Sinchroninė anaerobinė fotosintezė per tiesioginį tarp rūšių elektronų perkėlimą | gamtos komunikacijos

Sinchroninė anaerobinė fotosintezė per tiesioginį tarp rūšių elektronų perkėlimą | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Bakterijų fiziologija
  • Aplinkos mikrobiologija
  • Simbiozė

Anotacija

Mikrobų fototrofai, pagrindiniai pirminiai Žemėje gamintojai, kaip elektronų donorus naudoja H 2 O, H 2, H 2 S ir kitus redukuotus neorganinius junginius. Čia aprašome metabolizmo formą, jungiančią anoksigenišką fotosintezę su anaerobiniu kvėpavimu, kurią mes vadiname „sinchronine anaerobine fotosinteze“. Parodome, kad fotoautotrofiją žaliojoje sieros bakterijoje „ Prosthecochloris aestaurii“ gali sukelti elektronai iš kieto elektrodo arba acetato oksidacija, tiesioginiu elektronų perdavimu tarp rūšių gyvūnų iš heterotrofinės partnerės bakterijos Geobacter sulfurreducens . P. aestuarii fotosintetinis augimas naudojant reduktorių, gaunamą naudojant elektrodą arba sintezę, yra tvirtas ir priklauso nuo šviesos. Priešingai, P. aestuarii neauga kartu su G. sulfurreducens mutantu, neturinčiu trans-išorinės membranos porino-citochromo baltymų komplekso, reikalingo tiesioginiam tarpląsteliniam elektronų perdavimui. Taigi sinchroninė anaerobinė fotosintezė yra anglies ciklo procesas, kuris gali vykti anoksinėje aplinkoje. Šis procesas galėtų būti panaudotas biotechnologinėms reikmėms, tokioms kaip atliekų apdorojimas ir bioenergijos gamyba, naudojant inžinerines fototrofines mikrobų bendrijas.

Įvadas

Fotosintetinis CO 2 fiksavimas cianobakterijomis (deguonies turinčiais fototrofais) ir violetinės bei žalios sieros bakterijomis (anoksigeniškais fototrofais) sudaro beveik pusę viso pirminio produktyvumo 1 . Pagrindiniai anoksigeniškos fotosintezės elektronų donorai - anaerobinis procesas - apima redukuotus neorganinius junginius, tokius kaip H 2 S, S o, H 2 ir Fe 2+ (2) . Anoksinėje aplinkoje elektronai teka tarp mikrobų, kurie sudaro intymius sinchroninius konsorciumus palaikydami papildomus metabolizmus. Ko gero, labiausiai intriguojantis šių elektronų srauto mechanizmas yra tiesioginis tarprūšinis elektronų perkėlimas, procesas, kurio metu elektronai tarp ląstelių nešami fiziškai liečiant laidžius elektronų nešiklius 3, 4 . Kai kurie pavyzdžiai yra anaerobinis etanolio oksidavimas konsorciumuose, sudarytuose iš dviejų „ Geobacter“ rūšių 5, ir etanolio pavertimas metanu, naudojant „ Geobacter“ rūšių kultūrų, ir metanogeninę „Archaea“, pvz., „ Methanosaeta 6“ . Nors tyrimai rodo, kad tiesioginis skirtingų rūšių elektronų perdavimas yra įprastas anoksinėje metanogeninėje aplinkoje 3, 4, 7, 8, 9, nežinoma, ar susiję reiškiniai yra labiau paplitę, taip pat ir apšviestoje anoksinėje aplinkoje.

Mes tiriame šią galimybę ir pranešame apie naujos sinchroninio metabolizmo formos, sintetinės anaerobinės fotosintezės, atradimą. Parodome, kad fotoautotrofiją žaliojoje sieros bakterijoje „ Prosthecochloris aestaurii“ gali sukelti elektronai iš kieto elektrodo arba acetato oksidacija, tiesioginiu elektronų perdavimu tarp rūšių gyvūnų iš heterotrofinės partnerės bakterijos Geobacter sulfurreducens . Abiejų rūšių elektronų perdavimas tarp G. sulfurreducens ir P. aestuarii bei elektronų paėmimas P. aestuarii yra nuo šviesos priklausomi procesai. Šviesa reikalinga fotosintetiniam metabolizmui fototrofe. Sintetinės anaerobinės fotosintezės atradimas atskleidžia naujas bioinžinerijos fototrofinių mikrobų bendruomenių panaudojimo galimybes atliekų apdorojimo ir bioenergijos gamybos srityse.

