Trimatis kalcio sulfato ir mezoporinių bioaktyvių stiklinių pastolių spausdinimas, siekiant pagerinti kaulų regeneraciją in vitro ir in vivo | mokslinės ataskaitos

Trimatis kalcio sulfato ir mezoporinių bioaktyvių stiklinių pastolių spausdinimas, siekiant pagerinti kaulų regeneraciją in vitro ir in vivo | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biomedicininės inžinerijos
  • Biomedicininės medžiagos

Anotacija

Klinikoje kaulų defektai, atsirandantys dėl infekcijų, traumų, chirurginės rezekcijos ir genetinių apsigimimų, išlieka rimtu iššūkiu. Kaulinio audinio inžinerijos srityje žadami trimačiai (3D) pastoliai, skirti kaulų defektų gydymui. Šiame tyrime kalcio sulfato hidrato (CSH) / mezoporinio bioaktyvaus stiklo (MBG) pastoliai buvo sėkmingai pagaminami naudojant 3D spausdinimo techniką, kuri turėjo taisyklingą ir vienodą kvadratinę makroporų struktūrą, didelį poringumą ir puikų apatito mineralizacijos sugebėjimą. Žmogaus kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės (hBMSC) buvo auginamos ant pastolių, kad būtų galima įvertinti hBMSC prisijungimą, proliferaciją ir su osteogeneze susijusią genų ekspresiją. Norint ištirti CSH / MBG pastolių poveikį kaulų regeneracijai in vivo, buvo taikomi kritinio dydžio žiurkių kalvarijų defektai. In vitro rezultatai parodė, kad CSH / MBG pastoliai stimuliavo hBMSC adheziją, proliferaciją, šarminės fosfatazės (ALP) aktyvumą ir su osteogeneze susijusią genų ekspresiją. In vivo rezultatai parodė, kad CSH / MBG pastoliai gali žymiai pagerinti naujų kaulų formavimąsi esant kalvarijų defektams, palyginti su CSH pastoliais. Taigi 3D atspausdinti CSH / MBG pastoliai bus perspektyvūs kandidatai skatinti kaulų regeneraciją.

Įvadas

Pastoliai yra perspektyvūs kaulų defektų gydymui, atliekant kaulų audinio inžineriją. Tokie pastoliai turėtų būti laidūs elektrai, skaidomi ir biologiškai aktyvūs, be to, jie turėtų turėti sudėtingą trijų dimensijų (3D) sujungtą porėtą tinklą ir stiprias mechanines apkrovos savybes 1, 2 . Pagrindiniai įprasti porėtų kaulinio audinio inžinerinių pastolių gamybos būdai yra poliuretano putplasčio štampavimas, putų dujinimas ir porogenų panaudojimas poroms kurti. Tačiau pastoliai, paruošti putojant dujas, nėra pakankamai stiprūs, norint implantuoti kaulus 3, o štampuojant poliuretano putomis, labiau tinka metaliniai arba keraminiai pastoliai 4, 5, 6 . Nors metodais, kurių pagrindą sudaro porogenai, galima gauti didesnio mechaninio stiprumo porėtus pastolius, poros ne visada yra tarpusavyje susijusios 7 . Be to, šiais įprastiniais metodais nėra lengva tiksliai nustatyti pastolių morfologiją, porų dydį ir bendrą poringumą. Pvz., Norint gauti keraminius pastolius, poliuretano putų šablonai turėtų būti pašalinti kalcinuojant, dėl to pastoliai gali susitraukti 8 . Neseniai 3D spausdinimo technika buvo išplėtota kaip idealus būdas paruošti porėtus pastolius, kurie švelniomis sąlygomis galėtų tiksliai valdyti pastolių architektūrą, naudodamiesi kompiuterio pagalba (CAD) / kompiuterio pagalba (CAM). Iki šiol įvairios biomedžiagos buvo atspausdintos 3D formatu, kad būtų galima formuoti pastolius, kurių morfologija, porų dydis ir poringumas yra tokie kaip bioaktyvus stiklas, hidroksiapatitas, trikalcio fosfatas ir polimeriniai pastoliai 9, 10, 11, 12, 13, 14 .

Kalcio sulfato hidratas (CaSO 4 · 0, 5H 2 O, CSH), reaguodamas su vandeniu, virsta kalcio sulfato dehidratu (CaSO 4 · 2H 2 O, CSD). Tai buvo naudojama sulfatiniam cementui gaminti kaulų padidinimui, narkotikų nešikliams. ir kaulų transplantato pakaitalai 15, 16, 17 . Be to, CSH yra daug ekonomiškesnis nei daugelis kitų biomedžiagų, tokių kaip hidroksiapatitas, kalcio silikatas ar bioaktyvus stiklas. Svarbu tai, kad CSH cemento mechanines savybes galima pagerinti sukietėjus 37 ° C temperatūrai esant 100% santykinei drėgmei 18, 19 laiko. Tačiau silpna rūgštinė aplinka, silpnas biologinis aktyvumas ir per greitas CSH pagrindu pagamintų medžiagų rezorbcijos greitis in vivo apribojo jų klinikinį pritaikymą 20, 21, 22 . Todėl buvo stengiamasi gaminti CSH turinčius cementus, derinant juos su kitomis bioaktyviomis medžiagomis, siekiant pagerinti biologinį aktyvumą, stabilizuoti pH aplinką ir sumažinti rezorbcijos greitį, taip pat pritaikyti nustatymo laiką ir injekcijos galimybes. Huanas ir kt . į CSH įvedė trikalcio silikatą, kad gautų naują kaulų cementą, pasižymintį geresnėmis savitvarkos savybėmis ir in vitro biologiniu aktyvumu 23, o Chen et al . pagerinus CSH cemento fizikines ir chemines savybes bei osteogeninį aktyvumą, pridedant dikalcio silikato 24 . Petruskevičius ir kt . pasiūlė, kad CSH sujungimas su mažiau rezorbuojančiu kalcio fosfatu būtų geriau pritaikytas žmonėms 25 . Tačiau dauguma CSH pagrindu pagamintų kaulų cementų vis dar nėra tinkami naudoti kaulų audinių inžinerijos tikslais, nes nepavyksta kartu pagerinti nei fizikinių, cheminių savybių, nei biologinio aktyvumo. Taigi vis tiek reikia sukurti geresnius CSH pagrindu pagamintus cemento pastolius kaulų regeneracijai.

