Trimatis nanometrinių nanometrinių dalelių lokalizavimas, kad būtų galima pagerinti mikroskopijos super skiriamąją gebą | gamtos komunikacijos

Trimatis nanometrinių nanometrinių dalelių lokalizavimas, kad būtų galima pagerinti mikroskopijos super skiriamąją gebą | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Nanodalelės
  • Ypatingos raiškos mikroskopija

Anotacija

Norint įvykdyti nanometrų skiriamąją gebą, kurią žada mikroskopijos su ypač raiška mikroskopijos metodai (pointilistas: PALM, STORM, skenavimas: STED), reikia, kad mėginio pokytis būtų stabilizuotas realiu laiku viso gavimo proceso metu. Metalinės nanodalelės yra puikūs zondai, leidžiančios sekti šoninius dreifus, nes jie suteikia trapios ir fototapetines informacijos. Vis dėlto pasiekti pagrindinį iššūkį yra nanometrinės ašinės super-lokalizacijos užtikrinimas, nes difrakcija reikalauja didelių gylių. Čia demonstruojame greitą trijų dimensijų nanometrinių nanometrinių dalelių super-lokalizaciją tuo pačiu metu imant intensyvumą ir fazę, naudojant bangų kraštus matuojančią kamerą, pagrįstą keturkampio šoninio kirpimo interferometrija. Mes parodome, kaip derinti informaciją apie intensyvumą ir fazes, kad būtų raktas į trečiąjį ašinį matmenį. Šiuo metu mes demonstruojame net didelius kelių mikronų trimačius svyravimus, precedento neturintį sub nanometrų lokalizacijos tikslumą iki 0, 7 nm šonuose ir 2, 7 nm ašine kryptimi 50 kadrų per sekundę greičiu. Mes parodėme, kad nanomalių stabilizavimas labai pagerina vaizdo kokybę ir skiriamąją gebą atliekant tiesioginį stochastinių optinių rekonstrukcijų mikroskopijos vaizdavimą.

Įvadas

Ypač didelės skiriamosios gebos mikroskopijos ir nanoskopijos metodai optinio vaizdavimo ribas nustumia iki molekulinės skalės 1, 2 . Norint pasiekti šią aukščiausią skiriamąją gebą, reikia dar labiau pagerinti erdvinį tikslumą ir greitą reakcijos laiką stabilizuoti visą sąranką nuo mechaninių ir šiluminių dreifų. Tai yra didelis techninis iššūkis, ypač tokiems kaip pointilistiniai ypač didelės skiriamosios gebos metodai, kaip (f) PALM 3, 4 arba (d) STORM 5, 6, 7, kuriems reikia kelių vaizdų įsigijimo ir ilgo integravimo laiko. Nors buvo pasiūlyta įvairių būdų šiai problemai išspręsti 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, griežti apribojimai riboja stabilizacijos tikslumą, kuriam arba trūksta jautrumo 8, o siauras diapazonas yra 8, 9, 10, 11, 14 pav ., Nekompensuoja ašinio poslinkio 5, 13, reikia puikiai sukalibruoto mėginio ir 12 objekto arba sukelti fono triukšmą 5, 13, 14 .

Šiuo metu plačiausiai naudojamas metodas yra fluorescencinių ar sklaidomųjų nanodalelių vaizdavimas, siekiant nustatyti jos taško pasiskirstymo funkcijos centridą ir kiekybiškai įvertinti mėginio pasislinkimus 15 . Nors taip gaunami lokalizacijos tikslumai <10 nm skersiniuose xy matmenyse 16, nanodalelių lokalizacija išilgai optinės ašies yra daug sudėtingesnė, nes difrakcija reikalauja didelių kelių šimtų nanometrų lauko gylio. Todėl, siekiant užtikrinti geresnę ašinę lokalizaciją, dažnai pristatoma artimo lauko optika 17 arba sudėtingi optiniai elementai. Pastarieji apima cilindrinį lęšį arba deformuojamus veidrodžius, kad būtų galima parodyti astigmatizmą 18, arba naudoti interferometriją, kad būtų pasiekta 10–20 nm ašinė skiriamoji geba 19, 20, 21, 22 . Nedaugelis metodų jau pasiekia geresnį nei 10 nm tikslumą 9, 10, 23, 24, tačiau jiems reikalingas dvigubo objektyvo nustatymas, o tai labai apsunkina optinį derinimą ir netinka visiems pavyzdžiams. Be to, jų dinaminis diapazonas yra ribotas, todėl jie nesugeba pakoreguoti svarbaus fokusavimo. Kaip alternatyva, komercinės sistemos stebi židinį stebėdamos infraraudonosios šviesos atspindį ant dangtelio paviršiaus 25, 26, 27. Ašinė skiriamoji geba yra lauko gylio dalis ir paprastai yra ≥20 nm. Nepaisant įspūdingo ankstesnių darbų progreso, sulaužyti mažesnę nei 10 nm ašinės skiriamosios gebos lygį, turint svarbų dinaminį diapazoną ir greitą gavimo greitį, išlieka iššūkis, reikalaujantis naujo požiūrio į super lokalizaciją.

