Sintetinis žmogaus ląstelių likimo reguliavimas baltymų valdomais rna jungikliais | gamtos komunikacijos

Sintetinis žmogaus ląstelių likimo reguliavimas baltymų valdomais rna jungikliais | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Apoptozė
  • Ribos jungikliai
  • Sintetinė biologija
  • Vertimas
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2012 m. Vasario 7 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Suprasti, kaip valdyti ląstelių likimą, labai svarbu biologijoje, medicinos moksle ir inžinerijoje. Šiame tyrime pristatome metodą, kai tarpląstelinis baltymas naudojamas kaip trigeris žmogaus ląstelių likimui reguliuoti. Įjungimo / išjungimo transliaciniai jungikliai, sudaryti iš tarpląstelinio baltymo L7Ae ir jį rišančios RNR motyvo, reguliuoja norimo baltymo ekspresiją ir kontroliuoja du skirtingus apoptozės kelius tikslinėse žmogaus ląstelėse. Kombinuotas jungiklių naudojimas parodo, kad specifinis baltymas gali tuo pačiu metu slopinti ir suaktyvinti dviejų skirtingų mRNR transliaciją: vienas baltymas pasiekia dviejų skirtingų baltymų / kelių pakilimą ir žemyn. Genomo koduotas baltymas, sulietas su L7Ae, kontroliavo apoptozę abiem kryptimis (mirtimi ar išgyvenimu), priklausomai nuo jo ląstelių išraiškos. Šis metodas gali išgydyti ląstelių defektus arba pagerinti naudingųjų molekulių gamybą ląstelėje, apeinant ar perjungiant vidinius signalų tinklus.

Įvadas

Žmogaus ląstelėse specifinis tikslinių baltymų gamybos reguliavimas po transkripcijos turi didelę reikšmę nustatant ląstelių fenotipus, tokius kaip augimas, proliferacija, diferenciacija ar užprogramuota ląstelių žūtis (apoptozė) 1, 2, 3 . Pavyzdžiui, keli tyrimai, kuriuose buvo lyginamas ekspresuotų mRNR ir baltymų kiekis eukariotinėse ląstelėse, parodė, kad mRNR išraiška tik silpnai koreliuoja su atitinkamo baltymo ekspresija, parodydama, kad baltymo ekspresija yra reguliuojama ne tik transkripcijos lygiu, bet ir po kelių poslinkių. -transkripcijos etapai, įskaitant transliacijos reguliavimą ir mRNR / baltymų skaidymą 1, 4, 5, 6 . Nors buvo pranešta apie daugybę sintezės būdų, kaip kontroliuoti transkripciją 7, 8, 9, 10, 11, iki šiol buvo pranešta tik apie keletą vertimo kontrolės būdų 11, 12, 13, 14, 15, 16 .

Ypač naudinga būtų sistema, leidžianti endogeniniu būdu ekspresuojamai molekulei, tokiai kaip baltymas, kontroliuoti tikslinio geno ekspresijos lygį. Metodas, kurio metu konkretus baltymas, pagamintas ląstelėje, gali tiesiogiai ir kiekybiškai sureguliuoti tikslinio (-ių) baltymo (-ų) gamybą, galėtų būti naudojamas apeiti ar persukti vidinius signalizacijos tinklus ir sukonstruoti naujas kaskadas ar grįžtamojo ryšio grandines ląstelių funkcijoms valdyti (1a pav. ) 17, 18 .

Image

a ) Scheminis šio tyrimo rezultatų vaizdas. Baltymas, užkoduotas genome, keičia transliacijos jungiklius ir reguliuoja vidinę apoptozės signalo kaskadą, kad kontroliuotų ląstelių likimą (mirtį ar išgyvenimą). b ) grandinės, sujungtos su vidinėmis apoptozės signalo kaskadomis, kurias reguliuoja jungikliai, schema. Du skirtingi (nuo mitochondrijų priklausomi ir nepriklausomi) apoptozės keliai, kontroliuojami L7Ae. L7Ae griežtai reguliuoja apoptozinių reguliavimo baltymų (tai yra, Bcl-xL, Bim, FADD), dalyvaujančių sudėtingose ​​vidinėse apoptozės signalo kaskadose, gamybą. Norint nustatyti ląstelių mirtį, reikia atlikti keletą signalų perdavimo kaskadų žingsnių ir aktyvuoti kaspazių rinkinį.

Visas dydis

Sintetiniai chimeriniai baltymai buvo naudojami perjungti ląstelių signalizacijos kelius, kad būtų galima kontroliuoti ląstelių fenotipą 19, 20, 21 . Pavyzdžiui, receptoriaus tirozinkinazės ErbB2 signalo perdavimas buvo perjungtas sujungiant adapterių baltymų Grb2 ir ShcA SH2 arba PTB domenus su FADD mirties efektoriaus domenu (Fas-Associated protein with Death Domain) 22 . Šioje sistemoje chimeriniai adapteriai perdavė signalą iš epidermio augimo faktoriaus (EGF) į kaspazės 8 priklausomą apoptozės kelią, kad sukeltų ląstelių žūtį. Tačiau kontroliuojami signalizacijos keliai yra tik tie, kurie naudoja turimus adapterio baltymus. Taip pat lieka nežinoma, ar ląstelėse ekspresuojamas baltymas gali būti naudojamas kaip įjungiamasis signalas norimo baltymo ekspresijos šiose sistemose reguliavimui.

