Laikinas sinachokokų sruogų kitimas Ramiojo vandenyno pakrantės stebėjimo vietoje | nežinomas žurnalas

Laikinas sinachokokų sruogų kitimas Ramiojo vandenyno pakrantės stebėjimo vietoje | nežinomas žurnalas

Anonim

Anotacija

Synechococcus genties jūrų cianobakterijos randamos visuose pasaulio vandenynuose ir yra svarbios pasaulinio pirminio produktyvumo ir anglies ciklo įtakos. Kultūriniai izoliatai ir aplinkos DNR klonų bibliotekos Synechococcus parodė šių mikrobų įvairovę. Tačiau natūralus šios įvairovės pasiskirstymas erdvėje ir laike bei ekologinė jų pasiskirstymo svarba vis dar menkai suprantamos. Norėdami suprasti Synechococcus įvairovės sezoninę dinamiką, mes sukūrėme kiekybinę PGR strategiją, naudodami geną, koduojantį kaip DNR priklausomos RNR polimerazės ( rpoC1 ) subvienetą, ir pritaikėme jį 3 metų laikotarpių paviršiaus mėginiams iš Scripps Institution. Okeanografijos prieplauka (La Jolla, CA, JAV) - pakrantės vieta Ramiojo vandenyno šiaurės rytuose. I ir IV klasių sinechokokas buvo dominuojantis per visą laiko eilutę ir koreliavo su bendru Synechococcus gausumu. Santykinis šių dviejų dominuojančių kladelių gausumas parodė sezoninio ciklo požymius. IV klade sinechococcus paprastai buvo gausesnis, tačiau I clade sinechokokas dominavo laikotarpiais prieš pat metinį pavasario žydėjimą Synechococcus . II ir III klotų sinechokoko nebuvo pavasarį ir vasaros pradžioje, tačiau vasaros pabaigoje ir žiemą jų buvo nedaug, galbūt dėl ​​cirkuliacijos pokyčių Pietų Kalifornijos įlankoje. Kaip pirmoji ilgalaikė laiko seka, apibūdinanti Synechococcus populiacijos įvairovę, ši laiko dinamika buvo naudojama aiškinant aplinkoje stebimą genetinę / genominę įvairovę ir galimus veiksnius, reguliuojančius jų pasiskirstymą.

Įvadas

Synechococcus genties jūrų cianobakterijos vaidina pagrindinį biogeocheminį vaidmenį pasaulio vandenynuose. Dėl savo fotosintetinio gyvenimo būdo ir gausaus gausumo, jie yra svarbūs pirminės vandenynų gamybos ir pasaulinio anglies ciklo dalyviai (Johnsonas ir Sieburtas, 1979; Waterbury ir kt., 1979; Glover, 1985; Li, 1994; Smith ir Kemp, 2001; Richardson ir Jackson, 2007). Kaip pikofitoplanktono komponentas, ši grupė sudaro 40% viso vandenyno pirminio produktyvumo (Agawin ir kt., 2000). Kai kuriose pakrančių vietose Synechococcus sukuria 20% pirminio produktyvumo (Li, 1994). Tačiau norint tinkamai suprasti jų vaidmenį aplinkoje, reikia geriau suprasti jų užimamas ekologines nišas, kaip jos prisitaiko prie besikeičiančios aplinkos ir kaip šios adaptacijos yra susijusios su jų raida ir įvairinimu.

Yra tvirtas genetinės informacijos, apibūdinančios jūrinio Synechococcus įvairovę, pagrindas. Daugelis jūrinių Synechococcus formuoja monofilinę grupę, pagrįstą filogenetiniais medžiais, sukonstruotais su 16S rRNR, rpoC1 ir kitomis konservuotomis genų sekomis, ir yra glaudžiai susiję su kitomis pagrindinėmis jūrų cianobakterijų gentimis - Prochlorococcus (Palenik, 1994; Toledo ir Palenik, 1997; Rocap et al.)., 2002; Fuller ir kt., 2003; Zeidner ir kt., 2003; Chen ir kt., 2004; Gibson ir kt., 2006; Jenkins ir kt., 2006; Penno ir kt., 2006).

Jūrų Synechococcus grupėje buvo atpažįstamos skirtingos odelės, pagrįstos rpoC1 geno filogeniškumu (Palenik, 1994; Ferris ir Palenik, 1998). Šiuos klodus palaiko kitos geno filogenijos ir jie buvo pavadinti skaitmeniniu būdu su maždaug 10 šiuo metu identifikuotų kladų (Rocap ir kt., 2002; Fuller ir kt., 2003; Ahlgren ir Rocap, 2006; Penno ir kt., 2006). Vis dėlto, kadangi šie klodai buvo atskirti remiantis genų sekų filogeniškumu, fenotipiniai bruožai, kurie apibūdina kiekvieną Synechococcus gniužulą, nebuvo nustatyti, išskyrus judrumą, kuris randamas tik III kladės kamienuose (Toledo ir kt., 1999). Be to, mažai žinoma apie Synechococcus klizmų biogeografinius modelius ir jų priežastis.

Plačiai aprašyta Synechococcus įvairovės erdvinė biogeografija. I, II ir IV kladų sinechokokas yra labiausiai paplitęs visame pasaulio vandenyne (Zwirglmaier ir kt., 2008). Panašu, kad I ir IV klades yra vyraujantis tipas vidutinio klimato pakrantės aplinkoje (Brownas ir Fuhrmanas, 2005; Brownas ir kt., 2005; Zwirglmaier ir kt., 2007; Zwirglmaier ir kt., 2008), o II klotas yra pasiskirstęs subtropinėse. / atogrąžų aplinkoje (Fuller ir kt., 2006; Zwirglmaier ir kt., 2008) ir atviroje jūroje esančioje oligotrofinėje aplinkoje (Ferris and Palenik, 1998; Toledo ir Palenik, 2003; Ahlgren and Rocap, 2006).