Rezultatai

Elektrodas kaip P. aestuarii elektronų donoras

Iki šiol purpurinė ne sieros bakterija Rhodopseudomonas palustris TIE-1 buvo vienintelė žinoma fototrofa, galinti pasisavinti elektronus iš kieto elektrodo 10 . Keletas tyrimų taip pat parodė, kad kai kurie mišrios kultūros anaerobiniai fototrofai gali naudoti elektrodą kaip elektronų donorą fotosintezei 11, 12 . Tačiau nei mechanizmai, nei fototrofai, atsakingi už elektronų mainus su elektrodais, dar nėra nustatyti, todėl liko atviras klausimas, ar kiti fototrofai taip pat gali fiksuoti elektronus tiesiai iš kieto elektrodo fotosintezei. Ankstesniame tyrime dėl elektronų perdavimo mikrobiniame kilimėlyje, surinktas iš Karšto ežero - epizomito ežero šiauriniame Vašingtone (JAV, JAV) - mes nustatėme, kad žaliosios sieros bakterija Prosthecochloris aestuarii vyrauja anglies mikroelektrodo, įdėto į apšviestą kilimėlį, gale. 13 . Vėlesniuose eksperimentuose buvo išskirtos grynos P. aestuarii kultūros. P. aestuarii gali augti fotoautotrofiškai, naudodamas sulfidą arba elementinę sierą (S o ) kaip elektronų donorą 14 . Naujausi tyrimai aprašė keletą sieros oksiduojančių bakterijų, kurios taip pat sugeba paaukoti / priimti elektronus iš elektrodo 15, 16 . Norėdami nustatyti, ar karštasis ežeras P. aestuarii taip pat gali panaudoti elektronus iš kietojo elektrodo, mes jį pasėjome į sterilią dviejų kamerų bioelektrocheminę sistemą, kurioje yra augimo terpė, kurioje vienintelis anglies šaltinis buvo CO 2 . Elektrodas buvo poliarizuotas esant –600 mV Ag / AgCl (šiek tiek mažesnis už H 2 S redoksinį potencialą (E o ′ [S o / H 2 S] –479 mV Ag / AgCl )), o elektronų perdavimas iš elektrodo buvo vertinamas kaip katodinė srovė. Buvo aptikta nuo šviesos priklausoma katodinė srovė, kuri palaipsniui didėjo per 24 valandas; po 17 dienų srovė pasiekė 104 μA (∼ 36, 74 μA cm −2 ) (1a pav.). Šis elektronų įsisavinimo greitis fototrofu yra daug didesnis nei anksčiau pasiektas R. palustris TIE-1 (1, 5 μA cm −2 ) 10 . Tolesnis katodinės srovės vystymasis po terpės mainų rodo, kad P. aestuarii elektronų įsisavinimui nereikalingi tirpūs elektronų jungikliai (papildomas 1a pav.).

Image

a ) Katodinė srovė, sukuriama P. aestuarii kultūroje šviesiomis ir tamsiomis sąlygomis iš kieto elektrodo, poliarizuoto −600 mV Ag / AgCl . Katodinė srovė buvo stebima visuose trijuose biologiniuose eksperimentuose su šia sistema. b ) Nuskaitytas elektrodo paviršiaus (2 μm skalės juostos) elektronų mikrografas, parodantis tipinę P. aestuarii ląstelių protezavimo morfologiją ( c ) (skalės juosta, 500 nm). 16 įrašytų vaizdų mikrografo. d ) tipiškų sulfidu išaugintų P. aestuarii ląstelių skenavimas elektronų mikrografu ant izoporinės membranos filtro (mastelio juosta, 500 nm). 27 įrašytų vaizdų mikrografas.

Visas dydis

Nuskaityta elektrodo pjūvio elektroninė mikroskopija patvirtino, kad kaupianti medžiaga iš tikrųjų buvo P. aestuarii ląstelių (1b – d pav.) Biofilmas , artimai liečiantis su elektrodo paviršiumi. Šios prie elektrodo pritvirtintos ląstelės buvo naudojamos inokuliuoti šviežią P. aestuarii augimo terpę, kurioje kaip elektronų donoras buvo sulfidas, ir augimas įvyko, patvirtinant jų gyvybingumą ant elektrodo (papildomas 1b pav.).

Norėdami išsiaiškinti, ar molekulinio vandenilio (H 2 ) sukeltas elektronų perdavimas tarp elektrodo ir P. aestuarii , mes pasėjame terpę, kurioje H2 yra vienintelis elektronų donoras, apšviestas P. aestuarii . P. aestuarii tokiomis sąlygomis neauga, net po ilgo inkubavimo (> 10 dienų), tai rodo, kad šis fototrofas negali panaudoti H 2 kaip elektronų donoras fotosintezei (papildomas 2a pav.) Ir kad elektronai iš elektrodo neprisiėmė. tarpininkauja H 2 .

