Tdag8, sukeliantis uždegiminę hiperalgeziją ir nustatantis hiperalgezinį pradumą pelėms mokslinės ataskaitos

Tdag8, sukeliantis uždegiminę hiperalgeziją ir nustatantis hiperalgezinį pradumą pelėms mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Molekulinė medicina
  • Somatinė sistema

Anotacija

Lėtinį skausmą, atsirandantį dėl traumos, artrito ir vėžio, dažnai lydi uždegimas. Didelė protonų koncentracija, randama uždegusiuose audiniuose, sukelia audinių acidozę, pagrindinę skausmo ir hiperalgezijos priežastį. Acidozės signalai gali tarpininkauti pereinant nuo ūmios prie lėtinės hiperalgezijos (hiperalgezinio pradėjimo) per protonų jutiklius jungiančius G baltymus jungiančius receptorius (GPCR). Su T ląstelių mirtimi susijusio geno 8 (TDAG8), protonų jutimo GPCR, ekspresija padidėja uždegiminės hiperalgezijos metu. Sumažindama TDAG8 raišką nugaros smegenyse, slopiname kaulų vėžio skausmą, tačiau ar TDAG8 dalyvauja uždegiminėje hiperalgezijoje ar hiperalgeziniame grunte, neaišku. Šiame tyrime mes panaudojome TDAG8 išnaikinimą arba išardymą, kad ištirtume TDAG8 vaidmenį skausme. Sustabdyta TDAG8 ekspresija atitolino uždegiminės hiperalgezijos pradžią ir sutrumpino hiperalgezijos laiką pelėms. Dvigubos rūgšties injekcijos modelyje (rūgštis [pH 5, 0] švirkščiama du kartus, su 5 dienų pertrauka) TDR8 slopinimas shRNR sutrumpino antrosios hiperalgezijos trukmę. Panašūs rezultatai buvo rasti pelėms, kuriose trūko TDAG8. Dvigubas TDAG8 agonisto skyrimas taip pat patvirtino, kad TDAG8 dalyvauja hiperalginiame gruntavime. Atitinkamai, TDAG8 gali tarpininkauti acidozės signalams inicijuoti uždegiminę hiperalgeziją ir nustatyti hiperalgezinį pradą.

Įvadas

Lėtinis skausmas, atsirandantis dėl sužalojimo, infekcijos, artrito ar vėžio, dažnai lydimas uždegimo, kuris sustiprina skausmo patirtį padidindamas nociceptorių jautrumą tiek šiluminiams, tiek mechaniniams dirgikliams 1 . Uždegiminėje „sriuboje“ yra palyginti didelė vietinių protonų koncentracija, kuri sukelia audinių acidozę ir tiesiogiai prisideda prie skausmo ir hiperalgezijos 2 . Acidozė neseniai buvo pasiūlyta tarpininkauti ląstelinę kinazę signalizuojančiam jungikliui (nustatančiam pradinę būseną), kuris reguliuoja perėjimą nuo ūmaus prie lėtinio skausmo 3, 4, 5 .

Protonus jautrūs receptoriai vaidina svarbų vaidmenį perduodant acidozės signalus. 3 rūgšties jutiklinis jonų kanalas ir trumpalaikis receptorių potencialas / vanilloidinio receptoriaus 1 potipis (TRPV1) dalyvauja nustatant rūgšties sukeltą pradmenis raumenų nociceptoriuose 6 . Odos noiceptoriuose signalo perjungimas iš baltymo kinazės A (PKA) į baltymo kinazę C (PKCε) yra susijęs su rūgštiniu arba pilnu Freundo adjuvanto (CFA) indukuotu pradmeniu 3, bet kurie receptoriai yra prieš kinazės signalizaciją, kad nustatytų hiperalgezinis gruntas lieka neaiškus.

Su T-ląstelių mirtimi susijęs 8 genas (TDAG8), priklausantis OGR1 šeimai, buvo identifikuotas kaip protonus jautrus G-baltymų jungiklis, visiškai aktyvinamas esant 6, 4–6, 8 pH. Suaktyvinus TDAG8, suaktyvinamas cAMP-PKA kelias, padidėja tarpląstelinis kalcio lygis ir Rho aktyvacija. Maždaug trys ketvirtadaliai mažo skersmens nugaros šaknies ganglijų (DRG) neuronų ir maždaug pusė izolektino B (4) (IB 4 ) teigiamų nepeptiderginių neuronų ekspresuoja TDAG8 10 . TDAG8 ekspresija padidėja esant CFA sukeltam uždegiminiam skausmui, o jo aktyvinimas protonais jautrina TRPV1 funkciją, ypač IB 4 teigiamuose neuronuose 11 . Slopindama stuburo PKA aktyvaciją, kurią sukelia TDAG8, sumažėjo kaulų vėžio skausmas 12 . Taip pat CFA padidinta TDAG8 išraiška sumažėjo po gydymo PKC inhibitoriais, o tai rodo, kad TDAG8 vaidina svarbų vaidmenį palaikant hiperalgeziją 3 . Be to, TDAG8 tarpininkauja rūgšties slopinamų citokinų gamybai makrofaguose, T ląstelėse ir mikroglia 13, 14, 15, taigi TDAG8 gali būti neigiamas veiksnys, reguliuojantis uždegimą.

Šiame tyrime mes panaudojome TDAG8 shRNR, norėdami numušti TDAG8 geno raišką, kad nustatytume, ar TDAG8 dalyvauja pereinant nuo ūmaus prie lėtinio skausmo. Sumažinta TDAG8 ekspresija atitolino mechaninės hiperalgezijos pradžią pelėms su rūgšties, karagenino arba CFA injekcijomis. TDAG8 ekspresijos slopinimas taip pat sumažino cAMP kaupimąsi ir Ca 2+ signalus DRG neuronuose. Sušvirkštus dvigubą rūgštį, numušta TDAG8 ekspresija sutrumpino hiperalgesiją, sukeltą antrosios rūgšties injekcijos. TDAG8 aktyvacija gali reguliuoti cAMP signalizavimą, kad būtų galima inicijuoti uždegiminę hiperalgeziją ir nustatyti hiperalgezinį pradėjimą.

Rezultatai

„TDAG8“ išraiška ir funkcija yra sunaikinta „shTDAG8“

Norėdami suprasti, ar TDAG8 dalyvauja uždegiminėje hiperalgezijoje, pirmiausia subklonavome TDAG8-shRNR plazmidės (shTDAG8-A1, -B1, -C1) į pLKO.1-vyšnių vektorių (1 lentelė) ir išbandėme jų numušimo efektyvumą atliekant bendrą transfekciją su TDAG8. -EGF HEK293T ląstelėse. „shTDAG8“ išraiška sumažino TDAG8-EGFP fluorescencijos intensyvumą kartu transfekuotose ląstelėse (1A pav.). TDAG8-EGFP-ekspresuojančių ląstelių fluorescencijos intensyvumas buvo sumažintas atlikus shTDAG8-A1 arba -B1 ko-transfekciją (1 pav. B). TDAG8 ekspresuojančių ląstelių skaičius smarkiai sumažėjo atitinkamai atitinkamai 66, 8% ir 83, 5% vartojant shTDAG8-A1 ir -B1, ir šiek tiek sumažėjo (16, 8%) vartojant shTDAG8-A1, nemažėjant vyšnių vektoriaus kontrolei (0%) ( 1C pav.). Likusiems eksperimentams pasirinkome „shTDAG8-B1“ dėl didesnio atmušimo efektyvumo.

