykinė genų ekspresija buvo įvertinta naudojant 2- ΔΔCT metodą, kad būtų galima apskaičiuoti geno ekspresijos pokyčius raukšle . Transkripcijos lygio normalizavimas atliktas lyginant glicerraldehido 3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH), namuose laikančio geno, kaip endogeninės kontrolės, raišką. Tyrime naudojami pradmenys yra tokie patys, kaip anksčiau pranešta 35, ir yra išvardyti (papildomoje S9 lentelėje). Statistinė reikšmingumo analizė atlikta studentų t-testu ir apibūdinta kaip * p <0, 01.

Bisbenzimido kaupimosi tyrimas

Visų auginamų suspensijų OD 600 buvo sureguliuotas iki 0, 1, o į kiekvieną Corning® 96 Well Black juodumą su skaidraus plokščio dugno plokštelėmis buvo pasėjami 180 μL alikvotai. Į kiekvieną šulinėlį įpilama 1 μM galutinė PPEF koncentracija. Fluorescencija buvo nuskaityta iš šulinėlių viršaus, naudojant sužadinimo ir emisijos filtrus, atitinkamai 340 ir 475 nm, su 5 blyksniais / šulinyje; rodmenys buvo imami 30 ciklų su 60 sekundžių delsimu tarp kiekvieno ciklo, naudojant „Tecan Infinite Pro 200 Reader 36“ .

PPEF įsisavinimas ir ląstelių žūties analizė fluorescencine mikroskopija

Kultūros buvo apdorotos 1XMIC PPEF ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 1 valandą. 106 ląstelės buvo surinktos, išplautos ir pakartotinai suspenduotos 1 ml filtruotame PBS, pH 7, 3, 1 ml mėginio buvo pridėta 1 μg PI, po to inkubuojamos ant ledo 30 min. 37 . Po inkubacijos ląstelės buvo pastebėtos ant stiklinių stiklelių ir analizuotos naudojant Zeiss mikroskopą su 100x padidinimu, naudojant axio programinę įrangą. Ląstelės buvo analizuojamos naudojant dvigubą sužadinimą ultravioletiniu / 488 nm bangomis ir išmatavimas buvo matuojamas naudojant standartinius 461 ir 645 nm filtrus.

Ląstelių mirties analizė, naudojant srauto citometriją

Kultūros su ~ 106 ląstelių buvo apdorotos 1XMIC PPEF ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 0, 5, 15, 30, 45 ir 60 minučių. Kiekvienu laiko momentu buvo užfiksuota 50 000 PI pasisavinimo atvejų, naudojant „Becton Dickinson LSR Fortessa TM“ srauto citometrą 38 .

Šaškių lentos tyrimas

PPEF ir CCCP derinio sinergetinis poveikis buvo nustatytas tikrintojų lentos metodu, kaip aprašyta anksčiau 39 . Šiame tyrime buvo imtasi šių kombinacijų: 1 / 2XMIC fiksuoto CCCP ir dviejų kartų nuosekliųjų PPEF skiedimų, panašiai kaip 1 / 2XMIC iš fiksuoto PPEF ir dviejų kartų nuosekliųjų CCCP praskiedimų. Minimali slopinamoji koncentracija buvo nustatyta naudojant „Tecan“ mikrotekinių plokštelių skaitytuvą, esant 600 nm bangos ilgiui.

Derinio poveikis buvo apibrėžtas pagal FIC indeksą, kai FIC = FIC (PPEF) + FIC (CCCP), kur FIC (PPEF) yra PPEF MIC MIK derinyje / MIC tik PPEF, o FIC (CCCP) yra CCCP MIC kartu / CCCP MIC.

FIC aiškinimas; antagonistinis, jei FIC> 4, 0, abejingumas, jei FIC> 1 ir ≤ 4, priedas, jei FIC> 0, 5 ir ≤1, ir sinergetinis, jei FIC ≤ 0, 5 40, 41 .

Laiko žudymo tyrimas

Norint įvertinti PPEF, CCCP ir PPEF bei CCCP derinio poveikį bakterijų augimui, pagal NCCLS 42 standartus buvo sudaryta laiko ir atsako augimo kreivė. 1 ml bakterijų suspensijos, kurių ląstelių tankis yra 107 CFU mL -1, buvo veikiamos PPEF (1XMIC), CCCP (0, 5XMIC) ir PPEF (1XMIC) ir CCCP (0, 5XMIC) deriniu. Į kontrolinį mėgintuvėlį buvo įpilta vienodo tūrio sterili miliQ vandens. Šios kultūros buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje, nuolat maišant, esant 200 aps./min. Sultinio alikvotai buvo surinkti skirtingais laiko momentais, nuosekliai skiedžiami druskos tirpalu, dedami ant MH agaro terpės ir 18 valandų auginami 37 ° C temperatūroje, kad būtų galima nustatyti bendrą kiekvienos kultūros KSV. Ląstelių procentas buvo apskaičiuotas dalijant iš apdorotų CFU, apskaičiuotą iš neapdorotų ląstelių, CFU, apskaičiuotą atitinkamais laiko momentais.

