Tgf-β1 poveikis sukelia epitelinį ir mezenchiminį perėjimą tiek a549 ląstelių linijos cscs, tiek ne cscs, todėl padidėja cd133 + a549 ląstelių frakcijos migracijos galimybės | ląstelių mirtis ir liga

Tgf-β1 poveikis sukelia epitelinį ir mezenchiminį perėjimą tiek a549 ląstelių linijos cscs, tiek ne cscs, todėl padidėja cd133 + a549 ląstelių frakcijos migracijos galimybės | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Vėžinės kamieninės ląstelės
  • Epitelinis – mezenchiminis perėjimas
  • Metastazės
  • Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys

Anotacija

Metastazės yra pagrindinė mirties nuo vėžio priežastis. Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys (NSCLC) sudaro beveik 85% pirminių piktybinių plaučių navikų. Naujausi tyrimai parodė, kad epitelio ir mezenchiminis perėjimas (EMT) vaidina pagrindinį vaidmenį ankstyvame vėžio ląstelių metastazių procese. Transformuojantis augimo faktorius β 1 (TGF- β 1) yra pagrindinis EMT induktorius. Šio tyrimo tikslas yra ištirti TGF- β 1 poveikį vėžinėms kamieninėms ląstelėms (CSC), kurios yra nurodytos kaip ląstelės, teigiamos CD133, šoninės populiacijos (SP), ir ne vėžinės kamieninės ląstelės (ne CSC), nurodytos kaip ląstelės, neigiamos CD133, ir SP A549 ląstelių linijoje. Mes parodėme, kad TGF- β1 sukelia EMT tiek CSC, tiek ne CSC A549 pogrupiuose, iš naujo reguliuodamas mezenchiminių žymenų, tokių kaip vimentinas ir šliužas, raišką ir žemindamas epitelio žymenų, tokių kaip e-kadherinas ir citokeratinai, lygį. CSC ir ne CSC A549 subliniai, kuriems atliekama EMT, rodo stiprią migraciją ir stiprų MMP9 lygį, išskyrus CD133 - ląstelių frakciją. OCT4 lygis yra stipriai padidintas visose ląstelių frakcijose, išskyrus CD133 - ląsteles. Priešingai, žaizdos dydis rodo, kad TGF- β1 padidina laukinio A549, taip pat CD133 + ir SP + ląstelių judrumą. CD133 ir SP ląstelių TGF- β 1 poveikis nepakeičia judrumo. Galiausiai, įvertinus augimo kinetiką, paaiškėja didelis kolonijų formavimo efektyvumas CD133 + A549 ląstelėse. Visų pirma, SP + ir SP - A549 ląstelės turi didesnį efektyvumą formuodamos kolonijas nei neapdorotos atitinkamos ląstelės, tuo tarpu CD133 - ląstelėse po TGF- β1 ekspozicijos nebuvo stebimas kolonijų skaičiaus pokytis. Darome išvadą, kad galima išskirti skirtingas ląstelių subpopuliacijas, turinčias skirtingo laipsnio stiebus. Atrodo, kad kiekviena populiacija yra susijusi su skirtingais biologiniais mechanizmais, tokiais kaip stiebo palaikymas, tumorigeniškumas, invazija ir migracija.

Pagrindinis

Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys (NSCLC) sudaro beveik 85% pirminių piktybinių plaučių navikų1 ir yra pagrindinė mirčių nuo vėžio priežastis visame pasaulyje. 2 Nepaisant to, kad patobulinti diagnostiniai metodai gali būti naudingi, maždaug 50% pacientų, sergančių NSŠKL, yra pažengusi liga. 3 Be to, dauguma vėžiu sergančių pacientų miršta nuo metastazių, o ne nuo pirminių navikų.

Metastazavusio sklaidos procesas vis dar menkai suprantamas dėl jo sudėtingumo. Tai apima daugybę žingsnių: vietinė vėžio ląstelių invazija į aplinkinius audinius, pernešimas per limfos ir kraujo sistemų mikrovaskuliarus, translokacija, daugiausia per kraują, į tolimų audinių mikrodangalus, išėjimas iš kraujotakos, išgyvenimas ir adaptacija tolimoji mikroaplinka ir galiausiai antrinio naviko formavimasis. 5, 6, 7