P. aestuarii ir G. sulfurreducens bendra kultūra

Papildydami duomenis, gautus atlikus P. aestuarii fotosintezę nuo elektrodų (1 pav.), Mes ištyrėme galimybę, kad šis organizmas galėtų būti auginamas kartu su heterotrofine partnerės bakterija. Be elektronų perkėlimo į kitas bakterijų rūšis, anaerobinė ir chemoheterotrofinė bakterija Geobacter sulfurreducens gali paaukoti elektronus į kietą elektrodą 17, 18, 19 . Kadangi mūsų eksperimentai parodė, kad P. aestuarii augo fotoautotrofiškai, naudodamas elektrodo tiekiamus elektronus (1 pav.), Mes hipotezavome, kad G. sulfurreducens taip pat gali paaukoti elektronus P. aestuarii ląstelėms palaikyti abiejų rūšių augimą tokiomis sąlygomis, kuriomis nė vienas negalėjo augti savarankiškai. Norėdami tai patikrinti, mes auginome du organizmus apšviestoje, anoksinėje terpėje, kurioje yra acetato, bet neturime HS -, S o ar kitų galimų elektronų donorų ar akceptorių. Kaip sieros šaltinis biosintetiniams poreikiams buvo pridėtas nedidelis kiekis tiosulfato (0, 5 mM); tačiau tiosulfatas nenaudojamas nei kaip fotosintetinio elektronų donoras P. aestuarii 14, 20, nei kaip elektronų akceptorius G. sulfurreducens 21 . Kadangi P. aestuarii nesugeba pritvirtinti CO 2, jei nėra HS - arba S 0 (nuoroda 14), o G. sulfurreducens nesugeba oksiduoti acetato, jei nėra elektronų akceptoriaus, mes pagrįstume, kad jei kultūra, kurioje yra abu organizmai augo, tai turi būti tarp rūšių elektronų perdavimo rezultatas.

Šių kultūrų eksperimentų metu augimas iš tikrųjų įvyko kartu su acetato vartojimu (2a, b pav.). Tiek P. aestuarii, tiek G. sulfurreducens augo bendroje kultūroje. Tai patvirtina tiek srauto citometrija (papildomas 3 pav.), Tiek elektronų mikroskopija (2c – e pav.), Kurių metu buvo galima įvertinti morfologiškai skirtingas rūšis. TEM ištisiniai P. aestuarii ( Pa ) ir G. sulfurreducens ( Gs ) kultūrų vaizdai taip pat rodė intymias ląstelių jungtis, galbūt veikiančias perduodant elektronus iš G. sulfurreducens į P. aestuarii (2d, e pav.). Acetato suvartojimo ir ląstelių tankio pokyčiai keičiant bendras kultūras iš tamsios į apšviestą ir atvirkščiai (3 pav.) Rodo, kad sinchroninis augimas tarp G. sulfurreducens ir P. aestuarii priklauso nuo šviesos.

Image

P. aestuarii ir G. sulfurreducens a ) ląstelių tankio ir ( b ) acetato sunaudojimo kitimas laikantis aksonų kultūrų ir jų kultūrų. Kiekvienas simbolis yra vidurkis ± sd ( n = 3). c ) SEM bendros kultūros vaizdas (mastelio juosta, 5 μm). ( d, e ) TEM sveiki G. sulfurreducens ( Gs ) ir P. aestuarii ( Pa ) kultūrų vaizdai parodo dvi morfologiškai skirtingas rūšis ir jų ląstelių-ląstelių kontaktą per intymias tarpląstelines asociacijas (mastelio juostos, 0, 5 μm ir 200 nm). atitinkamai). Šie vaizdai atspindi gautus 20 SEM ir 26 TEM vaizdus.

Visas dydis

Image

a ) Bendrosios kultūros pakeitimas iš tamsios į apšviestą būseną paskatino acetato vartojimą. ( b ) Perjungimas iš apšviesto į tamsų režimą sustabdė P. aestuarii fotosintezę ir nutraukė acetato vartojimą kultūroje. c ) P. aestuarii ir G. sulfurreducens kultūrų ląstelių tankis (OD 600 ), esant šviesai. Klaidų juostos parodo pakartotų eksperimentų sem (p = 3).

Visas dydis

Kai šios kultūros buvo subkultūruojamos šviežioje terpėje, turinčioje acetato, jos toliau augo ir vartojo acetatą (papildomas 4 pav.). Tai rodo, kad sinchroninė sąveika buvo stabili per kelias kartas. Tikėtina, kad lėtesnis biomasės padidėjimas subkultūrose nei originaliose kultūrose, nes ląstelių tankis kultūrų pasėlyje yra mažesnis nei dviejų grynų kultūrų. Mes darome išvadą, kad kultūrų augimas atspindi anksčiau nepripažintą anoksigeniškos fotosintezės formą, kurioje abipusiai panaudojami heterotrofo ir fototrofo papildomi metabolizmai. Kadangi kultūrų augimas griežtai priklauso nuo kiekvienos bakterijos partnerės metabolinio aktyvumo, šį procesą mes vadiname „sinchronine anaerobine fotosinteze“.