Tačiau nedaugelis tyrimų išnagrinėjo laikinus Synechococcus įvairovės ir gausos pokyčius. Visi šie keli tyrimai atrinko Akabos įlanką Raudonojoje jūroje, kurioje vyrauja II klade esantys sinnechokokai (Fuller ir kt., 2005; Muhling ir kt., 2005, 2006; Penno ir kt., 2006). Įrodyta, kad Synechococcus genetinė sudėtis iš Akabos įlankos laikui bėgant keičiasi, galbūt dėl ​​maistinių medžiagų koncentracijos pokyčių ar virusinių infekcijų (Muhling et al., 2005), tačiau šie tyrimai buvo trumpi, paprastai 1 metai, ir buvo naudojami Pietinis hibridizavimas, klonų biblioteka arba DNR pirštų atspaudų atskyrimo metodai, kurie pateikė tik santykinį kiekį.

Šiame tyrime mes sukūrėme kiekybinio PGR (qPCR) metodą, pagrįstą rpoC1 filogenija, kad įvertintume trijų pagrindinių Synechococcus klodų, I, II ir IV, ir ketvirtojo, III, III klotų. Įrodyta, kad rpoC1 geno seka yra tvirtas genetinis žymeklis, apibūdinantis Synechococcus įvairovę iš kelių jūrinių aplinkų (Palenik, 1994; Toledo ir Palenik, 1997; Ma ir kt., 2004; Muhling ir kt., 2006). Šį qPCR metodą pritaikėme 3 metų laiko eilutėms, esančioms Scripps Institute of Oceanography (SIO) prieplaukoje, Ramiojo vandenyno pietinėje Kalifornijos įlankos dalyje, ir duomenys buvo analizuojami atsižvelgiant į fizinius ir cheminius parametrus iš tų pačių svetainė. Kaip pirmoji ilgalaikė laiko seka, apibūdinanti Synechococcus populiacijos įvairovę, ši laikinė dinamika suteikia būtinos informacijos suprasti genetinės / genominės įvairovės, fiziologijos ir aplinkos sąveiką.

medžiagos ir metodai

Mėginių rinkimas

Paviršinio jūros vandens mėginiai buvo imami nuo SIO prieplaukos galo La Jolla mieste Kalifornijoje (32 ° 53 ′ šiaurės platumos, 117 ° 15 ′ vakarų ilgumos) kas savaitę ryte nuo 2005 m. Sausio mėn. Iki 2008 m. Sausio mėn. Mėginių ėmimo vieta yra už banglenčių zonos ir dugno gylis vidutiniškai yra 7 m, o potvynio potvynio diapazonas yra 2 m. Iš jūros vandens mėginių 1 ml jūros vandens kopijos buvo konservuotos su 0, 25% gluteraldehido (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), inkubuojamos kambario temperatūroje 15 min. Ir laikomos –80 ° C temperatūroje, kol jos buvo analizuojamos srauto citometrija. DNR analizei atlikti 500 arba 1000 ml mėginio buvo filtruojami per 0, 2 μm „Supor“ filtro diską („Pall Life Sciences“, Ann Arbor, MI, JAV), kad būtų surinkti mikroorganizmai, o filtro diskas buvo laikomas –80 ° C.

Mėginių paėmimas sutapo su chlorofilo, temperatūros, druskingumo ir maistinių medžiagų (nitratų (NO 3 - ), amoniako (NH 4 + ), fosfato (PO 4 3− ), nitritų (NO 2 - ) ir reaktyvaus silikato) matavimais, kurie buvo renkami kas dvi savaites. per Pietų Kalifornijos pakrančių vandenyno stebėjimo sistemos (SCCOOS) programą.

Srauto citometrija

Srauto citometrija buvo naudojama visų Synechococcus ląstelių gausumui įvertinti. Taikant srauto citometriją, Synechococcus ląstelės išsiskiria iš kitų pikoplanktono jų fitoeritrininių pigmentų fluorescencija. Mėginiai buvo analizuojami didžiausiu srautu, naudojant FACSort srauto citometrą (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, JAV), kaip aprašė Collier ir Palenik (2003), tačiau netaikant kompensacinės matricos. Buvo suskaičiuoti mėginių, kurie taip pat naudojami DNR ekstrakcijai ir qPCR analizei, dubliavimai.

DNR ekstrahavimas

DNR buvo išgauta iš mikroorganizmų, surinktų ant 0, 2 μm „Supor“ filtrų diskų (Pall), nuo kiekvieno mėnesio iki kas dvejus mėnesius. Filtrų diskai pirmiausia buvo inkubuojami 12, 5 mg / ml lizocime (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, JAV), 20 mM EDTA (Sigma) ir 50 mM Tris (Sigma), pH 8, 0 30 minučių 37 ° C temperatūroje. . SDS (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV) ir proteinazė K (Sigma) buvo pridėta atitinkamai iki 1% ir 1 mg ml- 1 galutinės koncentracijos ir inkubuota 2, 5 valandos 55 ° C temperatūroje. RNR buvo pašalinta pridedant 2 mg ml – 1 RNazės (Sigma) 5 minutes kambario temperatūroje. Baltymai buvo pašalinti, ekstrahuojant du kartus po vienodą tūrį 25: 24: 1 fenolio / chloroformo / izoamilo alkoholio (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) ir vieną kartą naudojant 24: 1 chloroformo / izoamilo alkoholio (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, JAV). ). Naudojant fenolį / chloroformą, buvo ištirpintas „Supor“ filtras ir padidintas DNR ekstrahavimo efektyvumas. Vandeninėje fazėje esanti DNR buvo išgryninta naudojant silikagelio kolonėlę (DNeasy Blood and Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą ir iš kolonėlės išplauta naudojant 400 μl gamintojo buferio. DNR buvo kiekybiškai įvertinta naudojant „PicoGreen“ („Quant-iT“; „Qiagen“), DNR rišančius fluorescencinius dažus, pagal gamintojo protokolą.