Čia mes suprantame nanodalelių super-lokalizaciją vaizdo greičiu nanometrų tikslumu tiek skersine, tiek ašine kryptimi, naudodamiesi tuo pačiu intensyvumu ir fazių vaizdavimu, naudojant bangos fronto jutiklį. Priešingai nei ankstesni metodai, kurie remiasi tik šviesos intensyvumu, mūsų požiūris visiškai išnaudoja papildomos fazės informaciją. Mes aprašome, kaip išnaudoti bendrą aukso nanodalelių intensyvumą ir fazinę reakciją, kad būtų pasiektas precedento neturintis vieno kadro trijų matmenų (3D) lokalizacijos tikslumas - 1, 5 nm šonuose ir 6, 5 nm - ašine kryptimi, esant greitam vaizdo greičiui 50 kadrų per sekundę. Taikant šį metodą, galima garantuoti sub nanometrų 3D lokalizacijos tikslumą, jei atsižvelgiama į ilgesnį integracijos laiką arba jei vienu metu stebimos kelios nanodalelės. 3D stebėjimas yra nepaprastai tvirtas net ir esant dideliam kelių mikronų dreifui, nes žinios apie visą skaliarinį elektromagnetinį lauką (amplitudę ir fazę) visada leidžia skaitmeniniu būdu nustatyti geriausią fokusavimo vietą. Norėdami stabilizuoti mikroskopą dSTORM vaizdavimo metu, naudojame 3D nanodalelių lokalizaciją. Mes parodome, kad šis visas 3D dreifo korekcijos metodas veikia žymiai geriau nei dabartiniai tradiciškai naudojami būdai, pagerindami ir dSTORM erdvinę skiriamąją gebą, ir signalo bei triukšmo santykį, kad būtų galima aptikti vienos molekulės fluorescenciją. Kaip papildomi mūsų požiūrio pranašumai, jis yra patogiai įgyvendinamas naudojant komercinį bangos fronto jutiklį ant mikroskopo šono ir nereikalauja nei sudėtingų interferometrinių ar holografinių elementų, nei išsamių žinių apie nanodalelių tipą ar formą. Kadangi procesas nepriklauso nuo fluorescencijos, fotono srautas yra pakankamai didelis, kad būtų galima greitai įgyti laiką, mažesnį nei milisekundės; be to, kadangi nėra nanodalelių fotobalinimo, stebėjimo trukmė yra neribota. Kaip papildomas pagrindinis pranašumas, 3D super lokalizacijos tikslumas išlaikomas nanometrų režime net esant dideliems 3D svyravimams iki kelių mikronų.

Rezultatai

Nanodalelių intensyvumas ir fazinis atsakas į fokusavimą

Mūsų stabilizavimo metodas priklauso nuo aukso nanodalelių padėties stebėjimo naudojant kombinuotą intensyvumo ir fazinį vaizdą komerciniu bangos fronto jutikliu (1a pav.). Matomame ir artimajame infraraudonųjų spindulių spektriniame diapazone dominuoja įsivaizduojama aukso lūžio rodiklio dalis, palyginti su realiąja dalimi 28 . Todėl, kai aukso nanodalelės yra tinkamai išdėstytos mikroskopo židinyje (1b pav.; Z = 0), intensyvumo kritimas yra didelis, nes dėl absorbcijos ir sklaidos 29, 30 prarandama šviesa, o fazės atsakas silpnas, nes optinis subbangos ilgio nanodalelėms sulėtėjimas yra beveik nereikšmingas. Intensyvumo vaizdas fokusuojant suteikia nanodalelių 2D super-lokalizaciją skersinėje plokštumoje, naudojant įprastą 2D Gausso difuzijos ribotos vietos 31, 32, kaip buvo aprašyta fluorescencijos emiteriuose ankstesniuose darbuose, pritaikymą 33 . Tačiau esant nanometriniam ašiniam defokusui (1b, c pav.), Intensyvumas beveik nesikeičia. Be to, intensyvumo priklausomybė nuo ašinės padėties yra simetriška, atsižvelgiant į optimalią fokusavimo padėtį. Todėl ašinę super lokalizaciją sunku pasiekti naudojant tik intensyvumo atvaizdus, ​​nereikalaujant laiko fiziniam mėginio pakopos poslinkiui ir gaunant įvairaus intensyvumo vaizdus.