Šiame tyrime mes pranešame apie pažangias baltymų valdomas transliacines reguliavimo ON / OFF sistemas, skirtas kontroliuoti žmogaus ląstelių likimą (1a, b pav.). OFF sistemos dizainas buvo pagrįstas mūsų anksčiau pranešta transliacijos represijų sistema 15, susidedančia iš archealinio ribosomų baltymo L7Ae ir jo surišančio RNR motyvo, C / D dėžutės posūkio (Kt) 23 . OFF sistemoje L7Ae, ekspresuojamas žmogaus ląstelėse, tiesiogiai ir kiekybiškai slopina tikslinio geno transliaciją. Taip pat buvo sukurta nauja L7Ae suaktyvinta transliacijos aktyvavimo (ON) sistema, skirta reguliuoti trumpų plaukų segtukų RNR (shRNR) apdorojimą. Mes sugebėjome efektyviai kontroliuoti apoptozę žmogaus ląstelėse su kiekviena sistema atskirai ir kartu. Pabaigoje mes parodėme naują požiūrį į žmogaus ląstelių likimo nustatymą, naudojant specifinį genomo užkoduotą baltymą, kuris tarnauja kaip ląstelės aplinkos indeksas (1a pav.).

Rezultatai

Kiekybinės transliacijos represijos gyvose ląstelėse

Pirmiausia mes ištyrėme, ar galime stebėti kiekybinę L7Ae transliacijos kontrolę atskirose gyvose ląstelėse. Buvo sukonstruotos dvi plazmidės: pKt- GFP -I- CFP , kurioje mRNR yra dėžutės C / D Kt motyvas, įterptas prieš EGFP koduojančios sekos AUG kodoną, ir pdKt- GFP -I- CFP , kuriame yra trūkumų. Kt motyvas. Dėl pKt- GFP -I- CFP EGFP gamybą kontroliuoja L7Ae ekspresija dėl L7Ae sąveikos su Kt motyvu. Kadangi ECFP gamyba iš IRES nepriklauso nuo L7Ae, EGFP ir ECFP signalų santykis rodo transliacijos represijų lygį (papildomas S1a pav.). Raudonas fluorescencinis baltymas (AsRed2) buvo sulietas su L7Ae (AsRed2-L7Ae), norint kiekybiškai įvertinti L7Ae ekspresijos lygį duomenims normalizuoti. Bendras transliacijos represijų efektyvumas visoje ląstelių populiacijoje patvirtino, kad OFF sistema yra labai efektyvi ir selektyvi (papildomas S1b pav.). Toliau mes išanalizavome efektyvumą atskirose ląstelėse. Rezultatai rodo, kad EGFP gamyba iš Kt -GFP -I- CFP mRNR buvo kiekybiškai ir selektyviai slopinama atskirose ląstelėse, atsižvelgiant į L7Ae ekspresijos lygį (papildomas S1c pav.). Taigi darome išvadą, kad transliacinio reguliavimo efektyvumas atitinka įvesto L7Ae baltymo ekspresijos lygį.

Ląstelių žūties kelių perprogramavimas naudojant OFF sistemą

OFF sistema buvo pritaikyta žmogaus ląstelių likimui kontroliuoti moduliuojant apoptozę reguliuojančių baltymų vertimą (1b pav.). Iš mitochondrijų priklausomi apoptozės keliai buvo naudojami vidiniams apoptozės keliams kontroliuoti (1b pav., Bcl-xL / Bim priklausomi keliai), nes pusiausvyra tarp proapoptotinio (tai yra Bim) ir antiapoptotinio (tai yra, Bcl-xL) Bcl- 2 šeimos baltymai lemia ląstelių likimą 24 . Būtent norint apoptozės kelius valdyti genų reguliavimu, reikia griežtos pro- ir antiapoptotinių baltymų raiškos pusiausvyros25. Pavyzdžiui, nesandari proapoptotinio geno išraiška apsunkina apoptozės slopinimą, nes ji sustiprina apoptozės signalus naudodama teigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmą 26, 27 . Norėdami valdyti L7Ae apoptozę, mes sukonstravome šias tris plazmides: pKt -Bcl-xL -I- GFP (antiapoptotinis agentas), pdKt -Bcl-xL -I- GFP (neigiamos kontrolės plazmidė, turinti trūkumų turinčią Kt) ir plazmidę. koduojantis Bim (p Bim , proapoptotinis agentas) (2a pav., papildomas S2 pav.). „Western blot“ analizė parodė, kad L7Ae, išreikštas HeLa ląstelėse, efektyviai slopina Bcl-xL raišką iš pKt -Bcl-xL-I- GFP (2b pav., 5 juosta), tačiau neturi įtakos defektuotam Kt mutantui, pdKt- Bcl -xL -I- GFP (2b pav., 7 juosta). Srauto citometrinė analizė patvirtino, kad Bcl-xL ekspresija iš pKt- arba pdKt -Bcl-xL -I- GFP efektyviai slopina Bim sukeltą apoptozę ląstelėse (2c pav., 2 juosta, palyginti su 3 ar 5 juosta). Be to, L7Ae sukėlė apoptozę sukeliantį signalą atitinkamose ląstelėse, skatindamas Bcl-xL transliacinį reguliavimą. L7Ae ekspresija sukėlė apoptozę specifiškai ląstelėse, kuriose yra ir pBim, ir pKt -Bcl-xL -I- GFP (2c pav., 4 juosta; papildomas S3 pav.). Ląstelių morfologijos analizė patvirtino, kad L7Ae sukėlė apoptozę slopindamas Bcl-xL raišką tikslinėse ląstelėse (2d pav., Kairėje, vidurinėje nuotraukoje), tuo tarpu normalus fenotipas buvo pastebėtas ląstelėms, kuriose yra kontrolinė plazmidė (2d pav., Dešinė, vidurinė). nuotrauka). Taigi L7Ae, ekspresuojamas ląstelėse, kuriose yra Kt -Bcl-xL mRNR, sukelia apoptozę, slopindamas Bcl-xL raišką.

