Terapinė imuninio komplekso sukelto glomerulonefrito blokada labai selektyviai slopinant brutono tirozinkinazę | mokslinės ataskaitos

Terapinė imuninio komplekso sukelto glomerulonefrito blokada labai selektyviai slopinant brutono tirozinkinazę | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Imunologija
  • Inkstų ligos
  • Reumatologija

Anotacija

Vilkligės nefritas (LN) yra potencialiai pavojinga organų galūnių patologija, kuria serga 60% pacientų, sergančių vilkligė. Brutono tirozinkinazė (BTK) yra svarbi B ląstelių vystymuisi, Fc receptorių signalizavimui ir makrofagų poliarizacijai. Šiame tyrime mes ištyrėme naujo, labai selektyvaus ir stipraus BTK inhibitoriaus, BI-BTK-1, poveikį indukuojamame LN modelyje, kuriame pelės gauna nefrotoksinį serumą (NTS), kuriame yra anti-glomerulinių antikūnų. Pelės buvo gydomos kartą per parą vien tik nešikliu arba BI-BTK-1, profilaktiškai arba terapiškai. Palyginus su kontrolinėmis pelėmis, pelės, gavusios NTS ir užkrėstos pelės, profilaktiškai gydomos BI-BTK-1, parodė reikšmingai susilpnėjusią inkstų ligą, kuri priklausė nuo dozės. Gydant BI-BTK-1, sumažėjo IBA-1 + ląstelių įsiskverbimas, taip pat C3 nusėdimas inkstuose. RT-PGR ant viso inksto RNR ir serumo profiliavimas parodė, kad BTK slopinimas reikšmingai sumažino LN reikšmingus uždegiminius citokinus ir chemokinus. Inkstų RNR raiškos profiliavimas pagal RNR-seq atskleidė, kad BI-BTK-1 dramatiškai moduliuoja kelius, susijusius su uždegimu ir glomerulų pažeidimais. Svarbu tai, kad skiriant terapiškai, BI-BTK-1 panaikino nustatytą proteinuriją ir pagerino inkstų histopatologiją. Mūsų rezultatai pabrėžia svarbų BTK vaidmenį patogeninėje imuninio komplekso sukelto nefrito patogenezėje ir BTK slopinimą kaip perspektyvų terapinį LN taikinį.

Įvadas

Sisteminė raudonoji vilkligė (SLE) yra autoimuninė liga, kuriai būdingas autoantikūnų susidarymas ir sisteminis uždegimas, kuris baigiasi įvairiomis galinių organų patologijomis. Inkstų veikla, vadinama vilkligės nefritu (LN), paveikia daugiau kaip 60% ŠKL sergančių pacientų, ir dėl šios ligos padidėja sergamumas ir mirštamumas 1 .

Dabartinė vilkligės nefrito (LN) terapija daugiausia susideda iš nespecifinio imunosupresijos, kuri gali būti susijusi su pavojingu šalutiniu poveikiu, tačiau dažnai nesukelia ilgalaikės remisijos. Norint patobulinti pacientų priežiūrą ir ilgalaikę prognozę, reikia papildomų tyrimų dėl LN patogenezės ir naujų terapinių tikslų 2 .

Manoma, kad B ląstelės ir makrofagai yra svarbūs patogenuojant LN 3 . Inkstuose esantys autoantikūnų kompleksai gali suaktyvinti komplemento kaskadą ir Fc receptorius ant vietinių ir infiltruojančių ląstelių, taip sukeldami inkstų sužalojimą 4 . Be to, aktyvuoti inkstų makrofagai yra ligos pradžios ir remisijos žymenys 5, o makrofagų išeikvojimas palengvina ligą - rodo jų svarbą LN 6, 7 .

Brutono tirozinkinazė (BTK), kuri yra nereceptinių tirozinkinazių Tec šeimos narė, yra būtina tarpląsteliniam signalizavimui B ląstelėse ir mieloidinėse linijose. BTK vaidmenį signalizuojant BCR rodo pavyzdys, kad sutrikus B ląstelių vystymuisi ir funkcijoms, stebėtoms žmogaus X-sujungtos agammaglobulinemijos ir X-sujungto imunodeficito pelėms, turinčioms specifines BTK mutacijas 8, 9 . BTK taip pat reikalingas FcR signalizavimui, kuris tarpininkauja mieloidinių ląstelių tipų, tokių kaip monocitai ir makrofagai, imuninio komplekso (IC) aktyvacijai 10 . Galiausiai LN sergantiems pacientams BTK raiška yra žymiai padidinta 11 . Taigi taikymas į BTK gali būti perspektyvus terapinis taikinys LN, nes jis daro įtaką ir B ląstelių, ir makrofagų funkcijai.

Šiame tyrime mes panaudojome klasikinį eksperimentinį modelį, žinomą kaip nefrotoksinis serumo nefritas (NTN), kuris remiasi iš anksto suformuotų nefrotoksinių antikūnų pasyviu perdavimu pelėms, kad sukeltų IC medijuoto nefrito. Gautas proliferacinis glomerulonefritas pasižymi IC nusėdimu, komplemento aktyvacija ir imuninių ląstelių infiltracija. Kadangi NTN histologiniu ir mechaniniu požiūriu yra labai panašus į glomerulonefritą, kurį mato ŠKL, jis dažniausiai naudojamas kaip pavyzdys šiai raudonajai vilkligei pasireikšti 12 .

Mes ištyrėme naujo, labai selektyvaus ir stipraus BTK inhibitoriaus, BI-BTK-1 (patentų leidinys WO2014025976), vaidmenį NTN. Vykdėme profilaktinį gydymą, norėdami ištirti BTK vaidmenį antikūnų sukelto nefrito patogenezėje. Papildomi tyrimai parodė reikšmingą gydomąjį BI-BTK-1 poveikį NTN, pabrėždami BI-BTK-1, kaip gydymo būdo, gydant LN ir kitas antikūnų sukeliamas glomerulopatijas, galimybes.

