Terapinis metodas, skirtas tiesiogiai perprogramuoti žmogaus kepenų vėžio ląsteles, naudojant tik chemines medžiagas | mokslinės ataskaitos

Terapinis metodas, skirtas tiesiogiai perprogramuoti žmogaus kepenų vėžio ląsteles, naudojant tik chemines medžiagas | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vėžio modeliai
  • Diferenciacija
  • Onkogenezė
  • Naviką slopinantys baltymai
  • Šio straipsnio priedas buvo paskelbtas 2012 m. Spalio 18 d
  • Šis straipsnis buvo atšauktas 2012 m. Lapkričio 9 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Buvo sukurti įvairūs metodai, skirti tiesiogiai perprogramuoti žmogaus somatines ląsteles. Tačiau nebuvo sukurtas terapinis metodas, skirtas perprogramuoti ir pašalinti žmogaus kietas naviko ląsteles. Čia parodome naują terapinį metodą, kaip perprogramuoti ir pašalinti chemikalų pagalba žmogaus kietas naviko ląsteles. Šis terapinis metodas gali būti taikomas įvairioms žmogaus kietosioms naviko ląstelėms, kurios ekspresuoja aldo-keto reduktazės 1 šeimos narį B10 (AKR1B10) ir retinoido X receptorius (RXR).

Įvadas

Buvo sukurti įvairūs tiesioginio žmogaus somatinių ląstelių perprogramavimo metodai 1 . Tačiau terapiniai metodai, skirti perprogramuoti ir sunaikinti žmogaus kietas navikines ląsteles, nebuvo sukurti.

Nustatyta, kad aciklinis retinoidas (AKR) sumažina pasikartojimo laipsnį po gydomosios kepenų ląstelių karcinomos (HCC) terapijos nedidelio atsitiktinio imties kontroliuojamojo tyrimo metu (n = 89) 2, ir panašūs rezultatai buvo stebimi neseniai atliktame didesniame (n = 401) atsitiktinių imčių būdu. kontroliuojamas tyrimas 3 . Pavojaus santykis (AKR, palyginti su placebu) 2 metus ar ilgiau po gydomojo gydymo buvo 0, 27 (95% PI: 0, 07–0, 96) 3 . Tačiau AKR nepavyko nuslopinti pasikartojimo per 1–2 metus po gydomosios terapijos 3 . Pavojaus santykis (AKR, palyginti su placebu) per vienerius metus trukusį gydomąjį gydymą buvo 0, 72 (95% PI: 0, 45–1, 17) 3 . Pastebėta, kad aldo-keto reduktazės 1 šeimos narys B10 (AKR1B10) 4 slopina retinoinės rūgšties (RA) sukeltą ląstelių diferenciaciją 5 ; tačiau ši hipotezė nebuvo įrodyta.

Rezultatai

AKR1B10 ekspresija kepenų vėžio ląstelėse iš HCC sergančių pacientų, kuriems buvo atlikta kepenų transplantacija

Remdamiesi anksčiau mūsų grupės ir kitų 4 aprašytais metodais ( plg. Metodus ), mes ištyrėme AKR1B10 raišką kepenų vėžio ląstelėse iš 10 HCC sergančių pacientų, kuriems buvo atlikta kepenų transplantacija 6 . AKR1B10 raiška buvo stebėta 6 pacientams, sergantiems HCC (1a, 1b paveikslai ir papildomas 1a paveikslas).

Image

a) AKR1B10 išraiška atliekant Western blot analizę kepenų vėžio ląstelėse pacientams, sergantiems HCC (n = 6) ir kuriems atlikta kepenų transplantacija. Kitų pacientų (n = 4) mėginiai buvo AKR1B10 neigiami. β-aktinas parodytas kaip kontrolinis. b) Kiekybiniai AKR1B10 realaus laiko PGR duomenys kepenų vėžio ląstelėse iš HCC sergančių pacientų, kuriems buvo atlikta kepenų transplantacija (n = 10).