Naujausi tyrimai parodė, kad epitelio ir mezenchiminis perėjimas (EMT) vaidina pagrindinį vaidmenį ankstyvame vėžio ląstelių metastazių procese. 4, 5 EMT yra procesas, kurio metu ląstelės morfologiškai keičiasi iš epitelio poliarizuoto fenotipo į labai judrų fibroblastinį arba mezenchiminį fenotipą. EMT procese epitelio ląstelės praranda savo ypatybes, įgyja mezenchimines savybes ir tampa judrios ir invazinės. 4 Transformuojantis augimo faktorius β (TGF- β ) dalyvauja daugelyje biologinių procesų, įskaitant embriogenezę, žaizdų gijimą, ląstelių proliferaciją, diferenciaciją, apoptozės kontrolę ir EMT. 5, 8, 9, 10

Vėžyje TGF- β veikia kaip naviko slopintuvas ankstyvose navikogenezės stadijose, slopindamas ląstelių augimą ir sukeldamas ląstelių apoptozę. Atvirkščiai, vėlesniuose naviko progresavimo etapuose jis veikia kaip naviko promotorius, nes naviko ląstelės praranda savo sugebėjimą sustabdyti augimą TGF- β , atliekant EMT, o tai koreliuoja su didėjančia invaziškumu ir metastazėmis. 11

Vėžinės kamieninės ląstelės (CSC) buvo apibrėžtos kaip naviko ląstelės, turinčios gebėjimą savarankiškai atsinaujinti ir sukelti heterogenines vėžio ląstelių, turinčių naviką, linijas. 12 Šios dvi galutinės biologinės savybės daro CSC pagrindiniu kandidatu pradėti atkrytį. Šios ląstelės išreiškia kamienų žymenis, gali sudaryti plūduriuojančias sferas terpėje, kurioje nėra serumo - savybę, susijusią su kamieninėmis ląstelėmis, ir taip pat geba diferencijuoti esant nukrypstančiam ląstelės fenotipui, sudarančiam naviko heterogeniškumą. 13 Eksperimentiniu būdu ši populiacija identifikuojama pagal jos gebėjimą implantus, kurių imunodeficitas yra šeimininkas, sudaryti naujus navikus, atkuriant naviko heterogeniškumą. 14 Yra trys skirtingos ir pagrindinės CSC išskyrimo iš kietų navikų metodikos: (i) CSC išskyrimas srauto citometrija pagal CSC specifinius ląstelių paviršiaus žymenis, tokius kaip CD133 15, 16 ; (ii) šoninių gyventojų (SP) fenotipo nustatymas pagal Hoechst33342 išskyrimą 17 ; iii) rutulio formavimas auginant apibrėžtą terpę, kurioje nėra serumo, su augimo faktoriais, kurie palaiko CSC nediferencijuotus. 18, 19

Ankstesniame mūsų tyrime 20 įrodėme, kad TGF- β1 pakoregavo visas kamieno savybes, naudodamas EMT programą, pradedant nuo vienos pirminės plaučių vėžio ląstelių linijos, gautos mūsų laboratorijoje. TGF- β1 apdorota LC31 ląstelių linija prarado epitelio morfologiją, darant prielaidą, kad į fibroblastus panaši išvaizda, rodo vimentino, CD90, šliužo, Twist ir β- katenino padidėjusį reguliavimą ir citocheratino, e-kadherino ir CD326 reguliavimą. Ši ląstelių linija taip pat parodė Oct4, Nanog, Sox2 ir CD133, visų kamieninių genų, ekspresiją, padidėjusį pneumosferos formavimo pajėgumą ir padidėjusį naviko formavimo sugebėjimą NOD / SCID pelėms.

Tačiau tiek mūsų, tiek kituose tyrimuose gydymas TGF- β 1 buvo atliekamas su visa ląstelių populiacija ir buvo įvertintas jo poveikis. Daugeliu atvejų, kaip minėta pirmiau, tai padidino stiebų savybes ir migracijos potencialą. Įdomu tai, kad reikėjo suprasti ir įvertinti, kokia ląstelių populiacija yra nukreipta iš TGF- β 1. Todėl mes išrūšiavome A549 plaučių vėžio ląstelių liniją CD133, CSC žymeklį plaučių vėžiui ir SP profilį. Tada mes apdorojome ląstelių frakcijas, surūšiuotas pagal TGF- β 1, ištyrę jų poveikį tiek CSC, identifikuotiems kaip teigiamas CD133 ir SP ląstelėms, tiek ne vėžinėms kamieninėms ląstelėms (ne CSC), identifikuotoms kaip ląstelės, neigiamos CD133 ir SP A549 ląstelių linijoje. Mes sutelkėme dėmesį į EMT ir migracijos galimybes.