Rezultatai

BI-BTK-1 yra selektyvus stiprus BTK inhibitorius

BI-BTK-1 yra stiprus mažų molekulių BTK inhibitorius (1a pav.), Sudarantis negrįžtamą kovalentinį ryšį tarp R 'esančio elektrofilo ir cisteino 481, esančio netoli kinazės domeno ATP rišamosios kišenės, kaip nustatyta bendro -kristalizavimas ir masių spektrometrija (nerodyta). Dėl negrįžtamo surišimo, BI-BTK-1 rodomas priklausomai nuo laiko (Kinact / Ki = 85 000 1 / M sek) ir stiprus (IC50 = 0, 9 nM) BTK fermentinio aktyvumo slopinimas (1 lentelė). BI-BTK-1 stipriai slopino BCR stimuliuojamą B ląstelių aktyvaciją, matuojant CD69 ekspresija pirminėse žmogaus CD19 + B ląstelėse, išskirtose iš PBMC (1b pav.) Ir viso žmogaus kraujyje (papildomas 1 pav.), Taip pat citokinų sekrecijoje. iš IC stimuliuotų žmogaus CD14 + monocitų (1c pav.). BI-BTK-1 (iki 10 μM) neturėjo jokios įtakos CD3 / CD28 stimuliuojamai T ląstelių aktyvacijai (nerodyta). BI-BTK-1 molekulinio ir ląstelinio tyrimo rezultatai yra apibendrinti 1 lentelėje. Ištyrus BI-BTK-1 kinazės selektyvumo grupėje, paaiškėjo> 80% slopinimas esant 3 μM tik 8/282 kinazėms (papildoma 1 lentelė). .

Image

( a ) BI-BTK-1 cheminė struktūra. ( b ) αIgD stimuliuota CD69 ekspresija pirminėse žmogaus CD19 + B ląstelėse, išskirtose iš PBMC. Pateiktas CD69 + ląstelių procentas, nustatytas FACS. ( c ) Anti-žmogaus serumo albumino imuninio komplekso slopinimas BI-BTK-1 skatina IL-6 (⦁), TNF (▴) ir IL-1b (▪) sekreciją žmogaus CD14 + monocituose. POC, kontrolės procentas. Kiekvienoje skydelyje ( b, c ) pateikiami vieno donoro reprezentaciniai duomenys.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

BI-BTK-1 panaikina inkstų ligą NTN

129 sv / J pelėms buvo sušvirkštas nefrotoksinis serumas, kad sukeltų antikūnų sukeltą glomerulonefritą, imituojantį spontanišką LN. Nešikliais gydomos, sergančios kontrolinės pelės (VC) pradėjo žymiai padidinti proteinurijos lygį (vertinant pagal uristix), pradedant 7-ą dieną ir piko metu 11 dieną. Tačiau pelėms, gydomoms BI-BTK-1 po 3 mg / kg, pradedant nuo kitos dienos. 4 nesukūrė proteinurijos ir niekada nebuvo reikšmingai skirtingos nei HC pelės (2a pav.). Šlapimo albuminas: kreatinino lygis, išmatuotas ELISA metodu, patvirtino šiuos duomenis (2b pav.). Be to, serumo kreatininas ir BUN buvo išmatuoti inkstų funkcijai įvertinti. Kaip matyti iš proteinurijos analizės, pelės, gydomos BI-BTK-1, buvo apsaugotos nuo inkstų funkcijos sutrikimo, pasireiškiančio VC grupėje (2c, d pav.).

Image

Proteinurijos lygis buvo matuojamas 11-ą paskutinę dieną naudojant uristix ( a ). Šlapimo albumino lygis buvo išmatuotas ELISA metodu, o po to normalizuotas iki šlapimo kreatinino lygio, kad būtų galima koreguoti šlapimo kiekį ( b ). Inkstų funkcija buvo analizuojama matuojant serumo BUN ( c ) ir kreatinino ( d ) kiekį ELISA metodu. Čia parodyti vieno eksperimento rezultatai (apdoroti BI-BTK-1, n = 8; VC, n = 8; HC, n = 5). Žvaigždutės rodo, kad VC yra statistiškai skirtingas nei kiekvienoje grupėje (* p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, **** p <0, 0001).

Visas dydis

Kadangi 3 mg / kg BI-BTK-1 užtikrino prasmingą apsaugą nuo perkeltų antikūnų nefrotoksinio poveikio, mes norėjome nustatyti įvairių šio junginio dozių poveikį. Todėl mes įgyvendinome reakciją į dozę, išbandydami 0, 3, 1, 3 ir 10 mg / kg BI-BTK-1. Kaip matyti 3 pav., BI-BTK-1 palengvino nefritą atsižvelgiant į dozę. Kaip ir pirmajame eksperimente, nuo 4 dienos skiriant 3 mg / kg BI-BTK-1, visiškai išvengta proteinurijos po nefrotoksinio poveikio ir normalizuotas galutinis šlapimo albumino: kreatinino ir BUN lygis. Panašiai veiksminga buvo ir 10 mg / kg dozė. 1 mg / kg dozė užtikrino tarpinę apsaugą, o 0, 3 mg / kg dozė buvo žymiai mažiau veiksminga. Apskritai šis eksperimentas parodė, kad optimali dozė yra 3 mg / kg, nes tai buvo mažiausias BI-BTK-1 kiekis, vis tiek užtikrinantis maksimalią funkcinę apsaugą.

Image

Proteistiurijos lygis nustatytomis dienomis buvo matuojamas uristix ( a ). Iki 11 dienos BI-BTK-1 gydytos pelės parodė, kad nuo dozės reaguoja į aukštą proteinurijos lygį, pastebėtą VC pelėse ( b ), atsižvelgiant į dozę, ir tai patvirtina šlapimo albumino / kreatinino santykis, išmatuotas ELISA paaukojimo dieną. ( c ). Inkstų funkcija taip pat išliko gydomose pelėse, įvertintose pagal BUN lygį ( d ). Čia parodyti vieno eksperimento rezultatai (10 mg / kg apdoroto BI-BTK-1, n = 8; 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; 1 mg / kg BI-BTK-1, n = 8 0, 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; VC, n = 8; HC, n = 5). Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, palyginti su VC (* p <0, 05, ** p <0, 01, **** p <0, 0001).

