Nukreipti membraninius baltymus antikūnams aptikti, naudojant fagų demonstravimą | mokslinės ataskaitos

Nukreipti membraninius baltymus antikūnams aptikti, naudojant fagų demonstravimą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Antikūnų generavimas
  • Antikūnų terapija
  • Taikomoji imunologija
  • Baltymų dizainas

Anotacija

Kritinis sėkmingo naujų antikūnų atskyrimo fage demonstravimo veiksnys yra teisingai sulankstyto antigeno pateikimas. Nors tai yra gana paprasta tirpiems baltymams, kurie gali būti išgryninti ir imobilizuoti ant plastikinio paviršiaus, membraniniai baltymai siūlo didelius antikūnų atradimo iššūkius. Visos ląstelės gali panardinti į membranos baltymo natūralųjį pavidalą, tačiau jį apsunkina mažas antigeno tankis, didelis nesvarbių antigenų fonas ir nespecifinis fago dalelių jungimasis prie ląstelių paviršių. Čia aprašytam metodui naudojamas pereinamasis kintamų ląstelių-šeimininkų linijų transfekcija ir griežti plovimo veiksmai, skirti pašalinti visus šiuos apribojimus. Aprašytas trijų ant membranos surištų baltymų sėkmingas antikūnų išskyrimas iš naivios scFv bibliotekos; žmogaus CD83, šunų CD117 ir šikšnosparnių CD11b.

Įvadas

Membraniniai baltymai yra ypač patrauklūs kaip tyrimų, diagnostikos ir gydymo tikslai. Specifiniai membraniniai baltymai gali apibrėžti tam tikrus ląstelių tipus ar vystymosi stadijas, ypač imuninių ląstelių pogrupius apibūdina tai, kad yra arba nėra įvairių diferenciacijos klasterio (CD) žymenų 1 . Be to, sergant ląstelėmis pasikeitė normalus membranos receptorių baltymų lygis; pavyzdžiui, Her2 receptoriaus ekspresija yra labiau sureguliuota daugiau kaip 20% krūties vėžio atvejų 2 . Antikūnai prieš membraninius baltymus yra labai reikalingi tiek kaip tiriamieji reagentai, tiek ir terapiniai tikslai. Europoje ir JAV yra beveik 50 monokloninių antikūnų (mAb), patvirtintų ar peržiūrimų kaip terapiniai vaistai, ir iš šių 61% tikslinių baltymų, esančių ląstelės paviršiuje (//www.antibodysociety.org/news/approved_mabs). php, atnaujinta 2015 m. gegužės 26 d.).

Nauji mAb gali būti išskirti keliais skirtingais metodais. Gyvūnų imunizacija kartu su 3 hibridomos technologija išlieka labiausiai paplitęs metodas, ypač tiems monokloniniams antikūnams, kurie naudojami kaip laboratoriniai reagentai, nes tai yra patikimas ir be licencijos metodas, kurio metu gaunami didelio afiniteto monokloniniai antikūnai. Tačiau iš pelių gaunami monokloniniai antikūnai yra ribotai naudojami klinikoje, nes jie yra imunogeniški žmogaus šeimininkui 4 . Šiems mAb reikia baltymų inžinerijos strategijų, kad būtų sukurti chimeriniai arba humanizuoti mAb, kad būtų sumažintas jų imunogeniškumas žmonėms.

Siekiant visiškai išvengti pelių gautos sekos, mAb taip pat gali būti išskirti naudojant transgenines, humanizuotas peles 6 (po jų seka hibridomos technologija) arba naudojant antikūnų bibliotekų demonstravimo technologijas 7 . Ankstesnė technologija yra labai brangi ir jai trukdo intelektinės nuosavybės apsauga, o ekrano technologijos yra palyginti pigios ir prieinamos tyrimų laboratorijoms. Fagų rodymas yra labiausiai paplitusi rodymo technologija (kuri taip pat apima ribosomų, mielių ir žinduolių rodymą). Pirmiausia jį aprašė George'as P. Smithas, kuris pademonstravo, kad baltymai ar peptidai gali būti aptikti gijinio fago paviršiuje per genetinį susiliejimą su fago apvalkalo baltymu fagos genome 8 . Vėliau ši technologija buvo išplėsta, kad būtų galima klonuoti į paprastesnius phagemidų vektorius ir sukurti antikūnų fragmentų (scFv ar Fab) bibliotekas, klonuoti iš žmogaus kraujo ir parodyti fage 9, 10 . Tada šios bibliotekos buvo tikrinamos prieš imobilizuotus tikslinius baltymus, kad būtų išskirti apibrėžto specifiškumo antikūnai, vadinamu „biopanning“ 11 .

Tirpių, išgrynintų baltymų antikūnų bibliotekų biologinio aptikimo metodika yra gerai nustatyta 12, 13, tačiau sėkmingas mAb išskyrimas naudojant fagų ekraną labai priklauso nuo naudojamo antigeno kokybės. Antigeną reikia pateikti fagų bibliotekoje kuo arčiau jo gimtosios struktūros. Tai gali būti sunku pasiekti membraniniams baltymams, kuriuose yra hidrofobinių transmembraninių domenų ir kurie gali turėti išplėstines tarpląstelines sritis, sudarytas iš kelių domenų, arba, be to, gali būti daugelio subvienetų baltymų klasterio dalis. Šios problemos sprendimas yra biopano bibliotekos, kuriose kaip antigeno šaltinis naudojamos ištisos ląstelės ir taip išlaikoma natūrali baltymo konformacija.

Visų ląstelių biobangavimas turi daug sunkumų. Pirma, yra didelis nereikšmingų baltymų fonas, ir, antra, palyginti su šiuo dideliu fonu, tikslinių baltymų gali būti nedaug. Trečia, fago dalelės yra linkusios nespecifiškai adsorbuotis ląstelių paviršiuose per apvalkalo baltymus, nesusijusius su antikūno fragmentu, ir šie fagai bus išplaunami kartu su specialiai surištu fagu.