Naujausi tyrimai parodė, kad mezoporinis bioaktyvusis stiklas (MBG) pasižymi puikiomis kaulų formavimo biologinėmis savybėmis, skilimu ir vaisto tiekimo savybėmis dėl didelio savito paviršiaus ploto, didelio porų tūrio ir mezoporinės struktūros. Buvo dedama daug pastangų ištirti galimą MBG pritaikymą kaulų audinių inžinerijoje. Pavyzdžiui, Wu ir kt . pranešti 3D atspausdinti MBG pastoliai, turintys kontroliuojamą porų architektūrą, puikų mechaninį stiprumą ir geras mineralizacijos galimybes, galėtų būti puikūs kandidatai kaulų regeneracijai 29 . Zhang ir kt . naudojamas 3D spausdinimas, kad būtų galima gaminti stroncio turinčius MBG pastolius kaulų regeneracijai, kurie sujungė gero kaulus formuojančio biologinio aktyvumo su kontroliuojamu jonų išsiskyrimu, vaisto tiekimu ir padidintu gniuždymo stiprumu privalumus 9 . Be to, bioaktyvus stiklas turi šarminį skilimo produktą ir santykinai lėtą rezorbciją 30, kuris galėtų papildyti CSH. Be to, iki šiol nėra pranešimų apie cemento chemijos derinimą su 3D spausdinimo technika kaulų regeneracijai. Todėl šio tyrimo tikslas yra 3D spausdinimo būdu pagaminti 3D porėtus CSH / MBG cemento pastolius kaulinio audinio inžinerijai. Pirma, MBG įdėjimas gali labai pagerinti kompozicinių pastolių biologines savybes. Antra, CSH sukietėjimas gali dar labiau pagerinti CSH / MBG pastolių mechanines savybes. Be to, naudojant 3D spausdinimo techniką, mes galime tiksliai valdyti pastolių architektūrą ir pagerinti jo mechaninį stabilumą.

Rezultatai

MBG miltelių ir CSH / MBG pastolių apibūdinimas

1A paveiksle parodyta MBG miltelių N2 adsorbcijos-desorbcijos izoterma ir atitinkamas porų dydžio pasiskirstymas. IV tipo izoterma su H1 histerezės kilpų histerezės kilpa (1A1 pav.) Buvo panaši į tą, kuri anksčiau buvo pranešta apie mezoporinius 58S bioaktyvius stiklus, atskleidžiant P6 mm mezoporinę MBG miltelių 31, 32 struktūrą. MBG miltelių BET paviršiaus plotas ir bendras vieno taško tūris, esant P / P 0 = 0, 99, buvo atitinkamai 356 m 2 / g ir 0, 38 cm 3 / g. 1A2 paveiksle parodyta MBG porų dydžio pasiskirstymo kreivė, kuri buvo apskaičiuota iš desorbcijos atšakų, naudojant BJH modelį. Smailių porų dydis buvo 3, 94 nm. TEM stebėjimas parodė, kad MBG milteliuose yra labai tvarkingi mezoporiniai kanalai (1 pav. B), kaip anksčiau buvo pranešta apie 58S bioaktyvius akinius 31 . 2 paveiksle parodyti CSH / MBG pastolių XRD modeliai prieš ir po inkubacijos 37 ° C temperatūroje esant 100% drėgmei 3 dienas. Prieš inkubuojant visuose mėginiuose buvo stebimos CSH smailės (2 pav. A), o po inkubacijos CSD smailės pasirodė visuose mėginiuose (2 pav. B), rodančios nepilną CSH kristalų hidrataciją po reakcijos su vandeniu. Dėl neišsamios CSH transformacijos į CSD inkubacijos metu įvyko kietėjimo procesas.

Image

( A ) N2 adsorbcijos – desorbcijos izotermos ir atitinkamas MBG porų dydžio pasiskirstymas; ( B ) MBG TEM vaizdas.

Visas dydis

Image

( A ) CSH ir CSH / MBG pastolių XRD modeliai prieš 3 dienas kietėjant ir po ( B ).

Visas dydis

Fotomikrografijos ir SEM atvaizdai (3 pav.) Parodė, kad visi CSH / MBG pastoliai turi tą pačią architektūrą ir turi taisyklingą makropoorinę struktūrą. Lygiagreti pagamintų pastolių porų struktūra buvo gana vienoda, o porų dydis ir statramsčio skersmuo buvo atitinkamai ~ 350 μm ir 400 μm. Padidinti paviršių vaizdai parodyti 3 pav. (A2 – D3). MBG dalelės be įprastos morfologijos parodytos CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 mėginiuose. Tačiau į strypus panašūs CSD kristalai buvo matomi CSH, CSH / MBG20 ir CSH / MBG40 pastoliuose, o nedidelis CSD užpildų kiekis CSH / MBG60 pastoliuose (3D2 – D3 pav.) Sukėlė laisvesnį paviršių, palyginti su kitais trim pavyzdžiais. (3A2 – C3 pav.). Be to, galima pastebėti, kad daugybė CSH kristalų liko mikroporose, susidariusiose CSD kaupiant. Įvertinta, kad pastolių CSH, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 poros yra atitinkamai 66, 7 ± 6, 4%, 67, 7 ± 5, 4%, 68, 2 ± 6, 7% ir 68, 3 ± 2, 6%.

Image

CSH ( A1 - A3 ), CSH / MBG20 ( B1 - B3 ), CSH / MBG40 ( C1 - C3 ) ir CSH / MBG60 ( D1 - D3 ) pastolių SEM atvaizdai prieš mirkant SBF, 1 x 200, 2 × 5000 ir 3 × 20000; ir įdėtos atitinkamos optinės nuotraukos, atspausdintos 3D biopoteriu.