Visas dydis

BTK slopinimas apsaugo nuo inkstų pažeidimo

VC pelėms pasireiškė sunkus histologinis glomerulonefritas (4a pav.), Turintiems aukštą glomerulų (4d pav.) Ir kanalėlių (papildomas 2 pav.) Balus. Remiantis biocheminiais inkstų funkcijos rodikliais, inkstų histologijos rezultatai parodė reikšmingą dozės atsaką į BI-BTK-1. Pelės, gydytos BI-BTK-1, vartojant 10 mg / kg arba 3 mg / kg, parodė, kad liga praktiškai pagerėjo, o 1 mg / kg ir 0, 3 mg / kg dozės - tarpinę apsaugą (4b – e pav.; Papildomas 2 pav.) ).

Image

Skydelyje ( a ) (kairėje) rodomas reprezentatyvus inkstų histologijos vaizdas (200 ×) pelėmis, apdorotomis VC, vaizduojant kanalėlių išsiplėtimą ir vamzdinius apvalumus, taip pat ypač hipercelulinius glomerulus. Padidėjęs padidinimas ( a dešinė (600 ×)) atskleidžia didelį imuninės sistemos nusėdimo, globalinio proliferacijos ir prasidedančio pusmėnulio kiekį. Priešingai, plokštelėse ( b, c ) normali inkstų architektūra pelėse, gydomose BI-BTK-1 (atitinkamai 10 mg / kg ir 3 mg / kg). Glomerulų histologijos balai parodyti d skiltyje. Čia parodyti vieno eksperimento rezultatai (10 mg / kg apdoroto BI-BTK-1, n = 8; 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; 1 mg / kg BI-BTK-1, n = 8 0, 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; VC, n = 8; HC, n = 5). Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, palyginti su VC (**** p <0, 0001).

Visas dydis

BTK slopinimas netrukdo indukuoti NTN

Norint patvirtinti BTK tikslo užimtumą (TO) po gydymo BI-BTK-1, BTK TO procentas buvo nustatytas inkubuojant pavienius splenocitus su fluorescenciniu bodipy pažymėtu BTK kovalentiniu kovinio galvutės inhibitoriumi, po to atlikus bendrojo BTK baltymo Western blot nustatymą. (5a pav.). Gydant BI-BTK-1, sumažėjo nuo dozės priklausomas BTK, žymimas nuo dozės, ir tai rodo šio kovalento, negrįžtamo BTK inhibitoriaus įsitraukimą į tikslą.

Image

a ) BI-BTK-1 poveikis% BTK užimtumui. (Viršuje) splenocitų lizatų, inkubuotų su bodipy pažymėtu negrįžtamu BTK inhibitoriumi, fluorescencinis skenavimas, po kurio seka SDS-PAGE ir perkeliamas į nitroceliuliozę. (Apatinis) bendrojo BTK baltymo Western blot aptikimas splenocitų lizatuose, naudojamuose viršutiniame skydelyje. Vidutinis% ± SD BTK TO max buvo atitinkamai 95 ± 3, 89 ± 7, 52 ± 28 ir 33 ± 14 atitinkamai 10, 3, 1 ir 0, 3 mg / kg grupėms (n = 3 / grupė). Atitinkama vidutinė ± SD (nM) BI-BTK-1 koncentracija plazmoje 1 valandą po dozavimo buvo 193, 3 ± 80, 9, 79, 3 ± 40, 4, 9, 7 ± 4, 9 ir 4 ± 4, 6 10, 3, 1 ir 0, 3 mg / kg grupėms (n = 3 / grupė), atitinkamai. Įvertinus triušių anti-pelių GBM lygį ( b ) galiniame serume, BI-BTK-1 netrukdė sukelti ligą. Čia parodyti vieno eksperimento rezultatai (10 mg / kg apdoroto BI-BTK-1, n = 8; 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; 1 mg / kg BI-BTK-1, n = 8 0, 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; VC, n = 8; HC, n = 5). Žvaigždutės rodo reikšmingą HC skirtumą, palyginti su visomis kitomis grupėmis (* p <0, 05).

Visas dydis

NTN modelio pagrindas yra inkstų IC nusėdimas, susidedantis iš antikūnų, gautų pradiniame imunizavime, kryžminiu būdu susiejant glomerulų nusėdusius nefrotoksinius antikūnus, pasyviai perkeltus 5 dieną. Norėdami įsitikinti, kad ligos palengvinimas atsirado ne dėl BTK slopinimo pakeisdami bet kurią iš šių dviejų antikūnų populiacijų, ELISA metodu išmatuojome jų kiekį serume. Tarp bet kurios iš grupių pelių anti-triušio IgG lygiuose reikšmingų skirtumų nebuvo, tai rodo, kad BTK slopinimas netrukdė antikūnų reakcijai, sukeltai 0 dieną (papildomas 3 pav.). Taigi, deponuotų triušių anti-pelių GBM antikūnų kryžminio susiejimo skirtumai neprisidėjo prie gydomojo BI-BTK-1 poveikio.

Visos grupės, išskyrus HC grupę, gavo nefrotoksinius antikūnus. Kiekvienoje iš šių penkių grupių buvo žymiai didesnis triušių anti-pelių GBM antikūnų lygis (be reikšmingo skirtumo tarp jų) nei HC grupėje, kuriai buvo įšvirkšta PBS, o ne NTS (5b pav.).

BTK slopinimas mažina inkstų ir serumo citokinus

Dėl NTN indukcijos pastebimai padidėja uždegiminiai citokinai tiek inkstuose, tiek sistemiškai. Norint ištirti mechanizmus, kuriais BI-BTK-1 daro savo apsauginį poveikį renoprotektoriui, ir įvertinti BTK slopinimo poveikį citokinų ekspresijai, RT-PGR buvo atlikta viso inksto RNR ekstraktuose, o Luminex atlikta galiniame serume.