Mes optimizavome antikūnų fagų bibliotekų ištisų ląstelių biologinio aptikimo metodą, kuris skirtas kiekvienai iš šių problemų. Metodas naudoja laikiną tikslinio baltymo ir žaliojo fluorescencinio baltymo (GFP) transfekciją, kad padidintų tikslinio baltymo tankį ir sudarytų priemones ląstelėms, turinčioms aukštą ląstelių paviršiaus baltymo ekspresiją, atrinkti naudojant fluorescenciniu būdu aktyvuotą ląstelių rūšiavimą (FACS). Ląstelių-šeimininkų linija pakaitomis keičiama tarp kiniškų žiurkėnų kiaušidžių (CHO) ir žmogaus embrioninio inksto (HEK) ląstelių su kiekvienu bioapdorojimo ratu, kad būtų lengviau pašalinti fono rišiklius. Mažas pH prausiklis yra skirtas pašalinti fagą, esantį nepririšant antikūnų.

Iš pradžių metodas buvo sukurtas naudojant žmogaus CD83 kaip pavyzdinę sistemą. CD83 antigenas yra ekspresuojamas aktyvuotose dendritinėse ląstelėse 14, ir mes anksčiau esame išreiškę tarpląstelinį CD83 domeną ir išskirtus antikūnus biologiškai apibarstydami tirpių baltymų 15 . Ląstelėmis pagrįsto biopanaudojimo metodo optimizavimui mes panaudojome pereinamai išreikštą su membranomis surištą CD83, naudodami tirpius baltymus kaip technikos sėkmės stebėjimo priemonę. Tada mes optimizavome ir išbandėme metodą, naudodamiesi šunų CD117 (c-Kit) ir šikšnosparnių CD11b, kuriems nebuvo rekombinantinės tirpios medžiagos ir antikūnų prieš tarpląstelinius domenus.

Rezultatai

Membranoje surištų antigenų ekspresija

Kiekvienas iš tikslinės membranos baltymų, įskaitant jų trans-membranos domenus, buvo klonuotas rėmelyje su GFP taip, kad tikslinis baltymas būtų rodomas tarpląsteliniame transfekuotų ląstelių paviršiuje, o GFP būtų tarpląstelinis, kaip transmembraninis sulietas baltymas (1 pav. 1a). Norėdami patvirtinti paviršiaus ekspresiją, CHO ląstelės, transfekuotos CD83-GFP, buvo tiriamos antikūnu (3C12) prieš tarpląstelinį CD83 15 domeną. 1b paveiksle parodyta, kad 3C12 surišimas buvo proporcingas GFP ekspresijai ląstelėse, patvirtinantis, kad CD83 buvo ekspresuojamas ląstelių paviršiuje, o perkeltų ląstelių laiko analizė parodė, kad CD83 ir GFP buvo aptiktas maksimaliai. 2 diena. GFP ekspresijos aptikimas sumažėjo greičiau nei CD83 po 3 dienos, greičiausiai dėl mažesnio sulietų baltymų GFP domeno konformacinio stabilumo, dėl kurio sumažėjo fluorescencija.

Image

( a ) Tikslinės membranos genas yra klonuotas į pEGFP-N1 rėmelyje su GFP. Transfekcija į CHO arba HEK ląsteles sukelia membraninio baltymo ekspresiją ląstelės paviršiuje, kuriame yra pridėtas tarpląstelinis GFP, ir tai suteikia ( b ) proporcingumą tarp GFP ir tikslinės ekspresijos (parodyta srauto citometrijos analizėje dvi dienas po CD83-GFP transfekcijos). transfekuotos ląstelės, jungiančios anti-CD83 antikūnus). Tikslinis baltymas ekspresuojamas maksimaliai antrą dieną po transfekcijos (čia parodytas kaip laiko tėkmės citometrijos tyrimas, parodantis ląstelių, ekspresuojančių CD83 ir GFP, procentą iki 6 dienų po transfekcijos). c ) Antrąją dieną po transfekavimo fagų biblioteka išeikvota nuo neperfektuotų ląstelių, o tada ( d ) nesurištas fagas inkubuojamas su transfekuotomis ląstelėmis. e ) Nuplovus žemo pH buferiu, FACS naudojamas aukšto GFP ekspresijos ląstelėms surinkti, o fagas išplaunamas iš ląstelių, kurių GFP yra aukštas, ir užkrėstos E. coli . f ) Fagas yra amplifikuojamas kitam panoravimo etapui, kai šeimininko transfekcijos ląstelių linija pakaitomis tarp CHO ir HEK ląstelių vyksta 3–4 raundus. g ) Atskiri klonai tikrinami srauto citometrijos metodu, atlikus 3–4 pakreipimo raundus.

Visas dydis

Ląstelių bioinformacijos optimizavimas CD83

Ląstelės, surinktos dvi dienas po transfekcijos, buvo inkubuotos 1 valandą su žmogaus naiviaisiais antikūnų fagų biblioteka, po pradinio išeikvojimo iš neperkeltų ląstelių (1c, d pav.). Ląstelių-fagų mišinys buvo plaunamas pH 5 buferiu, kad būtų pašalintas nespecifiškai adsorbuotas fagas, ir tada surūšiuotas naudojant FACS, kad būtų surinktos tik ląstelės, išreiškiančios aukštą GFP kiekį (1e pav.). Iš šių ląstelių surištas fagas buvo išplaunamas naudojant pH 3 buferį, užkrėstas E. coli ir amplifikuotas vėlesniems bioapdorojimo etapams.