Antikinių plėvelių aktyvumo tyrimas ir ląstelių gyvybingumas skaičiuoja MTT ląstelių bioplėvelės ląsteles

Kaip aprašyta anksčiau, 43 bioplėvelių slopinimo tyrimai buvo atlikti pasėjant 100 μl bakterijų suspensijos (~ 10 CFU) į 96 šulinėlių plokštelių duobutes, esant 1XMIC PPEF, 1XMIC CCCP, 1XMIC PPEF + 1 / 2XMIC CCCP ir 1XMIC CCCP +1. / 2XMIC PPEF 24 val., Tuo tarpu atliekant iš anksto suformuoto bioplėvelės likvidavimo bandymą, 100 μL bakterijų suspensijoms (~ 10 CFU) pirmiausia buvo leista susidaryti bioplėvelei 24 valandas 37 ° C temperatūroje statinėje būsenoje, o tada suformuota bioplėvelė buvo inkubuota su 1XMIC PPEF., 1 / 2XMIC CCCP, 1XMIC PPEF + 1 / 2XMIC CCCP 24 valandas 37 ° C temperatūroje. Abiem atvejais bioplėvelės masė buvo įvertinta kristalų violetinės spalvos dažymo metodu.

Toliau gyvybingos biofilmo ląstelės buvo nustatytos MTT 44 tyrimu. Apdorojimo sąlygos buvo tokios pačios, kaip aprašytos biologinio plėvelės slopinimo tyrime ir iš anksto suformuotame biofilmo slopinimo tyrime. Po apdorojimo šulinėliai buvo plaunami PBS ir į kiekvieną duobutę įpilama 200 μl 0, 5 mg / ml MTT, esančio PBS. Pridėjus MTT, plokštelė 4 valandas buvo inkubuojama 37 ° C temperatūroje, po to pridedama 50 μl 25% natrio dodecilsulfato (SDS). Procentinis gyvybingumas buvo apskaičiuotas kontrolinių ląstelių atžvilgiu, matuojant absorbciją esant 595 nm bangos ilgiui.

Citotoksiškumo tyrimas in vitro

HEK293T ir NIH / 3T3 ląstelių gyvybingumas prieš PPEF, CCCP ir jų derinį buvo įvertintas atliekant klonogeninio išgyvenimo testą 45 . Abi ląstelės buvo pasėtos po 400 ląstelių kiekvienoje duobutėje šešių šulinėlių plokščio dugno Corning® costar® ląstelių kultūros plokštelėje. Po 20 val. Kiekvienas junginys buvo pridėtas 0, 5, 2, 8 ir 32 μg / ml koncentracijose. Kombinuotam PPEF ir CCCP gydymui buvo pasirinktos kiekvienos koncentracijos 0, 5 μg / ml ir 2 μg / ml. Po 24 valandų gydymo vaistai buvo pašalinti, nuplauti ir ląstelėms leista toliau augti 10 dienų, kad susidarytų kolonijos. Kolonijos buvo nudažytos 0, 5% krištolo violetinės spalvos ir skaičiuojamos rankiniu būdu.

Neutropeninis šlaunų infekcijos modelis pelėms „Balb / c“

Balb / c pelių patelėms n = 6 kiekvienai 20–25 g dozės grupei buvo padaryta neutropenija atliekant 2 intraperitoninius ciklofosfamido injekcijas po 150 mg / kg kūno svorio ir 100 mg / kg kūno svorio 4 dienas ir 1 dieną prieš bakterinę infekciją. Į dešinįjį užpakalinį šlaunies raumenį buvo sušvirkšta 0, 1 ml 106 CFU / ml bakterinės suspensijos. Po 2 valandų pelės buvo užkrėstos PPEF (3 mg / kg kūno svorio), CCCP (3 mg / kg kūno svorio) ir PPEF + CCCP (3 mg / kg kūno svorio + 3 mg / kg kūno svorio). ištirpinamas 0, 1 ml sterilaus vandens, švirkščiant į veną vieną boliusą. Dvidešimt keturias valandas po antibakterinio vartojimo pelės buvo humaniškai paaukotos. Kiekvienos pelės dešinieji šlaunies raumenys aseptiniu būdu buvo surinkti, homogenizuoti ir nuosekliai praskiesti ir apdoroti kiekybinėms kultūroms.

Statistinė analizė

Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± standartiniai trijų nepriklausomų eksperimentų nuokrypiai. Statistinė analizė atlikta atliekant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), o Tukey diapazono testas buvo taikomas duomenims, kurių reikšmingumo lygis nustatytas p <0, 05, analizuoti.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Sinha, D. et al . Bisbenzimidazolo ir karbonilcianido 3-chlorfenilhidrazono derinio sinergetinis veiksmingumas prieš MDR bakterijų padermes. Mokslas. Rep. 7, 44419; „doi“: 10.1038 / srep44419 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.