Inkstuose BTK slopinimas sumažino LCN2 (koduojančio NGAL) ir kitų mediatorių, susijusių su LN, mRNR raišką, įskaitant (bet neapsiribojant) MCP-1, Fn14 ir CSF-1 (6a pav.). Įdomu tai, kad daugelis šių genų yra susiję su makrofagų funkcija, įskaitant MCP-1, kuris yra gyvybiškai svarbus pritraukiant makrofagus prie uždegimo inksto, ir CSF-1, kuris yra svarbus makrofagų įdarbinimui, aktyvavimui ir proliferacijai 13, 14 . Be to, SOCS3, kuris yra padidintas glomerulų infiltruojančiuose uždegiminiuose (M1) makrofaguose nefrito 15 metu, buvo sureguliuotas slopinant BTK. Šie duomenys atitinka pastebėtą BTK slopinimo naudą, atsirandantį dėl trukdžių makrofagų efektoriaus funkcijai.

Image

Inkstų ( a ) ir serumo ( b ) citokinų, susijusių su inkstų liga, ekspresija buvo įvertinta atitinkamai RT-PCR ir luminex. Be to, naudojant ELISA ( c ), NGAL lygiai buvo įvertinti tiek galiniame šlapime, tiek serume. Žvaigždutės rodo reikšmingą VC skirtumą, palyginti su visomis kitomis grupėmis (* p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, **** p <0, 0001).

Visas dydis

Panašiai BTK slopinimas sistemiškai sumažino uždegimines molekules: IL-13, VEGF, MIP-1α ir MIP-1β reikšmingai sumažėjo BI-BTK-1 gydytų pelių serume (6b pav.). Siekiant suprasti šių baltymų ekspresijos pokyčius inkstuose, buvo atliktas ir qPCR. VEGF sumažėjo VC grupėje, o gydymas BI-BTK-1 inhibitoriais normalizavo (padidino) jo raišką (6a pav.). Nebuvo rasta IL-13 ekspresijos, o reikšmingų MIP-1α ir MIP-1β skirtumų nepastebėta (neparodyta). Be to, NGAL reikšmingai sumažėjo tiek šlapimo, tiek serumo BI-BTK-1 gydytų pelių (6c pav.).

Pelėms, kurioms netaikomas vaistas, sukeliama daugybė su uždegimu ir (arba) LN susijusių būdų. RNR Seq analizė parodė> 500 genų, modifikuotų apdorojant 10 mg / kg BI-BTK-1 (naudojant q reikšmę <0, 05, kartų pokyčio (DEseq2) ribinė vertė 1, 5). Šilumos žemėlapis (7 pav.) Ir 2 papildoma lentelė rodo aukščiausius NTN sukeltus kelius ir tai, kaip gydymas BTK moduliavo šiuos genus. Be aukščiau aprašytų padarinių LCN2, VCAM-1 ir CSF-1, RNR seq parodė, kad BI-BTK-1 reikšmingai moduliuoja daugelio papildomų genų, įskaitant susijusius su komplemento aktyvacija, krešėjimu ir IFN keliais, ekspresiją. RNR seq 3 mg / kg BI-BTK-1 gydytoje grupėje parodė panašias tendencijas (neparodyta).

Image

Tiriamųjų pelių, kurių FDR <0, 05 ir inkstų pokyčio skirtumas yra 1, 5, inkstuose buvo diferencijuotai išreikšti genai, siekiant užklausti maršrutų duomenų bazes, įskaitant išradingumo kelio analizę ir „MetaCore“ duomenų bazę. Ženkliai modifikuoti genai, gauti iš aukščiausio rango kelių (pagal FDR), yra išvardyti RNAseq šilumos plane, naudojant normalizuoto genų ekspresijos lygio z skalę. Rezultatai buvo gauti iš vieno eksperimento (10 mg / kg apdoroto BI-BTK-1, n = 7; VC, n = 6; HC, n = 5).

Visas dydis

BTK slopinimas išsaugo dubeninį monocitų rezervuarą ir mažina inkstus

IBA-1 + ląstelės

Blužnyje yra monocitų rezervuaras, kurį galima greitai mobilizuoti į uždegimo vietą 16 . NTN (8 pav.) VC pelėse blužnyje yra žymiai pasišalinusių monocitų. Įdomu tai, kad pelių, gydomų 10 mg / kg BI-BTK-1, blužnies monocitų fondas buvo panašus į HC pelių, greičiausiai todėl, kad inkstuose chemotaktinis signalas buvo žymiai susilpnėjęs. Panaši tendencija buvo ir pelėms, gydytoms 3 mg / kg doze (p = 0, 09) (8a pav.).

Image

Paukščių, paimtų per perfuziją, skerdienos buvo perdirbtos į vienos ląstelės suspensiją ir nudažytos blužnies monocitais, siekiant įvertinti BI-BTK-1 poveikį monocitų judėjimui iš blužnies rezervuaro. Sumažėjęs skaičius, kaip matyti VC grupėje, atitinka šių monocitų įsiskverbimą į uždegimo vietas. 10 mg / kg BI-BTK-1 apdorotos pelės turėjo žymiai daugiau monocitų nei VC ir buvo panašios į HC ( a ). Be to, IBA-1 dažymas buvo atliktas siekiant įvertinti peri- ir intraglomerulinius makrofagų kaupimąsi ( b ). Čia parodyti vieno eksperimento rezultatai (10 mg / kg apdoroto BI-BTK-1, n = 8; 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; 1 mg / kg BI-BTK-1, n = 8 0, 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; VC, n = 8; HC, n = 5).

Visas dydis

Siekiant ištirti makrofagų kaupimąsi inkstuose, pjūviai buvo dažomi IBA-1, siekiant įvertinti peri- ir intraglomerulų kaupimąsi. HC pelėse buvo normalios intersticinės makrofagų populiacijos, tačiau joms trūko periglomerulinių ir intraglomerulinių makrofagų, pastebėtų VC pelėse. Pelėms, kurioms buvo duota 0, 3 mg / kg BI-BTK-1, taip pat buvo matomi vidinių ir periglomerulinių makrofagų sankaupos, tuo tarpu pelės, kurioms buvo skiriamos didesnės dozės, buvo apsaugotos nuo šio kaupimosi ir atrodo daug panašesnės į HC pelėms (8b pav.).

BTK slopinimas mažina komplemento kaupimąsi inkstuose

Inkstų komplemento aktyvacija ir nusėdimas įvyksta NTN pelėms susidarius IC. Norint įvertinti BTK slopinimo poveikį inksto komplemento nusėdimui, pjūviai buvo nudažyti C3. Kaip matyti 9 pav., Komplemento nusėdimo inkstuose kiekis buvo atvirkščiai susijęs su BI-BTK-1 doze, o vartojant didesnes dozes, reikšmingai sumažėjo, palyginti su VC.