Rezultatai

Srauto citometrija ir SP analizė

Norėdami atskirti CSC ir ne CSC, pradedant nuo A549 ląstelių linijos, mes suskirstėme pagal CD133 ekspresiją ir SP fenotipą. Mes nustatėme, kad vidutinis CD133 ekspresijos lygis buvo apie 4% (1a pav.). SP ląstelių buvimas A549 ląstelių linijoje buvo tiriamas dažant ląsteles Hoechst 33342, kad būtų sukurtas Hoechst mėlynai raudonas profilis. Remdamiesi „Hoechst 33342“ etikečių variantais, mes išskyrėme stipriausias dažų ištekėjimo ląsteles kaip SP ląsteles, kurios buvo apatiniame kairiajame FACS profilio kvadrante. Kaip kontrolė, buvo pridėta ATP rišančios kasetės (ABC) transporterio inhibitoriaus verapamilio, siekiant sumažinti Hoechst 33342. gebėjimą išskirti iš jo. A549 ląstelėse buvo aptiktos SP ląstelės, kurių vidutinis procentas sudarė apie 15% visos ląstelių populiacijos, o SP ląstelių frakcija buvo pašalinta, kai buvo verapamilis (1b pav.).

Image

Citometrinės CD133 ekspresijos ir šoninės populiacijos profilio analizės. a ) CD133 raiškos lygis buvo ∼ 3, 9%. Išrūšiuotų CD133 populiacijų grynumas buvo įprastas 90%. b ) A549 ląstelėse buvo aptiktos SP ląstelės, turinčios apie 12, 3% visos ląstelių populiacijos, ir SP ląstelių frakcija buvo pašalinta, jei buvo verapamilis. Išrūšiuotų populiacijų grynumas šoninėms populiacijoms buvo įprastas 90%

Visas dydis

Išrūšiuotų populiacijų grynumas buvo įprastas 90% (1a ir b pav.), O surūšiuotos CD133 ir SP ląstelės buvo naudojamos TGF- β 1 gydymo tyrimui, RT-PGR, imunofluorescencijos ir in vitro migracijos tyrimams.

TGF- β 1 skatina morfologinius pokyčius tiek CSC, tiek ne CSC

Norėdami įvertinti TGF- β1 poveikį laukinio tipo (WT), CD133 +, CD133 -, SP + ir SP - A549 ląstelėms, 48 ​​valandas jas apdorojome 2 ng / ml TGF- β1 . Kaip mes jau pademonstravome, 15 WT A549 ląstelių, gydytų TGF- β 1, prarado epitelio morfologiją po 48 valandų gydymo; jie išsisklaidė ir įgavo panašų į fibroblastą ilgą formą ir centrinį branduolį. Tas pats pokytis buvo pastebėtas visuose mėginiuose, surūšiuotuose jau po 48 valandų gydymo nepriklausomai nuo stiebo. Taip pat šiuo atveju ląstelės prarado epitelio morfologiją ir įgijo mezenchiminius bruožus, turinčius panašų į fibroblastą pavidalą (2 pav.).

Image

Šviesos mikroskopo analizė. Tiek WT, tiek išrūšiuotas A549 rodė morfologinius pokyčius pailgintose, į fibroblastus panašiose ląstelėse po gydymo TGF- β1 . Originalus padidinimas: × 100

Visas dydis

TGF- β 1 skatina EMT CSC ir ne CSC

Morfologinis TGF- β1 poveikis WT A549 ir ​​išrūšiuotoms ląstelių linijoms leido manyti, kad TGF- β1 skatina EMT. Išskirtinius ląstelių, kurioms atliekama EMT, morfologinius pokyčius lydi išraiškos pokytis iš epitelio į mezenchiminį repertuarą. Norėdami nustatyti, ar TGF- β1 sukėlė tokį poslinkį, mes panaudojome imunofluorescenciją ir RT-PGR, norėdami ištirti vimentino, e-kadherino, citokeratinų ir šliužo raišką ir pasiskirstymą. Atliekant imunofluorescencijos testą, prieš gydymą ir po jo, vimentinas buvo išreikštas tiek WT A549, tiek A549, skirstant juos pagal 100% teigiamumą. Įdomu tai, kad tai buvo vimentino platinimas. Visose neapdorotose išrūšiuotose ir nerūšiuotose ląstelėse vimentino buvo perinuklearinėse pūslelėse. Po apdorojimo vimentinas buvo tolygiai paskirstytas, kad susidarytų tarpiniai citoskeleto siūlai, taip pat nurodydami ląstelių fibroblastinę formą. Tiek CSC, tiek ne CSC, šis žymenų pasiskirstymas buvo aptinkamas (3 paveikslas). Kalbant apie citokeratino ekspresiją, prieš gydymą jis buvo silpnai ekspresuojamas visose ląstelių frakcijose. Visų pirma, visuose tirtuose mėginiuose citokeratinai buvo lokalizuoti iš dalies perinuklearinėse pūslelėse ir iš dalies, kad susidarytų ląstelių citoskeleto gijos. Po gydymo visos ląstelių frakcijos tapo neigiamos šiam epitelio žymeniui.