Pilno dydžio lentelė

Image

( A – F ) HEK293T ląstelės liko neinfekuotos; perkeltas TDAG8-EGFP; kartu transfekuoti su TDAG8-EGFP ir shRNR-vyšnių vektoriais, shTDAG8-A1, B1 arba C1; arba kartu transfekuota su G2A-pEGFP ir shTDAG8-B1 16 val. ( A ) ląstelių, kurios kartu išreiškia TDAG8 (žalia fluorescencija) ir shTDAG8-B1 (raudona fluorescencija), vaizdai. Parodo fazinio kontrasto vaizdą. ( B ) srauto citometrijos analizė. Y ašis yra ląstelių, išreiškiančių TDAG8-EGFP, skaičius. X ašis žymi žalios fluorescencijos intensyvumą (TDAG8 išraiška). Neišpjaustytų ląstelių (mėlynos linijos) fluorescencijos intensyvumas buvo <1 savavališkas vienetas, apibrėžtas kaip fono lygis (ctrl). Pilka sritis (juoda linija) žymi ląsteles, išreiškiančias vien TDAG8. ( C ) ląstelių, ekspresuojančių TDAG8, dalis iš ( B ). ** P <0, 01, *** p <0, 001, palyginti su vien TDAG8, naudojant vienpusę ANOVA. ( D ) TDAG8 mRNR lygio qRT-PGR ląstelėse, kartu transfekuotose su TDAG8-EGFP ir vyšnių vektoriu arba shTDAG8-B1. ** P <0, 01 vienpusė ANOVA. ( E, F ) Transfekuotos ląstelės buvo stimuliuotos pH 7, 6 ir 6, 8 buferiu, po to atliktas ( E ) cAMP matavimas arba stimuliuotas pH 5, 5, po to užrašomas ( F ) Ca 2+ . * p <0, 05, ** P <0, 01, *** p <0, 001, palyginti su vien TDAG8 vienpusine ANOVA. ( G – J ) shTDAG8-B1 / CG arba vyšnių vektorius / CG buvo įšvirkštas į pelę ir ekspresuotas 7 dienas. Juosmeninės 4-6 DRG šoninės pusės įšvirkštos letenos buvo pašalintos ir padalytos pjūviais, po to imuniniu būdu apsaugotos antiperiferinu (PERI) arba anti-TDAG8 antikūnu. ( G ) Ląstelių vaizdai praėjus 7 dienoms po shTDAG8-B1 arba vektoriaus injekcijos. Raudona fluorescencija rodo shTDAG8-B1 arba vektoriaus ekspresiją, o žalia - fluorescencinius PERI teigiamus neuronus. Rodyklių galvutės yra neuronai, išreiškiantys ir shTDAG8-B1, ir PERI, arba vektorių, ir PERI. Mastelio juostos yra 50 μm. ( H ) Raudonai fluorescencinių neuronų santykis su visais PERI teigiamais neuronais. ( I ) Ląstelių vaizdai praėjus 7 dienoms po shTDAG8-B1 injekcijos. Raudona fluorescencija rodo shTDAG8-B1 ekspresiją ir žali fluorescenciniai TDAG8 teigiami neuronai. Rodyklių galvutės yra neuronai, išreiškiantys tiek shTDAG8-B1, tiek TDAG8. Mastelio juostos yra 50 μm. Žalios fluorescencijos intensyvumas pateikiamas kaip kontrolės (vektoriaus kontrolės) procentas ( J ). *** P <0, 001 vienpusė ANOVA.

Visas dydis

shTDAG8-B1 nesumažino G2A ekspresuojančių ląstelių skaičiaus (0% sumažėjimas, 1 pav. C), o tai rodo, kad slopinamasis ShTDAG8-B1 poveikis buvo būdingas TDAG8 genui. TDAG8 mRNR išraiška sumažėjo 80% ląstelėse, kartu transfekuotose su shTDAG8-B1 (1 pav. D). Sumažėjus pH, cAMP kaupimasis padidėjo TDAG8 transfekuotose ląstelėse ir pasiekė aukščiausią lygį esant 6, 8 pH (1 pav. E). Esant shTDAG8-B1, cAMP kaupimasis buvo slopinamas TDAG8 transfekuotose ląstelėse (1 pav. E), taigi shTDAG8-B1 gali slopinti TDAG8 tarpininkaujamą cAMP kaupimąsi. Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant shTDAG8-A1. Esant žemam pH (pH 5, 5), TDAG8 tarpininkavo Ca 2+ signalui, o Ca 2+ signalus specialiai slopino shTDAG8-A1 ir -B1 (1 pav. F).

Mes įvedėme shTDAG8-B1 arba vyšnių vektorių plazmides į transplantuotus pelių DRG, naudodamiesi CG tiekimo sistema. Praėjus 7 dienoms po shTDAG8-B1 arba vektoriaus injekcijos, 87 ± 4% ir 73 ± 4% periferinu teigiamų neuronų išreiškė atitinkamai shTDAG8-B1 ir vyšnių vektorių (1G pav., H). Norėdami patikrinti 7 dienų TDAG8 baltymo ekspresiją, DRT iš SHTDAG8-B1 arba neinjekuotų pelių mes dažome kartu su anti-TDAG8 antikūnais. ŠTDAG8-B1 įšvirkštų DRG neuronų TDAG8 fluorescencijos intensyvumas buvo sumažintas 70% (1 pav., J).

TDAG8 ekspresijos slopinimas uždelsia hiperalgezijos pradžią ir sutrumpina uždegiminę hiperalgesiją

Tada mes ištyrėme, ar TDAG8 dalyvauja mechaninėje hiperalgesijoje, kurią sukelia uždegimas. shTDAG8-B1 buvo įvežtas pelėms prieš karagenino injekciją po 7 dienų. Sumažinta TDAG8 išraiška veiksmingai slopino hiperalgeziją per pirmąsias 4 valandas, o slopinamasis poveikis palaipsniui pasikeitė 1 dieną po karagenino injekcijos (2A pav.). Panašūs rezultatai buvo rasti naudojant CFA injekciją (2 pav. B). Sumažėjęs slopinamasis poveikis po pirmosios dienos nebuvo dėl „ShRNA“ klono, nes panašūs rezultatai buvo rasti naudojant „shTDAG8-A1“ (2 pav. C).