Image

Inksto C3 nusėdimas buvo atvirkščiai susijęs su pelėms suleista BI-BTK-1 doze, o nusistovėjusio C3 kiekis 10 mg / kg ir 3 mg / kg grupėse pasirodė labai panašus į HC pelių. Čia parodyti vieno eksperimento rezultatai (10 mg / kg apdoroto BI-BTK-1, n = 8; 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; 1 mg / kg BI-BTK-1, n = 8 0, 3 mg / kg BI-BTK-1, n = 8; VC, n = 8; HC, n = 5).

Visas dydis

BI-BTK-1 panaikina nusistovėjusį nefritą NTN

Norint įvertinti BI-BTK-1, kaip gydymo antikūnų sukeltu nefritu, galimybes, gydymas buvo pradėtas skirtingomis dienomis, siekiant įvertinti poveikį nustatytai ligai. Įdomu tai, kad gydymas BI-BTK-1 galėjo ne tik užkirsti kelią proteinurijos išsivystymui, bet ir pakeisti jį pelėmis, sergančiomis ankstyvu nefritu (10a pav.). Be to, BUN lygis visose gydomose grupėse buvo palyginamas su HC pelėmis (10b pav.). Žadantys rezultatai buvo ypač pastebimi, kai gydymas BI-BTK-1 buvo pradėtas dar 7 dieną. Kaip matyti iš 10a pav., Šiose pelėse buvo padidėjęs proteinurijos lygis, palyginamas su VC pelėmis. Tačiau, praėjus vienai dienai nuo gydymo pradžios, proteinurija sumažėjo iki lygio, kuris panašus į HC pelių. Inkstų histologijos analizė patvirtino atidėto gydymo veiksmingumą (10c pav.; Papildomas 4 pav.). Šie rezultatai rodo BTK slopinimo gebėjimą ne tik užkirsti kelią nefrito atsiradimui po vėlesnio sąlyčio su patogeniniais antikūnais, bet ir panaikinti jau nustatytą ligą, bent jau ankstyvosiose stadijose.

Image

Gydymas BI-BTK-1 (3 mg / kg) buvo atidėtas nuo 4 dienos iki kitų dienų (5, 6 ir 7), kad būtų galima įvertinti terapinį potencialą esant nustatytai ligai. Gydymas sugebėjo sustabdyti nefrito progresavimą per dieną nuo gydymo pradžios ( a ). Iki 8 dienos ir tęsiant iki aukojimo dienos, kiekvienos gydomosios BI-BTK-1 grupės proteinurijos lygis reikšmingai skyrėsi nuo VC grupės. Aukojimo metu visų gydytų grupių BUN lygis buvo normalus, nepaisant vėlesnio gydymo pradžios ( b ). Glomerulų histologija patvirtino teigiamą gydymo BI-BTK-1 poveikį ( c ). (4 dienos pradžia, n = 8; 5 dienos pradžia, n = 8; 6 dienos pradžia, n = 8; 7 dienos pradžia, n = 8; VC, n = 8; HC, n = 5). Žvaigždutės rodo reikšmingą VC skirtumą, palyginti su visomis kitomis grupėmis (* p <0, 05, **** p <0, 0001).

Visas dydis

Diskusija

Dabartinės LN gydymo galimybės yra ribotos ir nėra idealios dėl nepakankamo jų veiksmingumo, citotoksiškumo ir imuninę sistemą slopinančio poveikio. Pacientams būtų labai naudinga tikslingesnė intervencija, o BTK yra specifinis taikinys, turintis pažadą dėl terapijos.

Čia parodėme, kad profilaktinis BTK slopinimas palengvina NTN sukeltą inkstų ligą. Konkrečiai, gydytos pelės buvo apsaugotos nuo dozės priklausomu būdu nuo nenormaliai padidėjusios proteinurijos ir inkstų funkcijos sutrikimo, pastebimo kontrolinėmis pelėmis. Be to, inkstų histopatologijos analizė patvirtino visišką inkstų apsaugą, kurią slopina BTK. Galiausiai BTK slopinimas netrukdė sukelti ligos modelį.

Tolesnė citokinų tiek inkstuose, tiek serume analizė parodė, kad BTK slopinimas panaikino tų uždegiminių mediatorių, kurie pastebimi sergančiose kontrolinėse pelėse, padidintą reguliaciją. Konkrečiai, daugelis šių citokinų yra susiję su makrofagų funkcija - tai rodo, kad BTK slopinimas gali būti mechaniškai panaikinantis ligą dėl jos kišimosi į makrofagus, kurie prisideda prie patogenezės. Mes nustatėme papildomų įrodymų, kad trukdoma makrofagų efektoriaus funkcijai vertinant blužnies monocitų fondą, kuris buvo išeikvotas sergančioms VC pelėms, tačiau palaikomas didesnėmis BI-BTK-1 dozėmis.

NGAL yra LN 17 ir plačiau inkstų ligos biomarkeris, kurio padidėjęs lygis yra neinvazinis inkstų pažeidimo laipsnio žymeklis. Vis dėlto NGAL vaidmuo viršija biologinio žymeklio vaidmenį, nes žinoma, kad NGAL vaidina lemiamą vaidmenį nefrito srityje, skatindamas inkstų uždegimą ir apoptozę 18 . Pastebėtas nepaprastas NGAL padidėjimas pelių, sergančių VC, inkstuose, šlapime ir serume; tačiau gydymas BI-BTK-1 palaikė NGAL lygį, panašų į HC pelių, palaikydamas žadamą šio vaisto potencialą palengvinant inkstų ligas.

