Gerybinių ir piktybinių prostatos epitelio ląstelių transkriptominės analizės formalinu fiksuotuose parafinuose įterptuose ištisai pritvirtintuose radikalios prostatektomijos mėginiuose | prostatos vėžys ir prostatos ligos

Gerybinių ir piktybinių prostatos epitelio ląstelių transkriptominės analizės formalinu fiksuotuose parafinuose įterptuose ištisai pritvirtintuose radikalios prostatektomijos mėginiuose | prostatos vėžys ir prostatos ligos

Anonim

Anotacija

Formaline fiksuoti parafinu įterpti (FFPE) prostatos pavyzdžiai yra turtingi molekulinės patologinės informacijos šaltiniai. Tačiau audinių mėginių, atliktų FFPE pagrindu, mikrotraumų analizę gali trukdyti RNR molekulių skaidymas ir cheminis pakeitimas dėl konservavimo procedūros. Šioje ataskaitoje mes panaudojome zondo analizę „Affymetrix“ oligonukleotidų masyvuose kiekvieno zondo lygyje, kad kompensuotume galimą genų identifikavimo praradimą, susijusį su pakenkta mRNR kokybe FFPE preparatuose. Be to, norėdami pagerinti mėginio kokybę, mes panaudojome prostatos naviko ir gerybinių epitelio ląstelių mikrodiskreciją lazeriu. Pažymėtina, kad šių metodų derinys atspindėjo bendrą su prostatos vėžiu susijusį genų ekspresijos pokytį. Su prostatos vėžiu susijusių genų raiškos pokyčių, tokių kaip AMACR , Kallikrein genų šeima, ir genų, susijusių su androgenų signalizavimu, tokių kaip PDEF ir STEAP, identifikavimas atitiko ankstesnius prostatos vėžio duomenis. Šie duomenys leidžia manyti, kad diskrecijos lazeriu derinimas su skaičiuojamuoju mikrotrauminio duomenų padidinimu gali būti naudingas vertinant genų ekspresijos pokyčius FFPE prostatos vėžio mėginiuose.

Įvadas

Per praėjusį šimtmetį ląstelių patologija, pagrįsta šviesos mikroskopija, pritaikė ir įtraukė naujas technologijas, pavyzdžiui, elektronų mikroskopiją, imunohistochemiją ir molekulinės biologijos metodus, gerinančius normalių ir sergančių audinių tyrimus. Beveik visi klinikiniai ir autopsijos mėginiai, taip pat ir iš pacientų, kuriems stebimas ilgalaikis stebėjimas, ir iš didelių klinikinių tyrimų, yra fiksuojami formalinu ir įterpti į parafiną (FFPE). 1988 m. „Rupp“ ir „Locker 1“ sugebėjo sėkmingai išgauti RNR iš FFPE audinių, tačiau stebėjo RNR skilimą. Todėl šio tipo audiniai buvo laikomi netinkamais daugeliui genomikos ir proteomikos metodų. Tačiau Reidas ir kt. 2 sėkmingai ištraukėme 1918 m. Ispanų gripo viruso hemagglutinino RNR iš mūsų ginkluotųjų pajėgų patologijos instituto (AFIP) archyvuotų pacientų, kuriems pasibaigė 1918 m. Ispanijos gripo protrūkis, skrodimų FFPE pavyzdžių.

Naudojant RNR kaip pradinę medžiagą, dauguma pastangų analizuoti pasaulines genų ekspresijas buvo paremti užšaldytais audiniais, kurie paprastai neatspindi plataus spektro histologinių pokyčių, pastebėtų gerybinių, pirmtakų pažeidimų, invazinių navikų ir jų metastazių, stebėtų FFPE mėginiuose. Pastaruoju metu nemažai publikacijų pabrėžia FFPE pavyzdžių naudingumą pasaulinei genų ekspresijos analizei. 3, 4, 5

Šio tyrimo tikslas yra nustatyti prostatos karcinomos FFPE audinių tinkamumą atlikti „ląstelių tipui būdingus“ visuotinius genų ekspresijos vertinimus.