Image

( A – D ) Pelėms buvo atlikta intraplantalinė injekcija su ShTDAG8-A1 arba B1 / CG (1: 7, 5), o po 7 dienos buvo sušvirkšta karagenino (20 mg / ml, carra, A) arba CFA (50%, B – D). ). ( A – C ) Kojos ištraukimo riba (PWT) buvo išmatuota prieš (t = B) ir po injekcijos. Duomenys yra vidutiniai ± SEM, kai n yra ≥ 6 pelės kiekvienoje grupėje. * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, esant shTDAG8, palyginti su vektoriu, naudojant dvipusį ANOVA. ( D ) qRT-PGR TDAG8 mRNR lygio 4–6 DRG juosmens srityje, surinktų prieš ( B ) arba praėjus 1, ir 3 dienas po CFA injekcijos, praėjus 7 dienoms, naudojant shTDAG8-B1 arba vektoriaus injekciją. *** p <0, 001 B ir 1d atžvilgiu, ### p <0, 001 shTDAG8 vs vektoriui dvipusė ANOVA. ( E, F ) TDAG8 +/− arba TDAG8 - / - pelėms buvo implantuotas implantuotas CFA (50%), po to atlikti mechaniniai tyrimai. Duomenys yra vidutiniai ± SEM, kai n yra ≥ 3 pelės kiekvienoje grupėje. ** p <0, 01, *** p <0, 001, jei TDAG8 +/− vs TDAG8 - / - dvipusė ANOVA.

Visas dydis

Norėdami suprasti sumažėjusį TDAG8 slopinamąjį poveikį hiperalgezijai, išanalizavome TDAG8 mRNR mRNR raišką prieš ir po CFA injekcijos shTDAG8-B1– arba vektorių sušvirkštytose pelėse. 7 dieną po shTDAG8-B1 injekcijos TDAG8 išraiška sumažėjo 50% (2D pav., 0 d CFA injekcija). Pirmą dieną po CFA injekcijos TDAG8 geno ekspresija buvo padidinta maždaug tris kartus, palyginti su 0 diena. Tačiau „shTDAG8-B1“ veiksmingai slopino TDAG8 geno ekspresiją 1 ir 3 dienomis (2 pav. D). Todėl sumažėjęs hiperalgezijos slopinimas nebuvo susijęs su TDAG8 numušimo efektyvumu. Labiau tikėtina, kad TDAG8 vaidina svarbų vaidmenį hiperalgezijos inicijavime, o ne palaikyme.

Panašūs rezultatai buvo rasti su TDAG8 pelėmis (2 pav. E), parodančiose uždelstą mechaninės hiperalgezijos pradžią. Įdomu tai, kad TDAG8 geno delecija taip pat sutrumpino CFA sukeltą hiperalgesiją. Uždegiminė hiperalgezija grįžo į pradinį lygį 5-ą savaitę TDAG8 - / - pelėms, bet 7 savaitę - TDAG8 + / - pelėms (2 pav. F). Taigi šie duomenys leidžia manyti, kad TDAG8 gali būti susijęs su hiperalgezijos inicijavimu ir hiperalgeziniu pradmenų nustatymu.

TDAG8 ekspresijos slopinimas blokuoja cAMP kaupimąsi ir Ca 2+ signalus

Mūsų tyrime TDAG8 dalyvavo reguliuodamas ankstyvąją hiperalgezijos fazę, kurią sukėlė karageninas arba CFA, kuri atitinka PKA signalizacijos reguliavimą ankstyvoje hiperalgezijoje 3 . Atsižvelgiant į tai, kad TDAG8 aktyvacija skatina cAMP kaupimąsi, sukeliantį PKA aktyvaciją, TDAG8 greičiausiai reguliuoja PKA, kad inicijuotų hiperalgezijos vystymąsi. Tada mes ištyrėme cAMP lygį DRG. Po CFA injekcijos cAMP lygis padidėjo ir pasiekė aukščiausią tašką per 30 min., Po to sumažėjo po 4 val. Ir 3 dienų (3A pav.), O tai rodo, kad pradiniame etape (<4 val.) CAMP signalas yra būtinas. Gydant shTDAG8-B1, cAMP lygis buvo laikomas žemesniame lygyje, 20% mažesnis prieš CFA injekciją, 30% po 30 min. Ir 54% 90 min., Palyginti su vektoriaus kontrole (3 pav. B). Rezultatai rodo, kad TDAG8 ekspresijos sustabdymas sumažino cAMP kaupimąsi. Kadangi PKA yra paskesnis cAMP efektorius, nesitikima, kad PKA slopinimas turės įtakos cAMP kaupimuisi. Kaip ir tikėtasi, PKA inhibitorius H89 nesumažino cAMP lygio per 90 minučių (3 pav. C). TDAG8 numušimas blokavo cAMP kaupimąsi DRG, bet tik pradinėje fazėje (<4 val.). Šis rezultatas atitinka elgesio duomenis (2 pav. B) ir ankstesnį Huango ir kt . Tyrimą. 3 (2015), kuris rodo, kad TDAG8 tarpininkauja cAMP-PKA keliui, kad sureguliuotų pradinę uždegiminės hiperalgezijos fazę.

Image

cAMP matavimas DRG lygiakraščiu ar priešingu šoniniu pelės letena, kuriam 7 dienas buvo sušvirkštas ( A, B ) vektorius / CG arba shTDAG8-B1 / CG, po to 50% CFA injekcija arba ( C ) druskos arba baltymo kinazės A inhibitorius. H89, po to 50% CFA injekcija. * p <0, 05, *** p <0, 001, jei B prieš 30 min., 4 val., 3 d. vienpusė ANOVA. ### p <0, 001 SHTDAG8-B1 vs vektoriui dvipusio ANOVA.

Visas dydis

Norint nustatyti, ar TDAG8 numušimas taip pat paveikė rūgšties sukeltus Ca 2+ signalus, DRG buvo išskirti praėjus 2 ar 24 valandoms po CFA injekcijos ir kultivuoti. Po 2 val. Po injekcijos pH 6, 8 rūgštinis buferis žymiai padidino [Ca 2+ ] i lygį ipsilateraliuose DRG neuronuose (4 pav. A), bet ne priešinguose DRG neuronuose. Buvo nustatyti du [Ca 2+ ] i signalų tipai: vienas nuolatinis, o kitas trumpalaikis. Po 2 val. CFA injekcija žymiai padidino ilgalaikius, bet ne trumpalaikius signalus, palyginti su fiziologinio tirpalo kontrole (4 pav., C, E). Nors trumpalaikiai signalai nebuvo padidėję, neuronų, generuojančių pereinamuosius signalus, dalis padidėjo (nuo 6% iki 30%). CFA injekcija ankstyvoje fazėje gali padidinti neuronų, turinčių trumpalaikius signalus, skaičių ir sustiprinti ilgalaikius signalus. Po 24 val., Rūgšties sukeliami [Ca 2+ ] i signalai sumažėjo ipsilateraliuose DRG neuronuose (4 pav. B), daugiausia dėl sumažėjusių ilgalaikių signalų, palyginti su 2 val. Po CFA injekcijos (4 pav., F, H). Šie rezultatai rodo, kad pradiniame etape po CFA injekcijos DRG neuronų atsakas į rūgštį padidėja, o tai gali būti svarbu hiperalgezijos vystymosi metu.