Image

Su EMT susijusių baltymų imunofluorescencinės analizės. Tiek WT, tiek išrūšiuotas A549 parodė vimentino padidėjimą ir kartu ketokeratinų sumažėjimą po gydymo TGF- β1 . Originalus padidinimas: × 100

Visas dydis

RT-PGR duomenys parodė vimentino padidėjusį reguliavimą ir sumažėjusį e-kadherino reguliavimą tiek apdorotose WT A549 ląstelėse, tiek išrūšiuotose apdorotose ląstelėse, rodančius poslinkį nuo epitelio prie mezenchiminio fenotipo ir patvirtinantį EMT fenotipą. Visų pirma, RT-PCR analizė parodė didžiulį E-kadherino lygio sumažėjimą, daugiausia SP + A549 ląstelėse, ir stiprų Slug geno ekspresijos padidėjimą SP -, SP + ir CD133 + frakcijose. Visuose mėginiuose vimentino koncentracija šiek tiek padidėjo (4 paveikslas). RT-PGR duomenys patvirtino rezultatus, gautus atliekant vimentino imunofluorescenciją, ir, apibendrinant, stebėjimas per šviesos mikroskopą, imunofluorescencija ir RT-PGR analizė parodė, kad CSC ir ne CSC po EMG veikimo po TGF- β1 . Visų pirma, SP + A549 ląstelių atsakas į gydymą TGF- β 1 buvo efektyvesnis nei visų kitų išrūšiuotų ląstelių frakcijų, o CD133 - A549 ląstelės buvo tos, kurios mažiau reagavo į gydymą.

Image

RT-PGR analizė ir su EMT susijusių baltymų densitometrinis įvertinimas. Tiek WT, tiek išrūšiuotas A549 parodė vimentino ir šliužo padidėjimą, o lygiagrečiai - e-kadherino sumažėjimą po gydymo TGF- β1 . * P <0, 001, ** P <0, 0005, *** P <0, 0001, palyginti su tėvų ląstelių linija (0 gydymo diena)

Visas dydis

TGF- β1 padidina kamieno transkriptoriaus faktoriaus OCT4 lygį

Norėdami ištirti genus, reguliuojančius ir palaikančius ląstelių, turinčių EMT signalus, kamieninius fenotipus, OCT4 atlikome ir RT-PCR (5a pav.), Ir Vakarų blotinimą (5b paveikslas). Įdomu tai, kad transkripcijos faktorius OCT4, kurio, žinoma, pakanka perprogramuoti pelės ar žmogaus somatines ląsteles į nediferencijuotas, pluripotentines kamienines ląsteles, buvo žymiai padidėjęs visuose mėginiuose, gydomuose TGF- β 1, palyginti su negydytais atitinkamais kontroliniais bandiniais. Įspūdingai, OCT4 lygis buvo stipriai padidintas CD133 +, SP + ląstelėse, taip pat SP ląstelėse. CD133 ląstelėse OCT4 nepasikeitė po gydymo vaistais tiek atliekant RT-PGR, tiek Western blot analizę.

Image

OC-4 RT-PGR, densitometrijos ir Western blot analizė. ( a ) RT-PGR ir densitometrijos vertinimas parodė, kad po apdorojimo TGF- β1 padidėjo OCT4 padidėjimas visose rūšiuotose ir nerūšiuotose A549 ląstelėse, išskyrus CD133 - A549 ląsteles. ( b ) Western blot analizė parodė, kad OCT4 padidėjo visose išrūšiuotose ir nerūšiuotose A549 ląstelėse, išskyrus CD133 - A549 ląsteles, po gydymo TGF- β1 . β- aktinas naudojamas kaip apkrovos kontrolė. * P <0, 001, ** P <0, 0005, palyginti su tėvų ląstelių linija (0 gydymo diena)

Visas dydis

TGF- β 1 padidina migracijos potencialą in vitro pagal EMT programą

Kitas išskirtinis EMT požymis yra gebėjimo migruoti įgijimas. Kai buvo nustatyta, kad CSC ir ne CSC A549 buvo atliktas EMT, mes ištyrėme jų sugebėjimą migruoti po 48 valandų gydymo TGF- β 1. Rezultatai parodė, kad TGF- β1 žymiai padidino visų mėginių migraciją, palyginti su jų atitinkamais negydytais kontroliniais bandiniais, išskyrus CD133 frakciją (6a pav.). Tiesą sakant, dvi frakcijos parodė tą patį atsitiktinio migracijos procentą. Įdomu tai, kad po gydymo TGF- β 1 SP frakcija buvo tokia, kuri migravo daugiau nei visos kitos pagal padidėjimą kartų (padidėjimas 1, 72, palyginti su WT 1, 27, 1, 14, 0, 98 ir 1, 43, CD133 +, CD133 - ir Atitinkamai SP + A549 ląstelės). Tačiau palyginus visas frakcijas, apdorotas TGF- β 1, CD133 + frakcija parodė didžiulį migracijos procentą, kaip parodyta ir 1 papildomoje lentelėje.