Visas dydis

Visų 3D atspausdintų pastolių gniuždymo stipris buvo matuojamas sukietėjus 37 ° C temperatūrai esant 100% santykinei drėgmei įvairiais laikotarpiais (4A pav.) Ir vieną savaitę panardinus SBF (4B pav.). Pailgėjus kietėjimo laikui, CSH, CSH / MBG20 ir CSH / MBG40 pastolių atsparumas gniuždymui parodė pastebimą pagerėjimą. Tačiau CSH / MBG60 pastolių atsparumas gniuždymui neparodė jokio akivaizdaus pokyčio. Po 21 dienos kietėjimo CSH, CSH / MBG20 CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastolių atsparumas gniuždymui buvo atitinkamai 12, 8 ± 0, 7 MPa, 10, 4 ± 0, 5 MPa, 8, 2 ± 1, 3 MPa ir 4, 5 ± 0, 7 MPa. Be to, pastolių, įmirkytų SBF 7 dienas, gniuždymo stipris buvo šiek tiek mažesnis, palyginti su tais, kurie neturėjo SBF mirkyti pastolių (4B pav.).

Image

( A ) CSH ir CSH / MBG pastolių, sukietėjusių įvairiais laikotarpiais, gniuždymo stipris (n = 3; * nurodė reikšmingus skirtumus, palyginti su CSH, P <0, 05); ( B ) CSH ir CSH / MBG pastolių gniuždymo stipris po 7 dienų hidratacijos ir po 7 dienų panardinimo į SBF (n = 3; * nurodė reikšmingus skirtumus, P <0, 05).

Visas dydis

CSH / MBG pastolių degradacija ir apatito mineralizacijos galimybė

Siekiant ištirti skilimo savybes, buvo tiriami pH verčių pokyčiai, taip pat džiovintų pastolių svorio nuostoliai (5 pav.). Kaip parodyta 5A pav., Pastolių pH vertės pasikeitė inkubuojant SBF tirpale. Didėjant MBG masės santykiui, padidėjo pastolių inkubuoto SBF tirpalo pH, o tai gali padėti palengvinti uždegimą, kurį sukelia rūgštinė mikroaplinka 19 . Įvairių pastolių, pamerktų į SBF tirpalus 7 dienas, pH vertės galėtų būti stabilizuotos ties 7, 62, 7, 68, 7, 73 ir 7, 81 atitinkamai CSH, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60. Be to, kaip parodyta 5B pav., MBG papildymas galėtų pakoreguoti CSH / MBG pastolių skilimo greitis. Padidėjęs MBG kiekis lėmė pastolių degradacijos greičio sulėtėjimą, o tai galėtų išspręsti pernelyg greito CSH 20, 21, 22 degradacijos problemą.

Image

( A ) PH vertės ir ( B ) CSH / MBG pastolių skilimas SBF in vitro įvairiais laikotarpiais (n = 3; * nurodė reikšmingus skirtumus, palyginti su CSH, P <0, 05).

Visas dydis

CSH / MBG pastolių paviršiaus morfologija buvo apibūdinta taip, kad būtų galima įvertinti aparato susidarymą po 3 dienų panardinimo į SBF, kaip parodyta 6 pav. Kiekvieno pastolio paviršiuje buvo galima pastebėti akivaizdžių hidroksiapatito sluoksnio skirtumų, palyginti su palyginti lygiu paviršiumi prieš tai. SBF panardinimas (3 pav.). Didėjant MBG kiekiui, padidėjo ir apatitinių kristalinių agregatų tankis. Be to, XRD analizė parodė, kad CSH / MBG pastoliuose buvo aptiktos hidroksiapatito smailės, mirkytos 3 dienas SBF (1 pav. S). EDS analizė parodė visų CSH / MBG pastolių paviršiaus sudėties pokyčius panardinus į SBF, kaip parodyta 6A3 – D3 pav. Po SBF panardinimo EDS spektruose yra akivaizdžių būdingų Ca ir P elementų smailių. CSH, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastolių Ca / P santykiai buvo atitinkamai 2, 33, 1, 89, 1, 69 ir 1, 56. Kadangi CSH pastolių apatitinis sluoksnis buvo gana plonas, Ca ir S signalus taip pat buvo galima aptikti, todėl Ca ​​/ P santykis buvo per didelis (2, 33). Tačiau kitų pastolių Ca / P santykis buvo artimas 1, 67 hidroksiapatito.

Image

CSH ( A1, A2 ), CSH / MBG20 ( B1, B2 ), CSH / MBG40 ( C1, C2 ) ir CSH / MBG60 ( D1, D2 ) pastolių SEM vaizdai po 3 dienų panardinimo į SBF. CSS ( A3 ), CSH / MBG20 ( B3 ), CSH / MBG40 ( C3 ) ir CSH / MBG60 ( D3 ) pastolių EDS analizė, panardinta į SBF.

Visas dydis

Ląstelių atsakai į CSH / MBG pastolius

Norėdami ištirti ląstelių reakciją į CSH / MBG pastolius, mes panaudojome hBMSC. HBMSCs tvirtinimas ir morfologija ant CSH / MBG pastolių buvo stebimas SEM (7 pav.). Po 3 dienų (A1 – D1) arba 7 dienų (A2 – D2) kultūros hBMSCs buvo pritvirtintos prie porų statramsčių paviršiaus, gerai parodant kiekvieno tipo pastolių morfologiją. Tačiau hBMSCs tankis CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastoliuose buvo didesnis nei CSH pastoliuose.

Image

SB vaizdai, kuriuose hBMSC yra pritvirtinti prie CSH ( A1, A2 ), CSH / MBG20 ( B1, B2 ), CSH / MBG40 ( C1, C2 ) ir CSH / MBG60 ( D1, D2 ) pastolių po ląstelių auginimo 3 dienas ir Atitinkamai 7 dienos.

Visas dydis

HBMSC, auginamų CSH, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastoliuose, dauginimasis 3 ir 7 dienas yra parodytas 8A pav. Kaip nustatyta CCK-8 proliferacijos tyrimu, CSH, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastoliai palaikė hBMSC proliferaciją ilgėjant kultūrai. Vis dėlto CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastolių plitimo procentai buvo žymiai didesni nei CSH / pastolių ( P <0, 05). HBMSCs, auginamų ant CSH / MBG pastolių 7 ir 14 dienų, ALP aktyvumas parodytas 8B pav. Panašiai kaip ir proliferacijos rezultatai, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastoliai pasižymėjo žymiai padidintu ALP aktyvumu, palyginti su CSH pastoliais ( P <0, 05).