Iš pradžių transfekuotoms CHO ląstelėms buvo atlikti CD83 biobangimo bandymai. Srauto citometrija buvo naudojama fagų telkiniams iš kiekvieno biopaningo ciklo tirti, kad jie prisijungtų prie transfekuotų ląstelių. Nors fagų telkiniai parodė padidėjusį bendrą surišimą su ląstelėmis kiekvienu bioapdirbimo raundu, specifiškumo GFP ekspresuojančių ląstelių atžvilgiu nebuvo (2a pav.). Tačiau kai baseinai buvo analizuojami naudojant ELISA, kad surištų su imobilizuotu tirpiu CD83 tarpląsteliniu domenu, buvo akivaizdu, kad trečiajame apvaliajame baseine iš tikrųjų yra CD83 rišikliai (3a pav.). Taigi buvo padaryta išvada, kad CD83 rišiklių skaičius baseine, nors ir yra, buvo minimalus, palyginti su rišikliais prieš kitus ląstelės paviršiaus antigenus. Remiantis tokiu rezultatu, siekiant pašalinti CHO ląstelių rišiklius, buvo pradėtas ketvirtasis biopanzavimo etapas prieš CD83-GFP transfekuotas HEK ląsteles. ELISA rezultatas parodė, kad po šio ketvirtojo etapo fagų telkinys prisijungia prie tirpaus CD83 (3a pav.). Srauto citometrijos analizė parodė mažesnį bendrą jungimąsi su ląstelėmis, tačiau vis tiek nėra specifiškumas GFP ekspresuojančioms ląstelėms, rodantis, kad CD83 rišikliai vis dar yra nedidelė populiacija baseine (duomenys nepateikti).

Image

( a ) Fagų telkiniai iš biologiškai veikiančių CHO ląstelių, transfekuotų CD83-GFP. ( b ) Fagų telkiniai iš kintamų CHO ir HEK ląstelių biopanažų, perpiltų CD117-GFP. c ) Fagų telkiniai, gauti iš kintančių CHO ir HEK ląstelių, biologiškai apjungti, transfekuoti CD11b-GFP. 1 raundo analizė nurodoma juodai, 2 turas raudonai ir 3 turas mėlynai.

Visas dydis

Image

a ) Fagono fondo praskiedimų poliklonalinė analizė iš kiekvieno biobandenymo etapo. b ) Iš atsitiktinai parinktų klonų iš 3 ir 4 raundų biografijos išgelbėto fago monokloninė analizė.

Visas dydis

Žinant, kad 3 ir 4 raundų fagų telkiniuose buvo CD83 rišamųjų medžiagų, buvo atlikta 90 atskirų fago klonų iš kiekvieno baseino analizė naudojant ELISA (3b pav.). Iš 3 raundo nebuvo identifikuoti CD83 rišantys klonai, rodantys mažesnį nei 1 rišiklio 90 klonuose dažnį. 4 etape buvo identifikuoti trys CD83 surišantys klonai; vis dar žemas dažnis 1 iš 30 klonų, paaiškinantis, kad šių rišiklių neatskiriama nuo fono rišamųjų medžiagų, naudojant fagų baseinų srauto citometriją.

Kadangi tirpus antigenas ne visada yra prieinamas tikrinimo tikslams, buvo būtina parodyti, kad teigiamus klonus galima aptikti tokiu metodu, kuriam nereikia tirpių baltymų, todėl tie patys klonai iš 4 raundo buvo tikrinami srauto citometrijos būdu ant transfekuotų CHO ląstelių (4a pav. ). Kiekvieno klono specifiškumui nustatyti buvo naudojamas fagu surištų, GFP ekspresuojančių ląstelių santykis su fagu surištų, ne GFP ekspresuojančių ląstelių santykiu. 20% klonų buvo laikomi nespecifiniais, jungiančiais tiek GFP ekspresuojančias, tiek nespecifines GFP ekspresuojančias ląsteles, paaiškinančius, kodėl fagų baseinuose nebuvo galima aptikti jokio sodrinimo. Tačiau buvo aptikti devyni klonai, turintys specifiškumą GFP teigiamoms ląstelėms (4a pav.), Įskaitant tuos pačius tris klonus (C2, G4 ir D6), identifikuotus tirpiu CD83 ELISA metodu (3b pav.). Nustatyta, kad šie trys klonai yra identiški atlikus kintamųjų sričių fagemidiniame vektoriuje seką. Kiti šeši teigiami klonai, kurie nebuvo ELISA teigiami, buvo pavaizduoti keturiomis papildomomis unikaliomis sekomis. Šie klonai gali prisijungti prie epitopo, kuris yra ant ląstelės paviršiaus, tačiau prieinamas nėra, kai baltymas imobilizuojamas ant plastiko ELISA tyrimui. Šis rezultatas iliustruoja problemas, kylančias, kai imobilizuodami baltymai keičia struktūrą. Anksčiau tą pačią biblioteką panoraminome prieš imobilizuotą CD83, išskirdami septynis unikalius rišiklius (neskelbti duomenys), tačiau tik vienas iš šių rišiklių, 3C12, galėjo surišti natūralųjį ląstelės paviršiaus CD83.

Image

Klonai buvo analizuojami ląstelių, parodančių ir GFP ekspresiją, ir fagų jungimąsi (Q2 kvadrantas), procentą, palyginti su ląstelėmis, rodančiomis fago prisijungimą prie ne GFP ekspresuojančių ląstelių (Q1 kvadrantas). ( a ) fagų klonai iš CD83-GFP biopanaikinimo; ( b ) fago klonai iš CD117-GFP biopanaikinimo; c ) Faganų klonai iš CD11b-GFP biopanaikinimo. Nespecifiniai klonai, jungiantys nežinomą antigeną ant CHO ląstelių paviršiaus, yra paryškinti raudonai. ( d ) Scattergramos, parodančios klonus, paimtus iš CD117-GFP panoraminimo, kuriuose parodytas specifinis surišimas (specifinis klonas G1), nespecifinis surišimas (nespecifinis klonas F4) ir neįrišimas (neįpareigojantis klonas F5).