Image

a ) Jungiklio įjungimo / išjungimo būsenų schema. Ląstelėse, kurios neišreiškia L7Ae, transliuotas Bcl-xL baltymas jungiasi su Bim, kad būtų išvengta apoptozės (ON būsena). L7Ae slopina Bcl-xL vertimą, o Bim apoptozės signalas gali tęstis (OFF būsena). ( b ) Bcl-xL raiškos Western blot analizė HeLa ląstelėse, kartu transfekuotose su pL7Ae ir p (d) Kt -Bcl-xL-I- GFP . Bcl-xL ir L7Ae buvo aptikti naudojant atitinkamai anti-Bcl-xL ir anti-myc antikūnus. c ) Srauto citometrinė analizė, atlikta praėjus 24 valandoms po bendro transfekcijos su pBim ir plazmidėmis, aprašytomis b punkte . Duomenys pateikiami kaip trigubų eksperimentų vidurkis ± sd. d ) fazių mikroskopiniai ląstelių, analizuotų c . Mastelio juosta reiškia 200 μm.

Visas dydis

Norėdami parodyti OFF jungiklio moduliarumą, sukūrėme alternatyvią sistemą, nukreipiančią ląstelių likimą link išlikimo, reguliuodami nuo mitochondrijų nepriklausomą apoptozės kelią (1b pav., FADD priklausomas kelias). FADD išraiška vaidina lemiamą vaidmenį sukeliant apoptozę šiame kelyje (1b pav., Dešinėje; papildoma S4 pav.) 28 . Mes bandėme panaikinti apoptozę, atmesdami FADD gamybą L7Ae sistema (papildomas S5a pav.). L7Ae veiksmingai ir konkrečiai sumažino apoptozę, slopindamas FADD, gauto iš pKt- FADD plazmidės, vertimą (papildomas S5b – f pav.). Šie rezultatai rodo, kad slopindama anti- arba proapoptozinių baltymų ekspresiją, OFF sistema gali atitinkamai nukreipti apoptozės kelią mirties ar išgyvenimo link.

Tikslinės mRNR sintetinis transliacinis aktyvinimas

Kaip ir OFF sistema, baltymų suaktyvinta transliacijos aktyvavimo sistema (ON sistema) turėtų veikti kaip „baltymų ir baltymų informacijos keitiklis“, perduodama įvesto baltymo (pvz., L7Ae) perduodamą informaciją į norimą išvestinį baltymą (pvz., Bcl-xL). Tokie keitikliai yra naudingi apeinant vidinius ląstelių signalizacijos kelius arba konstruojant sintetinius signalizacijos kelius (1 pav.) 19, 20 . Norėdami sukonstruoti ON sistemą žmogaus ląstelėse, mes sukūrėme ir sukonstravome sintetinę 29–30, 31 shRNR, turinčią siRNR ir Kt motyvą jos kamieno ir kilpos srityse (1 ir 3a pav.; Papildomas S6 pav.). Šią konstrukciją vadinsime Kt-shRNR. Šioje sistemoje Kt-shRNR yra suprojektuota taip, kad būtų pasiektas specifinis tikslinės mRNR skaidymas RNR interferencijos (RNR) dėka. Manoma, kad ląstelėje išreikštas L7Ae prisijungimas prie Kt-shRNR gali trukdyti nuo Dicer priklausančiam shRNR skaidymui, todėl L7Ae kontroliuoja tikslinę mRNR (3a pav.).

Image

a ) ON / OFF būsenų schema. ( b ) Sh- GFP nukreipimas į EGFP geną. Raudona seka papildo EGFP mRNR (1). „Sh-N“ buvo sukurtas taip, kad nesunaikintų jokio geno, ir koduoja stop-kodoną (geltonai) kiekviename kadre (2). Kt-Sh- GFP sukūrėme įtraukdami Kt motyvą į Sh- GFP kilpos sritį (3). „dKt-Sh- GFP“ yra netinkamas Kt motyvui kilpos srityje (4). c ) Kt-Sh- GFP (40 nM) ir L7Ae (0–640 nM) jungimosi afiniteto nustatymas naudojant gelio poslinkio testą. Kt-Sh- GFP ir L7Ae buvo sumaišyti transfekcijos buferyje, Opti-MEMI (Invitrogen) ir atskirti atliekant gelio poslinkio testą. ( d ) Specifinis Kt ir L7Ae surišimas slopino Dicer skilimo aktyvumą Kt-Sh- GFP . Esant L7Ae, Kt-Sh- GFP ir L7Ae sudarė RNP kompleksą ir užkirto kelią Dicer skilimui, tačiau mutantas dKt-Sh- GFP vis tiek buvo skaidomas. e ) santykinė EGFP mRNR koncentracija. ( f ) EGFP fluorescencijos intensyvumas HeLa ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose EGFP (HeLa-GFP). Jie parodė, kad specifinis L7Ae prisijungimas prie Kt-Sh-GFP slopina Kt-Sh-GFP numušimo funkciją ir dėl to slopino EGFP mRNR skaidymą ir vėl suaktyvino EGFP ekspresiją HeLa-GFP ląstelėse. E ir f klaidų juosta rodo trijų nepriklausomų mėginių standartinį nuokrypį. Sh- GFP ir Sh-N buvo naudojami atitinkamai teigiamam ir neigiamam EGFP numušimo kontrolei.

Visas dydis

Prieš atlikdami ląstelių likimo kontrolės eksperimentus, mes patvirtinome, kad Kt-shRNR, nukreipianti EGFP geną į RNR (Kt-Sh- GFP ; 3b pav.), Specifiškai sąveikavo su rekombinantiniu L7Ae in vitro (3c pav.). Mes pastebėjome, kad „Dicer“ katalizinį aktyvumą efektyviai blokavo RNR-baltymo (RNP) sąveika (3d pav.). Buvo ištirtos dvi shRNR koduojančios plazmidės, pKt-Sh- GFP ir atitinkama neigiamos kontrolės plazmidė, pdKt-Sh- GFP , turinčios nekokybišką Kt, kad jos parodytų, kad jos veiksmingai sumažino EGFP ekspresiją tiek baltymo, tiek mRNR lygiu ( 3e, f pav. Kaip ir tikėtasi, L7Ae, ekspresuojamas HeLa ląstelėse, galėjo sureguliuoti EGFP raišką, prisijungdamas prie pKt-Sh- GFP , tačiau tai neturėjo įtakos pdKt-Sh- GFP EGFP ekspresijos sumažintam reguliavimui (3f pav.).