Image

( A ) hBMSC, auginamų CSH ir CSH / MBG pastoliuose, parodytų 1, 3 ir 7 dienas (n = 3), kiekybinė analizė; ( B ) hBMSC, auginamų 7 ir 14 dienų, ALP aktyvumas CSH ir CSH / MBG pastoliai ( * nurodė reikšmingus skirtumus, palyginti su CSH, P <0, 05).

Visas dydis

HBMSCs diferenciacija ant CSH / MBG pastolių buvo toliau įvertinta osteogenine ekspresija, nustatyta pagal osteogeninių žymenų OCN, OPN, ALP ir RUNX2 ekspresiją 7 ir 14 dienų metu (9 pav.). Genų ekspresijos analizės rezultatai parodė, kad MBG įtraukimas į CSH pastolius gali skatinti hBMSCs osteogeninę diferenciaciją. Ilgėjant auginimo laikui, visų osteogeninių genų ekspresija buvo sureguliuota CSH / MBG pastoliuose. Be to, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 pastoliai pasižymėjo padidintu ekspresijos lygiu, palyginti su CSH pastoliais ( P <0, 05).

Image

Osteogeninė OCN ( A ), OPN ( B ), ALP ( C ) ir RUNX2 ( D ) ekspresija hBMSC, auginamiems CSH ir CSH / MBG pastoliuose, naudojant qRT-PGR analizę po 7 ir 14 dienų (n = 3; * nurodyta) reikšmingi skirtumai, palyginti su CSH, P <0, 05).

Visas dydis

Kaulų regeneracijos analizė esant kalvarijų defektams

Mikro-KT vaizdai, kuriuose pavaizduota sureguliuotų kalvarialinių kaulų 3D morfologija ir 2D pjūviai 8-ą savaitę, yra pateikti 10 pav. Žiūrint iš sagitalinio (10A3 – D3 pav.), CSH grupės defektų srityje kaulų augimas buvo stebimas nedaug. Tačiau CSH / MBG grupė parodė padidėjusį naujų kaulų formavimąsi, priskirtiną MBG įtraukimui į CSH pastolius. Vietinis KMT buvo 0, 21 ± 0, 03 g / cm 3 CSH / MBG20 grupėje, 0, 3 ± 0, 03 g / cm 3 CSH / MBG40 grupėje ir 0, 675 ± 0, 04 g / cm 3 CSH / MBG60 grupėje (10E pav. ), ir visi šie rodikliai reikšmingai skyrėsi CSH grupėje (0, 056 ± 0, 01 g / cm 3 ) ( P <0, 05). Be to, BV / TV parodė tą pačią tendenciją kaip ir KMT rezultatai (10F pav.), Atskleisdami reikšmingą skirtumą tarp CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60 grupių bei CSH grupės ( P <0, 05). Šie rezultatai rodo, kad CSH / MBG pastoliai skatina geresnį kaulų regeneraciją, palyginti su CSH pastoliais, ir tai atitinka qRT-PCR analizės rezultatus.

Image

Reprezentatyvūs 3D paviršiniai ( A1 - D1 ), vidiniai vaizdai ( A2 - D2 ) ir sagitaliniai atvaizdai ( A3 - D3 ), susiję su kalvariumo kaulo defektais, padarytais praėjus 8 savaitėms po pastolių implantavimo. Kaulų mineralinio tankio (BMD) ( E ) ir kaulų tūrio / bendro tūrio (BV / TV) ( F ) morfometrinė analizė atlikta atliekant mikro-KT kiekvienai grupei praėjus 8 savaitėms po operacijos ( * parodė reikšmingus skirtumus, palyginti su CSH, P <0, 05).

Visas dydis

Van Giesono pikofuksino dažymo analizė aiškiai parodė, kad CSH grupėje nesusiformavo nė vienas naujas kaulas (11A pav.), O CSH / MBG20 grupėje buvo pastebėtas tik nedidelis kiekis naujų kaulų (11B pav.). Priešingai, CSH / MBG40 grupėje (11 pav. C) naujai susiformavusio kaulo įaugimas buvo akivaizdus centrinėje defektų srityje, taip pat periferinėje srityje šalia jau esančio kaulo. CSH / MBG60 grupėje aktyviausiai kaulai formavosi; naujai susiformavę kauliniai audiniai buvo palyginti stori ir beveik uždengė defekto vietą (11 pav. D). Histomorfometriniai rezultatai parodė, kad naujojo kaulo srities procentas buvo žymiai didesnis CSH / MBG20 pastolių grupėje (9, 33 ± 1, 86%), CSH / MBG40 grupėje (14, 33 ± 1, 51%) ir CSH / MBG60 grupėje (28, 83 ± 2, 64). %), palyginti su CSH grupe (5, 17 ± 1, 47%) ( P <0, 05) (11E pav.).

Image

Reprezentatyvūs naujai susiformavusio kaulo, esančio defekto srityje, histologiniai mikrofotografai ( A - D ), raudona rodyklė: CSH ir CSH / MBG pastoliai, mėlyna rodyklė: naujai suformuotas kaulas. ( E ) Naujo kaulų ploto procentinė dalis, įvertinta histomorfometrine analize praėjus 8 savaitėms po implantacijos. ( * nurodė reikšmingus skirtumus, palyginti su CSH pastoliais; P <0, 05).