medžiagos ir metodai

Tyrimo populiacija ir mėginių apdorojimas

Šešių prostatos vėžiu sergančių pacientų, gydomų Walterio Reedo armijos medicinos centre (WRAMC), prostatektomijos pavyzdžiai buvo apdoroti pagal AFIP protokolą. Sušaldytų audinių mėginiai buvo gauti atliekant prostatektomiją. Audinių mėginių ėmimo schema parodyta papildomame S1 paveiksle. Operaciniame kambaryje užšaldyto audinio vieta buvo paženklinta Indijos rašalu, kad būtų lengviau atpažinti visus pritvirtintus parafinu įterptus prostatektomijos pavyzdžius (WMRPS). Užšaldyti audiniai buvo laikomi OCT (optimali pjovimo temperatūra) junginyje -80 ° C temperatūroje. Prostatos buvo fiksuotos 10% neutraliame buferiniame formaline mažiausiai 72 valandas prieš pjaustymą po 2, 25–2, 3 mm intervalus ir visiškai įmerktos į žemai tirpstantį parafiną kaip sveiką jungtį. Histopatologinei analizei buvo naudojami 4 μm storio hematoksilino ir eozino dažyti pjūviai. Kiekvienas atskiras navikas buvo surūšiuotas pagal Gleason klasifikavimo sistemą ir PSO / Mostofi klasifikavimo sistemą branduolinio laipsnio ir liaukų diferenciacijai suskirstyti pagal stadijas pagal TNM (navikas, mazgas, metastazės) sistemą. 6, 7, 8 Visuose stovuose užšaldytos sekcijos vietos galėjo būti atpažįstamos pagal Indijos rašalą.

Iš 18 pacientų, naudojamų užšaldytų mėginių mikrorajonų analizei, 9 šeši buvo atsitiktinai parinkti šiam tyrimui. Operacijos metai, naviko laipsnis ir stadija nurodyti S1 papildomoje lentelėje. Užšaldyto mėginio hematoksilino ir eozino skyriai bei atitinkama prostatektomijos dalis buvo peržiūrėti, kad būtų galima palyginti palyginus tarp užšaldytų ir parafino mėginių ateities tyrimams.

Lazeriu užfiksuotas mikrodiskrecija

Prostatos epitelio ląstelėms iš FFPE audinių sekcijų mikrodiskutuoti buvo naudojama „PixCell II“ lazerio gaudymo mikrodisekcijos sistema (Arcturus, Mountain View, CA, JAV). Kiekvienam bandiniui buvo panaudota maždaug 2000 kadrų, kad būtų gauta maždaug 5000–6000 ląstelių, kaip aprašyta anksčiau. 9 Vienas šūvis paprastai užėmė 2–3 langelius. Lazerio galia (diapazonas 25–100 mW) ir impulsų trukmė (diapazonas 550 μs – 6, 0 ms) buvo sureguliuoti kiekviename bandinyje, kad būtų galima pilnai užfiksuoti audinį naudojant 7, 5–30 μm taškinio dydžio lazerio spindulį. Patologo akis nustatė, kad optimali ląstelių mėginių kokybė yra mažesnė nei 10% užkrėtimo stromos audiniu.

Dangtelis, kuriame yra užfiksuotas audinys, buvo dedamas į mikrotubulą ir paruoštas tolesniam perdirbimui.

RNR ekstrahavimas ir T7 pagrįstas tiesinis RNR amplifikavimas

Visa RNR iš lazeriu gautų mikrodalelių mėginių buvo išskirta naudojant „Paradise MicroRNA“ rinkinį (Arcturus, Mountain View, CA, JAV), kiekybiškai įvertinta naudojant „RiboGreen“ dažiklį („Molecular Probes“, „Eugene“, OR, JAV) ir „VersaFluor“ fluorimetrą („Bio-Rad“, „Hercules“). CA, JAV). Linijinė RNR amplifikacija buvo atlikta naudojant „Paradise RNR amplifikacijos rinkinį“ (Arcturus). Pirmajam amplifikacijos raundui panaudotos dvi nanogramos visos RNR, gautos iš lazeriu gautų normalios epitelio ląstelių, gautų iš lazerio, taip pat iš kiekvieno paciento naviko audinio. Antrajame amplifikacijos etape po cDNR sintezės ir gryninimo mėginiai buvo biotinizuoti in vitro transkripcijos metu ir naudojami „GeneChip“ analizei.