Norėdami sureguliuoti ląstelių likimą, mes paruošėme tris shRNR koduojančias plazmides, nukreiptas į Bcl-xL geną: pSh -Bcl-xL (teigiama kontrolė), pKt-Sh- Bcl-xL ir pdKt-Sh- Bcl-xL (4a pav.) . L7Ae selektyviai slopino Dicer aktyvumą Kt-Sh- Bcl-xL RNR in vitro , bet ne dKt-Sh- Bcl-xL RNR (4b pav.). Western blotting parodė, kad pKt-Sh- Bcl-xL arba pdKt-Sh- Bcl-xL transfekcija slopina Bcl-xL raišką ląstelėse po 24 valandų taip pat efektyviai, kaip ir teigiama kontrolinė pSh -Bcl-xL (4c pav., Juostos). 7 ir 8). Atvirkščiai, L7Ae selektyviai ir efektyviai apsaugojo Bcl-xL ekspresiją nuo pKt-Sh-Bcl-xL represijų (4c pav., 5 juosta). Rezultatai rodo, kad L7Ae ir Kt-shRNR sąveika slopina RNR aktyvumą, o tai lemia apsaugotos tikslinės mRNR transliaciją.

Image

( a ) Bcl-xL geno taikymas su shRNR, turinčiais kilpą (1), Kt (2, žalia) ir dKt (3, žalia). Seka raudona spalva yra papildoma Bcl-xL mRNR srities grandinė. „Dicer“ fermento skilimo vietos žymimos rodyklėmis. b ) Dicer skilimo tyrimas in vitro . c ) Bcl-xL Western blot analizė ląstelėse naudojant L7Ae-K-turn ON jungiklį. ( d ) Ląstelių mirties srauto citometrinė analizė, atlikta praėjus 24 valandoms po bendro transfekcijos su p AsRed2-L7Ae , p Bcl-xL , p Bim ir atitinkama pshRNR. Duomenys pateikiami kaip trigubų eksperimentų vidurkis ± sd. e ) Ląstelių morfologijos analizė atliekant fazinę mikroskopiją. Mastelio juosta reiškia 200 μm.

Visas dydis

ON sistema buvo naudojama kontroliuoti ląstelių likimą, suaktyvinant Bcl-xL vertimą, esant L7Ae. Srauto citometrinė (4d pav., 4 juosta) ir ląstelių morfologija (4e pav., Kairė, apatinė nuotrauka) analizė parodė, kad sistema slopina Bim sukeltą apoptozę, suaktyvindama Bcl-xL išraišką (1b pav.). Visi šie duomenys rodo, kad sintetinės transliacijos ON ir OFF sistemos gali kontroliuoti ląstelės likimą norima linkme (mirtimi ar išgyvenimu) moduliuodamos tikslinių mRNR vertimą.

Vienu metu kontroliuojamas ląstelių likimas tiek įjungimo, tiek išjungimo sistemomis

Kitas bandėme tuo pat metu atremti vienos mRNR vertimą ir suaktyvinti antrosios mRNR raišką žmogaus ląstelėse naudodami L7Ae. Buvo sukonstruotos plazmidės, koduojančios AsRed2, suprojektuotas veikti kaip represinis genas (AsRed2-OFF), ir EGFP, suprojektuotos tarnauti kaip aktyvinantis genas (EGFP-ON). L7Ae ekspresija vienu metu ir selektyviai slopino AsRed2 ir aktyvuoto EGFP vertimą, kurį patvirtinome srauto citometrija (5a, b pav.) Ir fluorescencine mikroskopija (5c pav.). Rezultatai rodo, kad vienas baltymas tuo pačiu metu reprezentuoja ir suaktyvina dviejų skirtingų mRNR transliaciją žmogaus ląstelėje.

Image

a ) EGFP ir AsRed2 sinchroninis įjungimas ir slopinimas sinchroniniais įjungimo / išjungimo jungikliais. Transfekuotų ląstelių fluorescencijos intensyvumas buvo analizuojamas srauto citometrijos metodu. Šie taškinės diagramos duomenys atitinka fluorescencinius mikroskopinius vaizdus, ​​pateiktus 5c paveiksle. b ) L7Ae vienu metu reguliuojamų EGFP-ON ir AsRed2-OFF jungiklių srauto citometrinė analizė. Transliacijos efektyvumas buvo normalizuotas, norint kontroliuoti transliacijos greitį, nesant p L7Ae (AsRed2-OFF) arba esant 0, 3 μg p L7Ae (EGFP-ON). Rezultatai pateikiami kaip trigubų eksperimentų vidurkis ± sd. Žalia vientisa linija su apskritimais; EGFP santykinis intensyvumas (Kt), žalia punktyrinė linija su trikampiais; EGFP santykinis intensyvumas (dKt), raudona vientisa linija su apskritimais; AsRed2 santykinis intensyvumas (Kt), raudona punktyrine linija su trikampiais; AsRed2 santykinis intensyvumas (dKt). c ) Sujungti fluorescenciniai mikroskopiniai ląstelių, turinčių EGFP-ON ir AsRed2-OFF jungiklius, vaizdai. Mastelio juosta reiškia 200 μm.

Visas dydis

Buvo patikrintas jungtinių ON / OFF sistemų naudojimas, siekiant kontroliuoti apoptozinius kelius žmogaus ląstelėse. OFF ir ON jungikliai buvo skirti atremti proapoptotinį Bim (Bim-OFF) ir atitinkamai suaktyvinti antiapoptotinį Bcl-xL (Bcl-xL-ON) (1b pav.). Kaip ir tikėtasi, L7Ae tuo pačiu metu slopino Bim raišką ir suaktyvino Bcl-xL raišką, kad sėkmingai modifikuotų apoptozę (6a pav., 3 juosta; 6b pav., 6b, viršuje kairėje). Mes sugebėjome viena kryptimi nukreipti žmogaus ląstelių likimą, tinkamai sujungdami dvi sistemas su esamais signalizacijos tinklais.