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime sėkmingai pagaminome 3D porėtus CSH / MBG pastolius, naudodami 3D spausdinimo techniką. 3D spausdinimas leidžia tiksliai kontroliuoti pastolių, taip pat statramsčių, porų dydį ir morfologiją. JAV maisto ir vaistų administracija (FDA) patvirtino, kad polikaprolaktonas (PCL) yra biologiškai skaidomas ir biologiškai suderinamas polimeras, ir buvo plačiai naudojamas klinikinėse srityse, tokiose kaip protezavimo prietaisai, implantai, audinių inžinerija, oda ir vaistų tiekimo sistemos 9., 12, 13, 33, 34 . Todėl PCL buvo naudojamas kaip rišiklis CSH / MBG pastoliams gaminti. Palyginus su tradiciniais CSH cementais 18, 23, 3D atspausdinti CSH / MBG pastoliai turėjo taisyklingą ir vienodą kvadrato formos makroporas, kurių porų dydis ir poringumas buvo atitinkamai maždaug 350 μm ir 68% (2 pav. S). Apskritai, didesnių nei 150 μm makroporų porų dydis ir didelis poringumas yra idealūs pastoliuose, naudojamuose kaulų regeneracijai, nes jie palengvina ląstelių dauginimąsi, kraujagyslių augimą ir vidinį mineralizuotų kaulų formavimąsi 29 . Todėl mūsų 3D atspausdinti CSH / MBG pastoliai turėjo pageidaujamą makropoorinę struktūrą, tinkančią kaulų regeneracijai.

Tačiau polimerų panaudojimas kaip rišiklis pastiesiems gaminti kaulų regeneracijai taip pat turi keletą trūkumų. Pavyzdžiui, polimerai, įdedami į spausdinimo pastą kaip klijai milteliams, siekiant padidinti pastolių stiprumą, pasirodė nepakankami 35, 36, 37 . Tačiau šiame tyrime įvairūs CSH kristalų kiekiai buvo įtraukti į CSH / MBG pastolius. Dėl greito CSH hidratacijos ir savaiminio nusistatymo CSD susidarė per gana trumpą laiką, sukietėjus keramikos milteliams ir taip pagerinant pradinį pastolių stiprumą. Kaip parodyta 3 pav., CSH strypai virto CSD lakštais po apdorojimo kietėjimu, dėl to sumažėjo visos sistemos poringumas ir dalelės tapo kompaktiškos. Be to, kaip parodyta 4 pav., CSH / MBG pastolių mechaninis stiprumas nepaprastai pagerėjo vandens valymu. 20% CSH pakeitus MBG, maždaug po 50% padidėjo stiprumas po vienos savaitės hidratacijos, o padidėjimas padidėjo net 110% po trijų savaičių. Be to, 40% CSH pakeitimas taip pat padidino stiprumą, o pagerėjimas padidėjo atitinkamai 10% ir 40% po 1 ir 3 savaičių vandens valymo. Tačiau keičiant CSG MBG iki 60%, vandens inkubacija turėjo labai nedidelę įtaką CSH / MBG60 pastolių mechaniniam stiprumui, kuris išliko maždaug 4 MPa.

CSH turi rūgščių skilimo produktų - savybę, kuri nėra naudinga ląstelių gyvybingumui ir proliferacijai 19 . Be to, pernelyg greitas CSH skaidymas yra nesuderinamas su naujo kaulo formavimu 19, 21, 22 . MBG dalelėse esančios kalcio rūšys buvo laisvai suskaidytos silicio dioksido tinkle ir lengvai išleistos į išorę. Ca 2+ hidrolizacija sąlygojo OH grupių gamybą, todėl padidėjęs MBG pakeitimas CSH galėtų stabilizuoti pastolių pH aplinką (5A pav.). Po vienos savaitės panardinimo į SBF, CSH / MBG60 pastolių pH vis tiek buvo palaikomas 7, 8. Be to, MBG skilimo greitis yra lėtesnis nei CSH. Taigi CSH / MBG pastolių degradacijos greitį įmanoma sureguliuoti keičiant MBG turinį, kaip parodyta 5B pav.

Biomaterjalų paviršiuje susidaręs apatito sluoksnis fiziologiniame skystyje yra labai reikšmingas, prisidedantis prie osteoblastinio aktyvumo, įskaitant proliferaciją ir diferenciaciją, taip pat numatant kaulų biologinį aktyvumą in vivo 28, 31, 38 . Mūsų tyrimas rodo, kad CSH pastoliai turi labai apatitinę mineralizaciją. Tačiau, padidinus MBG kiekį CAH / MBG pastoliuose, žymiai padidėjo apatitų sluoksniai ant pastolių (6 pav.). Apatinių mineralizacijos CSH / MBG pastoliuose mechanizmas yra tas, kad Ca 2+ jonai iš MBG miltelių pirmiausia išsiskiria, kad sudarytų Si turtingą sluoksnį, kuris paskui skatina Ca – P branduolio susidarymą ir tolesnį apatito kristalų susidarymą 39 . Todėl MBG įvedimas į medžiagas, kurių pagrindą sudaro kalcio sulfatas, galėtų pagerinti jų biologinį aktyvumą.

Ląstelių ir medžiagų sąveika daro didelę įtaką hBMSC adhezijai, judrumui, proliferacijai ir diferenciacijai, kurie yra svarbūs žingsniai, vykstantys prieš kaulų mineralizaciją 40, 41 . CSH / MBG pastoliai vis labiau skatino hBMSCs proliferaciją, ALP aktyvumą ir su osteogeneze susijusią genų ekspresiją, didinant MBG. Palyginti su įprastu bioaktyviu stiklu, MBG turi didesnį Ca ir Si kiekį ir stabilią pH aplinką ląstelių kultūros terpėje, o tai gali skatinti ląstelių augimą, proliferaciją ir diferenciaciją 42 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad, palyginti su CSH pastoliais, CSH / MBG pastoliai atpalaidavo Ca ir Si jonus ir stabilizavo aplinkinį pH, sukurdami geresnę osteogenezės mikroaplinką, kuri gali prisidėti prie didesnio hBMSC adhezijos, proliferacijos ir diferenciacijos CSH / MBG pastoliai.