Image

a ) Optinio nustatymo ir pavyzdžio schema. Geltonai paryškintas mikroskopo prievadas yra skirtas nanodalelių intensyvumui ir fazių vaizdavimui per apšvietimą, naudojant mikroskopo lempą, o MHM yra santrumpa Modified Hartman Mask. Raudonai paryškintas prievadas atitinka „dSTORM“ atvaizdą. b ) Dviejų 100 nm aukso nanodalelių, fokusuotų (z = 0) arba šiek tiek nefokusuotų ( z = ± 250 nm), intensyvumas ir faziniai vaizdai. Atkreipkite dėmesį į kontrasto inversiją faziniuose vaizduose dėl fokusavimo ir silpnus ryškumo signalo kitimus. Mastelio juosta, 2 μm. c ) užregistruotos vienos 100 nm aukso nanodalelės intensyvumas (juodi kvadratai) ir fazės (raudoni taškai), palyginti su mechaniniu mėginio poslinkiu. Linijos yra skaitmeninio sklidimo rezultatai, apskaičiuoti naudojant tik z = 0 plokštumos duomenis; jie nėra skaitmeniniai, atitinkantys eksperimentinius duomenis.

Visas dydis

Esminis mūsų technikos elementas yra tas, kad fazinis atsakas (arba lygiavertis optinis sulėtėjimas) smarkiai kinta priklausomai nuo nanodalelių ašinės padėties ir turi pastarosios ženklo inversiją (1b, c pav.). Fazinio atsako nuolydis, palyginti su ašiniu defokusu z, tiesiogiai keičiamas atsižvelgiant į intensyvumo silpnėjimą (žr. Papildomą diskusijos pavyzdį). Todėl fazinis nuolydis, palyginti su ašiniu defokusu, gali būti labai reikšmingas sugeriančioms metalinėms nanodalelėms, nepaisant mažos tikrosios aukso lūžio rodiklio dalies ir nanodalelių mažosios skyros dydžio. Ši fazių informacija yra raktas norint pasiekti super-lokalizaciją nanometrų tikslumu ašies kryptimi.

Fotografavimas tiek fazėje, tiek intensyvume suteikia išsamų skaliarinio elektromagnetinio lauko atvaizdą fiksuotos ašinės z padėties atžvilgiu. Ši informacija leidžia mums skaitmeniškai apskaičiuoti sklidimo poveikį bet kurioje savavališkai pasirinktoje plokštumoje (išsamiau žr. Papildomus metodus). Kaip matyti 1c pav., Skaitmeninio sklidimo rezultatai labai sutampa su eksperimentiniais duomenimis, net ir esant dideliam defokusui, didesniam kaip 2, 5 μm (šešis kartus didesniam už lauko gylį). Naudodami tik vieną poros intensyvumo fazių vaizdų matavimą bet kuriai (nežinomai) stebėjimo plokštumai, galime apskaičiuoti 3D poslinkį į geriausią fokusavimo vietą nanometrų tikslumu, nejudindami jokio optomechaninio elemento.

Auksinių nanodalelių nanometrų lokalizacijos tikslumas

Mes išmatuojame 3D 3D lokalizacijos metodo tikslumą, naudodami 400 pakartotinių padėties matavimų 50 Hz vaizdo dažniu (20 ms gavimas ir apdorojimo laikas vienam matavimui). 2a paveiksle pavaizduota šoninės x ir ašinės z padėčių sklaidos schema. Standartinis padėties matavimo nuokrypis (sd) esant 50 Hz kaupimo greičiui yra σ ( p xy ) = 1, 5 nm šoninėmis kryptimis ir σ ( p z ) = 6, 5 nm ašies kryptimi. Tai atitinka nepaprastus super lokalizacijos tikslumus ∼ λ / 400 išilgai xy ir ∼ λ / 90 išilgai z krypties.