Image

( A, B ) L4-6 DRG buvo surinktos per 2 arba 24 valandas po to, kai pelėms buvo atlikta intraplantalinė injekcija su 50% CFA, o neuronai buvo išskirti ir kultivuojami 12 valandų. [Ca 2+ ] i signalai buvo registruojami kultivuojamuose neuronuose, veikiant pH 6, 8 buferiui. [Ca 2+ ] i signalų laiko tėkmė, pridėjus pH 6, 8 ipsilateraliniuose DRG neuronuose, parodyta ( C – F ). Duomenų taškai rodo smailių [Ca 2+ ] i signalus (maždaug 20 sekundžių po to, kai pridedamas pH buferis) ( A, B, G, H ). Duomenys yra vidutiniai ± SEM. Frakcija skliausteliuose nurodo reaguojančius neuronus į visas surinktas ląsteles. ( A ) # <= 0, 001 tarp CFA-ipsi ir -contra. ** p <0, 01 tarp CFA ir druskos-ipsio; ( G ) * p <0, 05 tarp CFA ir fiziologinio tirpalo.

Visas dydis

Tada mes ištyrėme shTDAG8-B1 poveikį. Praėjus 2 valandoms po shTDAG8-B1 paskyrimo, ašipsilatiniuose DRG neuronuose CFA padidėję [Ca 2+ ] i signalai buvo ženkliai sumažėję (5A pav.). Tiek nuolatiniai, tiek trumpalaikiai signalai buvo slopinami (5 pav. C, E, G). TDAG8 numušimas nesumažino [Ca 2+ ] i signalų ipsilateraliniame DRG 24 val. (5B pav., D, F, H). Priešingai, [Ca 2+ ] i signalai ipsilateralinėje pusėje buvo šiek tiek padidėję (5B pav.). Taigi, TDAG8 numušimas slopino CFA padidėjusius [Ca 2+ ] i signalus tik praėjus 2 valandoms po CFA injekcijos. Šie rezultatai taip pat atitinka cAMP ir elgesio duomenis, kurie rodo, kad TDAG8 tarpininkauja cAMP-PKA ir kalcio signalams, kad sureguliuotų pradinę uždegiminės hiperalgezijos fazę.

Image

( A, B ) L4-6 pjaunamasis DRG buvo surinktas per 2 arba 24 valandas po 50% CFA injekcijos į shTDAG8-B1 arba vektoriaus sušvirkštas pelėms. Neuronai buvo išskirti ir kultivuojami 12 val. [Ca 2+ ] i signalai buvo registruojami kultivuojamuose neuronuose, veikiant pH 6, 8 buferiui. [Ca 2+ ] i signalų laiko tėkmė, pridėjus pH 6, 8, parodyta ( C – F ). Duomenų taškai rodo smailių [Ca 2+ ] i signalus (maždaug 20 sekundžių po to, kai pridedamas pH buferis) ( A, B, G, H ). Duomenys yra vidutiniai ± SEM. Frakcija skliausteliuose nurodo reaguojančius neuronus į visas surinktas ląsteles. ( A ) ## p <0, 01 tarp CFA ir B1 + CFA. ** p <0, 01 tarp CFA ir druskos-ipsio; ( G ) # <p <0, 01 tarp CFA- ir B1 + CFA-ipsi.

Visas dydis

TDAG8 slopinimas sutrumpina mechaninę hiperalgeziją, sukeltą dvigubos rūgšties injekcijos

Mes nustatėme, kad pelėms, neturinčioms TDAG8 geno, pasireiškia sutrumpinta hiperalgezija, o tai rodo, kad TDAG8 gali būti susijęs su hiperalgeziniu pradžia 4, 5 . Norėdami dar labiau patvirtinti, ar reikalingas TDAG8 hiperalgeziniam gruntavimui, pradinio efekto tyrimui panaudojome dvigubos rūgšties injekciją. Pirmoji rūgšties injekcija (pH 5, 0) iš karto sukėlė ūmią vienašališką hiperalgesiją, kuri pasiekė aukščiausią 30 min. Greitį ir grįžo į pradinę padėtį 3 dieną (6A pav.). 5 dieną po pirmosios injekcijos vėl buvo suleista rūgštis ir hiperalgezija truko ilgiau, 8 dienas (6 pav. B). Hiperalgesija nebuvo nustatyta priešingose ​​pusėse.

Image

( A – D ) PWT, išmatuotas pelėms prieš (t = B) ir atlikus išankstinę intraplantarinę injekciją su 12, 5 μg shTDAG8-B1 / CG arba vektorių / CG 7 dienas, po to injekcija su rūgštimi (pH 5, 0), po to su rūgštimi ( pH 5, 0) vėl po 5 dienų. Duomenys yra vidutiniai ± SEM, kai n yra ≥ 6 pelės kiekvienoje grupėje. ** P <0, 01 ir *** p <0, 001 ipsi prieš kontrastą; * p <0, 05, ** P <0, 01 ir *** p <0, 001, esant shTDAG8, palyginti su vektoriu, naudojant dvipusę ANOVA. ( E ) TDAG8 mRNR lygio mRNR-PCR, atliktas juostelėje 4-6 DRG, surinktų iš pelių B, 1, 4 val., 3d ar 10 d., Po rūgšties injekcijos praėjus 7 dienoms po shTDAG8 arba vektoriaus injekcijos. *** P <0, 001, jei B prieš 1 arba 4 valandas; # p <0, 05, ### P <0, 001 shTDAG8 vs vektoriui dvipusio ANOVA. ( F ) TDAG8 baltymo lygis DRG 5 lumbare, surinktas iš pelių B, 1, 4 val. Ar 3d metu po rūgšties injekcijos praėjus 7 dienoms po shTDAG8 arba vektoriaus injekcijos. *** P <0, 001 shTDAG8 vs vektoriui; ### P <0, 001 B ir 10d atžvilgiu dvipusė ANOVA.

Visas dydis

Pelėms buvo pristatytos TDAG8-shRNR plazmidės, po kurių 7 dienas pelėms buvo suleistas rūgšties buferis (pH 5, 0) ir jos buvo mechaniškai patikrintos. Esant 7 dienų „shTDAG8-B1“ ekspresijai, slopinamasis „ShTDAG8-B1“ poveikis tęsėsi 4 valandas (6 pav. C). Po antrosios rūgšties injekcijos hiperalgezija buvo palaikoma tik 5 dienas (kontrolinėms - 8 dienas) (6D pav.). Todėl paskyrus shTDAG8-B1, buvo slopinama pradinė pirmosios hiperalgezijos fazė ir sutrumpinta hiperalgezija, sukelta antrosios rūgšties injekcijos.

Trumpas slopinamasis ShTDAG8-B1 poveikis negalėjo atsirasti dėl nevisiško TDAG8 geno ar baltymo slopinimo. Mes ištyrėme TDAG8 geno ekspresiją prieš (B) arba praėjus 1 ir 4 valandoms, 3 ir 10 dienų po rūgšties injekcijos. Kontroliuojant vektorių, TDAG8 geno lygis buvo padidintas dvigubai, įpurškiant rūgštį per 1 ir 4 valandas, tačiau lygis buvo grąžintas į pradinį lygį praėjus 3 dienoms ir šiek tiek sumažėjo po 10 dienų. „ShTDAG8-B1“ injekcija sumažino TDAG8 geno ekspresiją (85% sumažėjimas) 0 val., o žemas TDAG8 lygis buvo palaikomas mažiausiai 10 dienų (6 pav. E). Mes taip pat ištyrėme baltymų kiekį DRG, naudodami imuninį dažymą ir nustatėme, kad kontroliuojant vektorių, TDAG8 baltymų lygis nepakito nuo 1 val. Iki 3 dienų po rūgšties injekcijos, tačiau po 10 dienų šiek tiek sumažėjo. „ShTDAG8-B1“ injekcija nuslopino TDAG8 baltymų lygį žemesniame lygyje (6F pav.).