Kultūriniai Synechococcus klotų atstovai (CC9311 I klotui, CC9605 II clade, WH8102 III klotui ir CC9902 III clade) buvo suskaičiuoti, filtruojami ir jų genominė DNR ekstrahuojama laikantis tos pačios tvarkos kaip ir aplinkos mėginiuose. Vidutiniškai 10 10 ląstelių buvo filtruojamos DNR ekstrakcijai, kurio galutinis tūris buvo 400 μl. DNR ekstraktai iš kultivuotų padermių buvo naudojami kladei specifinių qPCR pradmenų specifiškumui patikrinti ir kaip koncentracijos standartai.

qPCR

Kiekvienam klodui buvo sukurti du oligonukleotidiniai pradmenys, skirti amplifikuoti 145–304 bp rpoC1 geno fragmentus (1 lentelė). rpoC1 yra vienos kopijos genas, todėl buvo išvengta problemų, kai naudojamas 16S rRNR genas kaip žymėjimo lokusas normalizuoti ląstelių skaičių su keliomis 16S rRNR geno kopijomis.

Pilno dydžio lentelė

Grunto sekos yra unikalios tam tikram klodui, remiantis visų galimų Synechococcus rpoC1 genų sekų suderinimu neredaguojamoje (nr) „GenBank“ duomenų bazėje tiek iš aplinkos, tiek iš kultūrinių šaltinių. Dalinis pradmenų sričių suderinimas pateiktas papildomoje S1 lentelėje. Naudojant kultivuotų atstovų DNR (žr. Aukščiau), pradmenys buvo tiriami, norint nustatyti klodo specifiškumą, naudojant PGR reakcijų atkaitinimo temperatūrų diapazoną. Buvo pasirinkta tinkama atkaitinimo temperatūra (1 lentelė), kad DNR amplifikuotų tik iš tikslinio klodo.

qPCR reakcijas sudarė 1X Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, JAV), 30 nM Rox etaloninis dažiklis (Stratagene), 0, 8 μM kiekvieno grunto (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, JAV), 0, 1 mg / ml BSA (Naujosios Anglijos BioLabs, Ipswich, MA, JAV) ir šablono DNR. Dešimčiai kartų nuoseklūs aplinkos DNR atskiedimai (paprastai nuo 5 ng iki 0, 05 pg DNR) buvo naudojami kaip šablonai qPCR reakcijose. Serijiniai skiediniai buvo naudojami kaip replikacijos ir norint atskiesti bet kokius PGR inhibitorius, atsirandančius atliekant DNR ekstrakcijas. Iš išaugintų Synechococcus padermių DNR buvo nuosekliai praskiedžiamos 6 dydžiais, kad būtų galima naudoti kaip koncentracijos etalonus. Naudojant „Stratagene 3000P“ aparatą SYBR Green fluorescencijos duomenims gauti, reakcijos buvo inkubuojamos 95 ° C temperatūroje 10 min., Po to sekė 40 ciklų 95 ° C 30 s, o kladės specifinė kaitinimo temperatūra 30 s ir 72 ° C 30 s. s, ir baigėsi 95 ° C 1 min., rampa iki 55 ° C ir rampa iki 95 ° C esant 0, 2 ° C s – 1, kad būtų galima įvertinti amplifikuoto produkto disociacijos kreivę.

Šabloninės DNR standartinėms kreivėms buvo gautos iš kultivuotų ląstelių, kurios buvo suskaičiuotos prieš DNR ekstrahavimą, taigi DNR kiekis, pridėtas prie kiekvienos standartinės qPCR reakcijos, parodo DNR iš žinomo ląstelių skaičiaus, atsižvelgiant į bet kokius DNR ekstrakcijos neveiksmingumus. Aplinkos mėginių slenksčio ciklas ( C t ), nustatytas iš kiekvieno qPCR, buvo konvertuotas į ląstelių skaičių, remiantis standartine kreive. Ląstelių skaičius kiekviename qPCR buvo konvertuotas į ląsteles mililitre, remiantis kiekvieno mėginio filtruoto jūros vandens tūriu ir qPCR naudojamo DNR ekstrahavimo tūriu (qPCR ląstelių skaičius / (filtruoto jūros vandens tūris / ( išgautos DNR tūris × DNR tūris qPCR)).

rpoC1 klonų biblioteka

Du cianobakterijoms būdingi pradmenys (SAN-157F = 5 ′ YTN AAR CCN GAR ATG GAY GG ir SAC-1039R = 5 ′ CYT GYT TNC CYT CDA TDA TRT C, pradmenų pavadinimuose esantys skaičiai žymi pirmąjį nukleotidą ten, kur yra pradmenys. palei rpoC1 geną) (suprojektavo J Collier), kad būtų galima amplifikuoti rpoC1 geno 841 bp fragmentą. Šie pradmenys generuoja ilgesnį rpoC1 geno fragmentą ir geriau suderina jūrines cianobakterijas nei anksčiau paskelbtos pradmenų poros (Palenik ir Haselkorn, 1992; Muhling et al., 2006). Naudojant DNR, ekstrahuotą iš mėginio, surinkto iš SIO prieplaukos 2005 m. Gegužės 12 d., PCR buvo naudojamas amplifikuoti rpoC1 geno fragmentą iš cianobakterijų populiacijos. Šablono DNR (20 ng) buvo sujungta su 1, 33 μM kiekvieno pradmens ir 25 μl Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). Šis mišinys buvo inkubuotas 2 minutes 94 ° C temperatūroje, po to sekė 30 ciklų, laikant 94 ° C temperatūroje 30 s, 52 ° C 1 min. Ir 72 ° C 1 min., Ir baigiant inkubacija 72 ° C 10 min. . Gautas PGR produktas buvo surištas į pCR4-TOPO plazmidinius vektorius ir klonuotas transformavus į TOP10 chemiškai kompetentingas Escherichia coli ląsteles pagal gamintojo protokolą (Invitrogen). Plazmidinė DNR buvo pagaminta iš 21 klono, naudojant „QIAprep Spin Miniprep Kit“ (Qiagen) pagal gamintojo protokolą. „ RpoC1“ geno fragmento intarpas buvo sekvenuotas („SeqXcel“, San Diegas, CA, JAV) iš abiejų galų, naudojant T3 ir T7 sekvenavimo pradmenis, kuriuos pateikė gamintojas („Invitrogen“).