Image

a ) Nanodalelių šoninės x ir ašinės z padėties sklaidos diagrama, rodanti 400 matavimų, esant 50 kadrų per sekundę vaizdo spartai (20 ms gavimo laikas vienam matavimui, skaitinio skaičiavimo laikas yra nereikšmingas). X ir z padėties histogramos pateikiamos pilka spalva. b ) išmatuotos nanodalelių padėties SD išilgai x (juoda linija) ir z (raudona punktyrinė linija) sd kaip kalibruoto ašinio defokuso, kurį sukelia pjezo stadija, funkcija. Kiekvienai ašinei etapo padėčiai atlikti 50 matavimų 50 Hz dažniu, norint įvertinti lokalizacijos sd. Triukšmo lygį, atitinkantį nustatytą vibraciją per 2 s integracijos laiką, žymi pilka punktyrinė linija x krypčiai ir oranžinė punktyrinė punktyrinė linija z krypčiai. c ) Išmatuota ašinė padėtis kaip kalibruoto pjezo etapo z poslinkio funkcija.

Visas dydis

Svarbus parametras yra ašinio diapazono, kuriame galioja super lokalizacijos procedūra, apimtis. Norėdami tai padaryti, nanodalelių mėginiui taikome kalibruotus poslinkius 3D pjezo stadijoje, įrašydami nanodalelių padėtį (2b, c pav.). Pažymėtina, kad net esant labai dideliam iki 3 μm fokusavimui (lygus 7, 5 karto didesniam kaip vaizdo ryškumo gylio gylis, nustatytas difrakcija), dirbant 50 kadrų, šoninis ir ašinis tikslumai gali būti atitinkamai geresni nei 10 nm ir 40 nm. per sekundę. Norint pasiekti tokias vertes, mūsų požiūris visiškai išnaudoja fazės informaciją, leidžiančią skaitmeniniu būdu apskaičiuoti sklidimą ir fokusavimą (žr. 1 papildomus metodus ir papildomą filmą).

Mes išmatuojame tikslumą, kuris yra būdingas mūsų super-lokalizacijos metodui, stebėdami koreliuojamą dviejų imobilizuotų nanodalelių poslinkį regėjimo lauke (žr. Matematinio aprašymo papildomus metodus). 50 kadrų per sekundę greičiu matuojame atitinkamai 0, 7 ir 2, 7 nm sd šonine ir ašine kryptimis. Šiuos rezultatus galima dar labiau patobulinti savavališkai

Image
koeficientas, kai naudojamas ilgesnis integracijos laikas ir vidutiniškai apskaičiuojami N vaizdai. Tai iliustruoja galimybę pasiekti sub nanometrų lokalizacijos tikslumą 3D formatu.

„dSTORM“ patobulinimas naudojant dreifo kompensaciją nanoskalėje

Šiluminiai ir mechaniniai dreifai turi būti aktyviai kompensuoti, kad būtų pasiekta maksimalios skiriamosios gebos vaizdo gavimo metodika. Atliekame fiksuoto kinietiško žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelių dSTORM vaizdavimą, naudodamiesi super lokalizacijos informacija iš 100 nm aukso nanodalelių, norėdami fokusuoti mėginį ir kompensuoti 3D poslinkius. Nanodalelės yra pritvirtintos ant dangtelio dangtelio pagrindo poli-L-lizino (PLL) sluoksniu, ant kurio auginamos ląstelės (1a pav.). Mėginio paruošimas ir dSTORM vaizdo atkūrimas yra aprašyti skyriuje „Metodai“ su papildoma informacija „Papildomuose metoduose“.

3 paveiksle parodyti F-aktino tinklų dSTORM vaizdai fiksuotose CHO ląstelėse, pažymėtose Alexa Fluor 647 phalloidin (daugiau dSTORM vaizdų tubulino tinkle parodyta papildomame 1 pav.). Kai stabilizavimas neaktyvus norint kompensuoti erdvinius poslinkius (3b pav.), Aptinkama labai mažai fluorescencinių molekulių, o erdvinė skiriamoji geba yra prasta. Įprastas būdas atkurti aptikimo įvykius, kai fokusuojamas fokusavimas, yra sumažinti fluorescencijos aptikimo slenkstį. Šoninius ( x , y ) poslinkius galima kompensuoti naudojant aukso nanodalelių atskaitos duomenų intensyvumo vaizdus. Tačiau tokiu atveju (3c pav.) Kiekvieno fluoroforo lokalizacijos signalo ir triukšmo santykis yra mažas, todėl rekonstrukcijos neapibrėžtis yra gana didelė, o dSTORM skiriamoji geba yra ribota. Visiško 3D stabilizavimo naudojant mūsų metodą atveju (3d pav.), Skyros padidėjimas yra aiškiai matomas, nes rekonstruotuose vaizduose atsiranda potinkliai. Mes įvertiname dSTORM erdvinę skiriamąją gebą pagal lokalizacijos histogramas (3e pav. Ir papildomas 2 pav.). F-aktino eksperimentų su 3D stabilizavimu šoninė skiriamoji geba yra 11 nm mažiausiems pluoštams, realizavus trimatę skiriamąją gebą, gautą be šoninio dreifo kompensavimo (žr. 2 papildomą paveikslą ir 2 papildomą lentelę).