CSH / MBG pastolių vaidmuo kaulų regeneracijai in vivo buvo nustatytas ištyrus jų sugebėjimą atitaisyti žiurkių modelio kritinio dydžio kalvarijų defektus. Mikro-CT kiekybinė analizė parodė, kad CSH / MBG pastoliai gali žymiai pagerinti osteogenezę kalvarijų defektų modelyje. CSH / MBG pastoliai žymiai pagerino naujų kaulų formavimąsi, o efektyvumas didėja didėjant MBG kiekiui. Histologinė analizė taip pat parodė, kad CSH pastolių grupėse defektų vietose nedaug buvo naujai susiformavusių kaulų, tuo tarpu CSH / MBG pastolių grupės reikšmingai skatino kaulų formavimąsi, o rezultatai atitiko mikro-KT duomenis. MBG papildymas CSH pastoliuose galėjo sureguliuoti Si ir Ca jonų išsiskyrimą, stabilizuoti pH aplinką ir suderinti CSH / MBG pastolių skilimo greitį naujais kaulais. Tai padidino osteogeninio našumo laipsnį in vivo, palyginti su CSH pastoliais.

Išvados

CSH / MBG pastoliai su hierarchine porų architektūra buvo sėkmingai paruošti 3D spausdinimo technika. CSH / MBG pastoliai turėjo vienodus tarpusavyje sujungtus makroporus, didelį poringumą ir pagerintas mechanines savybes. CSH / MBG pastoliai pasižymėjo geru apaito formavimo gebėjimu. Be to, mūsų rezultatai parodė, kad MBG pridėjimas prie CSH pastolių stimuliavo hBMSC adheziją, proliferaciją, ALP aktyvumą ir su osteogeneze susijusią genų ekspresiją. In vivo tyrimais CSH / MBG pastoliai galėjo žymiai pagerinti naujų kaulų formavimąsi esant kalvarijų defektams, palyginti su CSH pastoliais. Visi šie rezultatai rodo, kad 3D atspausdinti CSH / MBG pastoliai yra perspektyvūs kandidatai skatinti kaulų regeneraciją.

Medžiagos ir metodai

Etinis patvirtinimas šiam tyrimui buvo gautas Šanchajaus šeštosios žmonių ligoninės tyrimų etikos komitete, priklausančiame Šanchajaus Jiao Tong universitetui. Visi metodai buvo atlikti laikantis atitinkamų Šanchajaus šeštosios Liaudies Ligoninės Tyrimų etikos komiteto gairių ir taisyklių, visus eksperimentinius protokolus patvirtino Šanchajaus Šeštosios Liaudies Ligoninės Tyrimų etikos komitetas - Šanchajaus Jiao Tongo universitetas. Su žmonėmis atlikti tyrimai turi atitikti Helsinkio deklaraciją. Žmogaus kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės (hBMSC) buvo gautos iš trijų donorų, davusių rašytinį informuotą sutikimą.

Medžiagos

Nejoninis blokinis kopolimeras EO20PO70EO20 (P123, Mw = 5800) buvo pirktas iš BASF (Ludwigshafen, Vokietija). Druskos rūgštis (HCl, ≥ 36%), tetraetil-orto silikatas (TEOS, 98%), trietilo fosfatas (TEP, 99, 8%), etanolis (99, 7%) ir kalcio nitratas (Ca (NO 3 ) 2 · 4H 2 O, 99%). ) buvo įsigyti iš „Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.“ (Šanchajus, Kinija) CaSiO 4 · 1 / 2H 2 O (CSH, ≥97, 0%) milteliai buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV). Polikaprolaktonas (PCL, Mn70 000–90 000) buvo pirktas iš „Sigma-Aldrich“. Visos cheminės medžiagos buvo naudojamos be papildomo gryninimo.

CSH / MBG pastolių gamyba 3D spausdinimu

MBG milteliai (Si / Ca / P molinis santykis 80/15/5) buvo paruošti naudojant nejoninį blokinį kopolimerą EO20PO70EO20 (P123) kaip struktūrą nukreipiantį agentą pagal anksčiau aprašytą metodą 28 . 3D 3-D Bioplotter ™ (EnvisionTEC GmbH, Vokietija) buvo naudojami 3D CSH / MBG pastoliams gaminti. Prieš spausdinant pastolius, injekuojama CSH / MBG pasta buvo ruošiama taip: Pirmiausia buvo sumalami skirtingi MBG ir CSH miltelių masės santykiai (100: 0, 80:20, 60:40, 40:60) ir išleidžiami per 300 akių. sietai, iš kurių susidaro homogeniniai milteliai, kurių dalelių dydis yra mažesnis kaip 45 μm. Šiame tyrime PCL buvo pasirinktas kaip rišiklis 3D spausdinimui. Toliau 1, 5 g PCL buvo visiškai ištirpinta 5 ml chloroformo ir į PCL tirpalą įpilama 3, 5 g MBG / CSH miltelių mišinio, greitai maišant kambario temperatūroje, kad susidarytų injekcinė pasta. Galiausiai paruošta pasta buvo įdėta į polietileno įpurškimo kasetę, kuri pritvirtinta prie 3D Bioplotter ™ spausdintuvo.

Tuo pačiu metu cilindrų modeliai (φ8 × 2 mm, φ8 × 10 mm ir jų porų dydis buvo 350 μm) buvo įkelti į „Bioplotter CAD / CAM“ programinę įrangą ir pastoliai buvo pažymėti sluoksniu po sluoksnio, ekstruzijoje pastos kaip pluošto, iki 25 sluoksniai. Architektūra buvo pakeista nubraižant pluoštus 0 ir 60 kampų žingsniais tarp dviejų vienas po kito einančių sluoksnių, dozavimo slėgis į švirkšto pompą buvo 2, 2–3, 6 bar, o dozatoriaus greitis buvo 4, 5–8, 2 mm / s, purkštuko dydis 0, 4 mm. Pagaliau gatavi pastoliai buvo pavadinti CSH, CSH / MBG20, CSH / MBG40 ir CSH / MBG60, atsižvelgiant į skirtingą CSH ir MBG miltelių masės santykį. Prieš naudojimą, visi pastoliai buvo kietinami 100% drėgmės vandens vonelėje 37 ° C temperatūroje įvairiais laikotarpiais.