Visas dydis

Ląstelių pagrindu pagamintos biobandencijos patvirtinimas CD117 ir CD11b

Bandant pagerinti specifiškumą ir praturtinti fagų baseiną šunų CD117 ir šikšnosparnių CD11b biologinio apipjaustymo kampanijų metu, transfekcijos šeimininko ląstelių linija buvo keičiama kiekviename biologinio apdirbimo raunde. ELISA tyrimui nebuvo nei tirpaus šuns CD117, nei šikšnosparnio CD11b, todėl atranka buvo atlikta tik srauto citometrija. Kintama ląstelės-šeimininkės linija labai pagerino specifiškumą, pašalindama rišiklius iš ląstelių-šeimininkų baltymų, kaip rodo fagų telkinių analizė iš kiekvieno bioapdirbimo raundo (2b, c pav.). Fagų antikūnai, jungiantys specifiškai GFP ekspresuojančias ląsteles, buvo akivaizdūs 2-ojo raundo fagų junginiuose, o padidėjęs surišimas - 3-ame raunde. Fagų telkiniai labai mažai jungėsi su ne GFP ekspresuojančiomis ląstelėmis, nes pasikeitė šeimininkų ląstelių antigenai tarp kiekvienos. bioapdorojimo turas. Tai dar kartą patvirtina monokloninio srauto analizė, skirta CD117 (4b pav.) Ir CD11b (4c pav.), Kai nespecifinių rišiklių buvo sumažinta iki 4–5% populiacijos, palyginti su 20%, kai CD83 biopandencija nepakeičiama. ląstelių linijos (4a pav.). Teigiami klonai buvo identifikuoti pagal jų prisijungimo prie GFP ekspresuojančių ląstelių santykį su jų prisijungimu prie ne GFP ekspresuojančių ląstelių. Dinaminis šio santykio diapazonas tarp antigenų skiriasi, nes tai priklauso nuo kiekvieno antigeno ekspresijos lygio. CD11b turėjo vieną logą mažesnę GFP fluorescenciją nei CD117, todėl monokloninis ekranas buvo mažiau jautrus, tačiau teigiamų klonų vis tiek buvo galima aptikti.

Kadangi CD83, CD117 ir CD11b buvo transfekuoti kaip GFP sulieti baltymai, buvo galima įsivaizduoti, kad išskirti fago klonai jungiasi prie GFP (nepaisant to, kad jie yra ekspresuojami tarpląsteliniu būdu) arba su kitu transfekcijos artefaktu. Todėl buvo ištirtas teigiamas kiekvienos biopanaudojimo kampanijos klonų kryžminis reagavimas į visas transfekuotas ląstelių linijas. Visi unikalūs klonai buvo išanalizuoti ir kiekviename iš jų buvo nustatyta, koks fagių jungimasis būdingas transfekuotam baltymui, naudojamam bioapdirbimui, suteikiant pasitikėjimo, kad fagas jungiasi prie ląstelių paviršiaus paveiktoje jų atitinkamų taikinių antigenų srityje (tipiški klonai, parodyti 5 pav.).

Image

CHO ląstelės buvo transfekuotos CD83-GFP ( a - c ), CD117-GFP ( d - f ) arba CD11b-GFP ( g - i ) ir po to zonduotos bet kuriuo C2 klonu, išskirtu atliekant CD83-GFP bioaktyvinimą ( a, d, g ) A3 klonas, išskirtas biobandant CD117-GFP ( b, e, h ), arba H7 klonas, išskirtas biobandant CD11b-GFP ( c, f, i ).

Visas dydis

Biobandant rekombinantinį baltymą, izoliuoti klonai taip pat turi būti patikrinti, ar jie jungiasi su natūraliu antigeno šaltiniu. Hodžkino limfomos ląstelių linija KM-H2 pasižymi dendritinėms ląstelėms būdingomis savybėmis, įskaitant CD83 16 ekspresiją. Pradiniai srauto citometrijos rezultatai, naudojant KM-H2 ląsteles ir fago daleles, reikšmingo surišimo neparodė (įskaitant teigiamą kontrolinį fagą 3C12). Tai buvo priskirta žemos CD83 ekspresijos ląstelių paviršiuje ir žemo fago išreikšto scFv avidumo deriniui. Fagos scFv buvo performatuoti į visą ilgį, dvivalenčius IgG1 antikūnus 15 . Po to suformatuotas C2 antikūnas buvo lyginamas su 3C12_IgG1 15 (išskirtas fago ekranu prieš tirpių CD83) ir 3C12C_IgG1 17 (3C12 lengvosios grandinės subrendimo versija), kad prisijungtų prie KM-H2 ląstelių srauto citometrijos būdu (6a pav.). Rezultatai parodė, kad visi trys antikūnai prisijungė prie KM-H2 ląstelių. Kaip ir tikėtasi, didesnis afinitetas 3C12C_IgG1 suteikė didesnį fluorescencijos poslinkį nei 3C12_IgG1 (daugiau nei tris kartus). C2_IgG1 davė plačią smailę su vidutine fluorescencija, panašia į 3C12C smailę.

Image

( a ) Anti-CD83 monokloniniai antikūnai buvo patikrinti, ar jie jungiasi prie KM-H2 ląstelių, taikant srauto citometriją. 3C12, išskirtas biobandant nuo rekombinantinio tirpaus CD83, parodytas mėlynai. 3C12C yra 3C12 (purpurinė) giminystės subrendimo versija, o C2 buvo išskirtas biologiniu būdu apdorojus ląsteles prieš CD83-GFP (tealą). Kontroliniai mėginiai buvo tik ląstelės (nuspalvintos) ir ląstelės, apdorotos tik antriniu antikūnu (raudonos spalvos). Vidutinė fluorescencija rodoma virš tiriamųjų mėginių. ( b ) Anti-CD117 monokloniniai antikūnai buvo tiriami imunohistocheminiu būdu, siekiant surišti juos su šunų kaulas. Skyriai buvo tiriami tik naudojant antrinius antikūnus (kairėje), teigiamos kontrolės anti-žmogaus c-Kit (viduryje) ir A3 monokloninius antikūnus, išskirtus ląstelių biopanoksavimu CD117-GFP (dešinėje). Masto juosta yra 50 μm.

Visas dydis

Šunų CD117 atveju buvo parodyta, kad performatuotas A3 klonas jungiasi su šunų kaulas ląstelių naviko audiniais imunohistocheminiu būdu (6b pav.). Dėl medžiagos trūkumo dar nebuvo atliktas specifinių CD11b klonų vietinio šaltinio tyrimas.