Image

a ) Epi-fluorescencinis vaizdas. b ) „dSTORM“ vaizdas nepataisant dreifo. c ) dSTORM rekonstrukcija stabilizuojant šoninius ( x , y ) dreifus. Aptikimo slenkstis yra sumažintas, kad būtų padidintas aptiktų molekulių skaičius ir taip sumažintas neigiamas ašinių dreifų poveikis. d ) „dSTORM“ rekonstrukcija su visiška 3D dreifo korekcija. e ) Intensyvumas pjaunamas pagal pavienių vaizdų linijas ( ad ). Bendras įsigijimo laikas yra 25 min.

Visas dydis

Palyginimas su įprastu stabilizavimo metodu

Norėdami įvertinti mūsų technikos pranašumą, mes atliekame palyginimą su įprastiniu metodu, derindami aktyvią ašinio automatinio fokusavimo sistemą („Perfect Focus“, „Nikon“, Japonija) ir šoninį dreifo kompensavimą, naudodami fluorescencinėje kameroje vaizduojamas fluorescencines nanodaleles. Svarbu tai, kad palyginimas atliekamas su tuo pačiu pavyzdžiu lygiavertėmis dSTORM vaizdavimo sąlygomis (daugiau informacijos rasite skyriuje „Metodai“). 4 paveiksle ir papildomame 4 pav. Parodyti aiškūs vaizdai, naudojant mūsų požiūrį. Norėdami kiekybiškai įvertinti dSTORM skiriamąją gebą kiekvienu metodu, mes apskaičiuojame sd, rastą lokalizacijos histogramoms, tuo pačiu F-aktino pluošto rinkiniu. Kiekvieno pluošto sd mūsų metodu yra mažesnis nei taikant įprastą metodą (4e pav.). Tai reiškia, kad pastebimas dSTORM erdvinės skiriamosios gebos pagerėjimas 26%, atsižvelgiant į mūsų požiūrį (4f pav.). Šis rezultatas parodo aukščiausias mūsų technikos savybes, kurios nedaug priklauso nuo svarstomo aktino pluošto.

Image

a ) Pažymėto F-aktino vaizdas CHO ląstelėse, gautas naudojant mūsų 3D stabilizavimo metodą. Intarpas rodo pluoštus, naudojamus dSTORM skiriamąja geba įvertinti (pažymėti rodyklėmis 1, 2 ir 3). b ) Tas pats, kaip naudojant įprastą dreifo korekcijos metodą, derinant komercinį automatinį fokusavimą („Nikon Perfect Focus“) ir 2D šoninį stabilizavimą, naudojant fluorescencines nanodalelių sekimas (dirbtinė žvaigždė). ( c, d ) Molekulės padėties histogramos, išvestos iš atitinkamai a, b duomenų. Aptiktų įvykių skaičius abiem atvejais yra panašus. Duomenų taškai atitinka atskirus pluoštus, išryškintus intarpuose a, b, užtemdytas plotas žymi sukauptus duomenis, o linija yra Gauso forma, naudojama lokalizacijai sd σ nustatyti . e ) dviem skirtingais pluoštais rastas sd. 1–3 pluoštai pavaizduoti a, b, 4–6 pluoštai pateikiami papildomame 3 pav. Brūkšniuotos horizontalios linijos rodo kiekvieno metodo vidutinę vertę, parodydamos geresnę skiriamąją gebą mūsų metodu. ( f ) dSTORM skyros pagerėjimas, apskaičiuotas kiekvienam aktino pluoštui kaip sd verčių santykis e . Gaunamas vidutinis 26% pelnas.