Charakteristika

Plačiakampiai XRD modeliai buvo gauti naudojant Bruker D8 anksto rentgeno miltelių difraktometrą (Bruker Corp., Billerica, MA, JAV). Skanavimo elektronų mikroskopija (SEM) buvo atlikta naudojant FEI Quanta 450 lauko emisijos skenavimo elektroninį mikroskopą („Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV). Perdavimo elektronų mikroskopija (TEM) buvo atlikta naudojant JEM-2010 elektronų mikroskopą (Jeol Ltd., Tokijas, Japonija), veikiantį 200 kV pagreičio įtampa. N2 adsorbcijos – desorbcijos izotermos buvo gautos „MicromeriticsTristar 3020“ („Micrometrics Instrument Corp.“, Norcross, GA, JAV), esant –196 ° C, nepertraukiamos adsorbcijos sąlygomis. Norėdami nustatyti paviršiaus plotą, porų dydžio pasiskirstymą ir porų tūrį, buvo naudojami Brunauer-Emmett-Tellwe (BET) ir Barrett-Joyner-Halenda (BJH) metodai.

CSH / MBG pastolių (φ8 × 10 mm), laikomų vandens vonioje 37 ° C temperatūroje skirtingais laikotarpiais, gniuždymo stipris buvo patikrintas naudojant „Zwick“ statinių medžiagų bandymo mašiną (5 kN) (Zwick Roell, Ulmas, Vokietija). esant 0, 5 mm / min skersinei galvai.

CSH / MBG pastolių poringumas buvo matuojamas naudojant Archimedo principą: matavimui buvo naudojami CSH / MBG pastoliai (φ8 × 10 mm), o kaip skysta terpė buvo naudojamas vanduo. Akytumas (P) buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę: P = (W sat - W sausa ) / (W sat - W sus ) × 100%, kur W sausas yra CSH / MBG pastolių sausas svoris, W sus yra vandenyje suspenduotų CSH / MBG pastolių svoris ir W sat yra CSH / MBG pastolių, prisotintų vandeniu, svoris.

CSH / MBG pastolių degradacija ir apatito mineralizacijos galimybė

Visi sudėtiniai pastoliai buvo inkubuojami šviežiai pagamintame imituotame kūno skystyje (SBF) santykiu 1 g pastolių per 200 ml SBF, esant 37 ° C, per 30 dienų, SBF keičiant kas 7 dienas. Kiekvieno SBF pokyčio metu buvo užrašytos tirpalo pH vertės ir džiovintų pastolių svoris. Visų tiriamų pastolių paviršiaus morfologijai stebėti po 3 dienas mirkant SBF, buvo naudojama SEM ir energijos dispersinė spektrometrija (EDS).

Ląstelių atsakas į CSH / MBG pastolius

Trumpai tariant, smegenų čiulpai buvo išgauti iš šlaunikaulio vidurinio veleno ir po to suspenduoti mažiausiai būtinoje terpėje, kurioje yra 10% vaisiaus vaisiaus serumo (Hyclone; GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 100 V / ml penicilino ir 100 mg / L streptomicino (Hyclone). Vėliau nelipnios ląstelės buvo išmetamos; lipnios ląstelės susiliejo iki 80–90% santakos ir buvo pakeistos kaip vienos praėjimo (P1) ląstelės. Eksperimentams buvo naudojamos P3 ląstelės.

Ląstelių adhezija ir proliferacija

hBMSC (1 × 105 ląstelių / ml) buvo pasėtos į sterilizuotus pastolius (5 mm skersmens × 3 mm) į 24 šulinėlių auginimo plokšteles ir inkubuotos DMEM, papildytame 10% FBS, esant 37 ° C, 5% drėgnoje atmosferoje. CO 2 . Po 3 ir 7 dienų pastoliai su pritvirtintomis ląstelėmis buvo pašalinti, 3 kartus nuplauti PBS ir fiksuoti 2, 5% glutaraldehide 24 valandas. Pastovieji mėginiai buvo tris kartus plauti PBS ir dehidratuoti per rūšinį etanolio kiekį (50%, 70%, 90%, 95% ir 100%), po to mirkyti heksametildisilizane (HMDS) 4 valandas. Mėginiai buvo padengti auksu, o pritvirtintų ląstelių morfologinės savybės buvo tiriamos naudojant SEM (FEI Quanta 450).

HBMSC proliferacija ant pastolių buvo įvertinta naudojant ląstelių gyvybingumo testą (Cell Counting Kit-8 (CCK-8); Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japonija). Trumpai tariant, hBMSCs buvo kultivuojami ant pastolių (n = 3), atlikus aukščiau aprašytą procedūrą, pradiniu 1 × 10 4 ląstelių tankiu tankiuose 1, 3 arba 7 dienas. Pasibaigus auginimo laikotarpiui, į kiekvieną duobutę kiekvienu laiko momentu buvo įpilama 360 µL auginimo terpės ir 40 µL CCK-8 tirpalo (9: 1), o sistema inkubuota 37 ° C temperatūroje 4 valandas. Alikvotai (100 μL) buvo pašalinti iš šulinėlių ir perkelti į šviežią 96 šulinėlių plokštelę. Mėginių absorbcija buvo išmatuota esant 450 nm bangos ilgiui, naudojant spektrofotometrinį mikroteklių plokštelių skaitytuvą (Bio-Rad 680; Bio-Rad, Hercules, CA, JAV).

HBMSCs šarminės fosfatazės (ALP) aktyvumas CSH / MBG pastoliuose

Norint įvertinti osteoblastinį hBMSC, išaugintų ant pastolių, diferenciaciją, ALP aktyvumas buvo matuojamas 7 ir 14 dienomis po to, kai 1 x 105 hBMSC buvo pasėjami ant kiekvieno pastolio (n = 3). Iš anksto nustatytu laiku kultūros terpė buvo dekantuojama, ląstelių sluoksnis tris kartus švelniai plaunamas PBS, po to vieną kartą plaunant šaltu 50 mM Tris buferiu, o hBMSCs lizuotas 200 μL 0, 2% Triton X-100. Lizatai buvo ultragarsu apdoroti po to, kai buvo centrifuguoti 14 000 g 15 minučių 4 ° C temperatūroje, tada 50 μL supernatantas buvo sumaišytas su 150 μL darbiniu tirpalu pagal gamintojo protokolą (BeyotimeInstitute of Biotechnology, Jiangsu, Kinija). P-nitrofenilfosfato virsmas p-nitrofenoliu, esant ALP, buvo nustatytas matuojant absorbciją 405 nm bangos ilgyje, naudojant mikroteklių plokštelių skaitytuvą (Bio-Rad 680).