Keli tyrimai anksčiau nagrinėjo galimą BTK slopinimo vaidmenį LN. Honigbergas ir kt . ištyrė BTK inhibitoriaus ibrutinibo poveikį pelėms, sergančioms MRL / lpr lupus linkusioms prieš pradedant ligą (8 savaites). Pelės buvo gydomos 12 savaičių trimis skirtingomis dozėmis, žymiai pagerėjus proteinurijai. Histopatologinė analizė parodė bendrą pagerėjimą vartojant dvi didesnes dozes, tačiau reikšmingų skirtumų glomerulų histologijoje nebuvo. Hutchenson ir kt . įvertino tą patį BTK inhibitorių SLE1.3 vilkligės modelyje, įvertindama numatytą 30 mg / kg dozę. Šiame tyrime buvo nagrinėjamas BTK slopinimo poveikis B ląstelių funkcijai, pažymint sumažėjusį humoralinį imunitetą, kuris slopina LN. Konkrečiai, apdorotoms pelėms buvo uždelstas autoantikūnų susidarymas, sumažėjo splenomegalija ir susilpnėjo nefritas 20 .

Kitas Mina-Osorio ir kt . Tyrimas. ištyrė BTK inhibitoriaus RN486 chw formą NZB / W F1 pelėms, taip pat numatytą 30 mg / kg dozę. Pelės pradėjo gydytis 32 savaičių amžiaus, kai joms pasireiškė lengva proteinurija. Gydymas sustabdė LN ligos progresavimą ir sumažino proteinuriją iki žemiau pradinio lygio 21 . Panašiai yra Rankin ir kt . pranešė, kad profilaktinis gydymas PF-06250112 NZB / W F1 pelėms pagerino nefritą 22 . Bet koks bet koks druskingasis poveikis spontaninei šių vilkligės padermių ligoms galėjo būti susijęs su sumažėjusiais autoantikūnų titrais, o ne vietiniu poveikiu inkstų uždegimui. Be to, nors Rankin ir kt . taip pat pranešė apie teigiamą PF-06250112 poveikį NTN, proteinurijos laipsnis nebuvo išmatuotas kiekybiškai ir mechanizmas nebuvo detalizuotas.

Mūsų tyrimas pabrėžia stiprų ir selektyvų BTK inhibitorių, kuris ne tik veikia profilaktiškai, bet, dar svarbiau, rodo veiksmingumą terapinėje aplinkoje. Nors šis modelis neleidžia ištirti poveikio B ląstelėms, paskelbti duomenys apie BTK inhibitorius B ląstelėms ir mūsų in vitro duomenys rodo, kad BTK slopinimas taip pat gali paveikti B ląstelių autoimunitetą. Be to, šio tyrimo duomenys rodo, kad slopinant mieloidinių ląstelių aktyvavimą, kurį sukelia IC, yra papildomas privalumas, slopinantis daugelį uždegimo takų / genų, susijusių su ligos patogeneze ir progresavimu. BTK slopinimas susilpnina pagrindinius inkstų pažeidimo kelius, tokius kaip komplemento aktyvacija, leukocitų chemotaksis, interferono sukeliami genai ir kiti keliai / genai, susiję su LN. Be to, IFN reguliuojamų genų žemutinis moduliavimas BTK apdorotose pelėse, aptiktas RNR seq analizėje, atitinka BTK reguliuojamą IC sukelto monocito ir IFN kelio aktyvaciją 21 . Nesvarbu, ar IFN šaltinis yra iš T H 1 ląstelių, kurios įsiskverbia į inkstus, ar iš inkstų rezidentų ląstelių, mes nustatėme, kad IFN reguliuojami genai, susiję su ligos patogeneze, yra modifikuoti BTK slopinimo. Be to, klinikiniu požiūriu, atidėtas gydymas ne tik sustabdo ligos progresavimą, bet ir panaikina nusistovėjusią ligą, kaip matyti iš sumažėjusios proteinurijos, pagerėjusios inkstų histopatologijos ir normalizuojant BUN paaukojimo metu. Šie duomenys kartu su mūsų junginio specifiškumu suteikia pasitikėjimo naujojo inhibitoriaus veiksmingumu, apie kurį pranešta šiame tyrime.

„BI-BTK-1“ taip pat žada klinikinį vertimą, nes BTK inhibitoriai jau yra tirti su žmonėmis atliekant neinksalines indikacijas, tačiau nėra jokio bendro sunkaus šalutinio poveikio, dėl kurio reikia nutraukti gydymą. Apibendrinant ibrutinibo saugumą ir veiksmingumą lėtinės limfocitinės leukemijos atveju, dauguma praneštų šalutinių reiškinių (viršutinių kvėpavimo takų infekcija, nuovargis, viduriavimas) buvo 1 arba 2 laipsnio, taigi pacientams buvo suteiktas ilgesnis gydymas šiuo vaistu 23 . Pabrėždamas geresnio čia aprašyto naujojo BTK inhibitoriaus terapinio santykio potencialą, biocheminis profiliavimas parodė, kad BI-BTK-1 neslopina daugelio kinazių, kurias farmakologinės koncentracijos slopina ibrutinibas. Tiksliau, BI-BTK-1 reikšmingai neslopina EGFR (susijęs su nepageidaujamais reiškiniais, tokiais kaip išbėrimas ir viduriavimas) ar ITK (kritiškai svarbus NK funkcijai).

Mes tikime, kad mūsų rezultatai išryškina naują BTK inhibitorių, pasižymintį geresniu selektyvumu palyginti su esamais BTK inhibitoriais ir žadantį terapinį potencialą autoimuninių inkstų ligų atvejais. Be to, mūsų tyrimas pakartoja BTK svarbą kuriant LN ir pabrėžia šį fermentą kaip svarbų terapinį taikinį. Nors ankstesniuose tyrimuose buvo svarstomas BTK slopinimo poveikis nefritui, greitas BI-BTK1 veikimo pradžia ir stiprumas hiperaktyviame ir sunkiame modelyje, jo veiksmingumas keičiant nustatytą ligą, didelis selektyvumas palyginti su kitais BTK inhibitoriais ir dissekcija. apsaugos mechanizmų savybės yra naujos šio konkretaus inhibitoriaus savybės. Galiausiai, mūsų rezultatai vienareikšmiškai rodo, kad BTK slopinimas makrofaguose gali būti pagrindinis mechanistinis taikinys ir potencialiai perspektyvus terapinis požiūris ateityje gydant LN.