Tiesioginis elektronų perkėlimas palaiko sintetinę anaerobinę fotosintezę

Nors mūsų bendrakultūros eksperimentai atskleidė metabolinę chemotrofo ir fototrofo priklausomybę, elektronų perdavimo mechanizmas liko neaiškus. Chemiškai tarpinstitucinis rūšių elektronų perdavimas keičiantis tirpiu organiniu junginiu, pavyzdžiui, formatu, arba H2, buvo galimas elektronų perdavimo iš G. sulfurreducens į P. aestuarii mechanizmas . Tačiau tai buvo panaikinta kaip galimybė mūsų kultūrose, nes P. aestuarii negali panaudoti H2 ar formatato kaip elektronų donoras (papildomas 2a pav.). Trys papildomos įrodymų eilutės patvirtina mūsų išvadą, kad metabolinė priklausomybė tarp G. sulfurreducens ir P. aestuarii nėra tirpaus elektronų nešiklio rezultatas, o tam reikalingas ląstelių ir ląstelių kontaktas bei tiesioginis tarp rūšių esantis elektronų perdavimas. Pirmiausia, du organizmai neauga, auginant toje pačioje terpėje, bet fiziškai atskirti į dvi kameras membraniniais filtrais (poros dydis 0, 1 μm), tuo tarpu augo lygiagreti kultūra, kurioje yra abu organizmai tame pačiame reaktoriuje (papildomas 5 pav.). Antra, skirtingai nuo kultūrų su laukinio tipo G. sulfurreducens vienodomis sąlygomis, P. aestuarii ir G. sulfurreducens delecijos mutanto, neturinčio ombB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC genų klasterio, kultūrų neauga ir acetatas nebuvo sunaudotas (4 pav.). „ OmbB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC“ genų klasteris koduoja trans-išorinės membranos porin-citochromo baltymų kompleksą, būtiną tarpląsteliniam elektronų perdavimui G. sulfurreducens į kietųjų elektronų akceptorius, tokius kaip ferrihidritas 22, ar kietąjį elektrodą (pav. .4a). Kanamicinas (200 μg ml −1 ) buvo pridėtas prie kultūros, kad būtų išlaikytas G. sulfurreducens A mutB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC mutantas; tačiau tai neturėjo įtakos šios P. aestuarii padermės , kuri, kaip mes nustatėme, natūraliai atspari kanamicinui, augimui (papildomas 2b pav.). Trečia, kai G. sulfurreducens mutantas genetiškai buvo papildytas „ ombB-omaB-omcB“ genų grupe, kuri anksčiau buvo įrodyta, kad atstato tarpląstelinio elektronų perdavimo pajėgumą Fe 3+ (22) ir elektrodams (4a pav.), Tada buvo išbandyta bendro kultūros nustatymo metu atnaujintas nuo šviesos priklausomas acetato vartojimas (4b pav.).

Image

a ) G. sulfurreducens in ombB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC padermė ant elektrodo nesukūrė srovės (+300 mV Ag / AgCl ). Srovė buvo iš dalies atstatyta, kai ji buvo papildyta „ ombB-omaB-omcB“ genu . Kiekvienai padermei buvo atlikti trys biologiniai pakartojimai ir pateikti tipiniai duomenys. Rodyklė rodo tašką, kuriame buvo užkratyti reaktoriai. b ) P. aestuarii ir laukinio tipo G. sulfurreducens ( Gs - wt ) kultūrų acetato sunaudojimas; P. aestuarii ir Δ ombB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC G. sulfurreducens (Gs- mt) ir P. aestuarii ir papildytų Δ ombB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC G sulfurreducens (papildytas Gs- mt), kuris buvo įvestas su ombB-omaB-omcB genų grupe . Klaidų juostos žymi pakartotinių eksperimentų dalį ( n = 3).

Visas dydis

Geobakterių rūšims reikalingas tiesioginis kontaktas per išorinės membranos citochromus ir (arba) laidžius pilius, kad išoriniai elektronai galėtų pernešti elektronus į netirpius elektronų akceptorius (pvz., Elektrodą, Fe (III) oksidą) ir kitus organizmus. 23, 24, 25 . Bendrosios kultūros elektroniniai mikrografiniai vaizdai parodė artimus ryšius tarp G. sulfurreducens ir P. aestaurii ląstelių (papildomas 6a, b pav.). Ryšiai apėmė kontaktus tarp ląstelių tarp natūraliai išsikišančių fototrofo protezų ir G. sulfurreducens ląstelių paviršiaus bei ląstelių priedų. Be to, iš kultūrų, dažytų nuo kraujo, dažytų ląstelių preparatais, buvo gausu beicuotų dažytų gijinių struktūrų, jungiančių ląsteles (papildomas 6c, d pav.). Šių struktūrų buvimas rodo, kad elektronų perdavimą tarp G. sulfurreducens ir P. aestaurii ląstelių skatina baltymai, kurių sudėtyje yra hemos . Bendrai šie rezultatai palaiko tiesioginį tarp skirtingų rūšių elektronų perdavimo mechanizmą sinchroninei anaerobinei fotosintezei.