Image

Migracijos potencialo analizė. a ) Migracijos tyrimas parodė, kad TGF- β1 žymiai padidino visų mėginių migraciją, palyginti su jų kontrole, išskyrus CD133 frakciją. ( b ) RT-PGR ir densitometrijos analizė parodė, kad MMP-9 geno ekspresijos lygis padidėjo visose rūšiuotose frakcijose, išskyrus CD133 - frakciją. CD133 + frakcija parodė aukštesnį MMP-9 geno ekspresijos lygį nei kitos frakcijos. c ) MMP-9 Western blot analizė patvirtino RT-PGR rezultatus. β- aktinas naudojamas kaip apkrovos kontrolė. ** P <0, 0005, *** P <0, 0001, palyginti su tėvų ląstelių linija (0 gydymo diena)

Visas dydis

Galiausiai, norėdami ištirti galimybę pažeisti tarpląstelinę matricą, mes taip pat atlikome MMP-9 lygio analizę RT-PGR pagalba. Atrodė, kad šie duomenys patvirtina migracijos tyrimo rezultatus. MMP-9 geno ekspresijos lygis padidėjo visose rūšiuotose frakcijose, išskyrus CD133 - frakciją, kurios lygis buvo šiek tiek sumažėjęs, palyginti su neapdorota atitinkama kontrole. Be to, įdomu, kad CD133 + frakcija parodė aukštesnį MMP-9 geno ekspresijos lygį nei kitos frakcijos (6b paveikslas). Norėdami patvirtinti duomenis, gautus naudojant RT-PGR, mes analizavome baltymų ekspresijos lygius Western blot analize. Kaip parodyta 6c paveiksle, MMP-9 ekspresija buvo sureguliuota visose frakcijose, apdorotose TGF- β1, išskyrus frakciją CD133. Ląstelių subpopuliacija, rodanti aukštesnį metaloprotezių kiekį, buvo pavaizduota kaip CD133 + ; Taigi galima daryti išvadą, kad būtent frakcija geriausiai reaguoja į gydymą TGF- β1 .

Todėl, nors visos frakcijos buvo tiriamos EMT, atsižvelgiant į migraciją, rezultatai yra skirtingi, o padidėjęs gebėjimas migruoti pastebimas visų išrūšiuotų mėginių, išskyrus CD133, frakcijai.

TGF- β 1 padidina judrumo potencialą in vitro pagal EMT programą

Žaizdų gijimo tyrimas buvo naudojamas A549 frakcijų, dar vienos EMT charakteristikos, judrumui matuoti. Kaip parodyta 7 paveiksle, žaizdos dydžio analizė, atlikta per 24, 48, 72 ir 96 valandas po 48 valandų gydymo TGF- β 1, parodė, kad TGF- β1 padidino judrumą WT A549, taip pat CD133 + ir SP + ląstelėse. palyginti su neapdorotais atitinkamais kontroliniais preparatais. Šiame kontekste CD133 + ląstelės rodė didesnį judrumą nei kitų ląstelių frakcijos. CD133 ir SP ląstelių TGF- β 1 poveikis nepakeitė judrumo.

Image

Žaizdų gijimo analizė. Žaizdų dydžio analizė, atlikta 24, 48, 72 ir 96 val., Po gydymo TGF- β1 , parodė, kad TGF- β1 padidino WT A549, taip pat CD133 + ir SP + ląstelių judrumą, palyginti su negydytais kontroliniais preparatais. CD133 + ląstelės rodė didesnį judrumą nei kitų ląstelių frakcijos. CD133 ir SP ląstelių TGF- β 1 poveikis nepakeitė judrumo