Diskusija

Terapiniai antikūnai dažnai yra nukreipti į membraninius baltymus, kai siekiama iššaukti imuninį atsaką prieš tikslinę ląstelę, pristatyti konjuguotą vaistą į tikslinę ląstelę arba blokuoti receptorių prisijungimą prie savo natūralaus ligando. Fagų rodymas paprastai naudoja išgrynintus, imobilizuotus baltymus kaip bioapdailos taikinį, tačiau membraninius baltymus sunku išvalyti, nes juose yra hidrofobinių domenų, ir jie gali denatūruoti gryninimo proceso metu. Antikūnų bibliotekų, apimančių rišiklius prie membraninių baltymų, tikrinimo galimybė yra naudoti ištisas ląsteles kaip antigeno šaltinį, tačiau ištisų ląstelių bioapdailos procesas turi savų apribojimų. Mažas tikslinio baltymo kiekis dideliame nesvarbių antigenų fone ir būdingas fago dalelių lipnumas apsunkina šią metodiką, todėl yra palyginti nedaug pranešimų apie sėkmingą ląstelių biologinį plėtimąsi 18, 19, 20 .

Svarbus antikūnų prieš membraninius baltymus biologinio apipavidalinimo žingsnis yra gauti aukštą tikslinio antigeno paviršiaus tankį, nes žemo lygio, kuris paprastai pastebimas vietinėse ląstelėse, nepakanka, kad būtų galima surinkti net didelio afiniškumo antikūnus iš labai skirtingų bibliotekų. Mielių 21 ir vabzdžių ląstelėse 22 aprašyti būdai, kaip parodyti padidėjusį antigeno kiekį ląstelių paviršiuose rekombinantinės ekspresijos būdu, tačiau žinduolių ląstelės suteikia teisingo žinduolių tikslinių baltymų sulankstymo ir posttransliacinio perdirbimo pranašumą, nors jų ekspresija gali būti mažesnė . Čia aprašytu būdu žinduolių ląstelėse naudojami laikinai ekspresuojami membraniniai baltymai, sujungti su tarpląsteline GFP. Tai leidžia pasirinkti ląsteles, išreiškiančias aukštą GFP, tiesiogiai proporcingą transfekuoto receptoriaus tankiui.

Fagų biblioteka surišama praėjus dviem dienoms po transfekcijos ir dėl trumpalaikio transfekcijos pobūdžio fagas veikiamas ląstelėmis, kurių antigenas yra įvairaus lygio - nuo jokio iki aukšto ekspresijos. Net atlikus pradinį neperkeltų ląstelių išeikvojimo etapą, neišreiškiančios ląstelės perinfekuotoje populiacijoje veikia, norėdamos toliau surinkti bet kokius rišiklius nuo fono antigenų. Po fagų inkubavimo ir plovimo, sulietas GFP naudojamas siekiant palengvinti FACS būdu surinkti tik labai ekspresuojančias ląsteles. Tai yra panašu į anksčiau aprašytą metodą, kai stabilios ląstelių linijos buvo dažytos ir po to sumaišomos su neišraiškinga ląstelių linija, kad būtų galima surinkti nepageidaujamą fagą prieš FACS 19 . Tačiau tam konkrečiam metodui reikia varginančio ir lėto stabilios ląstelių linijos, išreiškiančios dominantį antigeną, gamybos ir vėlesnio ląstelių dažymo, tuo tarpu mūsų modifikacija naudoja laikiną transfekciją su GFP sulietu baltymu ir todėl gali būti atliekama per daug trumpesnį laiką. Dėl trumpalaikio transfekcijos ląstelių-šeimininkų liniją galima pakeisti pakaitomis kiekviename bioapdirbimo etape, o tai keičia fono antigenus. Mes parodėme, kad ląstelių-šeimininkų linijos kaitaliojimas žymiai padidina specifinių ir nespecifinių rišiklių praturtėjimo santykį, kuris yra nepaprastai svarbus sėkmingoms ląstelių biologinio plėtimo strategijoms.

Anksčiau buvo pranešta, kad ištisų ląstelių biologinis apdirbimas gali praturtinti fagų klonus, kuriuose nėra scFv intarpo 23 . Tai įvyksta dėl to, kad kartu su specifiniu fagu, surištu per scFv sritį, išplaunamas fagas, nespecifiškai surištas prie ląstelės paviršiaus. Bet koks nespecifinis fagas, kuriam trūksta scFv įterpimo arba turi sutrumpintus arba už rėmo esančius intarpus, vėliau turi augimo pranašumą gelbėjant fagą. Taigi, mes įtraukėme žemo pH plovimą, kurį rekomendavo Tur et al. 23 prieš FACS pašalinti nespecifiškai surištą fagą. Be to, pats FACS procesas taip pat padeda pašalinti nespecifiškai surištą fagą dėl srauto citometrijos kirpimo jėgos.

Įdomu tai, kad mes pastebėjome, kad antikūnų afinitetai CD83 ir CD117, išskirti aprašytu ląstelių bioapdirbimo metodu, yra labai stiprūs naiviajai bibliotekai. CD83 atveju izoliuotas antikūnas geriau prisirišo prie KM-H2 ląstelių nei antikūnas, išskirtas iš tos pačios bibliotekos, bet dedamas ant tirpiojo CD83 (6 pav.). Be to, jis surišo ir su afinitetu subrendusio pastarojo antikūno versiją. Galbūt taip yra todėl, kad imobilizuodami tirpių antigenų ant plastikinių paviršių, susidaro didelis antigeno tankis, leidžiantis išskirti mažesnio afiniteto rišiklius, tuo tarpu ląstelių pagrindu pagamintas biopanavimas verčia didesnio afiniteto rišiklius dėl mažesnio antigeno tankio. Preliminarūs tyrimai su antikūnais prieš CD117 rodo afinitetą sub nanomolių diapazone; pavyzdžiui, performatuotas antikūnas A3 jungiasi su išgrynintu CD117 tarpląsteliniu domenu, kurio afinitetų konstanta (KD) yra 9, 25 × 10 –10 M (žr. papildomą 1 paveikslą).