Visas dydis

Antruoju palyginimu mes sutelkiame dėmesį į savo požiūrį laikinai, kad tiksliai kompensuotume greitą dreifą. Čia mes naudojame tą patį dSTORM F-aktino vaizdų rinkinį esant 100 nm aukso nanodalelėms, ir įgyvendiname „dirbtinės žvaigždės“ metodą, pasirinkdami fluorescencinį emisijos filtrą, perduodantį nedidelį kiekį atgal išsklaidytos sužadinimo lazerio šviesos, kad gautume fiksuota vieta kiekviename dSTORM vaizde. Mes taip pat įvertiname dreifo korekciją pertekline kryžmine koreliacija, kuri yra grynai skaitinis a posteriori gydymas 34 . Atliekant šį matavimų rinkinį, ašinis poslinkis yra kompensuojamas mūsų technika, nes mes kreipiame dėmesį į šoninių dreifų korekciją. Palyginus dSTORM atvaizdus, ​​kompensuotus mūsų metodu (5a pav.) Ir dirbtinę žvaigždę (5b pav.), Paaiškėja, kad kai kurios molekulės yra arti dirbtinės žvaigždės (tokios, kaip pažymėta balta rodykle). Dėl nereikalingo kryžminės koreliacijos algoritmo gaunami dSTORM vaizdai neryškiau, ypač ant plonų struktūrų (5c pav.). Šoninių dreifų laiko dinamikos stebėjimas suteikia papildomų įžvalgų (5d – f pav.). Nereikalingas kryžminės koreliacijos algoritmas nesugeba atkurti greitų dreifų, todėl sklandžiau įvertinamas dreifas. Dirbtinė žvaigždė pateikia palyginti triukšmingesnius rezultatus. Visi šie rezultatai rodo, kad mūsų technika, palyginti su dviem įprastais metodais, suteikia geresnį tikslumą ir laiko dinamiką. Palyginimas su komercine automatinio fokusavimo sistema, stebinčia infraraudonųjų spindulių atspindį ant dangtelio paviršiaus, pateiktas papildomame 4 pav. Vėlgi, rezultatai patvirtina geresnį erdvinį ir laiko tikslumą mūsų metodu.

Image

Šiam eksperimentui ašinis stabilizavimas atliekamas mūsų metodu. ( a - c ) FST aktino atvaizdai dSTORM fiksuotose CHO ląstelėse. a ) Drifto kompensacija naudojant mūsų techniką. b ) Poslinkio kompensacija, dirbtinai stebint kiekvieną įgytą fluorescencinį vaizdą, naudojant dalį dSTORM sužadinimo lazerio šviesos, kurią atgal išsklaidė aukso nanodalelės. c ) Skaitinė posteriori dreifo korekcija pertekline kryžmine koreliacija (50 vaizdų pogrupis). d ) dreifo kitimas laike, išmatuotas x kryptimi. e ) Priartinimas per dieną nuo 75 iki 125 s, rodantis nereikalingo kryžminės koreliacijos metodo netikslumą greitų įvykių atveju. f ) Priartinimas per dieną nuo 150 iki 200 s rodo didesnį triukšmą, kurį rado dirbtinės žvaigždės artėjimas, palyginti su mūsų metodu.

Visas dydis

Norėdami užbaigti diskusiją, papildomoje diskusijoje parodome, kad optinės aberacijos daro nereikšmingą poveikį mūsų stebėjimams ir kad bet kurios nanodalelės matymo lauke gali būti naudojamos mėginių poslinkiams sekti. Norint maksimaliai padidinti aukso nanodalelių optinę reakciją ir optimizuoti mūsų metodo jautrumą, pravartu pasirinkti šviečiantį bangos ilgį, artimą nanodalelių vietiniam paviršiaus plazmoniniam rezonansui (žr. Papildomą diskusiją). Tačiau atkreiptinas dėmesys, kad mūsų technika neapsiriboja vien metalų nanodalelių sugertimi: dielektriniai subbangio ilgio objektai taip pat gali būti super-lokalizuoti 3D (Papildoma diskusija rodo aukso ir polistireno nanodalelių palyginimą).