Visas dydis

TGF- β1 padidina tumorigeninio poveikio in vitro potencialą

Vienas navikogeninio potencialo analizės metodas yra minkšto agaro tyrimas, kuriuo matuojamas nuo tvirtinimo vietos nepriklausomas augimas, kuris yra ląstelių virsmo rodiklis. Kaip pranešta 8 paveiksle, augimo kinetikos įvertinimas atskleidė didelį kolonijų formavimo efektyvumą CD133 + A549 ląstelėse, palyginti tiek su neapdorotomis atitinkamomis ląstelėmis, tiek su visomis ląstelių frakcijomis, išrūšiuotomis, neapdorotomis ir apdorotomis (8 paveikslas). Visų pirma, SP + ir SP - A549 ląstelės sudarė didesnį efektyvumą formuodamos kolonijas nei neapdorotos atitinkamos ląstelės, o vidutinis raukšlės padidėjimas buvo atitinkamai 1, 1 ir 1, 0. CD133 ląstelėms, priešingai, nebuvo pastebėtas kolonijų skaičiaus pokytis po TGF- β 1 ekspozicijos. Kai minkštame agare atrodė 1000 ląstelių, buvo galima pastebėti stiprų kolonijų susidarymo sumažėjimą po gydymo TGF- β1 .

Image

Minkšto agaro analizė. Kolonijų augimo kinetika atskleidė didelį kolonijų formavimo efektyvumą CD133 + A549 ląstelėse, palyginti tiek su negydytomis ląstelėmis, tiek su visomis rūšiuojamomis ląstelių frakcijomis. SP + ir SP - A549 ląstelės sudarė didesnį efektyvumą formuodamos kolonijas nei neapdorotos ląstelės. Po TGF- β1 ekspozicijos CD133 ląstelėse kolonijų skaičiaus pokyčių nepastebėta

Visas dydis

Diskusija

Naviko progresavimas link metastazių yra daugiapakopis procesas, kurio metu piktybinės ląstelės plinta iš kilmės naviko ir kolonizuoja tolimus organus. 21, 22, 23 Vėliau atsirandančių metastazių prevencija perėjo į klinikinio dėmesio centrą. Genai, kurie leidžia transformuotoms ląstelėms įsibrauti į aplinkinius audinius ir pritraukti palaikomąją stromą, taip pat palengvina vėžio ląstelių išsisklaidymą ir tikriausiai tęsia tai po to, kai vėžio ląstelės įsiskverbia į tolimus audinius. Genus, kurie lemia šią veiklą, galima apibrėžti kaip metastazių inicijavimo genus. Šie genai gali skatinti ląstelių judrumą, EMT, tarpląstelinės matricos skilimą, kaulų čiulpų progenitorių mobilizaciją, angiogenezę ar imuninės sistemos vengimą. EMT tarpininkauja vystymosi programos, kurias kontroliuoja nenormaliai reguliuojami transkripcijos veiksniai, tokie kaip TWiST1, SNAi1 ir SNAi2 (taip pat žinomi kaip SluG), ir apibūdinama kaip poliarizuotų epitelio ląstelių perėjimas į migruojančias mezenchimines ląsteles. EMT rodo ląstelių morfologijos, ląstelių elgsenos ir su EMT susijusių baltymų žymenų raiškos pokyčiai. Visų pirma, E-kadherino lygio sumažėjimas yra laikomas EMT požymiu. 24, 25, 26 Kartu su epitelio žymenų, tokių kaip E-kadherinas, praradimu, ląstelės, kurioms taikoma EMT, įgyja mezenchiminius žymenis, tokius kaip vimentinas ir fibronektinas. 27 Naujausi tyrimai pateikia įrodymų, kad EMT įvairiose ląstelių linijose, įskaitant A549 ląsteles, gali būti sukeltas in vitro . 28, 29, 30

Sutikdami su ankstesniais pranešimais, 31, 32, mes parodėme, kad A549 ląstelių linijai buvo atliktas EMT, reaguojant į TGF- β 1 stimuliaciją. Po gydymo TGF- β1 akivaizdžiai pasikeitė morfologija, išsisklaidžius ląstelėms, sumažėjo citokeratinų ir e-kadherino kiekis, padidėjo šliužas ir vimentinas. Naujausi tyrimai ( 33 ir ankstesni dokumentai) 20 parodė, kad TGF- β1 reguliavo tiek stiebo charakteristikas, tiek migraciją. Šiuose straipsniuose 20, 31, 32, 33 TGF- β 1 buvo apdoroti visai ląstelių populiacijai. Patvirtinę, kad A549 ląstelių linijai buvo atliktas EMT, mes ištyrėme TGF- β 1 vaidmenį skirtingose ​​ląstelių populiacijose pagal kamieno fenotipą, kad nustatytume ląstelių pogrupį, reaguojantį į TGF- β 1 gydymą. Klausimai, į kuriuos bandome atsakyti šiame rankraštyje, yra šie: ar TGF- β 1 veikia be išlygų visose ląstelių populiacijose ar tik konkrečiose ląstelių populiacijose? Jei tiesa, kad TGF- β1 padidina ir stiebo, ir migracijos charakteristikas, ar TGF- β 1 stiprina CSC ir (arba) taip pat skatina ne CSC turėti daugiau stiebo ir migrantų?