Visas dydis

In vitro priešvėžinių vaistų jautrumo tyrimas 6 pacientams, sergantiems HCC, kuriems pasireiškė AKR1B10

In vitro priešvėžinių vaistų jautrumo tyrimai buvo atlikti 6 pacientams, sergantiems HCC, kuriems pasireiškė AKR1B10 ( plg. Metodus ). Po 6 dienų buvo pastebėtas reikšmingas AKR1B10 teigiamų kepenų vėžio ląstelių, gydomų vien ACR, ir ląstelių, gydomų ACR ir zopolrestatu, kuris yra AKR1B10 7 inhibitorius, gyvybingumas (2A paveikslas; P <0, 001, Mann-Whitney U testas) ). Taip pat reikšmingas skirtumas buvo stebimas AKR1B10 teigiamų kepenų vėžio ląstelių, gydomų vien zopolrestatu, ir tų, kurios buvo gydomos ACR ir zopolrestatu, gyvybingumas per 6 dienas (2A paveikslas; P <0, 001, Mann-Whitney U testas). Be to, vidutinė alfa-fetoproteino (AFP) vertė per 3 dienas mėginiuose, gydomuose vien ACR, buvo 45, 3 ng ± 5, 2 ng / L x 10 4 ląstelių / 24 h, o mėginiuose, apdorotuose ACR ir zopolrestatu, nustatyta pagerinta 3, 6 ng vertė. ± 2, 2 ng / L × 104 ląstelių / 24 h (P <0, 001, Mann-Whitney U testas). Vidutinė albumino vertė per 3 dienas mėginiuose, gydomuose vien ACR, buvo 19, 3 ng ± 7, 3 ng / L × 104 ląstelių / 24 h, tuo tarpu mėginiuose, apdorotuose ACR ir zopolrestatu, reikšmingai pagerėjo reikšmė - 93, 3 ng ± 3, 0 ng / L ×. 10 4 ląstelės per 24 h (P = 0, 02, Mann-Whitney U testas).

Image

(A) AKR1B10 teigiamas kepenų vėžio ląstelių gyvybingumas po 6 dienų. (B) AKR1B10 neigiamų kepenų vėžio ląstelių gyvybingumas po 6 dienų.

Visas dydis

In vitro priešvėžinių vaistų jautrumo tyrimas 4 pacientams, sergantiems HCC, kurie neišreiškė AKR1B10

In vitro priešvėžinių vaistų jautrumo tyrimai taip pat buvo atlikti 4 pacientams, sergantiems HCC, kurie neišreiškė AKR1B10 ( plg. Metodai ). Po 6 dienų buvo pastebėtas reikšmingas AKR1B10 neigiamų kepenų vėžio ląstelių, gydomų vien ACR, ir ląstelių, gydomų ACR ir zopolrestatu, gyvybingumas (2B paveikslas; P = 0, 02, Mann-Whitney U testas). Taip pat reikšmingas skirtumas buvo stebimas AKR1B10 neigiamų kepenų vėžio ląstelių, gydomų zopolrestatu, ir tų, kurios buvo gydomos ACR ir zopolrestatu, gyvybingumas per 6 dienas (2B paveikslas; P <0, 001, Mann-Whitney U testas). Be to, vidutinė AFP vertė per 3 dienas mėginiuose, gydomuose vien ACR, buvo 50, 3 ng ± 6, 5 ng / L x 10 4 ląstelių per 24 val., O mėginių, apdorotų ACR ir zopolrestatu, vidutinė vertė buvo pagerinta ties 7, 6 ng ± 3, 5 ng. / L × 10 4 ląstelių / 24 h (P = 0, 01, Mann-Whitney U testas). Vidutinė albumino vertė per 3 dienas mėginiuose, gydomuose vien ACR, buvo 17, 1 ng ± 5, 2 ng / L × 104 ląstelių / 24 val., O mėginių, apdorotų ACR ir zopolrestatu, vidutinė reikšmė žymiai pagerėjo, kai 85, 3 ng ± 3, 9 ng / L × 10 4 ląstelės / 24 h (P = 0, 02, Mann-Whitney U testas).