Metodai

Pelės

129 / SvJ pelės buvo įsigytos iš „The Jackson Laboratory“ ir buvo laikomos Alberto Einšteino medicinos koledžo gyvūnų skyriuje (Bronksas, NY). Institucinis gyvūnų priežiūros komitetas patvirtino visus tyrimus su gyvūnais. Šiame tyrime atlikti eksperimentai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių.

Nefrotoksinis serumo perdavimas

Nefrotoksinis serumo nefritas buvo sukeltas, kaip aprašyta 7 . Trumpai tariant, pradiniam matavimui buvo paimtas kraujas ir šlapimas iš 10 savaičių amžiaus 129sv / J pelių patelių, kurios vėliau buvo imunizuotos CFA ir triušio IgG injekcijomis į pilvaplėvės ertmę. Visos toliau nurodytos dienos pradinės imunizacijos triušio IgG data bus laikomos 0 diena, o vėlesni laiko momentai bus nurodyti atsižvelgiant į tą pradinį tašką. 5 dieną pelėms į veną buvo švirkščiamas nefrotoksinis serumas (NTS) arba PBS. Pelės buvo kontroliuojamos kiekvieną dieną, pradedant nuo 7 dienos, naudojant uristix (Siemens Healthcare Diagnostic, Tarrytown, NY).

BTK inhibitoriaus BI-BTK-1 poveikiui tirti buvo naudojamos kelios pelių grupės, siekiant užkirsti kelią ligos pasireiškimui ar susilpninti jos sunkumą. Dvi grupės (BI-BTK-1 ir nešiklio kontrolė (VC); kiekvienoje n = 8 kiekvienoje) buvo imunizuotos 0 dieną, o 5 dieną jiems buvo duotas NTS. BTK inhibitorius buvo duodamas 3 mg / kg dozės, suspenduotos tirpiklyje ( 0, 5% Natrosolio, 0, 015% Tween 80) per burną, kiekvieną dieną pradedant nuo 4 dienos, tuo tarpu VC grupei kasdien buvo skiriamas kontrolinis tirpiklio tirpalas, taigi ji veikė kaip ligonių kontrolinė grupė. Paskutinė grupė buvo sveikos kontrolinės (HC) grupė, kuri buvo imunizuota 0 dieną, bet 5 dieną buvo suleista PBS (n = 5).

Atskiri bandymai buvo atlikti su BI-BTK-1, kuris keitė dienos terapinę dozę (0, 3 mg / kg, 1 mg / kg, 3 mg / kg arba 10 mg / kg) arba pradinio gydymo dieną (4 diena, diena). 5, 6 ir 7 dienos). Tai leido mums patvirtinti pirminius rezultatus nepriklausomose grupėse ir įvertinti tiek vaisto dozės reakciją, tiek terapinį potencialą.

Proteinurijos ir inkstų pažeidimų įvertinimas

Uristix bandymo juostelės buvo naudojamos proteinurijos lygiui įvertinti kasdien, atsižvelgiant į spalvos pasikeitimą. Tarpiniams spalvų pokyčiams buvo priskirta vidutinės proteinurijos reikšmė. Albumino lygis buvo matuojamas naudojant Albumin ELISA kiekybinį rinkinį (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) pagal gamintojo protokolą. Kreatinino kiekis serume ir šlapime buvo nustatytas naudojant „QuantiChrom“ kreatinino analizės rinkinį (BioAssay Systems, Hayward, CA), o karbamido azoto (BUN) kiekis kraujyje buvo matuojamas naudojant rinkinį DIUR 500 (BioAssays).

Inkstų histopatologija

Inkstų skyriai buvo deparafinuoti ir dažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E) bei periodine rūgštimi Schiff (PAS) pagal Histologijos ir lyginamosios patologijos branduolius Alberto Einšteino medicinos koledže. Inkstų pjūvius tada įvertino patyręs nefropatologas (LH), kuris buvo užmerktas į eksperimentines grupes. Taškai buvo paskirstyti, kaip aprašyta 7 . Trumpai tariant, skyriuose buvo įvertinta glomerulų sankaupos, endokapiliarinis proliferacija, glomerulų pusmėnulio formavimasis, intersticinis uždegimas, kanalėlių formos ir išsiplėtimas. Tada kiekvienai kategorijai buvo priskiriamas 0–4 balas, kur 4 yra sunki liga, o 0 nėra liga ar normali histologija. Vidutinės glomerulų sankaupų, endokapiliarinės proliferacijos ir glomerulų pusmėnulio susidarymo skalės buvo įvertintos kaip vidurkis, norint gauti glomerulų histologijos balus; Buvo suskaičiuoti vidutiniai intersticinio uždegimo, kanalėlių ir išsiplėtimo balai, kad būtų galima gauti kanalėlių histologiją.

Antikūnai su pelės anti-triušio IgG ir triušiais nuo pelių glomerulų rūsio membranos (GBM)

Pelių anti-triušių IgG ir triušių anti-pelių GBM antikūnų serumo titrai buvo išmatuoti ELISA metodu, kaip aprašyta anksčiau 24 .

BTK tikslo užimtumo nustatymas

BTK užimtumui įvertinti blužniai buvo surinkti praėjus dviem valandoms po paskutinės geriamosios BI-BTK-1 dozės. Išskirti splenocitai buvo skalaujami terpėje (RPMI 1640 be L-glutamino + 1% FBS), granuliuoti ir 10 minučių resuspenduoti raudonųjų kraujo kūnelių lizuojančiame buferyje (Sigma-Aldrich). Resuspensijoje terpėje splenocitai buvo inkubuojami su bodipy pažymėtu kovalentu zondu (galutinis 5 μM) 1 valandą 37 ° C temperatūroje. Po užšaldymo / atšildymo lizės ir centrifugavimo siekiant pašalinti netirpią medžiagą, blužnies ekstraktai buvo analizuojami SDS-PAGE. BTK užimtumas buvo apskaičiuotas išmatuojant fluorescencinį signalą, kurį perduoda surištas bodipo-kovalentinis zondas, naudojant „ChemiDoc Imaging System“ (Bio-Rad, ex, 615–645 nm; em, 670–724 nm), derinant su viso Apkrautas BTK, išmatuotas atliekant Western blot analizę (ląstelių signalizavimas).