Šiuo tikslu išrūšiavome A549 ląstelių liniją CD133 žymeniui ir SP fenotipui, gaudami CSC sublinkius su CD133 + ir SP + profiliu, o ne CSC sublinkius - su CD133 ir SP profiliais. Po gydymo TGF- β1 , tiek CSC, tiek ne CSC pogrupiai tapo pailgesni ir turėjo spindžio formos, į fibroblastus panašų fenotipą, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis, padidėjus vimentinui ir šliužui, kartu sumažėjus citokeratinams ir e-kadherinui. . Todėl pirmoji svarbi išvada yra ta, kad tiek CSC, tiek ne CSC A549 sublinkams buvo atliktas visas EMT.

EMT gali prisidėti prie didesnio naviko ląstelių judrumo ir didesnės migracijos. Migracija ir judrumas yra skirtingi metastazių etapai. Jau Maeda ir kt. parodė, kad TGF- β 1 sukeltas N-kadherino reguliavimas yra būtinas norint padidinti ląstelių judrumą, 34 ir kad sumažėjęs E-kadherino reguliavimas gali numatyti invaziją ir metastazę daugelyje karcinomos formų, įskaitant invazinę latakų krūties karcinomą, 35 stemplės adenokarcinomą. 36 ir skrandžio adenokarcinoma. 37 Savo tyrime pastebėjome, kad įdomiai ir stebėtinai, SP - A549 ląstelės pasižymėjo stipresne migracija, palyginti su raukšlių padidėjimu, nei kitos rūšiuojamos ląstelių frakcijos, nors po TGF- β 1 gydymo jose nebuvo pastebėti judrumo pokyčiai. CD133 + A549 ląstelės parodė didelį migracijos ir judrumo efektyvumą, palyginti su atitinkamomis neapdorotomis ląstelėmis ir kitomis išrūšiuotomis frakcijomis, tuo tarpu SP + ląstelės buvo mažiau migruojančios, palyginti su visomis rūšiuojamomis ir nerūšiuotomis ląstelėmis, nors atrodė, kad jos rodo didesnį judrumą nei neapdorota kontrolė. CD133 - A549 potipis neparodė nei migracijos potencialo, nei judrumo galimybių, palyginti tiek su atitinkamomis neapdorotomis ląstelėmis, tiek su kitomis rūšiuojamomis ląstelių frakcijomis. MMP9 yra matricos metaloproteinazė, dalyvaujanti tarpląstelinės matricos skilime, ir, esant plaučių vėžiui, dėl angiogeninių savybių ji skatina auglio augimą ir metastazes. 38 MMP9 pasiskirstymas atspindėjo migracijos ir judrumo duomenis. Atsižvelgiant į tai, mes padarome išvadą dėl metastazių proceso, kad, nors ir patiriamas EMT, CD133 ląstelių pogrupis nesugeba migruoti, judėti ir ardyti ECM, kaip mes tikėjomės, nes nėra kamieninės. CD133 + pogrupis rodo labai aukštą bazinį migracijos procentą, nors TGF- β1 poveikis jo stipriai nepadidina. Priešingai, kalbant apie padidėjimą kartų, SP sub - potekstė yra labiau migrantė, palyginti su kitomis, nors ji nejuda, kaip spėjama 2 papildomoje lentelėje. Tai atrodo prieštaringai vertinamas biologinis elgesys, tačiau judrumas ir migracija yra dvi skirtingos. mechanizmai, kurie patiria skirtingus metastazių etapus ir kurie ne visada yra tiesiogiai proporcingi. Greičiausiai TGF- β 1 dirgiklis, nors ir sukeltas EMT, būtų nepakankamas norint nustatyti SP sublinio judesių charakteristikas.

Galėtume kelti hipotezę, kad in vivo CD133 + ląstelės bus labiau linkusios skaidyti ECM, migruoti ir judėti, kaip mes tikimės būdami CSC. SP ląstelės galėtų sustiprinti CD133 + ląsteles ir suardydamos ECM, ir migracijos metu. Greičiausiai ilgesnis TGF- β 1 poveikis gali sukelti judrumo fenotipą.