Image

a ) Apoptozės reguliavimas sinchronizuotais Bcl-xL-ON ir Bim-OFF jungikliais. Ląstelės, kuriose yra Kt- Bim ir Kt-Sh- Bcl-xL, buvo apsaugotos nuo Bim sukeltos apoptozės, ekspresuojant L7Ae (3 juosta), tuo tarpu ląstelės, kuriose yra dKt- Bim ir dKt-Sh- Bcl-xL, sukelia apoptozę (6 juosta). . Ląstelės buvo analizuojamos naudojant srauto citometriją. Kt-ON / OFF jungikliai rodomi raudonai. Rezultatai pateikiami kaip trigubų eksperimentų vidurkis ± sd. ( b ) Ląstelių morfologijos analizė, pavaizduota 6a paveiksle, atliekant fazinę mikroskopiją. Skalės juostos sudaro 200 μm.

Visas dydis

Apoptozės kontrolė naudojant baltymą, užkoduotą genome

Galiausiai mes ištyrėme norėdami išsiaiškinti, ar dominantis baltymas, užkoduotas genome, kiekybiškai kontroliuoja apoptozės kelius kaip baltymo ekspresijos funkciją. L7Ae įterpimas į genomą leidžia mums naudoti L7Ae kaip molekulinę žymę dominančiam baltymui. Kaip bandomąją sistemą bandėme kiekybiškai reguliuoti apoptozę kontroliuodami įvesto baltymo (L7Ae pažymėto raudonojo fluorescencinio baltymo: DsRed-L7Ae), užkoduoto genome, ekspresijos lygį. Sąlyginiam DsRed-L7Ae ekspresijai, esant tetraciklinui, buvo naudojama stabili ląstelių linija (T-REx HeLa). Western blot analizė patvirtino, kad Bcl-xL produkcijos slopinimas kiekybiškai priklauso nuo DsRed-L7Ae ekspresijos (7a pav.). Be to, tikslinių ląstelių apoptozę sukėlė DsRed-L7Ae ekspresija priklausomai nuo dozės (7b pav.). Mes taip pat sugebėjome panaikinti apoptozę, kontroliuodami FADD išraišką, naudodami DsRed-L7Ae, išreikštą iš genomo (papildomas S7 pav.). Taigi atrodo akivaizdu, kad specifinis baltymas, užkoduotas genome, gali paskatinti transliacines reguliavimo sistemas, kad kontroliuotų ląstelių likimą.

Image

a ) Ląstelių lizatų Western blot analizė praėjus 24 val. po transfekcijos su pKt -Bcl-xL-I- GFP (arba pdKt -Bcl-xL-I- GFP ) ir p Bim , jei nėra arba nėra tetraciklino (0–15 ng) ml −1 ), naudojant anti -Bcl-xL antikūną. b ) tų pačių ląstelių srauto citometrinė analizė. Ląstelės, turinčios teigiamą EGFP ir Ramiojo vandenyno mėlynąją spalvą, buvo laikomos negyvomis. Mėlyna kolona, ​​Kt; geltona kolona, ​​dKt. Rezultatai pateikiami kaip trigubų eksperimentų vidurkis ± sd.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes parodėme, kad RNP jungiklis, kuriame yra L7Ae – Kt RNP sąveikos motyvas, leidžia valdyti žmogaus ląstelių fenotipą. Specifinis baltymas (L7Ae arba L7Ae pažymėtas dominantis baltymas), ekspresuojamas ląstelėse, represuotų ir aktyvuotų specifinių mRNR, koduojančių baltymus (tai yra, Bcl-xL, Bim, FADD), dalyvaujančių signalo perdavimo kaskadose, transliacijai. Be to, baltymų veikiamos ON / OFF sistemos gali valdyti vidines apoptozės signalizacijos grandines (tai yra nuo mitochondrijų priklausomus ir nuo jų priklausomus apoptozės kelius), kad nustatytų ląstelės fenotipą (ląstelės žūtis) (1a, b pav.). Griežta apoptozinė kontrolė šiame tyrime yra priskiriama efektyviam genų reguliavimui RNP jungikliais (2, 4 ir 5 pav.; Papildoma S1 pav.), Rodančiais, kad jis tarnauja kaip universalus jungiklis kitose programose. Kaip bandomoji sistema, dominantis baltymas, sulietas su L7Ae, integruotu į genomo kiekybiškai kontroliuojamus apoptozės kelius (7 pav., Papildomas S7 pav.), Parodantis, kad įmanoma sukurti sistemą ląstelės fenotipo, kaip funkcijos, valdymui. ląstelių aplinkos pokyčių (tai yra specifinio baltymo ekspresija) apskritai (1a pav.).

Mažos molekulės, tokios kaip tetraciklinas ar teofilinas, buvo naudojamos kaip sintetinio transliacinio reguliavimo aktyvikliai. Bakterijų ir mielių ląstelių genų ekspresijos aktyvacijai (ON) arba slopinimui (OFF) nustatyti buvo naudojama pati populiariausia RNR aptamers sistema, naudojama teofilinui 12, 32, 33 . Taip pat buvo sukonstruoti veiksmingi sintetiniai genetiniai jungikliai, kuriuos sukėlė maža molekulė. RNR reguliavimo sistemas derinant su žinduolių ląstelių represoriais baltymais 34 . Šie metodai yra universalūs ir universalūs. Tačiau naudojant mažą molekulę kaip įvesties signalą yra labai sunku kontroliuoti ląstelių funkciją, atsižvelgiant į konkretaus dominančio geno ekspresijos lygį.