Sėkmingas antikūnų išskyrimas naudojant bet kurį ląstelių biologinio plombavimo metodą priklausys nuo to, ar epitopai gali patekti į tikslinį baltymą. Iš trijų čia aprašytų antigenų gavome daugiausiai unikalių CD117 rišiklių. CD117 tarpląstelinis domenas yra palyginti pailgas su penkiais į imunoglobuliną panašiais domenais, besitęsiančiais nuo ląstelės paviršiaus 24, tokiu būdu atskleidžiant didesnį epitopų skaičių nei CD83, kuriame yra vienas į imunoglobuliną panašus domenas, esantis netoli ląstelės paviršiaus 25 . CD11b panoraminimas monokloninės atrankos metu neišskyrė tiek daug rišamųjų medžiagų (4 pav.), Kaip buvo numatyta iš polikloninės fagų baseino analizės (2 pav.), Nes tai parodė mažesnį sodrumą nei CD117. CD11b paprastai yra susietas su heterodimeriu su CD18, o nesant išorinio ligando, jis sulankstomas į kompaktišką struktūrą arti ląstelės membranos 26 . Jei ji taip pat suformuoja šią struktūrą, kai ji yra išreikšta monomeru, tada joje gali būti nedaug epitopų. Tai atitinka rezultatus, kuriuos pranešė Hoogenboom ir kt. 20, kur rišikliai buvo lengvai išskiriami iš membraninio baltymo, turinčio didelį ir prieinamą tarpląstelinį domeną, tačiau ta pati panardinimo strategija buvo nesėkminga naudojant kompaktiškesnį ir labai glikozilintą tarpląstelinį domeną 20 . Toliau bandome šį metodą, naudodami įvairias membranų baltymų struktūras. Daugialąsčiai membranos baltymai, tokie kaip jonų kanalai, turi dar mažiau eksponuotų epitopų, todėl tokiais atvejais išskirti specifinius rišiklius gali būti sunkiau20.

Kitas aprašyto metodo galimas apribojimas yra galimybė, kad susiliejusi GFP molekulė gali sutrikdyti membraninio baltymo tarpląstelinių domenų natūraliąją struktūrą, kuri gali atsirasti, jei baltymas kelis kartus praleidžia membraną arba yra kelių subvienetų baltymas. Šios problemos būtų galima išvengti išreiškiant GFP iš vidinės ribosomų įvedimo vietos perrašytame nuoraše, gaunant proporcingą, bet atskirą vertimą. Tačiau tam reikės optimizuoti kiekvieną atvejį atskirai, nes mūsų išankstiniai tyrimai parodė, kad GFP išraiška ne visada yra proporcinga IRES sistemoje, o tikslinės išraiškos lygis gali būti reikšmingas net nesant GFP išraiškos 27 .

Aprašytas ląstelių pagrindu pagamintas faginių antikūnų bibliotekos biopanažo metodas siūlo antikūnų, kurie suriša membraninius baltymų antigenus jų gimtojoje, membranoje surištoje būsenoje, išskyrimo protokolą. Tai suteikia tam tikrų pranašumų, įskaitant būtinybę pašalinti išraišką ir išgryninto rekombinantinio baltymo gamybą bioaktyvinimo kampanijoms. Svarbu tai, kad į metodiką buvo įtraukti žingsniai, siekiant sumažinti praturtėjusių fago antikūnų, kurie suriša nesusijusius ląstelės antigenus, sukimąsi ląstelės-šeimininkės, naudojamos membraninio baltymo ekspresijai, ir griežtų, optimizuotų plovimo žingsnių, siekiant sumažinti nespecifinį surišimą. Šis metodas greičiausiai efektyviai veikia membraninius baltymus, turinčius išplėstinius tarpląstelinius domenus, turinčius prieinamus antigeninius determinantus, o ne kondensuotas baltymų struktūras, kuriose nėra daug prieinamų regionų. Prieinamumą gali kliudyti dėl kitų priežasčių, tokių kaip platus tarpląstelinių baltymų domenų glikozilinimas. Apskritai metodas siūlo kitą antikūnų, surišančių membranos baltymų taikinius, išskyrimo strategiją.

Metodai

Baltymų išraiška

Žmogaus CD83 tarpląstelinis domenas (pažymėtas 6xHis) ir iš fago gautas monokloninis antikūnas 3C12, performatuotas į žmogaus IgG1-kappa, buvo ekspresuojami ir išgryninami, kaip aprašyta anksčiau 15 . Be to, afinitete subrandintas 3C12C buvo paruoštas, kaip aprašyta anksčiau 17 .

Žmogaus CD83 (NBCI Accession Q01151), šikšnosparnio CD11b (NCBI Accession ELK11001) ir šunų CD117 tarpląstelinius ir transmembraninius domenus (likučiai 1–544; NCBI nuoroda NP_001003181.1) seką susintetino „Geneart“ (Vokietija). CD117 citoplazminė sritis nebuvo įtraukta. Sekos apėmė natūraliųjų sekrecijos sekas ir buvo optimizuotos kodonams ekspresijai Cricetulus griseus (kinų žiurkėno kiaušidžių ląstelės). Sekos buvo klonuojamos rėmelyje su GFP į žinduolių ekspresijos vektorių pEGFP-N1 (Clontech) per NheI ir BamHI restrikcijos fermento vietas. DNR transfekcijai buvo paruošta naudojant PureLink HiPure Plasmid Maxiprep rinkinį (Invitrogen).