Deguonies vartojimas kepenų vėžio ląstelėse

AKR1B10 teigiamų kepenų vėžio ląstelių aerobinis kvėpavimas buvo įvertintas praėjus 3 dienoms po vien ACR, vien zopolrestato arba ACR plius zopolrestato vartojimo. AKR1B10 teigiamose kepenų vėžio ląstelėse, gydomose ACR ir zopolrestatu, deguonies suvartojimas buvo žymiai didesnis nei ląstelėse, gydomose vien ACR arba vien zopolrestatu (3A paveikslas; P <0, 001, Mann-Whitney U testas). AKR1B10 neigiamų kepenų vėžio ląstelių aerobinis kvėpavimas taip pat buvo įvertintas praėjus 3 dienoms po vien ACR, vien zopolrestato ir ACR plius zopolrestato vartojimo. AKR1B10 neigiamose kepenų vėžio ląstelėse, gydomose ACR ir zopolrestatu, deguonies suvartojimas buvo žymiai didesnis nei ląstelėse, gydomose vien ACR arba vien zopolrestatu (3B paveikslas; P <0, 001, Mann-Whitney U testas).

Image

(A) Deguonies suvartojimas AKR1B10 teigiamose kepenų vėžio ląstelėse praėjus 3 dienoms po vien ACR, vien zopolrestato ir ACR plius zopolrestato vartojimo. (B) Deguonies suvartojimas AKR1B10 neigiamose kepenų vėžio ląstelėse praėjus 3 dienoms po vien ACR, vien zopolrestato ir ACR plius zopolrestato vartojimo.

Visas dydis

Diskusija

HCC pasikartojimo dažnis yra didelis (49% per 38 mėnesius po gydomojo gydymo) ir bloga prognozė 2, 3 ; efektyvus pakartotinio HCC 2, 3 gydymas nenustatytas. Šis tyrimas, susijęs su AKR1B10 teigiamų ląstelių jautrumu priešvėžiniams vaistams nuo pacientų, kuriems yra atsparumas HCC ir AKR (2A ir 3A pav.), Rodo, kad AKR1B10 teigiami pacientai, kuriems yra atsparumas HCC ir AKR, turėtų būti gydomi AKR ir zopolrestatu, o ne tik ACR. siekiant sumažinti HCC pasikartojimą. Be to, mūsų eksperimentiniai rezultatai patvirtina 5 hipotezę, kad AKR1B10 slopina RA sukeltą ląstelių diferenciaciją.