RNR išskyrimas, cDNR sintezė, realaus laiko PGR ir RNR seka

RNR buvo išskirti iš greitai užšaldytų inkstų, homogenizavus „Trizol“, naudojant „Retsch MM300 Tissue Lyser“. Pridėta chloroformo ir vandeninė fazė buvo perdirbta naudojant „Agencourt RNAdvanced“ audinių rinkinį, kuris buvo modifikuotas automatizuoti „Biomek FXp“ iš „Beckman“. Taqman analizei atvirkštinė transkripcija buvo atlikta naudojant „TaqMan Reverse Transcription Reagents Kit“ („Applied Biosystems“). Gauta cDNR buvo naudojama „ViiA 7“ realaus laiko PGR sistemoje („Applied Biosystems“), naudojant pelėms skirtus zondus iš „Applied Biosystems“. Statistinę analizę atliko ANOVA, po to sekė Dennetto T-testas „GraphPad Prism“.

RNR seq atliko komerciškai „Labcorp“ (Sietlas, WA). Vieno galo RNR-seq rodmenys buvo susieti su STAR 2.4. Absoliutus skaitymų skaičius / genas buvo sugeneruotas naudojant „Subread“ funkciją „Skaičiavimo programa“ v1.4.6 ir „UCSC“ pelės mm10 nuorodos „gtf“ anotacijos failą. Diferencialinė išraiškos analizė buvo atlikta naudojant paketą DESeq2. Skirtingai išreikštų genų funkcinės anotacijos analizė buvo atlikta naudojant kelio analizės įrankius, įskaitant išradingumo kelio analizę (QIAGEN) ir MetaBase (Thomson Reuters).

BTK įrišimo testai

BI BTK-1 afinitetas buvo matuojamas atliekant FRET LanthaScreen surišimo testą pagal gamintojo instrukcijas (Invitrogen), naudojant PerkinElmer Viewlux (pvz., 340 nM; em. 615/665 nM). K inaktyviam / Ki nustatyti rišimosi tyrimas buvo stebimas kas 60 sekundžių per 60 minučių (M −1 S − 1 ), kaip aprašyta (Singh 1997) 25 .

Ląstelinio ir viso kraujo tyrimai

Pirminės CD19 + ląstelės buvo išgrynintos iš žmogaus periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (AllCells) ir neigiamai parinktos magnetiniu atskyrimu> 97% grynumu (Stemcell Technologies). Po 1 valandos inkubacijos su BI-BTK-1 arba tik nešikliu (1% DMSO), ląstelės buvo stimuliuotos 12, 5 μg / ml ožkos F (ab ') 2 anti-žmogaus IgD (Southern Biotech) 18–24 valandas. Po dažymo APC-CD19 ir PE-CD69 (BD Bioscience) B ląstelės buvo analizuojamos srauto citometrija, naudojant BD LSRII srauto citometrą. Gyvybingos ląstelės buvo surinktos, o CD69 +% buvo nustatytas naudojant FlowJo programinę įrangą. Iš sveikų savanorių, paimtų iš natrio heparino mėgintuvėlių (BD Biosciences), viso kraujo mėginiai 1 valandą buvo gydomi BI-BTK-1 arba nešiklio kontrole (1% DMSO), po to stimuliacija, kaip aprašyta aukščiau. Mėginiai buvo dažomi blokuojančiame buferiniame tirpale (PBS, 10% žmogaus serumo, 0, 1% natrio azido), skirti APC-CD19 ir PE-CD69. Atlikus raudonųjų kraujo kūnelių lizę (BD Biosciences), buvo atlikta srauto citometrija ir CD69 + CD19 + B ląstelių procentas buvo nustatytas naudojant FlowJo programinę įrangą.

Norint nustatyti BI-BTK-1 stiprumą slopinant monocitų suaktyvėjimą naudojant IC, CD14 + ląstelės buvo išgrynintos iš sveikų užšaldytų periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (AllCells) ir neigiamai parinktos magnetiniu atskyrimu> 97% grynumu (Stemcell Technologies). Ląstelės buvo pasodintos 2x105 / šulinio koncentracija RPMI terpėje, kurioje yra 10% FBS, ir 1 valandą buvo apdorotos BI-BTK-1 arba tik nešikliu (1% DMSO). Ląstelės buvo perkeltos terpėje į mikrotitravimo plokštelę, kurioje yra imobilizuoti žmogaus serumo albumino imuniniai kompleksai, paruošti taip, kaip aprašyta anksčiau 21 . Po inkubacijos 18–24 valandas, IL-1β, IL-6 ir TNF kiekis supernatante buvo išmatuotas ELISA metodu („Meso Scale Discovery“).

Srauto citometrijos analizė

Pelės buvo sistemingai perfuzuojamos, o blužniai buvo surinkti ir sutrinti per 70 μm filtrą, kad būtų sukurta vienos ląstelės suspensija. Po 15 minučių inkubacijos raudonųjų kraujo kūnelių lizės buferyje, ląstelės 30 minučių buvo užblokuotos ant ledo, naudojant Fc bloką (anti CD16 / CD32, BD Pharmingen), praskiestą santykiu 1: 200 3% FBS PBS. Tada ląstelės buvo dažytos anti-F4 / 80-FITC, anti-Ly6C-PE, anti-CD11c-PerCP ir anti-CD11b-APC 30 minučių, po to 3 kartus praplaunamos prieš pradedant naudoti LSRII.

Luminex

Serumo citokinai buvo išmatuoti naudojant „Luminex Mouse Magnetic Bead Panel“ pagal gamintojo instrukcijas (Millipore). Serumas buvo tiriamas trimis egzemplioriais naudojant Bio-Rad Bio-Plex skaitytuvą ir analizuojamas naudojant xMAP programinę įrangą.

NGAL ELISA

Serumo ir šlapimo mėginiai buvo paimti paaukojus ir, remiantis gamintojo instrukcijomis, buvo analizuojami pagal NGAL lygį pelių Lipocalin2 / NGAL DuoSet ELISA, gautais iš tyrimų ir plėtros sistemų (Minneapolis, MN).

Statistika

Norint įvertinti reikšmingus skirtumus tarp grupių, buvo atlikta ANOVA, po kurios buvo atlikti keli palyginimai per Tukey testą.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.