Rezultatams patvirtinti panaudojome TDAG8 + / + ir TDAG8 - / - peles. Pelėms su TDAG8 + / + pirmoji rūgšties injekcija sukėlė hiperalgesiją per 30 min., Kuri grįžo į pradinę padėtį 3 dieną; antroji rūgšties injekcija sukėlė 8 dienų trukmės hiperalgesiją (7A, B pav.). Pelių TDAG8 - / - hiperalgezija, sukelta pirmosios rūgšties injekcijos, buvo slopinama per pirmąsias 3 valandas (7 pav. C). Hiperalgezija, kurią sukėlė antroji rūgšties injekcija, buvo sutrumpinta iki 5 d (7 pav. D), o tai rodo, kad TDAG8 ištrynimas atitolino pirmąją hiperalgeziją ir sutrumpino antrąją hiperalgesiją.

Image

( A – D ) PWT, išmatuotas TDAG8 + / + arba TDAG8 - / - pelėse prieš (t = B), po to sušvirkštus rūgštimi (pH 5, 0), po to dar po 5 dienų - rūgštimi (pH 5, 0). Duomenys yra vidutiniai ± SEM, kai n yra ≥ 6 pelės kiekvienoje grupėje. ** P <0, 01 ir *** p <0, 001 Ipsi prieš kontrastą; * p <0, 05, ** P <0, 01 ir *** p <0, 001, esant shTDAG8, palyginti su vektoriu, naudojant dvipusę ANOVA.

Visas dydis

Tada mes suleidome TDAG8 agonistą BTB09089 14, kad patvirtintume TDAG8 funkciją hiperalgeziniame gruntavime. TDAG8 agonisto skyrimas sukėlė mechaninę hiperalgesiją per 30 min., Trunkančią 4 valandas (8A pav.). Praėjus 5 dienoms po pirmosios injekcijos, vėl buvo įšvirkštas TDAG8 agonistas ir mechaninė hiperalgezija buvo palaikoma mažiausiai 3 dienas (8B pav.). Nutraukus TDAG8 ekspresiją, buvo panaikinta BTB09089 sukelta pirmoji hiperalgezija (1, 5 val. Slopinimas) ir sutrumpinta antroji hiperalgezija (2 dienos) (8 pav., D), o tai dar labiau patvirtino, kad TDAG8 yra susijęs su hiperalgezijos inicijavimu ir hiperalgeziniu pradžia. Panašūs rezultatai buvo rasti slopinant PKA aktyvumą su H89 (8 pav. E), kas rodo, kad TDAG8 inicijuoja hiperalgeziją ir tarpininkauja hiperalgeziniam gruntui per PKA signalizaciją.

Image

( A, B ) PWT, išmatuotas pelėms prieš tai (t = B), po to injekcija su TDAG8 agonistu (BTB09089, BTB, 100 μM), po to vėl su BTB09089 po 5 dienų. ( C, D ) PWT, išmatuotas pelėms prieš (t = B) ir prieš tai atlikus intraplantarinę injekciją ir be jos, naudojant 12, 5 μg shTDAG8-B1 / CG ar vektorių, 7 dienas, po to injekcija su BTB, po to vėl po 5 dienų. Iš anksto buvo sušvirkštas ( E ) PKA inhibitorius H89 (50 μM), po to - BTB. Duomenys yra vidutiniai ± SEM, kai n yra ≥ 6 pelės kiekvienoje grupėje. * p <0, 05, ** P <0, 01 ir *** p <0, 001 Ipsi prieš kontrastą; # p <0, 05, ## P <0, 01 ir ### p <0, 001 už shTDAG8 vs vektorių; ** P <0, 01, o *** p <0, 001, jei naudojamas shTDAG8 prieš fiziologinį tirpalą *; ** P <0, 01 ir *** p <0, 001 H89 palyginimui su vechikulu, naudojant dvipusį ANOVA.

Visas dydis

Diskusija

Mes įrodėme, kad TDAG8 pašalinimas arba ilgalaikis TDAG8 geno ekspresijos numušimas naudojant shRNR, nukreiptą į TDAG8, atitolino rūgšties ar uždegimo sukeltą hiperalgesiją ir taip pat sutrumpino hiperalgeziją. Dvigubos rūgšties injekcijos modelyje TDAG8 ir TDAG8 ištrynimas sutrumpino antrosios rūgšties sukeltą hiperpalgesiją. Vartojant TDAG8 agonistą, buvo pradėta mechaninė hiperalgezija ir sukeltas hiperalgezinis gruntas. TDAG8 agonistų sukeltą hiperalgeziją ir hiperalgezinį pradėjimą slopino TDAG8 numušimas ir PKA inhibitoriaus vartojimas. Taigi, norint pradėti hiperalgesiją ir nustatyti hiperalgezinį pagrindą, reikia TDAG8.

Mes atrinkome du shRNR klonus (shTDAG8-A1 ir -B1), nukreiptus į TDAG8, ir stabiliai juos ekspresuojame in vitro ir in vivo . Abu klonai (A1 ir B1) slopino TDR8 mRNR ir baltymų ekspresiją ir slopino TDAG8 funkciją kultivuotose ląstelėse ar neuronuose (1 pav.). Nors shTDAG8 nuolat slopino TDAG8 geno ekspresiją, jis visiškai slopino CFA arba karagenino sukeltą hiperalgeziją tik ankstyvoje fazėje (50% slopinimas), vėlesnėje fazėje hiperalgezijos slopinimo nesugebėjimas (po 4 val.) Negalėjo būti siejamas su nepilnu slopinimu. iš TDAG8 išraiškos. Pelėms, kurių TDAG8 išmušė, taip pat buvo mažesnis 4 valandų slopinimas, o tai patvirtina, kad TDAG8 gali būti būtinas inicijuojant, o ne palaikant hiperalgeziją. Ankstesnis Huang 3 et al tyrimas. nustatė nuo kinazės priklausomą perėjimą nuo rūgšties ar CFA sukeltos hiperalgezijos. PKA reguliuoja pirmąsias 4 valandas, tuo tarpu PKCε kontroliuoja pailgėjusią fazę po 4 valandų. Huang 3 ir kt . pasiūlė, kad acidozės signalas yra atsakingas už kinazių priklausomą perėjimą per protonus jautrius G-baltymų sujungtus receptorius. Per 30 minučių po CFA injekcijos nustatėme iš karto padidėjusį cAMP (aukščiau esančio PKA reguliatoriaus) lygį, kuris sumažėjo po 4 valandų (3 pav.). Aukšto lygio cAMP laikas atitinka PKA veikimo laiką. TDAG8 geno ekspresijos pašalinimas arba slopinimas sumažino cAMP kaupimąsi ir slopino hiperalgeziją per pirmąsias 4 valandas, o tai atitinka PKA signalo perdavimo laiką. Vartojimas TDAG8 agonisto sukėlė trumpalaikę hiperalgesiją, kurią galėjo slopinti PKA inhibitorius H89 (8 pav. E). Šie rezultatai leido manyti, kad TDAG8 tarpininkauja hiperalgezijos pradžia per cAMP-PKA signalizaciją.