Diskusija

Remdamiesi šiais rezultatais, mes siūlome tiesioginio tarprūšinio elektronų perdavimo tarp G. sulfurreducens ir P. aestuarii sinchroninėje anaerobinėje fotosintezėje koncepcinį modelį. Iš acetato kilę elektronai perkeliami iš heterotrofo į autotrofą ir naudojami pastarajam, kad pritvirtintų CO 2 į ląstelės medžiagą. Pernešimas naudingas abiems organizmams, nes jis leidžia G. sulfurreducens oksiduoti acetatą kaip elektronų donorą ir išmesti elektronus į elektronų akceptorių (veiksmus, reikalingus jo bioenergetikai valdyti), tuo pačiu metu tiekdamas P. aestaurii reikalingus elektronus fotoautotrofinei medžiagai palaikyti. metabolizmas (5 pav.). Mes parodėme, kad P. aestuarii gali gauti elektronus iš elektrodų, kurie buvo poliarizuoti esant –600 mV Ag / AgCl . G. sulfurreducens yra gerai žinomas dėl savo sugebėjimo pernešti metabolinius elektronus tiesiai į tarpląstelinių elektronų akceptorius, įskaitant elektrodus. 17, 21, 23, 24, 26 . Nors buvo įrodyta, kad formalus G. sulfurreducens biofilmo, išauginto ant elektrodo paviršiaus, potencialas yra apie –400 mV Ag / AgCl (nuorodos 17, 26, 27, 28), kai kurie tyrimai rodo, kad ši bakterija gali pakoreguoti savo redoxą aktyvumas elektronų akceptoriaus potencialui 12, 18, 19, 29 . Be to, G. sulfurreducens sugeba redukuoti elementinę sierą 21, kuri yra žinoma P. aestuarii 14, 20 elektronų donore. Taigi tikėtina, kad bendrojoje kultūroje G. sulfurreducens potencialas buvo pakankamai sumažėjęs, kad jis galėtų būti donoru P. aestuarii fotosintezei.

Image

Abiejų rūšių sinchroninį augimą palaiko acetato oksidacija heterotrofu, o CO 2 sumažinimas fototrofu.

Visas dydis

Mes čia pademonstravome fotoautotrofo augimą, palaikomą tiesioginiu elektronų perdavimu iš heterotrofinio partnerio. Keletas neseniai atliktų tyrimų nurodo sinchroninius tarpšakinius elektronų perkėlimus tarp įvairių anaerobų kaip pagrindinę heterotrofinės anglies apykaitos priemonę anoksinėse mikrobų buveinėse. 3, 4, 8, 30 . Sinchroninė anaerobinė fotosintezė išplečia šią sąvoką, įtraukdama elektronų perkėlimą iš heterotrofų į fototrofus ir atskleidžia anksčiau nežinomą sinchronijos formą, jungiančią anaerobinę fotosintezę tiesiogiai su anaerobinės organinės anglies metabolizmu. Be to, nors čia parodyta su morfologiškai skirtinga žaliąja bakterija „ Prosthecochloris“ , mes įtariame, kad kitos žaliųjų (ir net violetinių) bakterijų rūšys - organizmai, plačiai paplitę 2- oje gamtoje - taip pat gali užmegzti tiesioginius tarpšakinius elektronų perdavimo ryšius su elektrogeniniais heterotrofiniais partneriais.

Ekologiniu požiūriu sinchroninė anaerobinė fotosintezė gali būti svarbi anglies apykaitos forma silpnai sumaišytų gėlavandenių ežerų anoksinėse zonose, kur sulfidų apribojimai riboja anoksigeniškų fototrofų veiklą, o neorganinių elektronų receptorių trūkumas riboja anaerobinį kvėpavimą. Be tiesioginės elektronų perdavimo tarp heterotrofų ir fototrofų ekologinės svarbos, sintetinės anaerobinės fotosintezės atradimas atskleidžia naujas bioinžinerijos fototrofinių mikrobų bendrijų galimybes pritaikymui atliekų tvarkymo ir bioenergijos gamybos srityse.

Metodai

Bakterijų padermės ir auginimo būklė

Buvo naudojamas Geobacter sulfurreducens kamienas PCA (ATCC 51573). Mutantinis G. sulfurreducens štamas , kuriame ombB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC genų klasteris buvo pakeistas antibiotikams atspariu genu, o jo papildytas kamienas su ombB-omaB-omcB genų klasteriu buvo sukurtas ir apibūdintas anksčiau 22 . Prosthecochloris aestuarii 728 padermė buvo izoliuota iš fototrofinio kilimėlio, surinkto iš epsomitinio, hipersalino karšto ežero netoli Orovilio, WA, JAV 31 .

Serumo buteliukuose, užkimštuose butilo gumos kamščiais, viso tyrimo metu buvo naudojamos griežtos anaerobinio auginimo procedūros. G. sulfurreducens laukinio tipo ir mutantinės padermės buvo kultivuojamos modifikuotoje Geobacter terpėje, turinčioje acetato (10 mM) ir fumarato (20 mM). Nustatyta, kad modifikuota terpė palaiko P. aestuarii augimą, taip pat pakeista sulfidu ir auginant abu štamus. Modifikuota terpė buvo pagaminta ištirpinant 8, 78 g NaCl, 3, 8 g KCl, 0, 25 g NH4CI, 70 mg CaCl2 · 2H 2 O, 0, 5 g KH2P04, 0, 5 g MOPS, 1, 0 g tirpalo. Mg 2 SO 4 · 7H 2 O ir 2, 5 g NaHCO 3 į 1 l terpės, į kurią buvo pridėta 1 x Wolfe mineralinio tirpalo ir 1 x Wolfe vitamino tirpalo. Šių mineralinių ir vitaminų tirpalų kompozicijos buvo aprašytos anksčiau 32 . Terpė buvo sureguliuota iki pH 7, 2, paskirstyta į suslėgtus buteliukus, užvirinama ir išvaloma CO 2 : N2 sumaišytomis dujomis (20%: 80%), prieš tai uždengiant dangtelį ir sterilizuojant autoklavu. Į terpę, kuri buvo naudojama auginant P. aestuarii ant elektrodų ir atliekant bendrosios kultūros eksperimentus, buvo pridedamas tiosulfatas (0, 5 mM) P. aestuarii biosintezei. Kanamicinas (200 μg ml −1 ) buvo įpiltas į terpę, kuri buvo naudojama kultivavimui ir kultivavimo eksperimentams su G. sulfurreducens mutantų padermėmis 22 .