RpoC1 geno fragmentų sekos buvo apkarpytos plazmidžių ir pradmenų sekomis ir deponuotos „GenBank“ (registracijos numeriai FJ790799 – FJ790819). Sekos buvo suderintos su žinomomis rpoC1 genų sekomis, gautomis iš kultūrinių jūrų cianobakterijų atstovų, tai yra, Synechococcus ir Prochlorococcus , pasiekiamų per „GenBank“. Filogenetinis medis buvo apskaičiuotas naudojant kaimyno sujungimo algoritmą PAUP (v.4.0b10) su atstumais, apskaičiuotais naudojant hky85 modelį. 50% daugumos sutarimo medis, apskaičiuotas iš 1000 įkrovos replikų, pateikė statistinę paramą.

Koreliacijos analizė

Savaitinis bendras Synechococcus gausumas, temperatūros, chlorofilo, druskingumo ir maistinių medžiagų matavimai buvo tiriami poromis. Taip pat išanalizuotas atskiras duomenų rinkinys kas dveji mėnesiai ir kas mėnesį, atsižvelgiant į specifinius kladų kiekius , bendrą Synechococcus gausumą, temperatūrą, chlorofilą, druskingumą ir maistinių medžiagų koncentracijas. Duomenys, išskyrus temperatūrą, prieš analizę buvo transformuoti (log ( x +1)), kad būtų galima gauti maždaug normalų duomenų verčių pasiskirstymą. Pearsono sandauginio koeficiento koeficientas ( r ) ir neparametrinis Spearmano koreliacijos koeficientas ( ρ ) buvo apskaičiuoti naudojant JMP v. 5.0.

Rezultatai

Iš 3 savaičių savaitinių mėginių, remiantis srauto citometrija, buvo nustatytas bendras Synechococcus gausumas. Ištyrus bendrą gausą, paaiškėjo aiškus metinis modelis (1 paveikslas). Nuosekliai gegužės viduryje Synechococcus gausumas padidėjo virš bazinių svyravimų, tai rodo, kad Synechococcus žydi kasmet. Žydėjimo laikas yra labai nuoseklus: didžiausias metinis gausumas būna 2005 m. Gegužės 12 d. (6, 06 × 10 5 ląstelės ml − 1 ), 2006 m. Gegužės 18 d. (2, 27 × 10 5 ląstelės ml − 1 ) ir 2007 m. Gegužės 17 d. (4, 84 × 10 5 ląstelės ml −1 ). Antrosios gausumo viršūnės įvyko 2006 m. Birželio pabaigoje (2006 m. Birželio 29 d., 2, 73 × 10 5 ląstelės ml −1 ) ir 2007 m. Kovo pabaigoje (2007 m. Kovo 26 d., 3, 95 × 10 5 ląstelės ml − 1 ), tačiau, Apskritai, Synechococcus gausumas per visus likusius metus išliko mažesnis nei 2 × 10 5 ląstelės ml − 1 . Gausybės minimumas buvo vykdomas visus metus; mažiausias laiko eilutėje buvo 319 ląstelių ml − 1 2006 m. kovo 23 d. Bendras Synechococcus gausumas silpnai koreliavo su temperatūra (Pearsono r = 0, 30, P = 0, 0001, Spearmano ρ = 0, 28, P = 0, 0002) ir neigiamai su fosfatu ( r = −0, 31, P = 0, 005, ρ = 0, 22, P = 0, 016), bet neturėjo reikšmingo koreliacijos su druskingumu, chlorofilu ar bet kuria kita išmatuota maistine medžiaga. Koreliacijos su chlorofilo koncentracija trūkumas nestebina, nes didesni fitoplanktonai, tokie kaip diatomai ir dinoflagellates, gali dominuoti daugiau kaip 70% chlorofilo (Melissa Carter, asmeninė komunikacija).

Image

Trejų metų savaitės paviršiaus pavyzdžių iš Scripps Institute of Oceanography (SIO) prieplaukos a ) bendras Synechococcus gausumas ir temperatūra; b ) chlorofilo, nitrato, fosfato ir silikato koncentracijos. Laikas pateikiamas kaip kiekvienų metų pirmoji mėnesio raidė.

Visas dydis

Pradėti buvo sukurti qPCR, kad būtų galima įvertinti Synechococcus populiacijos genetinę sudėtį per šią laiko eilutę. Pradinių medžiagų specifiškumas buvo patikrintas pagal kultūrų atstovų genominę DNR. Naudotoje atkaitinimo temperatūroje pradmenys buvo specifiški kladėms ir nepadaugino DNR iš bet kokio nederlingo kamieno (2 paveikslas; papildomas paveikslas S1). Visi pradmenys DNR kiekybiškai įvertino 6 dydžio dalimis, lygiaverčiomis 10–10 7 ląstelėms. Remiantis jūros vandens kiekiu, filtruojamu DNR ekstrakcijai, šio metodo aptikimo riba yra apytiksliai 10 ląstelių ml − 1 .