Mūsų baltymais varomi RNP jungikliai yra naudingi naudoti signalo perdavimo kaskadose, nes baltymų molekulės gali būti naudojamos tiek kaip įvesties, tiek išėjimo signalai, o tai neįmanoma mažoms molekulėms pagrįstoms sistemoms. Pavyzdžiui, L7Ae – Kt sąveika pagrįsta translytinė automatinio grįžtamojo ryšio sistema galėtų leisti sudėtingai kontroliuoti baltymų gamybą, atsižvelgiant į ląstelių aplinką, panašiai kaip natūraliai atsirandančios transliacinio grįžtamojo ryšio sistemos 35 . Mūsų išankstiniuose eksperimentuose ląstelėje ekspresuota L7Ae modifikavo savo transliacijos lygį, prisijungdama prie mRNR Kt motyvo (Stapleton, JA ir kt ., Neskelbti duomenys). Taigi, įjungimo / išjungimo jungiklis gali pasitarnauti kaip unikali priemonė tiksliai kontroliuoti ląstelių likimą, nes tam tikrų mRNR ekspresijos lygiai gali skirtis erdvėlaikiu būdu 36, kad sukeltų įvairius ląstelių fenotipus37.

Kiti baltymai, išskyrus L7Ae, gali būti naudojami kaip nauji sistemos reguliatoriai: (1) L7Ae baltymas galėtų būti naudojamas žymėti kitus dominančius baltymus ir (2) įvairūs RNR ir baltymų jungimosi motyvai, įskaitant natūraliai atsirandančius ir In vitro atrinkti RNR aptamerai galėtų būti naudojami statant naujus transliacinius jungiklius 38 . RNP sąveikos motyvai gali būti vertinami kaip naujas molekulinis šaltinis sąveikių komponentų ir modulių bibliotekoms kurti 39 . Atitinkamai, naujų RNP sąveikos motyvų rinkinio sukūrimas galėtų būti naudingas naujos kartos ir realiame pasaulyje pritaikytiems sintetiniams genų tinklams 9, 15, 39, 40 .

Pvz., In vitro atrinkti aptamerai gali tiesiogiai pajusti tikslinių baltymų ekspresiją (pavyzdžiui, Bcl-xL, kurio ekspresijos lygis kai kuriose vėžinėse ląstelėse yra padidėjęs) ir kontroliuoti norimų išvestinių baltymų ekspresiją. (pavyzdžiui, ląstelių žudiko geno aktyvacija; papildomas S8 pav.). Tokiu būdu jungiklis galėtų sukelti apoptozę tikslinėse vėžio ląstelėse. Kitas pavyzdys - mūsų RNP jungikliai gali būti naudojami kelių genų ekspresijai kontroliuoti, kad būtų gautos naudingos 40, 41 molekulės, nes jungikliai tuo pačiu metu slopina ir suaktyvina skirtingų mRNR transliaciją kaip specifinių baltymų ekspresijos gyvosiose ląstelėse funkciją. Bendras mūsų RNP jungiklio ir kitų nustatytų reguliavimo sistemų, pagrįstų transkripcijos kontrole 42, modulinis chimerinių baltymų 19, 43 inžinerija arba mažų molekulių pagrindu pagamintų ribos jungiklių 12, 32, 33, 44, 45, 46, naudojimas galėtų dar labiau padidinti sistema, kai rezultatui užtikrinti reikalingi keli veiksmai.

Metodai

Ląstelių kultūra ir gydymas

HeLa ląstelės ir HeLa-GFP ląstelės buvo kultivuojamos 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 DMEM / F-12 (Dulbecco modifikuota Eagle terpė: Nutrient Mixture F-12) 1: 1 mišinys (Invitrogen), papildytas antibiotiko tirpalu ( A5955, Sigma) ir 10% veršingų galvijų serumų (CBS, MP Bioscience) arba galvijų vaisiaus serumų (CCB). HeLa-GFP ląstelės buvo papildomai papildytos 50 μg ml −1 higromicino B (Invitrogen). DsRed-L7Ae indukuota ląstelių linija (T-REx HeLa-DsRed-L7Ae) buvo nustatyta anksčiau 15 taip. T-REx HeLa ląstelės (Invitrogen), užaugintos šviežioje terpėje, papildytoje 10% CBS (# 2001H, MP Biomedicals), buvo transfekuotos pcDNA4 / TO / DsRed-L7, turinčiomis tetraciklinu reguliuojamą promotorių ir DsRed M- L7Ae geną. Po 24 valandų terpė buvo pakeista šviežia terpe, papildyta 10% CBS, 5 μg ml −1 blastistidino (Invivogen) ir 100–200 μg ml −1 zeocino (Invitrogen). Ląstelės buvo kultivuojamos selektyvioje terpėje kas 3–4 dienas, kol buvo galima nustatyti židinius. Atrinktos ląstelės buvo klonuotos naudojant ląstelių rūšiatorių (FACS Aria, BD Biosciences). Klonas, pasižymintis aukščiausiu DsRed M- L7Ae ekspresijos lygiu, esant Tet, buvo patvirtintas Western blotting ir pavadintas H5. H5 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM / F-12, papildytame 10% CBS, 5 μg ml −1 blasticidino ir 150 μg ml −1 zeocino.

Transfekcija

Ląstelės buvo dedamos į tinkamas kelių šulinėlių plokšteles. Po 1 dienos 70–90% sulipusios ląstelės buvo transfekuotos plazmidėmis, naudojant Lipofectamine 2000 pagal standartinius protokolus, įtrauktus į Lipofectamine 2000 rinkinį (Invitrogen). Po 4 h transfekcijos, jei reikia, terpė buvo pakeista šviežia terpe.