P. aestuarii buvo įprastai auginamas anaerobiškai terpėje, kurioje yra sulfidų. Natrio sulfidas (3, 5 mM kaip Na2S · 9H2O) buvo tiekiamas į Geobacter terpę, modifikuotą taip, kaip aprašyta aukščiau. Terpė, kurioje yra sulfido, prieš sėjant P. aestuarii buvo leista sėdėti tamsoje mažiausiai 2–3 valandas. Kultūros buvo kultivuojamos nuolat apšviečiant (8, 3 ± 0, 2 μmol m –2 s – 1 ) ir esant temperatūrai (27 ± 0, 4 ° C), įvesta kaitrine lempute (25 W).

Bendrosios G. sulfurreducens ir P. aestuarii kultūros buvo gautos iš grynų kultūrų, esančių nejudančioje fazėje. Prieš panaudojant kultivavimui, supernatantas iš kiekvienos grynos kultūros (16 ml) buvo pašalintas po centrifugavimo (4200 g , 20 min.). Tada ląstelių granulės buvo plaunamos 2 ml terpės be substrato be sieros ar sulfido. Bendrosios kultūros buvo pradėtos naudojant 0, 5 ml užplikytų G. sulfurreducens inokuliantų ir 0, 5 ml užpilto išplauto P. aestuarii sėjimo į 15 ml modifikuotos Geobacter terpės, turinčios 10 mM acetato kaip vienintelio elektronų šaltinio. Iš terpės nebuvo deguonies šaliklių, tokių kaip natrio sulfidas ar cisteinas. Tarpkultūros taip pat buvo inkubuojamos esant pastoviam apšvietimui (8, 3 ± 0, 2 μmol m –2 s – 1 ) ir esant temperatūrai (27 ± 0, 4 ° C), įvestam kaitinamosios lemputės (25 W). Kai kurių eksperimentų metu kultivavimo buteliukai buvo apvynioti aliuminio folija, kad būtų pašalinta šviesa.

Perkeltos bendros kultūros buvo inicijuotos šviežia terpe, kurioje yra acetato, kaip vienintelio elektronų donoro, pasėjant 1 ml anksčiau užaugintų kultūrų. Bendros kultūros buvo inkubuotos tomis pačiomis sąlygomis, kaip aprašyta aukščiau.

Analizės metodai

Norint nustatyti ląstelių tankio pokytį auginimo metu, inkubacijos metu buvo imamas 1 ml kultūrinės terpės, kad būtų matuojamas optinis tankis (OD), naudojant ultravioletinių spindulių spektrofotometrą (Agilent, CA, JAV). G. sulfurreducens ir kultūrų OD buvo nustatyti esant 600 nm bangos ilgiui, o P. aestuarii kultūrų OD buvo stebimi esant 720 nm. Organinių rūgščių koncentracija buvo nustatyta naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (HPLC) su Aminex NPX-87H kolonėle (Bio-Rad, CA, JAV). Sieros rūgštis (5 mM) buvo naudojama kaip eliuentas 0, 6 ml min –1 . Organinės rūgštys buvo aptiktos 210 nm bangos intervale, naudojant UV detektorių (Agilent).

Ląstelių skaičiavimas

Iš kultūrų ląstelių augimo metu buvo imami mėginiai. 1 ml mėginiai buvo centrifuguoti (11 300 g , 10 min.), O supernatantai išmesti. Ląstelių granulės tris kartus plaunamos 0, 1 M fosfato buferiu (PBS; pH 7, 2), prieš tai pritvirtinant 4% paraformaldehide. Srauto citometrija buvo atlikta naudojant „BD Influx Fluorescence-Activated Cell Sorter“ („BD Biosciences“, San Chosė, CA, JAV). Norėdami sunaikinti ląstelių agregatus, kultūros buvo apdorotos 100 mM Na2 EDTA (Sigma Aldrich), 25 kartus praleistos per adatą su dydžiu 25, po to maišomos sūkuriu. Tada mėginiai buvo nudažyti SYBR Gold nukleorūgšties dėme („ThermoFisher“, Waltham, MA, JAV). Prieš kiekvieną srauto citometrijos analizę buvo atliktas optimizavimas ir kalibravimas, naudojant 3, 6 mm ultravioletines fluorescencines daleles (Spherotech, Lake Forest, IL, JAV). Iš priekio ir į šonus išsibarstę buvo naudojami ląstelių šiukšlėms išstumti, o 488 nm argono lazeris buvo naudojamas SYBR Gold sužadinti, matuojant emisiją esant 542/27 nm. 20 000 ląstelių vertės nustatymas ir mediana buvo atliktas naudojant Flow Jo programinę įrangą (Tree Star, Ashland, OR). Dviejų skirtingų ląstelių populiacijų santykis mišrioje mikrobų bendruomenėje buvo identifikuotas iš 20 000 užregistruotų ląstelių, naudojant dydžio ir sudėtingumo vartus FCS Express (Los Andželas, CA, JAV) srauto citometrijos programinėje įrangoje.