Image

Kiekybinių PGR (qPCR) reakcijų diapazonas ir specifiškumas naudojant genominės DNR iš kultivuotų Synechococcus padermių praskiedimus: ( a ) I klado qPCR pradmenys, nukreipti prieš CC9311; ( b ) II gaubto qPCR pradmenis, nukreiptus į CC9605; ( c ) III klade qPCR pradmenis, nukreiptus į WH8102; ( d ) IV kloto qPCR pradmenys, nukreipti į CC9902. Slenksčio ciklas yra PGR ciklas, kurio metu pradeda didėti fluorescencijos signalas. X ašyje nubraižytas ląstelių skaičius kiekvienoje qPCR reakcijoje, o ne DNR kiekis. Uždaryti simboliai rodo qPCR reakcijas naudojant DNR iš Synechococcus padermių, nukreiptų į klade specifinius qPCR pradmenis. Atidaryti simboliai rodo qPCR reakcijas, kai buvo tiriamos DNR iš netiesioginių padermių.

Visas dydis

Nuo dviejų mėnesių iki mėnesio mėginių, qPCR buvo naudojamas siekiant įvertinti Sinechococcus populiacijos įvairovę iš SIO prieplaukos. I ir IV klotų sinechokokas ištisus metus vyravo šioje pakrantės aplinkoje (3a ir b paveikslai). Ir I, ir IV klotų gausumas reikšmingai koreliavo su bendra Synechococcus koncentracija (4a ir b paveikslai; S2 papildoma lentelė), o šių gumbų gausumo maksimumai sutapo su metiniu viso Sinechococcus žydėjimu (3a ir b paveikslai). I ir IV klotų gausumas taip pat buvo stipriai koreliuojami vienas su kitu (4c paveikslas; papildoma S2 lentelė).

Image

Dviejų dominuojančių kladelių gausa per 3 metus iš Scripps Institute of Oceanography (SIO) prieplaukos paviršiaus mėginių: a ) I kloto gausumas; b ) IV klade gausybė; c ) I ir III klotų gausa; ( d ) I kartos I kartos pokyčio log 2 kartus padidėjimas iki IV kloto gausos. Teigiamos vertės rodo didesnę I kloto gausą aplinkoje. Neigiamos reikšmės rodo didesnę IV kloto gausą. Nulis (0) rodo, kad kiekvienos klotės buvo vienodai gausios (brūkšniuota pilka linija). Kiekvienoje skiltyje punktyrinė pilka linija rodo bendrą Synechococcus gausumą, matuojant kas savaitę. Kladėms būdingas gausumas buvo matuojamas kas mėnesį.

Visas dydis

Image

Klodui būdingo ir bendro Synechococcus gausumo pavyzdžių, ištirtų kiekybine PGR (qPCR), schemų schema per 3 metų laiko eilutes: a ) I klotas palyginti su visu Synechococcus gausumu; b ) IV klotas palyginti su visu Synechococcus gausumu; c ) I-ojo ir IV-ojo Bordo gausumas; d ) II-ojo klizmo ir III-ojo KLADO gausumas. Kiekvienoje skiltyje Synechococcus gausumo viršūnių pavyzdžiai pavaizduoti simboliais: + (2005 m. Gegužės 12 d.), × (2006 m. Gegužės 14 d.), ^ (2007 m. Kovo 26 d.) Ir * (2007 m. Gegužės 17 d.). ( C ) punkte pilkos spalvos simboliai žymi mėginius prieš pat Synechococcus žydėjimą, kur I- ojo klado gausumas viršija IV-osios clade. Pateikti koreliacijos analizės rezultatai (Pearsono koreliacijos koeficientas ( r ) ir Spearmano koreliacijos koeficientas ( ρ ) ir su juo susijusi P vertė). Geriausias tiesinis tinkamumas parodytas kaip šviesiai pilka linija.

Visas dydis

Šie du gaubtai sudarė vidutiniškai 168 ± 54% viso Synechococcus gausumo (3c paveikslas). Reikšmės svyravo nuo 83% iki 335%, išskyrus 2005 m. Gegužės 12 d., Kai abu gaubliai sudarė tik 34% viso gausumo (žr. Toliau). QPCR tyrimas galėjo pervertinti kladai būdingą gausą, nes dalijamosios ląstelės su pakartotinėmis chromosomomis srauto citometru būtų skaičiuojamos kaip vienos ląstelės. Tai rodo, kad aplinkos ląstelės paprastai turėjo pakartotas chromosomas, bet ne kultivuojamos ląstelės, naudojamos qPCR standartams.

Šių dviejų dominuojančių klodų gausos pokyčiams vienas kito atžvilgiu buvo naudojamas santykis tarp I ir IV klotų gausos. Didžiąją metų dalį IV clade Synechococcus buvo bent du kartus gausiau nei I clade (log 2 kartų pokytis <−1, 0; 3d pav.). Tačiau kiekvienais metais prieš pat metinį viso Synechococcus piko laiką I klade I kartos skaičius išaugo dvigubai daugiau (log 2 kartų pokytis> 1, 0; 3d pav.).

II ir III klotų sinechokokas šioje aplinkoje pasireiškė retai arba buvo mažai paplitęs (5 paveikslas). Paprastai II klade buvo gausesnis nei III klodas, tačiau abi klostes atsirado žiemą, kai vanduo yra šaltesnis ir oligotrofinis, taip pat vasarą, kai vanduo labiau stratifikuojamas. Šių kladelių gausa nebuvo koreliuojama su bendru Synechococcus (papildoma S2 lentelė), tačiau II-ojo klade gausumas buvo reikšmingai koreliuojamas su III-ojo klade gausumu, kas rodo, kad jų dinamiką gali įtakoti panašūs mechanizmai (4d pav.).

Image

Dviejų mažesnių kladelių gausa per 3 metus iš Scripps Institute of Oceanography (SIO) prieplaukos paviršiaus mėginių: a ) II kloto gausa; b ) III klade gausybė. Kiekvienoje skiltyje punktyrinė pilka linija rodo bendrą Synechococcus gausumą, matuojant kas savaitę. Kladėms būdingas gausumas buvo matuojamas kas mėnesį.