HBMSCs su osteogenu susijusi genų ekspresija CSH / MBG pastoliuose

Su osteogenu susijusių genų, susijusių su runtu, 2-ojo transkripcijos faktoriaus (RUNX2), osteokalcino (OCN), šarminės fosfatazės (ALP) ir osteopontino (OPN) ekspresijos lygiai buvo išmatuoti naudojant qRT-PCR. Paprastai ląstelės buvo sėjamos 1x105 ląstelių tankiu kiekviename pastolyje, auginamos 2 savaites ir buvo surinktos naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific), kad būtų galima išskirti RNR. Gauta RNR buvo atvirkščiai perrašyta į papildomą DNR (cDNR) naudojant „Revert-Aid First Strand“ cDNR sintezės rinkinį („Thermo Fisher Scientific“), o qRT-PGR analizė buvo atlikta naudojant ABI Prism 7300 šiluminį ciklą (Applied Biosystems, Foster City, CA), JAV), naudojant reagentą „SYBR Green“. Santykinė dominančių genų išraiška buvo normalizuota, palyginti su namų tvarkymo genu β-aktinu. Visi mėginiai buvo tiriami trimis egzemplioriais ir buvo atlikti nepriklausomi eksperimentai. Santykinė išraiška buvo apskaičiuota pagal šią formulę: 2 - (normalizuotas vidutinis Ct) × 100.

Eksperimentai su gyvūnais

Eksperimentus su gyvūnais patvirtino Šanchajaus šeštosios žmonių ligoninės mokslinių tyrimų etikos komitetas, priklausantis Šanchajaus Jiao Tongo universitetui, ir jie buvo atlikti laikantis laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo protokolų. Trumpai tariant, 48 subrendę žiurkių „Sprague – Dawley (SD) žiurkės (vidutinis kūno svoris 250–300 g) buvo aprūpintos steriliu maistu ir vandeniu ir laikomos barjerinėje patalpoje 12 valandų šviesos / tamsos ciklu. Šios žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes, kiekvienoje iš jų buvo šešios žiurkės. Atliekant chirurginę procedūrą, kaip aprašyta anksčiau 43, gyvūnai buvo anestezuojami intraperitoniniu būdu sušvirkščiant chloralinį hidratą (4%; 9 ml / kg kūno svorio) ir visos operacijos buvo atliktos steriliomis sąlygomis. Galvos odoje padarytas 1, 5 cm sagitalinis įpjovimas, o kalvarija buvo paveikta pjaunant bukas. Dantų trefinu buvo sukurti du kritinio dydžio kalvarijų defektai, kurių abipusis skersmuo buvo 5 mm, ir pastoliai buvo implantuoti į defektus. Po operacijos gyvūnams buvo sušvirkštos raumenys antibiotikų, jiems buvo suteikta laisva prieiga prie maisto ir vandens ir kasdien stebimi dėl galimų komplikacijų. Po aštuonių savaičių po operacijos žiurkės buvo nužudytos perdozavus anestetiko, o jų kaukolės buvo surinktos ir fiksuotos 4% paraformaldehido tirpale, buferiniame su 0, 1 M fosfato tirpalu (pH 7, 2) per naktį, prieš atliekant tolesnę analizę.

Mikrokompiuterinės tomografijos (mikro-KT) analizė

Visi surinkti mėginiai buvo ištirti naudojant mCT-80 sistemą, kad būtų galima įvertinti naujų kaulų susidarymą defekto srityje. Neapibrėžti mėginiai buvo nuskaityti 18 μm skiriamąja geba. Atlikus 3D rekonstrukciją, kaulų mineralinis tankis (BMD) ir kaulų tūrio frakcija (kaulų tūris / bendras tūris [BV / TV]) defektų vietose buvo naudojami apskaičiuojant naujo kaulo formavimąsi naudojant papildomą „mCT-80“ sistemos 44 programinę įrangą.

Histologinė analizė

Kiekvienas kaukolis buvo dehidratuotas per 70–100% rūšies alkoholio, o po to įterptas į polimetilmetakrilatą. Po sukietėjimo išilginiai pjūviai mikrotomu („Leica Microsystems Ltd“, Wetzlar, Vokietija) supjaustomi į 150–200 μm griežinėliais, priklijuojami ant plastikinės atramos ir poliruojami iki galutinio apytiksliai 50 μm storio. Naujų kaulų susidarymas ir mineralizacija buvo kiekybiškai įvertinti keturiose vietose, kurios vienodai paskirstė defekto vietą tarp dviejų išilginių pjūvių galų. Buvo apskaičiuota vidutinė keturių matavimų vertė, kad būtų gautos vidutinės kiekvienos grupės vertės. Po to sekcijos buvo nudažytos van Giesono pikofuksinu, kad būtų galima įvertinti naujų kaulų susidarymą 43 . Naujų kaulų formavimosi sritis buvo kiekybiškai įvertinta šešiuose atsitiktiniuose pjūviuose naudojant „Image Pro 5.0“ programinę įrangą (Media Cybernetics, Rockville, MD, JAV).

Statistinė analizė

Duomenys buvo surinkti iš trijų atskirų eksperimentų ir išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. Reikšmingumo lygiui nustatyti buvo naudojami vienpusiai ANOVA ir Studentų – Newmanų – Keulsų post-hoc testai, o P reikšmės <0, 05 buvo laikomos reikšmingomis.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Qi, X. et al . Trimatis kalcio sulfato ir mezoporinių bioaktyvių stiklinių pastolių spausdinimas, siekiant pagerinti kaulų regeneraciją in vitro ir in vivo. Mokslas. Rep. 7, 42556; „doi“: 10.1038 / srep42556 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas 1S paveikslas

  2. 2.

    Papildomas 2S paveikslas

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.