TDAG8 yra susijęs su hiperalgezijos inicijavimu ir taip pat turi įtakos hiperalgeziniam pradėjimui. CFA modelyje TDAG8 delecija sutrumpino uždegiminę hiperalgesiją. Dvigubos rūgšties injekcijos modelis atskleidė, kad TDAG8 geno ekspresijos slopinimas sutrumpino hiperalgesiją, sukeltą antrosios rūgšties injekcijos. Po antrosios injekcijos, skiriant TDAG8 agonistą du kartus per 5 dienas, atsirado ilgesnė hiperalgezija. Šie rezultatai patvirtino, kad TDAG8 yra susijęs su hiperalgeziniu gruntavimu. Taigi TDAG8-PKA signalizacija yra svarbi nustatant lėtinio skausmo būseną, nors to gali ir neprireikti norint palaikyti lėtinę būklę. TDAG8 tarpininkaujama signalizacija gali reguliuoti [Ca 2+ ] i signalus, kad būtų galima nustatyti hiperlagesinį pradmenį. TDAG8 reguliuoja rūgšties sukeltą [Ca 2+ ] i in vitro 9 (1F pav.) Ir in vivo 11 (4 ir 5 pav.). Neuroninių [Ca 2+ ] i signalų analizė atskleidė du [Ca 2+ ] i signalų modelius (ilgalaikius ir trumpalaikius). Praėjus 2 valandoms po CFA injekcijos, padidėjo ilgalaikiai, bet ne trumpalaikiai [Ca 2+ ] i signalai, nors neuronų, turinčių pereinamuosius signalus, skaičius padidėjo. Praėjus 24 valandoms po CFA injekcijos, palaikomi [Ca 2+ ] i signalai grįžo į bazinį lygį. Tokius [Ca 2+ ] i signalus slopino TDAG8 smūgis 2 val., Bet ne 24 val. Priešingai, TDAG8 numušimas padidino nuolatines [Ca 2+ ] i sroves. Atitinkamai, TDAG8 aktyvinimas padidino nuolatines kalcio signalų sroves neuronuose, kad būtų galima sukelti hiperalgeziją (pirmąsias 4 val.), Tada slopino nuolatinius signalus, kad išplėstų hiperalgesija. Dėl slopintos TDAG8 ekspresijos hiperalgezijos pradžia buvo slopinama, o hiperalgezija sutrumpėjo. Vis dėlto neaišku, kaip TDAG8 reguliuoja kalcio signalus, tačiau neseniai nustatėme, kad TDAG8 galėtų reguliuoti TRPV1, kad padidėtų [Ca 2+ ] i in vitro 16 . TDAG8 gali reguliuoti kitus kanalus, norėdamas valdyti [Ca 2+ ] i . Kaip alternatyva, TDAG8 gali sukelti cAMP kaupimąsi, todėl cAMP tikriausiai suaktyvina Epac kelią, kad padidėtų [Ca 2+ ] i .

Laikydamiesi ankstesnio tyrimo 11, per dieną po CFA injekcijos radome padidėjusį periferinį TDAG8 išraišką DRG (2 pav. D). Tačiau TDAG8 tarpininkauja tik pradinėje hiperalgezijos fazėje. 1 dieną po injekcijos hiperalgezija nepriklausė nuo TDAG8. Atsižvelgiant į tai, kad TDAG8 yra ekspresuojamas neuronuose, taip pat imuninėse ląstelėse ir mikroglia 10, 13, 14, 15, hiperalgezijos inicijavimui gali pakakti nedidelio TDAG8 ekspresijos neuronuose. Praėjus 1 dienai po CFA injekcijos, padidėjusią TDAG8 ekspresiją DRG gali sukelti padidėjęs gliaudos ląstelių, o ne neuronų kiekis. Taigi padidėjusi TDAG8 ekspresija gali būti svarbesnė uždegiminiame procese ir mažiau svarbi neuronų veikloje. Nors glialinės ląstelės taip pat vaidina tam tikrą hiperalgesijos 17 palaikymą, TDAG8 aktyvacija glijos ar imuninėse ląstelėse siekia slopinti priešuždegiminius citokinus 13, 14, 15 . Taigi, TDAG8 delecija glijos ląstelėse gali dar labiau skatinti uždegimą, taip sukeldama sustiprintą hiperalgeziją. Tai iš dalies galėtų paaiškinti, kodėl TDAG8 ekspresijos slopinimas per 1 dieną (> 4 val.) Nesumažino hiperalgezijos. Išanalizavus DRG neuroninius [Ca 2+ ] i signalus paaiškėjo, kad slopinama TDAG8 raiška slopina tiek ilgalaikius, tiek pereinamuosius signalus ne per 2, bet per 24 valandas. Šie rezultatai patvirtina TDAG8 vaidmenį neuronuose, daugiausia pradedant, o ne palaikant hiperalgeziją.

Todėl neuronuose TDAG8 galėtų gauti acidozės signalus, tada paskatintų pasroviui nukreiptus kanalus (pvz., TRPV1) reguliuoti keliais, sukeliančiais skausmą ir hiperalgeziją. Priešingai, TDAG8 makrofaguose arba mikrogliutenijose gali reaguoti į acidozės signalus, kad sumažėtų citokinų gamyba, taip susilpnindama hiperalgeziją. Atsižvelgiant į tai, kad neuronai vaidina svarbų vaidmenį pradedant hiperalgeziją, numušta TDAG8 raiška ar TDAG8 pašalinimas neuronuose visiškai slopino CFA sukeltą hiperalgeziją hiperalgezijos pradžioje. Kadangi hiperalgezijos palaikymui reikalingos kai kurios kitos ląstelės, išskyrus neuronus, TDAG8 ekspresijos slopinimas neuronuose gali neturėti veiksmingos įtakos palaikymui. Tačiau numuštas arba ištrintas TDAG8 sutrumpino lėtinę hiperalgeziją, tai reiškia, kad norint nustatyti hiperalgezinį pagrindą, reikia TDAG8. Tai pasakius, negalima atmesti ne autonominio TDAG8 poveikio. Mes ištyrėme kitus protonų jutimo receptorius DRG iš KD ar KO pelių. Tik CFPV1 geno ekspresija buvo sumažinta iki CFA ar rūgšties stimuliavimo. Anksčiau mes nustatėme, kad TDAG8 gali reguliuoti TRPV1 11 . Taigi, TRPV1 gali prisidėti prie ląstelių autonominio TDAG8 poveikio.