Visas dydis

Norint nustatyti Synechococcus populiacijos sudėtį, 2005 m. Gegužės 12 d. Buvo sugeneruota rpoC1 klono biblioteka. Tą dieną buvo paimti viso Synechococcus žydėjimo mėginiai, tačiau qPCR nenurodė, kurie buvo dominuojantys klade. Šis mėginys yra akivaizdžiai pašalinis, remiantis I ir IV klotų gausumo ir bendro Synechococcus skaičiaus brėžiniais (4a ir b paveikslai). Tačiau sekų iš klonų bibliotekos filogenetinės analizės parodė, kad didžioji dalis šio pavyzdžio Synechococcus priklausė I ir IV klotams (6 pav.).

Image

Kaimynų sujungimo medis, apskaičiuotas pagal rpoC1 sekų suderinimą iš Scripps Institute of Oceanography (SIO) prieplaukos mėginio 2005 m. Gegužės 12 d. Ir kultivuotų izoliatų. Iš SIO prieplaukos pavyzdžių sekos paryškintos. Reikšmės mazguose rodo procentinę įkrovos palaikymą, pagrįstą 1000 pakartojimų. Mažesnės nei 70% vertės nerodomos. Skalės juosta rodo 10% nukrypimą.

Visas dydis

Ištyrus rpoC1 sekas iš bibliotekos, I-ojo ir IV-ojo clade qPCR pradmenys iš tikrųjų sutampa su atitinkamomis rpoC1 sekomis iš šios klono bibliotekos, todėl nežinoma, kodėl qPCR tyrimas nesugebėjo atpažinti šių dviejų klolių dominavimo šią datą. Cheminiai inhibitoriai, ekstrahuojami kartu su aplinkos DNR, galėjo slopinti qPCR reakciją. Tačiau praskiedus aplinkos DNR šios problemos nereikėjo išvengti.

Atitinkamai septyniolika ir trys aplinkos sekos, sugrupuotos stipriai palaikant I ir IV klotų štamus. I kladei aplinkos sekos sugrupuotos kaip dvi atskiros, bet stipriai palaikomos, odelės, besiskiriančios nuo auginamų atmainų. Tai rodo, kad Synechococcus populiacijos genetinė įvairovė aplinkoje gali smarkiai skirtis nuo izoliuotų padermių įvairovės, kaip tai taip pat neseniai parodyta metagenominiame tyrime mūsų stebėjimo vietoje (Palenik ir kt., 2009).

Diskusija

Mes sukūrėme qPCR strategiją kiekybiškai įvertinti Synechococcus klodus, apibrėžtus rpoC1 , 16S rRNR ir 16S – 23S vidinėmis transkribuotų tarpinių sekomis (Ferris ir Palenik, 1998; Rocap ir kt., 2002; Fuller ir kt., 2003). Šis požiūris leido mums dokumentuoti Synechococcus įvairovės pokyčius, atsižvelgiant į Ramiojo vandenyno pakrantės teritorijos 3 metų laiko eilutes. Iš šių laiko eilučių akivaizdu, kad Synechococcus populiacijoje visus metus dominavo I ir IV kladai (3a ir b paveikslai). Antra, šių dviejų dominuojančių gyslų gausumas buvo koreliuojamas su bendru Synechococcus gausumu, kuris parodė metinį gausumo viršūnę gegužės mėnesį (4a ir b paveikslai). Trečias intriguojantis rezultatas buvo tas, kad I kloto Synechococcus gausumas, palyginti su IV klade, išliko nekintamas, o pasikeitė ištisus metus, įrodant sezoninį ciklą. Visų pirma, nors paprastai vyraujantis IV kloto Synechococcus tipas buvo I klade, Synechococcus dominavo prieš IV clade prieš pat metinį viso Synechococcus gausumo pikas (3d pav.).

Viso Synechococcus gausumo sezoninis pobūdis

Metinis bendro Synechococcus gausumo skaičius šioje Ramiojo vandenyno pakrantės vietoje skiriasi nuo vidutinio klimato Atlanto vandenyno vietos (Woods Hole uostas) ir oligotrofinės vietos (Sargasso jūra). SIO prieplaukoje maksimalus gausumas, viršijantis 2 × 105 ląstelių ml −1, trunka maždaug 1 savaitę ir paprastai būna, kai temperatūra pakyla virš 17 ° C. Tuo tarpu iš Woods Hole uosto Synechococcus žydi, kai vanduo pasiekia 6 ° C, o žydėjimo laikotarpis trunka mėnesius, nuo balandžio iki birželio, o didelis Synechococcus gausumas (10 5 / ml) stebimas iki lapkričio (Waterbury et al., 1986). ). Sargasso jūroje Synechococcus piko metu būna kovo / balandžio mėn., Kai žydėjimo laikotarpis trunka kelis mėnesius (Durand ir kt., 2001).

Atrodo, kad pakilimas per slenkstinę temperatūrą yra nuolatinis veiksnys, kuris sutampa su žydėjimo pradžios laiku Ramiojo vandenyno ir Atlanto vandenynuose. Tikėtina, kad aukštesnė temperatūra padidins Synechococcus augimo greitį ir padidins jų gausą (Agawin et al., 1998). Tačiau žydėjimo trukmė tikriausiai labiau priklauso nuo kitų aplinkos veiksnių, tokių kaip ganymo slėgis ar maisto medžiagų prieinamumas. SIO prieplaukoje gana trumpas žydėjimo laikotarpis rodo, kad mirštamumas (pvz., Ganydamasis ar virusus skrodžiant) taip pat padidėjo, todėl greitai sumažėjo Synechococcus gausumas.