DNR paruošimas

Visi DNR šablonai ir pradmenys buvo įsigyti iš Hokkaido System Science arba Gene Design. PGR amplifikacija buvo atlikta naudojant Ex Taq DNR polimerazę (TAKARA BIO) arba KOD-PLUS-DNR polimerazę (TOYOBO).

Apoptozės tyrimas

Apoptozinės ir negyvos ląstelės buvo nudažytos Ramiojo vandenyno mėlynu ženklu pažymėtu aneksinu V pagal standartinius Vybrant Apoptosis Assay Kit # 14 (Invitrogen) protokolus. Negyvos ląstelės prireikus buvo papildomai dažomos 7-AAD (Invitrogen). Dažytos ląstelės buvo analizuojamos FACS arijoje. Ramiojo vandenyno mėlyniesiems sužadinti buvo naudojamas 405 nm puslaidininkinis lazeris, o EGFP, DsRed M, AsRed2 ir 7-AAD - 488 nm lazeris. Fluorescencinių signalų rinkimui iš atitinkamai „Pacific Blue“, EGFP ir 7-AAD buvo naudojami 450/40 nm, 530/30 nm ir 695/40 nm dažnių juostos pralaidumo filtrai. Kai EGFP ir DsRed M (arba AsRed2) buvo ekspresuojami vienu metu, signalams iš DsRed M (arba AsRed2) buvo naudojamas 695/40 nm juostos pralaidumo filtras; kitu atveju buvo naudojamas 616/23 nm pralaidumo filtras. Likusios ląstelės buvo surinktos ir laikomos –20 ° C temperatūroje, kad prireikus būtų atliktos Western blot analizės.

Apoptozę reguliuojančių baltymų transliacinis represinis tyrimas

Norint atlikti Bcl-xL represijos ląstelėse Western blot analizę, HeLa ląstelės (1 x 105 kiekvienoje duobutėje) buvo pasėtos į 12 šulinėlių plokšteles. p L7Ae (0, 4 μg) ir pKt -Bcl-xL-I- GFP (arba dKt -Bcl-xL-I- GFP , 0, 2 μg) buvo transfekuoti į HeLa ląsteles. Kaip kontrolė buvo naudojama tuščia plazmidė, pcDNA, žyminti pcDNA3.1-MycHisA (Invitrogen). Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo surinktos tripsinu ir Bcl-xL buvo aptiktas naudojant anti-Bcl-xL antikūną. Apoptozės, kurią reguliuoja Bcl-xL ir Bim, analizei, HeLa ląstelės buvo bendrai transfekuojamos, kaip aprašyta aukščiau, išskyrus tai, kad ląstelės buvo papildomai kartu transfekuotos su 0, 2 μg p Bim . Po 24 valandų surinktos ląstelės buvo nudažytos Ramiojo vandenyno mėlynuoju ženklu pažymėtu aneksinu V ir 7-AAD ir analizuotos FACS arijoje. Buvo tiriamos tik EGFP teigiamos ląstelės, siekiant pašalinti šiukšles, dulkes ar neperkeltas ląsteles. Ramiojo vandenyno mėlynos spalvos teigiamos ląstelės buvo laikomos negyvomis.

Apoptozės kiekybiniam reguliavimui vietoj HeLa ląstelių buvo naudojama DsRed-L7Ae indukuojama ląstelių linija (3 x 105 kiekvienoje duobutėje). Ląstelės buvo bendrai transfekuotos su 0, 4 μg pKt -Bcl-xL-I- GFP (arba dKt -Bcl-xL-I- GFP ) ir 0, 4 μg p Bim, naudojant 2 μl lipofektamino 2000. Po 4 val., DsRed- L7Ae indukuota tetraciklinu (Invitrogen) 0–15 ng ml –1 . Po 24 valandų ląstelės buvo nudažytos Ramiojo vandenyno mėlynuoju ženklu pažymėtu aneksinu V ir analizuotos FACS arijoje.

Norėdami patvirtinti proapoptotinį FADD ir jo kelio aktyvumą, DsRed-L7Ae indukuojamos ląstelių linijos (3 x 105 kiekvienoje duobutėje) buvo pasėtos į 12 šulinėlių plokšteles. Ląstelės buvo kartu transfekuotos su 0, 9 μg pKt- FADD ir 0, 4 μg p EGFP- N1, esant arba neturint 20 μM ZV-FMK (Sigma). Apoptozės, kurią reguliuoja FADD, analizei, HeLa ląstelės (5 x 105 kiekvienoje duobutėje) buvo pasėtos į šešių šulinėlių plokšteles. Ląstelės buvo kartu transfekuotos su 0, 5 μg pKt- FADD (arba pdKt- FADD ) ir 1 μg p L7Ae ir surinktos po 24 valandų. FADD ekspresija ląstelėse buvo nustatyta atliekant Western blot analizę, naudojant anti-c-Myc antikūną. Norėdami pašalinti neperkeltas ląsteles, srauto citometrinei analizei ląstelės buvo papildomai kartu su 0, 2 μg p EGFP- N1. Surinktos ląstelės buvo nudažytos Ramiojo vandenyno mėlynuoju ženklu pažymėtu aneksinu V ir 7-AAD ir atliktos srauto citometrinė analizė. Ramiojo vandenyno mėlynos spalvos teigiamos ląstelės buvo laikomos negyvomis.

Nuo dikterio priklausomos shRNR skilimo tyrimas in vitro

Kt-Sh- Bcl-xL arba dKt-Sh- Bcl-xL (40 nM) ir išgrynintas L7Ae baltymas (0, 800 arba 1600 nM) buvo sumaišyti su 1 μl 10 mM ATP, 0, 5 μl 50 mM MgCl2, 4 μl „Dicer“ reakcijos buferio („Genlantis“), 2 μl 0, 5 U μl –1 rekombinantinio žmogaus dikatoriaus fermento („Genlantis“) ir vandens (iki 10 μl). Mišiniai buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 14 valandų ir inkubavimas buvo sustabdytas naudojant 2 μl Dicer Stop tirpalo. Mišiniai 50 minučių buvo atskirti 15% natūraliu PAGE, esant 4 ° C temperatūrai, ir gelis nudažytas SYBER-Green (TAKARA BIO). Dažytos RNR fluorescencija buvo nustatyta naudojant FLA-7000 (Fujifilm) (4b pav.). Kt-Sh- GFP ir dKt-Sh- GFP taip pat buvo analizuojami taikant aukščiau aprašytą procedūrą (3d pav.).