Elektronų mikroskopinės analizės

Nuskaitytais elektronų mikrografais (SEM) buvo atvaizduojama ląstelės morfologija, pritvirtinimas prie elektrodo paviršių ir pasiskirstymas tarp kultūrų biofilmų. Kad būtų paimti G. sulfurreducens ir P. aestuarii bendros kultūros biofilmų mėginiai , prieš inokuliaciją į serumo buteliukus buvo įdėtas stiklo gabalėlis arba membraninis filtras, kaip bioplėvelės substratas. Stiklinis gabalas arba membraninis filtras su pritvirtintomis bioplėvelėmis buvo atsargiai pašalintas ir pritvirtintas SEM, kaip ir grafito elektrodai su elementais, pritvirtintais iš bioelektrocheminių sistemų (BES). Mėginiai buvo fiksuojami 2% gluteraldehidu, 2% paraformaldehidu 0, 1 M PBS, esant 7, 2 pH, iki 12 h, esant 4 ° C, po to tris kartus plaunami PBS po 10 min., Ir dehidratuoti etanolio grupėse (10, 35, 50)., 75, 95% ir 3 x 100% po 10 min.). Mėginiai iš karto du kartus buvo panardinami 10 minučių į heksametildisilazaną (Sigma Aldrich, MO, JAV), po to 9–12 valandų džiovinami oru garų gaubte. Mėginiai buvo padengti dulkėmis, padengti auksu, ir buvo pavaizduoti Quanta SEM (FEI, Hillsboro, OR) ir „Orion Helium“ jonų mikroskopu (Zeiss, Peabody, MA).

TEM sveiki tvirtinimo elementai buvo paruošti užlašinant 5 μl ląstelių lašą iš bendros kultūros ant formosvaru padengtos grotelės (Electron Microscopy Sciences (EMS, Hatfield, PA)) ir išdžiovinami oru. Tinkleliai buvo apžiūrėti naudojant FEI Tecnai. TEM, turinčiame 200 keV LaB6 elektronų šaltinį (FEI, Hillsboro, OR). Hemo aptikimas naudojant plonojo profilio TEM buvo atliktas apdorojant 3, 3′-diaminobenzidinu (DAB, EMS), laikantis anksčiau aprašytų protokolų 30, 32. Biofilmai iš kultūrų kultūros buvo surinkti atsargiai pašalinant terpę. Buteliuko apačioje esanti bioplėvelė buvo perkelta į centrifugos mėgintuvėlius, centrifuguojama mažu greičiu (850 g , 5 min.) Ir fiksuojama 2% gluteraldehide, 2% paraformaldehide 0, 1 M PBS per naktį 4 ° C temperatūroje. Fiksavimo priemonė buvo pakeista trimis plovimais PBS (kiekviena po 10 min.), Po to inkubuojamos dvi (po 10 min kiekvienoje tamsoje kambario temperatūroje) PBS, kuriame yra šviežio DAB (0, 05%). dėmė buvo sukurta trečią kartą inkubuojant su PBS, turinčiu šviežio DAB (0, 05%) ir 0, 018% H2 O 2 (10 min. Tamsoje kambario temperatūroje). Kontroliniai mėginiai gavo šviežią DAB tirpalą be H 2 O 2 . Reakcija buvo sustabdyta tris kartus plaunant PBS, prieš dehidratuojant didėjančia etanolio seka, infiltracija į „LR White“ įterpimo dervą (EMS) ir kietinama 55 ° C temperatūroje 24 valandas. Polimerizuoti blokai buvo padalyti į 70 nm plonas dalis naudojant „Leica Ultracut UCT“ ultramrototomą, naudojant „Diatome“ (Biel, Šveicarija) deimantinį peilį. Itin plonos sekcijos buvo sumontuotos ant formvariu padengtų 100 akių Cu grotelių, apipurkštų anglimi. TEM vaizdavimas buvo atliktas naudojant „Tecnai T-12“ (FEI) su LaB6 elektronų šaltiniu, veikiančiu esant 120 keV.