Kitas EMT bruožas yra tai, kad padidėja kolonijų formavimo ir stiebų efektyvumas. Mūsų tyrime vėl buvo teigiama, kad CD133 + A549 pogrupis galėjo sudaryti kolonijas, kurių efektyvumas buvo didesnis, palyginti su kitomis ląstelių pogrupiais. Tačiau SP + ir SP - A549 pogrupiai parodė stipresnį gebėjimą formuoti kolonijas nei neapdoroti atitinkami kontroliniai preparatai, tačiau jų efektyvumas buvo mažesnis nei pogrupio CD133 + A549. Priešingai, kolonijų susidarymo efektyvumas po gydymo TGF- β 1 nepasikeitė CD133 sub - linijoje. OCT4 yra daugybinio / daugiapotencinio kamieno transkriptoriaus faktorius, dalyvaujantis palaikant daugiapotenciškumą ir daugiapotencialumą bei sudarantis kompleksą su Nanog ir Sox2. Kaip mes jau pademonstravome, TGF- β 1 sukelia tokių kamieninių faktorių padidėjimą. Šiame tyrime TGF- β1 padidino OCT4 padidėjimą visuose pogrupiuose, išskyrus CD133 - A549. Įdomu tai, kad SP - A549 potinkis, nors ir negali judėti, parodė OCT4 padidėjusį reguliavimą, nurodydamas, kad TGF- β1 indukuoja kamienines savybes ląstelėse, kurios iš esmės nėra kamieninės. Dar kartą sakoma, kad TGF- β1 neturi jokio poveikio CD133 ląstelėms, kaip spėjama 2 papildomoje lentelėje. Šiuo atveju greičiausiai ši subpopuliacija atspindi diferencijuotas naviko ląsteles, jei apibūdina naviką pagal dydį, o ne pagal metastazes. arba invazija. Be to, TGF- β1 skatina ir kolonijų susidarymo, ir OCT4 reguliavimą SP ląstelėse, nors jos nėra kamieninės.

Apibendrinant, mes parodėme, kad CSC ir ne CSC A549 ląstelių subpozicija TGF- β 1 sąlygojo EMT, pasižymintį ląstelių morfologijos pokyčiais ir su EMT susijusių baltymų žymenų išraiška. Įdomu tai, kad TGF- β 1 skatina migraciją ir judrumą CD133 + ląstelių pogrupyje, o ne CD133 - arba SP + ląstelių pogrupyje. SP - ląstelių pogrupyje jis skatina stiprią migraciją, gebėjimą formuoti kolonijas ir raumenų ekspresiją OCT4.

Todėl mes hipotezuojame, kad TGF- β 1 veikia tiek CSC, tiek ne CSC. Brabletzas ir kt. 39 pasiūlė, kad egzistuoja dvi CSC populiacijos: (i) stacionarus CSC subpopuliacija ir (ii) migruojantis CSC populiacija. Mobilieji CSC daugiausia yra naviko ir šeimininko sąsajoje ir yra gaunami iš nejudančių CSC įsigyjant laikiną EMT fenotipą, o ne kamieninius. Šį modelį papildomai remia EMT žymenų išraiška pieno liaukos karcinomos CSC ir, kita vertus, kamieninių ląstelių žymenų aktyvacija EMT sukeltose pieno epitelio ląstelėse. 40 Todėl mes hipotezuojame, kad ląstelės, ekspresuojančios CD133, gali būti tikra migrantų populiacija plaučių adenokarcinomos atvejais, o SP + ląstelės gali būti laikomos stacionariomis CSC subpopuliacijomis. Be to, TGF- β1 sukelia SP - ląstelių, kurios migruoja, sudaro kolonijas ir ekspresuoja OCT4, funkcinius pokyčius - visus stiebo žymenis, nors jie nepasižymėjo judrumu. Mes hipotezuojame, kad ši ląstelių frakcija tam tikromis sąlygomis gali parodyti potencialų kamieninį pogrupį, kurį navikai naudoja kaip kamieninių ląstelių rezervuarą.

Apibendrinant galima manyti, kad galima išskirti skirtingas ląstelių subpopuliacijas su skirtingais kamienų laipsniais. Atrodo, kad kiekviena populiacija yra susijusi su skirtingais biologiniais mechanizmais, tokiais kaip stiebo palaikymas, tumorigeniškumas, invazija ir migracija.

Norint atskleisti ląstelių invazijos mechanizmą EMT procese, reikia atlikti papildomus tyrimus, kurie gali pateikti naujus terapinius taikinius ir strategijas vėžio invazijai ir metastazėms.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

  2. 2.

    2 papildoma lentelė

Žodynas

NSCLC

nesmulkialąstelinis plaučių vėžys

EMT

epitelio ir mezenchiminio transformacija

CSC

vėžio kamieninės ląstelės

TGF- β 1

transformuojantis augimo faktorius β 1

ABC

ATP rišančioji kasetė

WT

laukinis tipas

SP

šoninių gyventojų

Papildoma informacija pridedama prie šio pranešimo ląstelių mirties ir ligų svetainėje (//www.nature.com/cddis)