Bcl-xL transliacinis aktyvacijos tyrimas

Norėdami ištirti Bcl-xL transliacijos, suaktyvėjusios dėl Kt-L7Ae prisijungimo, pakartotinio aktyvavimo efektyvumą, mes kartu transfekavome HeLa ląsteles (3 x 10 5 kiekvienoje duobutėje), auginamas 1 dieną 12 šulinėlių plokštelėse su p Bcl-xL , p ( d) Kt-Sh- Bcl-xL ir p L7Ae, naudojant 2, 5 μl 2000. m. lipofektamino. Dvidešimt keturias valandas po transfekcijos Bcl-xL buvo kiekybiškai įvertintas Western blot analize. Norėdami ištirti ląstelių likimo nustatymo efektyvumą kontroliuodami Bcl-xL transliaciją, kurią sukėlė Kt-L7Ae surišimas, mes kartu transfekavome HeLa ląsteles (0, 5 x 10 5 kiekvienoje duobutėje), auginamas 1 dieną 24 šulinėlių plokštelėse su 0, 2 μg p Bim , 0, 2 μg p Bcl-xL , 0, 3 μg p (d) Kt- Sh- Bcl-xL ir 0, 2 μg p AsRed2-L7Ae, naudojant 1, 25 μl lipofektamino 2000. Dvidešimt keturios valandos po transfekcijos, sekant ląstelę morfologinės analizės būdu, ląstelės ir terpė buvo surinktos ir nudažytos Ramiojo vandenyno melsvu pažymėtu aneksinu V, kaip aprašyta apoptozės tyrime. Apoptozinių ir negyvų ląstelių populiacijos, pasižyminčios dideliu Ramiojo vandenyno mėlynosios fluorescencijos intensyvumu, buvo analizuojamos srauto citometru. Norint pašalinti nenormalias ląsteles, vidutinio intensyvumo skaičiavimui buvo pasirinktos tos ląstelės, kurių blauzdos vaisiaus serumas ir superlaidžių Super Collider signalų diapazonas buvo identiškas neapdorotų HeLa ląstelių ląstelėms. Raudona AsRed2-L7 fluorescencija buvo naudojama kaip žymeklis kartu transfekuotoms ląstelėms. pSh -Bcl-xL ir pSh-N buvo naudojami atitinkamai teigiamam ir neigiamam Bcl-xL numušimo kontrolei.

Sinchroninis ON / OFF vertimo jungiklių valdymas

Norėdami sinchroniškai valdyti AsRed2-OFF ir EGFP-ON jungiklius, suaktyvintus su Kt-L7Ae jungimu tose pačiose ląstelėse, mes kartu transfekavome HeLa ląsteles (0, 8 × 10 5 kiekvienoje duobutėje), auginamas 1 dieną 24 šulinėlių plokštelėse su 0, 0, 05, 0, 1, 0, 2, 0, 3 μg pL7Ae ir pcDNR (bendras kiekis 0, 3 μg), 0, 1 μg pEGFP, 0, 3 μg p (d) Kt-Sh-GFP ir 0, 1 μg p (d) Kt-AsRed2-I- CFP su 1, 5 μl lipofektamino 2000. Transfekcija fluorescencinei mikroskopinei analizei buvo atlikta panašiai, tačiau p (d) Kt-AsRed2-I-CFP pakeitus p (d) Kt-AsRed2. Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, ląstelės ir terpė buvo surinktos ir pakartotinai suspenduotos terpėje. Norėdami išmatuoti EGFP ir AsRed2 fluorescencijos intensyvumą, CFP ekspresuojančios ląstelės (kaip teigiama kontrolė transfekuotoms ląstelėms) buvo analizuojamos srauto citometru. Nenormalios ląstelės buvo pašalintos, kaip aprašyta transliacijos aktyvacijos tyrime. Tuo pačiu metu kontroliuojant Bim represijas ir Bcl-xL aktyvaciją sumaišant Kt-L7Ae OFF ir ON jungiklius, mes kartu transfekuotame HeLa ląsteles (1, 0 × 10 5 kiekvienoje duobutėje), auginamas 1 dieną 24 šulinėlių plokštelėse su 0, 2 μg pBcl-xL, 0, 2 μg pAsRed2-L7Ae, 0, 2 μg p (d) Kt-Bim ir 0, 3 μg p (d) Kt-Sh-Bcl-xL (bendras perkeltų plazmidžių kiekis buvo kompensuotas pcDNR iki 0, 9 μg) su 1, 25 μl 2000. m. lipofektamino. Dvidešimt keturias valandas po transfekcijos, atlikus ląstelių morfologinę analizę, ląstelės ir terpė buvo surenkamos ir nudažytos Ramiojo vandenyno melsvu pažymėtu aneksinu V, kaip aprašyta apoptozės tyrime. Apoptozinių ir negyvų ląstelių populiacijos, pasižyminčios dideliu Ramiojo vandenyno mėlynosios fluorescencijos intensyvumu, buvo analizuojamos srauto citometru. Raudona AsRed2-L7 fluorescencija buvo naudojama kaip žymeklis kartu transfekuotoms ląstelėms.

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį: Saito, H. et al . Sintetinis žmogaus ląstelių likimo reguliavimas baltymų valdomais RNR jungikliais. Nat. Bendruomenė. 2: 160 doi: 10.1038 / ncomms1157 (2011).

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi S1-S8 paveikslai ir papildomi metodai.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.