Bioelektrocheminių sistemų kūrimas ir eksploatavimo sąlygos

P. aestuarii auginimo BES buvo sukonstruoti kaip H tipo reaktorius, sudarytas iš dviejų stiklinių kamerų (Adams & Chittenden Scientific Glass, CA, JAV). Dvi kameros (100 ml darbinio tūrio / kiekvienoje), kuriose buvo skaitiklis ir darbiniai elektrodai, buvo atskirtos katijonų mainų membrana (5, 07 cm 2 ). Skaitiniai ir darbiniai elektrodai buvo paruošti mirkant ¼ colio skersmens strypo tipo grafito elektrodus 1 N HCl per naktį, po to ultragarsu du kartus sonuojant 100% etanolyje ir du kartus ultragarsiniame DI vandenyje (kiekvienas po 30 min.). Elektrodai buvo panardinti į elektrolitą, sukuriant pastovų išplatintą paviršių, lygų 83 2, 83 cm 2 darbiniam elektrodui ir ∼ 4, 3 cm 2 priešiniam elektrodui. Ag / AgCl etaloninis elektrodas buvo įdėtas į darbo kamerą per mėginių ėmimo angą. Vidinis visų BES atsparumas buvo <5 Ω. Visi elektrodai (darbiniai, pamatiniai ir priešiniai elektrodai) buvo sujungti elektra su potenciostato kabeliais, naudojant aligatoriaus spaustukus. Prieš sėjant, kameros buvo užpildytos anaerobine, modifikuota Geobacter terpe, kaip aprašyta aukščiau. Inokuliacijai 10 ml užaugintos P. aestuarii kultūros buvo centrifuguojamos ir supernatantas išmetamas. Suspenduotos ląstelės buvo suspenduotos 2 ml šviežios terpės ir panaudotos 100 ml darbinei kamerai inokuliuoti. Kontrolinis eksperimentas buvo atliktas filtruojant supernatantą iš 10 ml P. aestuarii kultūros per membraninį filtrą (0, 22 μm) ir įpilant į darbo kamerą. Visi eksperimentai buvo atlikti anaerobinėje kameroje (siekiant palaikyti aplinką be deguonies), kurioje yra kaitrinė 25 W lemputė, kurios pastovi temperatūra yra 26 ± 0, 7 ° C. Tamsaus ciklo eksperimentai buvo atlikti uždengiant BES kartono dėžute, kad būtų išvengta šviesos poveikio. Darbinis elektrodas buvo poliarizuotas esant –600 mV Ag / AgCl, naudojant „Gamry R300“ (Gamry, PA, JAV).

Dabartinei produkcijai iš ΔombB-omaB-omcB-orfS-ombC-omaC-omcC G. sulfurreducens mutanto padermės ir papildomo padermės, į kurią vėl buvo įvestas ombB-omaB-omcB genų klasteris, mes panaudojome 3 elektrodų plokščiąjį - plokštiniai reaktoriai (60 ml darbinio tūrio). Darbinis elektrodas buvo grafitas (gruntuotos grunto pavidalo grafito plokštės, stiklo pluošto klasės GM-10, 25 mm × 25 mm × 3 mm, „Poco Graphite, Inc.“, Decatur, TX). Eksperimentai buvo atlikti inkubatoriuje (tamsioje, 28 ± 0, 5 ° C temperatūroje), nuolat purškiant CO 2 : N 2 (20%: 80%) dujų mišiniu. Darbinis elektrodas buvo poliarizuotas esant 300 mV Ag / AgCl, naudojant individualiai pagamintą potenciostatą 34 . Reaktoriai buvo veikiami paketiniu režimu, naudojant modifikuotą „ Geobacter“ terpę, kurios vienintelis elektronų šaltinis buvo 10 mM acetato.

Membraninio filtro reaktorių veikimas

Membraninio filtro reaktorius buvo naudojamas tiriant kiekvienos rūšies augimą, fiziškai atskirtą į skirtingas kameras, bet keičiantis ta pačia terpe. Reaktorius buvo sukonstruotas naudojant du vakuuminių filtrų laikiklius (Millipore), sujungtus silicio vamzdeliais (papildomas 5 pav.). Į kiekvieną filtro laikiklį buvo įpilamas 0, 1 μm porų dydžio membraninis filtras, kad terpė (100 ml) kiekvienoje kameroje būtų atskirai pasėjama gryna vienos bakterijos kultūra. Kiekvienos filtro kameros išėjimas buvo pumpuojamas (∼ 0, 15 ml min –1 ) į kitą, antrą kartą filtruojant per kitą filtrą (0, 45 μm). Tokiu būdu abi bakterijos buvo fiziškai atskirtos, tačiau didieji tirpalai buvo gerai sumaišyti, kad būtų pašalinta difuzijos trukmė tarp G. sulfurreducens ir P. aestuarii kamerų.

Sterilizavus ir įdėjus membraninį filtrą, visi reaktoriai buvo perkelti į anaerobinę kamerą ir užpildyti ta pačia modifikuota Geobacter terpe, kurioje yra acetatas, kaip vienintelis elektronų donoras. P. aestuarii ir G. sulfurreducens iš kultūrų, anksčiau išaugintų atitinkamai su sulfidu ir acetatu / fumaratu, buvo surinkti, nuplauti ir įvesti į reaktorių. Pirmoji kamera buvo pasėjama P. aestuarii , o antroji kamera buvo pasėta G. sulfurreducens . Laikui bėgant buvo stebima acetato koncentracija kiekvienoje kameroje, kad būtų galima įvertinti ląstelių augimą ir aktyvumą. Kontroliniam eksperimentui kartu buvo pasėtos dvi bakterijos. Kiekvienos kameros mėginių acetato koncentracijos buvo stebimos naudojant HPLC (UV), kaip aprašyta aukščiau.

Duomenų prieinamumas

Visi reikalingi duomenys yra gauti iš autorių paprašius.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomos pastabos ir papildomos figūros

  2. 2.

    Tarpusavio apžvalgos byla

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.