Diskusija

Apibendrinant galima pasakyti, kad naudojant papildomą šviesos, išsklaidytos metalo nanodalelėmis, intensyvumą ir fazinius vaizdus, ​​nanodalelių lokalizacijos tikslumas yra 1, 5 nm iš šono ir 6, 5 nm - ašies kryptimi, esant 50 kadrų per sekundę greičiui. Tikslumą galima dar labiau padidinti iki 0, 7 × 0, 7 × 2, 7 nm 3, išlaikant tą pačią laiko skiriamąją gebą, stebint dvi nanodaleles, kad atsikratytų vibracijos iš pjezo scenos ir fotoaparato. Endogeninių dalelių panaudojimas taip pat gali būti svarstomas siekiant supaprastinti mėginio paruošimą: pavyzdžiui, fiksuotas vezikulė ląstelės viduje gali būti geras zondas. Ši vieno kadro 3D nanoskalės super skiriamoji geba derinama su „dSTORM“ fluorescenciniu vaizdavimu, kad būtų pagerinta vaizdo kokybė, pagerinta ir erdvinė skiriamoji geba, ir signalo bei triukšmo santykis. Mūsų požiūris turi keletą specifinių pranašumų. Jis įgyvendinamas tik naudojant komercinį bangos fronto jutiklį ant mikroskopo šono: nėra sudėtingo holografinio aparato ar judančių elementų; jis tinka bet kokiam mikroskopui be didelių modifikacijų, o apšvietimo bangos ilgį galima lengvai suderinti naudojant įprastus filtrus, kad atitiktų vartotojo reikalavimus. Kadangi metodas nereikalauja lazerio apšvietimo, vaizduose nėra raukšlių. Kadangi tai nėra fluorescencinio vaizdo metodas, nėra fotobalinimo ir nanodalelių lokalizavimas gali būti greitas esant dideliam fotonų skaičiui. Be to, mūsų požiūris gali būti naudojamas stabilizuojant ypač didelės skiriamosios gebos vaizdo gavimo sistemas, kai mėginys yra įdėtas į lūžio rodiklį atitinkančią terpę, kaip ir atliekant išsamų vaizdą STED. Galiausiai viso skaliarinio elektromagnetinio lauko žinojimas leidžia apskaičiuoti sklidimą atgal į geriausią fokusavimo plokštumą. Tai išlaiko puikų super lokalizacijos tikslumą net esant dideliam ir nežinomam kelių mikronų fokusavimui.

Metodai

Optinis nustatymas

Visi matavimai atliekami naudojant komercinį apverstą mikroskopą (TiE, Nikon), turintį x 100 skaitmeninę diafragmą = 1, 49 objektyvo ir dviejų pakopų filtrą, leidžiantį vienu metu vaizduoti nanodaleles esant λ = 594 ± 20 nm (geltona dalis 1a pav.) ) ir „Alexa Fluor 647“ fluoroforų fluorescencinis vaizdavimas (raudona dalis 1a pav.). Vaizdo intensyvumas ir fazinis vaizdas gaunamas naudojant komercinį keturių bangų šoninio kirpimo interferometrą (QWLSI) 35, 36 (SID4 elementas, „Phasics“, Prancūzija) ir „sCMOS“ kamerą („Orca Flash 4“, Hamamatsu, Japonija). Fazių ir intensyvumo nustatymo peršviečiamumas sukuriamas naudojant natūrinį Kohlerio apšvietimą mikroskopu, kurio angos diafragma yra uždaryta iki minimumo, kad būtų užtikrinta pluošto erdvinė darna, ir pralaidumo filtras λ = 594 ± 20 nm, suderintas su NP plazmono rezonansu. Fluorescencija sužadinama 637 nm lazeriu (Obis, Coherent, JAV) ir užrašoma „sCMOS“ fotoaparatu (Neo, Andoras, Airija). Kai kuriems eksperimentams, be 637 nm lazerio, taip pat panaudojome 405 nm lazerį (Obis), kad vėl suaktyvintume mirksinčią fluorescenciją.

NP super lokalizacija iš elektromagnetinio lauko matavimų

Buvo įdiegta namie sukurta „Labview“ programinė įranga, skirta intensyvumui / fazei gauti, NP super lokalizacijai ir skaitmeniniam fokusavimui. Iš QWLSI fotoaparato atvaizdo gaunamas intensyvumas ir fazės išgaunamas Furjė erdvėje naudojant algoritmą, aprašytą 35 ir 37 nuorodose. NP šoninis super lokalizacijos algoritmas pagrįstas netiesiniu Levenbergo – Marquardto, kurį Gausas pritaiko vaizdo intensyvumui 32, kaip paprastai daroma PALM / (d) STORM 33 . Ašinė superlokacija gaunama palyginus intensyvumą ir fazės vertę NP atvaizdo centre su kalibravimo kreive, gauta skaitiniu sklidimu skirtingose ​​ašies plokštumose atliekant vieno NP elektromagnetinio lauko matavimą (kaip parodyta 1c pav.). Kalibravimo procesas eksperimento pradžioje atliekamas tik vieną kartą ir yra galiojantis, kol dalelė lieka matymo lauke. Atsiradus ašiniam defokusavimui, mes naudojame skaitmeninį sklidimą, kad prieš atlikdami šoninę lokalizaciją skaitmeniniu būdu sufokusuotų nanodalelę.