Išvados

Tai yra pirmas tyrimas, įrodantis, kad TDAG8 funkcija yra būtina atliekant uždegiminę hiperalgeziją ir hiperalgezinį gruntą. Mes įrodėme, kad numušta TDAG8 raiška periferijoje arba TDAG8 ištrynimas atitolino uždegiminės hiperalgezijos ir sutrumpėjo pelių hiperalgeziją. Dvigubos rūgšties įpurškimo modelis pateikė tvirtų įrodymų, kad TDAG8 tarpininkauja acidozės signalui, kad būtų nustatytas hiperalgezinis pradmuo. Dvigubas TDAG8 agonisto modelis papildomai patvirtino, kad TDAG8 yra susijęs su hiperalgeziniu pradmenų nustatymu. Nukreiptas TDAG8 slopino neuronų kalcio signalus ir cAMP kaupimąsi, o tai rodo, kad TDAG8 tarpininkauja acidozės signalams, kad būtų galima inicijuoti hiperalgeziją ir sukurti hiperalgezijos pradžią per cAMP ar kalcio signalus.

Medžiagos ir metodai

Agentai ir konstruktai

CFA, karageninas, 2- (N-morfolino) etansulfoninė rūgštis (MES) ir 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansulfoninė rūgštis (HEPES) buvo iš „Sigma“. H89 dihidrochloridas (N- [2 - [[3- (4-bromfenil) -2-propenil] amino] etil] -5-izochinolinesulfonamido dihidrochloridas) buvo iš „Tocris Bioscience“. TDAG8 agonistas BTB09089 buvo iš Maybridge (Šiaurės Kornvalis, JK). Katijonizuotos želatinos (CG) mikrosferą maloniai paruošė ir pateikė dr. Yasuhiko Tabata 18 (Kioto universitetas, Japonija). Tyrimams su gyvūnais visi vaistai ar peptidai prieš injekciją buvo praskiedžiami druskos tirpalu.

TDAG8-shRNR plazmidės (shRNR klonai TRCN0000027417 [A01], TRCN0000027436 [B01], TRCN0000027459 [C01]) buvo iš Taivano nacionalinio RNAi pagrindinio įrenginio, „Academia Sinica“, Taivanas. TDAG8-shRNR plazmidės A01, B01 ir C01 (shTDAG8-A01, -B01, -C01) buvo subklonuotos į pLKO.1-Cherry vektorių (pervadintą shTDAG8-A1, B1, C1). Tikslinė TDAG8 seka yra 1 lentelėje. TDAG8 ir TDAG8-shRNR plazmidės buvo klonuoti atitinkamai pIRES-hrGFP-2a (pIRES-GFP) ir pLKO.1-puro vyšnios vektoriuose, siekiant transfekcijos eksperimentų.

Eksperimentai su gyvūnais ir audinių surinkimas

ICR pelės (8–12 savaičių) buvo įsigytos iš „BioLASCO Taiwan“ (Taipėjus), buvo užaugintos ir prižiūrimos pagal laboratorinių gyvūnų naudojimo vadovą (National Academy Press, Vašingtonas). Pelės buvo laikomos 3–4 kiekviename narve 12 valandų šviesos / tamsos cikle (šviesa įjungiama 7:00 ryto) su maistu ir vandeniu ad libitum , esant temperatūros ir drėgmės kontroliuojamai aplinkai Nacionaliniame centriniame universitete. Tyrimų su gyvūnais procedūras patvirtino vietinis gyvūnų naudojimo komitetas (IACUC, Nacionalinis centrinis universitetas, Taivanas). Elgesio testai buvo atlikti nuo 9 iki 17 valandos. Buvo stengiamasi sumažinti naudojamų gyvūnų skaičių ir jų kančias. Pelės TDAG8 + / +, TDAG8 +/−, TDAG8 - / - buvo sukurtos ir veisiamos kaip aprašyta 13 . Pradinės sekos genotipui nustatyti buvo TDAG8 - / -, į priekį, 5′-cgaactctagctggcttttatccaataat-3 ′ ir atvirkštinės, 5′-cttgtgtcatgcacaaagtagatgtcc-3 ′.

Pelėms buvo atlikta intraplantinė injekcija su 25 μl fiziologinio tirpalo, karagenino (20 mg / ml) arba CFA (50% druskos tirpalo) prieš atliekant ląstelių ar gyvūnų eksperimentus. Dvigubos rūgšties injekcijos modelyje pelėms buvo įšvirkščiama 25 μl rūgšties (pH 5, 0) du kartus per 5 dienas. Genų, audinių ar ląstelių eksperimentams pelės buvo dedamos į eutanazijos kamerą ir aukojamos įleidžiant 100% anglies dioksido, kurio užpildymo greitis buvo 20–30% / min. Pelės buvo be sąmonės paprastai per 2–3 minutes. Po paaukojimo nurodytu laiku buvo pašalintos juosmeninės 4-6 (L4-6) DRG ipsilate ir priešingos pusės įšvirkštoms letenoms RNR ekstrakcijai, audinių ekstrakcijai ar pirminės ląstelės kultūrai.

Kai kuriuose eksperimentuose pelėms iš anksto buvo sušvirkšta 25 arba 12, 5 μg shTDAG8 / CG poliplekso (1: 7, 5) arba vektoriaus / CG prieš rūgštingumo, karagenino ar CFA injekcijas po 7 dienų. ShTDAG8 / CG paruošimas buvo aprašytas 18, 19 . Trumpai tariant, plazmidės DNR (shTDAG8) ir CG kiekvienas buvo kaitinamas iki 65 ° C 10 minučių ir atskirai praskiedžiamas 5% gliukoze. CG buvo įpilta į plazmidės DNR masės santykiu 7, 5: 1 ir prieš injekciją pelėms buvo maišoma 30 sekundžių.

Elgesio eksperimentai daugiausia buvo daromi su pelių patinais, o genų ekspresijos ir ląstelių eksperimentai buvo atlikti su pelių patinais ir moterimis. Pelių patelės buvo išbandytos ir parodė panašų elgesį kaip pelių patinai, todėl jos buvo naudojamos genų ir ląstelių eksperimentuose.

Ląstelių kultūra ir transfekcija

Žmogaus embrioninės inksto 293 ląstelės (HEK293T, gautos iš Taivanio maisto pramonės tyrimų ir plėtros centro Bioresursų surinkimo ir tyrimų centro) buvo auginamos ir palaikomos DMEM (Invitrogen), papildytame 10% galvijo vaisiaus serumo (Invitrogen) ir antibiotikais, kaip aprašyta 11. . Atliekant Ca 2+ vaizdavimo eksperimentus, HEK293T ląstelės buvo pasėtos 4 × 105 dydžio ant 24 mm ilgio poli-D-lizinu padengtų dangtelių, perkeltų 1, 5 μg plazmidės pIRES-GFP-TDAG8, pIRES-GFP-G2A, pLKO- vyšnių-TDAG8shRNR, pIRES-GFP arba pLKO-vyšnių, tada buvo atliktas Ca 2+ vaizdas. CAMP tyrimui HEK293T ląstelės buvo pasėtos 1, 6x105 kiekvienoje duobutėje (70–80% santaka) 12 šulinėlių plokštelėse, persodintose 1, 5 μg plazmidės pIRES-GFP-TDAG8, pLKO-vyšnia-TDAG8shRNR, pIRES-GFP. arba pLKO-vyšnia, tada buvo atliktas cAMP tyrimas. Kai kuriuose eksperimentuose ląstelės buvo transfekuotos kartu su 1, 5 μg abiejų pIRES-GFP-TDAG8 ir pLKO-vyšnių-TDAG8shRNR arba pIRES-GFP-TDAG8 ir pLKO-vyšnių santykiu 1: 1.