CHO-S ląstelės (Life Technologies) buvo auginamos CD-CHO su 8 mM Glutamax (Gibco) 37 ° C temperatūroje, 7, 5% CO 2, purtant esant 130 aps./min. Transfekcijos dieną ląstelės buvo paruoštos esant ~ 3, 0 x 106 ląstelių / ml didesniam nei 98% gyvybingumui, išmatuotam naudojant Cedex HiRes ląstelių skaitiklį. 10 ml kultūros tūriui 20 μg plazmidės DNR sumaišoma su 1, 25 ml OptiPro ir inkubuojama kambario temperatūroje 30–60 sek .; kartu 80 μl PEI-Max buvo sumaišytas su 1, 25 ml OptiPro ir inkubuotas kambario temperatūroje 30–60 sek. Tada PEI-Max kompleksas buvo lengvai įpiltas į DNR kompleksą ir inkubuotas statiškai kambario temperatūroje 15 min. Tada DNR kompleksas supilamas į 10 ml kultūrą purtant kolbą ir maišant švelniai sukant. Kultūra buvo inkubuota 37 ° C temperatūroje, 7, 5% CO2, purtant 4 valandas esant 130 aps./min., Po to kultūra buvo praskiesta 1: 2 (tūris: tūris) CD-CHO ir antidumblinis agentas pridėtas iki 0, 4% ( v / v). Kultūra buvo inkubuojama 32 ° C temperatūroje, 7, 5% CO2, 130 aps / min iki 6 dienų.

Suspensijos HEK-293 ląstelės (Life Technologies) buvo transfekuotos panašiu būdu, tačiau buvo auginamos „Freestyle-293“ terpėje ir transfekuotos esant maždaug 2, 2 x 106 ląstelių / ml koncentracijai.

CD83 raiškos srauto citometrijos analizė

Kiekvieną dieną po transfekcijos buvo surinkta maždaug 1 × 106 ląstelių, kad būtų galima analizuoti CD83-GFP raišką srauto citometrijos metodu. Ląstelės buvo du kartus plaunamos PBS-2% (v / v) FCS, po to pakartotinai suspenduotos iki 2 x 106 ląstelių viename ml PBS-2% FCS. 2x105 ląstelių alikvotai buvo inkubuojami atskirai arba su 10 μg / ml galutinės 3C12 antikūno koncentracijos 1 valandą kambario temperatūroje, po to du kartus plaunant PBS-2% FCS. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su antriniu antikūnu, ožkos anti-žmogaus IgG Fc komponento-APC konjugatu (Jackson Immunoresearch) 30 minučių kambario temperatūroje. Ląstelės buvo plaunamos du kartus, kaip aprašyta aukščiau, tada buvo analizuojamos, ar nėra GFP ir APC, naudojant srauto citometrą „Accuri C6“ (BD Biosciences).

Panašiai 16 -os KM-H2 ląstelės, išaugintos RPMI su Glutamax ir 10% FCS, esant 37 ° C, 5% CO 2, buvo naudojamos antikūnų prisijungimui prie natūralaus CD83 šaltinio patikrinti srauto citometrijos metodu, tačiau buvo analizuojamos naudojant „Partec Cube8“ srauto citometrą. („Partec“, Vokietija). Antrinis antikūnas buvo FITC pažymėtas anti-žmogaus IgG (Southern Biotechnologies).

Biobangavimas

CD83-GFP biologiniam panardinimui buvo naudojama naivioji naivioji biblioteka „Sheets“ 28, kurios pranešimų įvairovė yra 6, 7 ​​× 10 9, maloniai parūpinta prof. James Marks (Kalifornijos universitetas, San Franciskas). CD117-GFP ir CD11b-GFP biologiniam panardinimui buvo naudojama naujai sukurta mAbLAb biblioteka, paruošta kaip aprašyta 1 papildomame protokole, naudojant pradmenis, išvardytus 1 papildomoje lentelėje. Šios bibliotekos (5 × 10 9 ) įvairovė yra panaši į „Sheets“ biblioteką, tačiau, nors „Sheets“ biblioteką daugiausia sudaro scFv su Vh3 sunkiosiomis grandinėmis, „mAbLAb“ bibliotekoje yra puikus visų Vh šeimų vaizdas (žr. Papildomą 1 paveikslą).

CD83-GFP biologiniam panardinimui pirmieji trys raundai buvo atlikti transfekuotose CHO-S ląstelėse, po to vienas raundas buvo transfekuotose HEK ląstelėse. CD117-GFP ir CD11b-GFP bioaktyvinimui 1 turas buvo atliktas CHO-S, 2 turas - HEK, 3 turas - CHO-S ir 4 turas - HEK transfekuotose ląstelėse. Visi biopandencijos ciklai buvo atlikti ląstelėms, surinktoms praėjus dviem dienoms po transfekcijos.

Biologinio panardinimo procedūra parodyta schematiškai 1 pav. Apytiksliai 1x107 neperkeltų ląstelių buvo surinktos, perplautos PBS, po to užblokuotos 5 ml 2% (m / v) pieno-PBS (MPBS), 30 min sukant esant 4 ° C. Tuo pačiu metu MPBS buvo blokuojama ~ 10 12 fago dalelių iš išgelbėtų bibliotekos atsargų. Tada užblokuotas fagas buvo pridėtas prie užblokuotų ląstelių ir inkubuotas 1 valandą sukant 4 ° C temperatūroje. Fago / ląstelės suspensija 3 minutes buvo centrifuguota 500 g greičiu, po to supernatantas, kuriame nėra nepririšto fago, buvo naudojamas pakartotinai suspenduotoms išplautoms transfekuotoms ląstelėms, po to inkubuojamas 4 ° C temperatūroje 1 val. The cells were then washed three times using pH 5 Wash Buffer (PBS with the pH lowered to 5.0 using citric acid, and containing 0.1% (v/v) Tween-20), followed by 3 washes in PBS, pH 7.4. The washed cells were sorted using a BD Influx TM cell sorter at 27 PSI, 100 micron nozzle, 200 mW 488 nm laser exciting GFP (528/38BP collection filter). After gating to exclude cellular debris, based on Forward and Side scattered light parameters, and excluding doublets, single cells with high GFP fluorescence (top 10%) were collected into PBS. The sorted cells were pelleted by centrifugation at 800 g for 5 min, then the phage eluted by incubation in 0.5 mL of 75 mM Citrate, pH2.3 for 6 min at room temperature. After centrifugation at 800 g for 5 min, the supernatant was neutralized with 0.5 mL 1M Tris, pH 7.5. The phage eluate was used to infect 10 mL XL1-Blue cells at OD 600 0.6–0.8.