Buvo pranešta, kad AKR1B10 veikia kaip pagrindinė retinaldehido reduktazė, todėl sumažėja RA kiekis ląstelėse 8, 9, 10, 11 . Šis veiksmas gali būti molekulinis pagrindas, kuriuo grindžiamas bendras ACR ir zopolrestato poveikis. Tačiau jokiais tyrimais nepranešta, kad AKR1B10 veikia RA ar ACR. Taigi, nors pagrįstai galima manyti, kad zopolrestatas slopina AKR1B10 žmogaus HCC ląstelėse ir stiprina endogeninį RA priešvėžinį aktyvumą, šio mechanizmo negalima pritaikyti ACR ir AKR1B10 inhibitoriaus deriniui, nebent galime įrodyti, kad AKR1B10 turi ACR reduktazės aktyvumą. . Atsižvelgdami į šiuos dalykus ir savo eksperimentinius rezultatus, manome, kad bendrą ACR ir zopolrestato poveikį galima priskirti prie sinergizmo tarp ACR ir 9-cis-RA 12, 13, kuriame ACR užkirto kelią hiperfosforilinimui ir RXRα inaktyvavimui ir tokiu būdu atstatė. 9-cis-RA aktyvumas. Taigi zopolrestatas gali užkirsti kelią endogeniniam 9-cis-RA išeikvojimui, tuo tarpu ACR apsaugo nuo RXRα inaktyvacijos. AFP ir albuminų vertės AKR1B10 teigiamose ar neigiamose kepenų vėžio ląstelėse pagerėjo po gydymo ACR ir zopolrestatu ir priartėjo prie verčių, kurių tikimasi iš normalių hepatocitų. Be to, kaip aprašė Otto Warburgas 1931 m., Nors vėžinės ląstelės energijai gaminti pirmiausia naudoja glikolitinius kelius, kai sumažina savo aerobinį kvėpavimo aktyvumą 14, deguonies suvartojimas AKR1B10 teigiamose arba neigiamose kepenų vėžio ląstelėse padidėjo vartojant ACR ir zopolrestatą (3A ir 3B paveikslai). ). Todėl bendras ACR ir zopolrestato poveikis gali efektyviai veikti tiesiogiai perprogramuojant ir sunaikinant žmogaus HCC ląsteles. Be to, mūsų rezultatai rodo, kad norint sumažinti HCC pasikartojimo normą, net pacientams, kuriems yra atsparus HCC ir AKR ir kuriems yra AKR1B10 neigiamos kepenų vėžio ląstelės, AKR ir zopolrestato terapija būtų pageidautina (2B ir 3B paveikslai).

Šis terapinis metodas taip pat gali būti taikomas kitoms žmogaus kietosioms naviko ląstelėms (ty HCC ląstelėms, nesmulkialąstelinėms plaučių vėžio ląstelėms iš rūkalių 4 arba gimdos kaklelio vėžio ląstelėms 15 ir kt . ), Kurios ekspresuoja AKR1B10 ir RXR. Tačiau artimiausiu metu reikės atlikti klinikinius tyrimus ir (arba) klinikinius tyrimus, kad būtų ištirtas ACR ir zopolrestato veiksmingumas ir saugumas žmogaus kietų naviko ląstelių, ekspresuojančių AKR1B10 ir RXR, atžvilgiu.

Apibendrinant, šie rezultatai patvirtina, kad kepenų vėžio ląstelės, turinčios atsparumą AKR, buvo tiesiogiai perprogramuotos, kad apytiksliai atitiktų normalius žmogaus hepatocitus, o ACR ir zopolrestatas sukėlė apoptozę (2A, 2B, 3A ir 3B paveikslai). Todėl buvo sukurtas terapinis žmogaus kietų naviko ląstelių perprogramavimo ir sunaikinimo vien cheminėmis medžiagomis metodas.

Metodai

Chemikalai

Ciklinį retinoidą (visus trans -3, 7, 11, 15-tetrametil-2, 4, 6, 10, 14-heksadekapentaeno rūgštį: ACR) ir zopolrestatą pateikė „Kova“ (Tokijas, Japonija).

Pacientų

Mūsų tyrime buvo gauta 10 kepenų vėžio mėginių, gavus informuotą pacientų, kuriems mūsų įstaigose buvo atlikta kepenų transplantacija, sutikimą (6 nuoroda). 10 pacientų, sergančių HCC prieš kepenų transplantaciją (6 nuoroda), amžius buvo 34–60 metų (mediana: 55, 7). Visiems vyrams (n = 7) buvo diagnozuotas II stadijos vėžys ir jie buvo HCV teigiami su A ir Child-Pugh balais; visoms moterims (n = 3) buvo diagnozuotas III stadijos vėžys, ir jos buvo HCV teigiamos, o Child-Pugh balas buvo B.