Pirminis DRG buvo auginamas, kaip aprašyta 11 . Trumpai tariant, ICR pelėms buvo iš anksto sušvirkšta shTDAG8-B1 arba be jo, po to sušvirkšta 50% CFA arba fiziologinio tirpalo. Po 2 ar 24 valandų po CFA injekcijos pelės juosmens 4-6 (L4-6) DRG buvo surinktos, apdorotos 0, 125% I kolagenazės (Sigma) ir suardytos 0, 25% tripsino. Ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos, surinktos ir 5 minutes centrifuguotos 1224 x g greičiu. Ląstelių nuosėdos buvo suspenduotos, sumaišytos ir kultivuojamos 12 valandų prieš vaizduojant Ca 2+ .

Mechaninis bandymas

Anksčiau buvo aprašytas skausmo elgesio testas 20 . Patyrusiems ICR pelėms su gydymu ar be jos buvo patikrinta, ar neatsiranda slenksčio mechaniniams dirgikliams (von Frey siūlams, „Touch-Test“, „North Coast Medical“, Morgan Hill, CA), taikomiems ant užpakalinės letenos. Pelės (n ≥ 6 kiekvienoje grupėje) buvo iš anksto treniruojamos 1-2 valandas kiekvieną dieną 2 dienas prieš testą. Von Frey pluoštai buvo dedami 5 kartus 5 sekundžių intervalais ant kiekvienos užpakalinės kojos padų paviršiaus įvairiais laikotarpiais po injekcijų. Lupos ištraukimo riba (PWT) buvo nustatyta, kai buvo pastebėta, kad letena ištraukta daugiau nei 3 iš 5.

Imunohistochemija ir srauto citometrija

Pelėms buvo intraplantariškai sušvirkšta shTDAG8 / CG, vėliau po 4 ar 7 dienų buvo gauti L4-6 DRG ir iškart sudėti į užšaldantį tirpalą. 12 μm storio nuoseklieji pjūviai buvo supjaustyti kriostatu (Leica microsystem 3510S, Bensheim, Vokietija). Skyriai buvo plaunami 1 × fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS), po to dažomi pirminiais antikūnais anti-periferinu (1: 500, Sigma) arba anti-TDAG8 (1: 100, pagal „Genesis“, Taivanas), po to FITC konjuguotu ožkos anti-triušio-IgG antikūnas (1: 250, Sigma). Visi antikūnai buvo praskiesti 1 × PBS, turinčiame 1% galvijų serumo albumino. Visos inkubacijos buvo atliekamos 4 ° C temperatūroje per naktį. Mėginiai buvo ištirti „Lecia DMI3000B“ fluorescenciniu mikroskopu (Vokietija) ir suskaitmeninti vaizdai buvo užfiksuoti naudojant „MetaVue“ programinę įrangą.

Srauto citometrijai atlikti transfekuotos ląstelės buvo tripsino ir suspenduotos DMEM. Po 5 minučių centrifugavimo esant 1000 x g, ląstelių granulės buvo pakartotinai suspenduotos PBS, 5 minutes išcentrifuguotos esant 1000 g, pakartotinai suspenduotos 70% etanolyje / PBS, po to atlikta srauto citometrija (Beckman Coulter). FITC kanalas buvo naudojamas TDAG8-EGFP fluorescencijos intensyvumui ir shTDAG8 raudonos fluorescencijos kanalui analizuoti.

cAMP tyrimas

Transfected HEK293T cells were pre-incubated for 15 min with serum-free DMEM containing 30 μM of the phosphodiesterase inhibitor RO201724 (Sigma), then stimulated with indicated pH buffers containing 30 μM RO201724 for 30 min at 37 °C. After stimulation, cells were lysed in ethanol. The lysates were dried, and cAMP level in dried lysates was quantified by use of the cAMP immunoassay kit (Assay Designs, MI) according to the manufacturer's protocol. For DRG tissue, L4-6 DRG were flash-frozen in liquid nitrogen and ground to a fine powder under liquid nitrogen. After liquid nitrogen evaporated, 0.1 M HCl (about 300 μl, 10-fold volume frozen tissue) was added into the ground powder. After centrifugation at 600× g for 10 min to remove debris, the supernatant was directly used in the assay or stored frozen for later analysis.

Imaging of intracellular Ca 2+ level ([Ca 2+ ] i )

[Ca 2+ ] i imaging was performed as described 11 . Briefly, cells grown on coverslips were pre-incubated at 37 °C with 2.5 μM Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2-AM, Molecular Probes) for 40 min in HEPES/MES buffer (125 mM NaCl, 1 mM KCl, 5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 8 mM glucose, 10 mM HEPES and 15 mM MES, pH 7.4). After being washed, cells were supplemented with 300 μl HEPES/MES buffer (pH 7.6), then stimulated with pH 6.8 or 5.5 HEPES/MES buffer (600 μl). The pH-evoked Ca 2+ transients were recorded by use of a Ca 2+ imaging system equipped with a Leica DMI3000B fluorescence microscope and analyzed by use of MetaFluor software.

RNA preparation and quantitative RT-PCR

DRG RNA extraction was performed as described 10 . Each DRG pool contained at least 9 to 12 DRG from 3 to 4 mice. RNA was extracted by using the RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA). The gene primers (100 nM), derived cDNA, and master mix (SYBR green I and AmpliTaq Gold DNA polymerase [Applied Biosystems, Foster City, CA]) were mixed for PCR reactions and product detection by use of ABI Prism 7300. For each assay, preparations were run in triplicate or quadruplicate. The thermal cycling conditions were 95 °C for 10 min, followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s, and 60 °C for 1 min. The threshold cycle (Ct) values of both the targets and internal reference (mGAPDH) were measured from the same samples, and target gene expression relative to that of mGAPDH was calculated by the comparative Ct method.

The primer sequences were for TDAG8, forward, 5′-atagtcagcgtcccagccaac-3′, and reverse, 5′-cgcttcctttgcacaaggtg-3′; and mGAPDH, forward, 5′-ggagccaaacgggtcatcatctc-3′, and reverse, 5′-gaggggccatccacagtcttct-3′, as an internal control.

Statistinė analizė

All data are presented as mean ± SEM. One-way or two-way ANOVA with post-hoc Bonferroni correction was used to compare results from multiple groups. P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

Papildoma informacija

How to cite this article : Dai, S.-P. et al . TDAG8 involved in initiating inflammatory hyperalgesia and establishing hyperalgesic priming in mice. Mokslas. Rep. 7, 41415; doi: 10.1038/srep41415 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.