Phage particles were prepared for subsequent rounds of biopanning, by amplification and rescue using M13K07 helper phage as per standard procedures 12 . The Round 1 amplified phage was used as the phage input for Round 2 biopanning, and so forth.

Polyclonal Phage ELISA

Pools of purified phage from the library stock (Sheets), and the Round 1, Round 2, Round 3 and Round 4 amplified stocks from the CD83-GFP biopanning were tested for binding to soluble CD83 using ELISA. Nunc Maxisorp 96-well plates were coated with 5 μg/mL CD83 in PBS overnight at room temperature. The wells were washed three times with PBS and then blocked for 1 hr with MPBS. Phage pools (~10 11 phage particles) were also blocked in MPBS. Dilutions of the blocked phage were then added to the CD83 coated plate and incubated for 1 hr at room temperature. The wells were washed three times with PBS containing 0.1% (v/v) Tween-20 (PBST), and then 200 μL secondary antibody added (1/5000 dilution of HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate-GE Healthcare) and incubated for 1 hr at room temperature. The wells were washed three times with PBST, followed by addition of 100 μL of 3, 3′, 5, 5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate (Sigma-Aldrich). The reaction was stopped after 10 mins using 100 μL 1 M sulphuric acid. Absorbance was measured at 450 nm using BioTek Powerwave HT Microplate Reader (Millenium Science).

Monoclonal Phage ELISA

Individual phage clones from either the third or fourth biopanning round on CD83-GFP were tested for binding to soluble CD83 by ELISA. Glycerol stock of XL1-Blue containing eluted phage from Rounds 3 and 4 were streaked onto 2YT-AmpGlu media to obtain individual colonies. Colonies were grown in 96-well plates in 2YT-AmpGlu followed by phage production using M13K07 helper phage rescue. Phage were produced overnight in 2YT-AmpKan, then the culture supernatant used for ELISA. ELISA plates were coated with 3 μg/mL soluble CD83 in PBS overnight at room temperature. Phage rescue supernatant and the coated plate were blocked in MPBS for 1 hr at room temperature. Blocked phage was then transferred to the ELISA plate, and the ELISA was continued as described above.

Flow Cytometry Analysis of Phage Pools and Clones

For each of the CD83-GFP, CD117-GFP and CD11b-GFP biopannings, pools of purified phage from the respective library stock, and the Round1, Round2 and Round3 amplified stocks were tested for binding to transfected cells using flow cytometry. CHO cells were transfected as described above with either the CD83-GFP, CD117-GFP or CD11b-GFP expression plasmids, and used two days post-transfection. ~2 × 10 5 cells were washed twice in 5 mL PBS, then blocked in 5 mL MPBS. Phage pools (~10 11 phage particles) were also blocked in MPBS. Cells were then incubated either alone or with blocked phage from the various pools for 1 hr at 4 °C. The cells were washed twice with PBS, then incubated with 1/200 diluted Anti-M13 Monoclonal Antibody (GE Healthcare), conjugated to Dylight 594 (Thermo Scientific), for 30 min at room temperature. The cells were washed twice in PBS, then analysed for GFP and DL594 fluorescence on a Partec Cube8 flow cytometer. Similarly, flow cytometry was also used to analyse individual phage clones, prepared as described above for monoclonal phage ELISA.

Sequencing of Clones

Phagemid DNA was isolated from individual clones which showed specificity for their target antigen. Clones were grown overnight in 2YT-AmpGlu media, then phagemids isolated using Purelink Hipure Plasmid Mini Prep kit (Invitrogen). Phagemid scFv inserts were sequenced by Sanger sequencing at the Australian Genome Research Facility (AGRF, Brisbane Australia), using phagemid-derived forward and reverse primers.

Reformatting and Expression of Phage Clones

Phage clones of interest were reformatted to whole human IgG1 using ligation-free cloning into mammalian expression vectors, expressed in CHO cells and purified by Protein A affinity chromatography as described previously 15 .

Imunohistochemija

Paraffin embedded canine mast cell tumour sections were prepared and supplied by Dr Rachel Allavena (The University of Queensland Veterinary School, Gatton). The sections were dewaxed in xylene, rehydrated in graded alcohols and deionized in distilled water. Heat-induced antigen retrieval was conducted by immersing the slides in 0.01 M Citric Acid-Based Buffer, pH 6.0 (Vector) for three periods of 5 mins in a microwave (650W). After cooling at room temperature (RT) for 25 mins, the endogenous peroxidase activity was quenched by incubation with 1% (w/v) hydrogen peroxide in methanol for 40 mins at RT in the dark. The slides were washed in TBS-T then blocked in 5% (v/v) goat serum (Abcam) in TBS-T for 30 min at RT. The slides were then treated with Endogenous Avidin/Biotin Blocking Kit (Abcam) as per the manufacturer's instructions. The reformatted phage clone A3, and a commercial positive control mouse anti-human CD117 (BD Biosciences) shown to cross-react with canine CD117 29, were diluted to 30 μg/mL in TBS, pH 7.4, and incubated on the slides overnight at 4 °C in a covered humidity chamber. A negative control slide was incubated concurrently in TBS buffer. The slides were then washed in TBS-T, followed by incubation with biotinylated Anti-human Fc (Life Technologies) or Anti-mouse IgG (Life Technologies), diluted 1/500 in TBS for 30 min at RT. After washing in TBS-T, the slides were incubated with ABC substrate solution (Vector) for 30 mins, then developed with DAB for 8 mins followed by distilled water rinsing. Tissue sections were counterstained with hematoxylin for 45 sec. The slides were then dehydrated, fixed and mounted with xylene mounting medium.

Papildoma informacija

How to cite this article : Jones, ML et al. Targeting membrane proteins for antibody discovery using phage display. Mokslas. Rep. 6, 26240; doi: 10.1038/srep26240 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.