I ir IV klijų Synechococcus bendro valdymo principai

Naudodamiesi qPCR, mes parodėme, kad tiek I, tiek IV klonai Synechococcus dominuoja SIO prieplaukos pakrantės aplinkoje, tačiau jų dinamika skiriasi. I ir IV klasių Synechococcus populiacijos bendras vaidmuo buvo įrodytas kitose Atlanto vandenyno, Viduržemio jūros, Ramiojo vandenyno rytų pietinėse dalyse, Kalifornijos pakrantėje ir Arkties vandenyne, ir manoma, kad jų dominavimas apsiriboja aukštesnėmis nei 30 ° platumos platumomis. N ir žemiau 30 ° pietų platumos (Brown ir Fuhrman, 2005; Brown ir kt., 2005; Zwirglmaier ir kt., 2007, 2008). Rytiniuose pietiniuose Ramiojo vandenyno ir Atlanto vandenynuose IV klotas yra gausiau nei I klotas, tačiau Arktyje jie pasitaiko vienodai (Zwirglmaier ir kt., 2008). Tačiau šie biogeografiniai tyrimai galėjo praleisti laikinus Synechococcus įvairovės aspektus.

Iš savo 3 metų laiko eilučių mes parodome, kad laikantis laiko, vieno kloto dominavimas prieš kitą yra dinamiškas ir rodo sezoniškumą. Visų pirma, I skiltelės Synechococcus pranoksta IV kladoje esančius Synechococcus prieš pat metinio gausumo viršūnę, o tai rodo, kad aplinka reguliariai teikia pirmenybę I klotui (arba nepalankią IV klotui), nepalankią IV klotui. Tačiau santykinė genetinės svarbos reikšmė, palyginti su aplinkos veiksniais, lemiančiais šiuos specifinius kladems būdingus Synechococcus gausos pokyčius, yra menkai suprantama, tačiau tikėtina, kad abu vaidina svarbų vaidmenį.

Buvo ištirtas tinkamas laiko duomenų rinkinys iš temperatūros, druskingumo ir nitratų, fosfato, silikato ir amoniako koncentracijos SIO prieplaukoje, kad būtų ištirtas galimas poveikis aplinkai iš apačios į viršų, sukeliantis Synechococcus clade dinamiką. Deja, nė vienas iš jų nebuvo reikšmingai koreliuojantis su kladei būdingu gausumu (papildoma S2 lentelė). Tačiau tai nereiškia, kad „iš apačios į viršų“ poveikis yra nereikšmingi veiksniai, lemiantys Synechococcus gausumą ar įvairovę. Kitos neišmatuotos maistinės medžiagos gali turėti didelę įtaką Synechococcus dinamikai. Įrodyta, kad sinechokokas naudoja karbamidą kaip azoto šaltinį (Collier ir kt., 1999), o kitos organinės maistinės medžiagos yra svarbios jų išgyvenimui (Moore ir kt., 2002, 2005; Zubkov ir kt., 2003; Bronk ir kt.)., 2007). Mikroelementai taip pat gali vaidinti reikšmingą vaidmenį (Hutchins ir kt., 1999; Leao ir kt., 2007; Dupont ir kt., 2008).

Poveikis aplinkai Synechococcus populiacijose taip pat nėra gerai suprantamas. Didelė įvairovė tiek pirmuonių ganytojų (Caron ir kt., 1991; Strom, 1991; Christaki ir kt., 1999, 2002; Guillou ir kt., 2001; Jeong ir kt., 2005) ir virusų (Suttle and Chan, 1993). ; Waterbury ir Valois, 1993; Wilson ir kt., 1993) buvo nustatyta, kad jie grobia Synechococcus . Šie mirštamumo veiksniai gali būti dominuojantis veiksnys, reguliuojantis bendrą Synechococcus gausumą (žr., Pvz., Baudoux ir kt., 2007), tačiau jų bendra įvairovė, specifiškumas Synechococcus tipams ir poveikis selektyviems agentams išlieka nežinomi.

Genetinė informacija kartu su biogeografiniais duomenimis suteikia dar vieną pagrindą suprasti veiksnius, lemiančius I ir IV kladų dominavimą pakrančių aplinkoje ir jų sambūvį. I ir IV kladų kultūrinių atstovų genomo sekos yra prieinamos (Palenik ir kt., 2006; Dufresne ir kt., 2008), taip pat sekos, gautos iš kelių kitų kladų atstovų (Palenik et al., 2003), turinčios tvirtą genetinės genetikos stuburą. informacija apie šį mikrobų taksoną.

Iš „California Current“ izoliuoto I klado atstovas CC9311 turi genomą su padidėjusiais jutimo ir atsaką reguliuojančiais genais, mažiau fosfatų šalinimo genų, didesne metalų transportavimo ir naudojimo geba ir daugiau genų, susijusių su organinių maistinių medžiagų naudojimu, nei atvira vandenyno padermė. (Palenik ir kt., 2006). Šie genai gali būti gyvybiškai svarbūs pakrantės vietose, kur yra daugiau maistinių medžiagų ir kintamesnė, dinamiškesnė aplinka, palyginti su oligotrofine.

Taip pat buvo sekvuoti dviejų IV klade išskiriamų izoliatų, CC9902 ir BL107, genomai. Šios padermės turi mažiau sensorinės histidino kinazės ir reakciją reguliuojančių genų nei CC9311 ir galėtų parodyti „specialisto“ gyvenimo būdą (Dufresne ir kt., 2008). CC9902 ir BL107 genomai yra maždaug 0, 38 ir 0, 33 Mb mažesni nei atitinkamai CC9311 ir turi mažiau kladei būdingų genų. Esant didesniam genetiniam repertuarui, I klade tipai gali būti įvairesni arba „oportunistai“ (Dufresne ir kt., 2008). Pavyzdžiui, CC9311 turi genus, galinčius pernešti geležį (II) arba halogenuojančius junginius per vanadį priklausančią bromoperoksidazę (Palenik ir kt., 2006), tačiau neatlikus konkretesnių fiziologinių tyrimų, genetinės sudėties ir nišos adaptacijos koreliacijos išlieka hipotetinės.