dSTORM vaizdo gavimo pavyzdžiai

Mes paruošėme mėginį naudodamiesi praskiestu 1/200 komercinių 100 nm aukso nanodalelių NP tirpalu (BBI Solutions, UK). 200 μl koloidinio tirpalo lašelis buvo nusodintas ir paliktas džiovinti per naktį ant išvalyto 1, 5 H dangtelio (VWR, Radnor). Tuomet ant mėginio 1 valandą 20 minučių kambario temperatūroje buvo dedamas 0, 1% PLL lašelis, prieš tai plaunant distiliuotu vandeniu. Tai užtikrina tiek NP imobilizaciją, tiek atskyrimą su biologiniais mėginiais, pridedant nm 200 nm polimerizuoto PLL 38 sluoksnį. Kadangi PLL yra biologiškai suderinamas ir stabilus esant 37 ° C, ląstelės gali būti tiesiogiai dedamos ant mėginio. Kadangi NP yra izoliuojamas polimerizuotu PLL, ląstelėse nėra NP internalizacijos. Nors NP įterptą dangtelio dangtelį paruošti nesunku, pažymėtina, kad egzistuoja komercinės dangteliai su tokiomis fiducialinėmis aukso dalelėmis 39 . DSTORM vaizdavimui CHO ląstelės buvo naudojamos ant NP paruoštų dangtelių; kultūros protokolas, dažymas ir ženklinimas pateikiami papildomuose metoduose. Fiksuoti mėginiai sumontuojami 50/50% PBS / Vectashield (Vector Laboratories, JAV) mišinyje arba tiolio ir deguonies kaupiklio mišinyje, aprašyta žemiau. Dėl „Vectashield“ mišinio „Alexa Fluor 647“ mirksi esant dideliam ryškumui 40, o tiolio ir deguonies kaupiklio mišinys leidžia vėl suaktyvinti fluoroforą, naudojant beveik ultravioletinę šviesą 7 .

Palyginimas su įprastais dreifo korekcijos metodais

Norėdami palyginti rezultatus su vaizdais, gautais naudojant moderniausius įprastus dreifo korekcijos metodus, kaip „dirbtinę žvaigždę“ naudojame fiksuotą fluorescencinę nanodalelę, kad kompensuotume šoninius dreifus, kartu su komerciniu automatinio fokusavimo metodu („Perfect Focus“), kad galėtume sekti ašinis defokusas. 20 nm skersmens fluorescencinės nanodalelės („FluoSphere 580/605“, „Life technologies“, JAV) yra parinktos taip, kad būtų kuo labiau sumažintas fotobalinimas ir išvengta fluorescencinio fotoaparato sodrumo. Ta pati fiksuota CHO ląstelė su F-aktinu, paženklinta falanidino-Alexa Fluor 647, nuosekliai vaizduojama naudojant pirmiausia įprastą 3D dreifo kompensavimo metodą (4a – c pav., Bendras gavimo laikas: 15 min), o paskui naudojant 3D stabilizacijos metodą ( 4d – f pav., Bendras įsigijimo laikas: 17 min). Palyginimui, abiejuose vaizduose bendras aptiktų molekulių skaičius yra lygus. Šią dvigubo vaizdavimo procedūrą galima atlikti naudojant buferį, sudarytą iš tiolio + deguonies kaupiklio ir 405 nm lazerio 7 . Buferiniame tirpale buvo 50 mM koncentracijos beta-merkaptoetilamino (MEA, Sigma-Aldrich) ir deguonies matuoklio, sudaryto iš 0, 5 mg ml −1 gliukozės oksidazės (G0543, Sigma-Aldrich), 40 μg ml −1 katalazės (C40, Sigma-Aldrich). Aldrichas) ir 10% (m / t) gliukozės, ištirpintos buferyje, sudarytame iš 50 mM Tris ir 10 mM NaCl (Sigma-Aldrich). Šis dSTORM buferis leidžia grįžtamai mirksėti fluoroforams tamsoje. Taigi juos galima suaktyvinti naudojant ultravioletinę šviesą (pavyzdžiui, 405 nm lazerį), kuri leidžia tuo pačiu ryškumu atvaizduoti tą patį fluorescencinių zondų baseiną dar bent vieną kartą.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    1-8 paveikslai, 1-3 papildomos lentelės, papildoma diskusija, papildomi metodai ir papildomos nuorodos

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas filmas

    Skaitmeninis intensyvumo ir fazių vaizdų fokusavimas, gautas ant 100 nm aukso nanodalelių, įterptų į ~ 200 nm PLL sluoksnį, užregistruotų tokiu pat pavidalu, kaip 1 pav. Defokusavimas kinta nuo –2, 8 μm iki +3 μm ir sukuriamas judant. mikroskopo objektyvas. Kairėje pateikiami registruoto intensyvumo ir faziniai vaizdai, o dešinėje - fokusuoti vaizdai.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.