Pareiškimas, nurodantis institucinio ir (arba) licencijavimo komiteto eksperimentinį patvirtinimą

Tyrimą patvirtino mūsų įstaigų Institucijų peržiūros tarybos (Harvardo medicinos mokykla, Tokijo universitetas, Tokijo medicinos ir odontologijos universitetas), o iš visų pacientų buvo gautas informuotas rašytinis sutikimas.

AKR1B10 raiškos įvertinimas

Mes panaudojome anksčiau aprašytą 4 metodą, norėdami ištirti AKR1B10 raišką kepenų vėžio ląstelėse iš 10 pacientų, sergančių HCC, kuriems buvo atlikta kepenų transplantacija 6 . Šiame tyrime buvo naudojamas AKR1B10 antikūnas (monokloninis triušio anti-žmogaus AKR1B10 antikūnas, 1A6 klonas; „Abnova Corporation“). AKR1B10 buvo įvertintas žmogaus HCC mėginiuose pagal teigiamai dažytų naviko ląstelių skaičių. Jei nė vienoje naviko ląstelėje nebuvo AKR1B10 imuninio dažymo, mėginys buvo laikomas AKR1B10 neigiamu. Buvo naudojamas šis gruntas ir zondai: seka (nuo 5 ′ iki 3 ′)

AKR1B10-F: CATATCCAGAGGAATGTGATTGTCA;

AKR1B10-R: AGACCTGAATGTTCTCAACAATGC

10 pacientų, sergančių HCC, jautrumas priešvėžiniams vaistams in vitro

Kepenų vėžio ląstelės buvo inkubuojamos kolboje, padengtoje kolageno geliu, CO2 inkubatoriuje, esant 37 ° C, 24 valandas. Tik gyvybingos ląstelės, prilipusios prie kolageno gelio, buvo surinktos ir pakartotinai suspenduotos rekonstruotame 1 tipo kolageno tirpale, kad galutinis tankis būtų 1 × 105 ląstelių / ml. Trys lašai kolageno-ląstelių mišinio buvo dedami į kiekvieną 6 šulinėlių plokštelės šulinį į 60 mm indą, ir plokštelėms buvo leidžiama 1 valandą įkaisti iki 37 ° C CO 2 inkubatoriuje. Galutinė koncentracija buvo maždaug 3x104 ląstelių / kolageno gelio lašelis. Į kiekvieną šulinėlį buvo įpilama mitybinės terpės, o plokštelė buvo inkubuota CO2 inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje per naktį. Priešvėžiniai vaistai (ty, 10 μM ACR, vienas 10 μM zopolrestatas arba 10 μM ACR ir 10 μM zopolrestatas) buvo dedami į ląsteles 2 dienas.

Albumino ir alfa fetoproteinų (AFP) nustatymas auginimo terpėje

Albumino baltymo koncentracija buvo nustatyta atliekant fermentinį imunosorbentų tyrimą (ELISA), naudojant ožkos anti-žmogaus albuminą (Cosmo Bio Co., Tokijas, Japonija). Kiekybinė AFP sekrecijos analizė buvo atlikta naudojant AFP Amerlex-M RIA aptikimo rinkinį (Ortho Clinical Diagnostics, Issy les Moulineaux, Prancūzija).

Deguonies sunaudojimo kepenų vėžio ląstelėse matavimas

AKR1B10 teigiamose ar neigiamose kepenų vėžio ląstelėse deguonies suvartojimas (vidurkis ± SD, nmol min –1 mg −1 baltymas) buvo matuojamas Clarko tipo deguonies mikroelektrotu. Matavimai buvo atlikti praėjus 3 dienoms po to, kai buvo sušvirkšta tik 10 μM ACR, 10 μM vien tik zopolrestatas ir 10 μM ACR ir 10 μM zopolrestatas.

Statistinė analizė

Visi statistiniai testai buvo atlikti naudojant „Dr. SPSS II“, skirtą „Windows“ (SPSS Japan, Inc, Tokijas), ir statistinis reikšmingumas buvo apibrėžtas kaip p <0, 05.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.