Ryšius tarp genetinės sudėties ir ekologinės nišos dar labiau apsunkina didžiulė genetinė įvairovė, egzistuojanti Synechococcus kloduose. Ištyrus įvairovę, užfiksuotą mūsų rpoC1 klonų bibliotekoje, Synechococcus , kurie dominavo aplinkoje, sugrupuoti atskirai nuo kultūringų atstovų (6 pav.). Be to, kaip ir kituose mikrobų taksonuose (Medini ir kt., 2005; Tettelin ir kt., 2005; Kettler ir kt., 2007), Synechococcus genomuose yra daugiausia konservuoti branduoliai, tačiau egzistuoja daug labai kintančių regionų, kuriuose yra genų, kurių įvairovė funkcijų, greičiausiai horizontalių genų perdavimo įvykių, galinčių turėti reikšmės jų fiziologijai ir ekologinei nišai, rezultatas (Palenik ir kt., 2009).

Retkarčiais pasireiškia Synechococcus iš II ir III klotų

Dviejų mažesnių kladelių, II ir III klotų, buvimas šioje pakrančių aplinkoje gali labiau atspindėti fizinius okeanografinius modelius. Jų atsiradimas vasaros pabaigoje sutampa su stipraus stratifikacijos laikotarpiais (Palacios ir kt., 2004). Stratifikacija mažina šaltesnių, druskingesnių ir maistinių medžiagų turinčių vandenų patekimą iš apačios, todėl paviršiniai vandenys išeikvoja maistines medžiagas. Rudenį ir žiemą stratifikacija yra silpnesnė, tačiau Pietų Kalifornijos įlankos pakrantės regionuose tęstinis srautas šiaurės kryptimi yra priešakinis srovė, priešingai nei srautas į pietus, vyraujantis visais kitais metų laikais (Hickey, 1979; Lynn ir Simpson, 1987; Di Lorenzo, 2003). Į šiaurę tekančių vandenų šaltinis yra šiaurės Ramiojo vandenyno rytinės dalies gretimoji rytinė ribinė srovė „California Current“, kuri pasuko į krantą į pietus nuo JAV ir Meksikos sienos, paskui dalijasi ir šiaurę paverčia pietine Kalifornijos įlanka, nes pakrantės prieš srovę ir į pietus išilgai Baja Kalifornijos (Hickey, 1979; Lynn ir Simpson, 1987). Šis srautas šiaurės kryptimi į krantą atneša daugiau oligotrofinių, maistinių medžiagų turinčių vandenų ir gali pritraukti Synechococcus iš II ir III klotų, kurie yra palyginti gausūs atviroje jūroje, link kranto (Ferris ir Palenik, 1998; Toledo ir Palenik, 2003). Nors mūsų mėginių ėmimo vieta yra pakrantės šelfe, šiai teritorijai įtakos turi šios pagrindinės cirkuliacijos tendencijos, taip pat pakrančių srovės, kryžminių pakrančių potvynių ir vietinio vėjo įtampos sukeliamos srovės (Winant ir Bratkovich, 1981).

Tiek stratifikacija, tiek šiaurinė priešpriešinė srovė gali sumažinti maistinių medžiagų koncentraciją paviršiniuose vandenyse Pietų Kalifornijos įlankoje, ir šios sąlygos gali paaiškinti Synechococcus atsiradimą iš II ir III klotų SIO prieplaukoje. Tačiau nepavyko rasti reikšmingo ryšio tarp maistinių medžiagų koncentracijos ir šių gleivių gausos.

Alternatyvus paaiškinimas gali būti Synechococcus priskyrimas II kladei iš pietų. Jei II klotas yra paplitęs subtropikų / atogrąžų pakrančių aplinkoje (Zwirglmaier ir kt., 2008), tada srautas į šiaurę gali atnešti šiuos Synechococcus tipus į pietų Kaliforniją iš pietų. Šią hipotezę patvirtintų perėjimas nuo I ir IV klotų dominavimo vidutinio klimato zonose prie II kloto. Panašus Synechococcus clade dominavimo poslinkis pastebėtas Atlanto vandenyne (Zwirglmaier et al., 2007).

II ir III klotų Synechococcus stebėjimas vasaros pabaigoje ir žiemą silpnai sutampa su Prochlorococcus buvimu šioje vietoje. Prochlorococcus paprastai nėra SIO prieplaukoje pavasario mėnesiais, nors be advekcijos į šią vietą ir toliau nuo jos, jų nebuvimą taip pat gali lemti padidėjęs ganymo slėgis (Worden ir kt., 2004).

Išvada

Aplinkos mikrobų biogeografija yra pagrindinė informacija, kuri yra labai svarbi norint suprasti jų evoliuciją, pritaikomumą ir funkcijas jų atitinkamose ekosistemose (Ramette ir Tiedje, 2007). Be to, kadangi „ Synechococcus“ yra pagrindiniai pirminės produkcijos veikėjai , jų biogeografija ir genetiniai bei aplinkos veiksniai, turintys įtakos gyventojų sudėčiai, turi didelę reikšmę suprantant anglies ciklą ir kitus globaliai svarbius biogeocheminius procesus. Naudodami qPCR, mes pateikėme svarbų įrankį Synechococcus biogeografijos, ekologijos ir evoliucijos tyrinėjimui. Nors keturių visame pasaulyje paskirstytų Synechococcus klodų laiko dinamikai įvertinti panaudojome qPCR, šį metodą galima pritaikyti bet kurioje erdvinių ir laiko imčių skalėje. Naudojant šias priemones, svarbiausia yra išsiaiškinti, kokiu mastu vyksta adaptacija ir kokią įtaką daro genetinė įvairovė, ir informuoti mus apie jų ekologines nišas.

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • FJ790799 – FJ790819

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildoma S1 lentelė

  3. 3.

    Papildoma S2 lentelė

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „ISME Journal“ svetainėje (//www.nature.com/ismej)