Genų lusto eksperimentai

Linijiškai amplifikuota aRNR buvo panaudota hibridizavimui su didelio tankio oligonukleotidų žmogaus genomo rinkiniu, „GeneChip HG X3P“ masyvu (Affymetrix, Santa Clara, CA, JAV), kuriame yra 61 359 zondo rinkiniai, kurie reprezentuoja apytiksliai 54 000 nuorašų. Mikro matricos analizei FFPE mėginiai susiduria su unikaliais iššūkiais, įskaitant cheminį modifikavimą ir galimą RNR molekulių suskaidymą. Siekdami įveikti šiuos galimus iššūkius, „Affymetrix“ ir „Arcturus“ sukūrė „HG X3P“ masyvą, skirtą sutelkti dėmesį į sekas, esančias arčiau nuorašo 3 'galo, palyginti su standartinėmis „GeneChip“ matricomis. Išskirtos RNR buvo amplifikuotos naudojant Rojaus RNR amplifikacijos rinkinį (Arcturus). Biotinilinti aRNR taikiniai buvo paruošti naudojant MEGA Script T7 in vitro transkripcijos rinkinį (Ambion, Austin, TX, USA). Biotinu pažymėta cRNR buvo išgryninta naudojant „Qiagen RNeasy“ verpimo kolonėles (Qiagenas, Valensija, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Biotinu pažymėta cRNR buvo suskaidyta į 40 μl reakcijos mišinį, kuriame buvo 40 mM Tris-acetato, pH 8, 1, 100 mM kalio acetato ir 30 mM magnio acetato, inkubuotų 94 ° C temperatūroje 35 minutes, o po to dedami ant ledo. Biotinu pažymėta ir suskaidyta aRNR buvo hibridizuota su HG X3P GeneChip matricu (Affymetrix). Hibridizacijos ir skenavimo procedūros iš esmės buvo tokios pačios, kaip aprašyta anksčiau. 9

Vaizdų analizė ir duomenų rinkimas

Zondų intensyvumo vertės buvo užfiksuotos iš „GeneChip“ vaizdų, naudojant „GCOS“ („GeneChip“ operacinę sistemą). Buvo „Affymetrix GeneChip Microarray“ analizės programinės įrangos 3.1 versija ir „Affymetrix Micro DB“ bei „Data Mining Tool 2.0“ versija („Affymetrix“), „Microsoft Excel 2000“ („Microsoft“, Sietlas, WA, JAV) ir „Statistica“ versija 4.1 („Stat Soft Inc.“, Talsa, OK, JAV). naudotas. Bioinformatikos analizei mes naudojome „Microarray Data Analysis“ programinę įrangą iš NHGRI ir „GeneSpring“ programinę įrangą (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV).

Duomenų analizė

Šešių pacientų, sergančių CaP, raiškos duomenys (24 „GeneChips“) buvo analizuojami „Genomatix ChipInspector“ ir Bibliosferos leidimo keliais, kaip aprašė pardavėjas („Genomatix GmbH“, Miunchenas, Vokietija, //www.genomatix.de).

Rezultatai

RNR preparatai iš šešių FFPE-WMRPS davė panašius ekspresijos profilius dviejuose iš eilės atliktuose „GeneChip“ eksperimentuose (FFPE1 ir FFPE2). Koreliacijos koeficientai ( r ) buvo apskaičiuoti naudojant Pearsono koreliaciją (FFPE1 ir FFPE2; vidutiniai FFPE1 ir FFPE2 navikų mėginiai, r = 0, 927025; vidutiniai FFPE1 ir FFPE2 gerybiniai mėginiai, r = 0, 930214). Norint nustatyti šešių WMRPS naviko ir gerybinių epitelio ląstelių raiškos skirtumus, „GeneChip CEL“ failai buvo analizuojami naudojant „ChipInspector“ programinę įrangą (//www.genomatix.de), kuri įvertina „GeneChip“ duomenis vieno zondo lygiu. „ChipInspector“ apibrėžti su CaP susiję genai buvo toliau analizuojami naudojant „BiblioSphere“ programinę įrangą (//www.genomatix.de.), Kuri apima paskelbtą literatūrą ir tinklo filtrus, skirtus ligai ir anatomijai (papildomas paveikslas S2 ir S3). 10 Ši analizė atskleidė daugumą genų, kurie, kaip pranešama, dažnai keičiasi CaP. Pažymėtina, kad šiame tyrime buvo nuosekliai reguliuojamas AMACR , kuris jau naudojamas chirurginėje patologijoje. Kiti 11, 12 su CaP susiję genų ekspresijos pakitimai buvo SPON2 , STEAP2 , OR51E2 (PSGR) , SPDEF . 13, 14, 15, 16

Apskritai, tarp dviejų nepriklausomų „GeneChip“ eksperimentų (1 lentelė ir 1 paveikslas) buvo didelis atkuriamumo laipsnis.

Pilno dydžio lentelė

Image

Su prostatos vėžiu susiję genai, apibrėžti „ChipInspector“ ir „Bibliosfera“. Kaip įvesties duomenys buvo panaudoti naviko ir gerybinio santykio santykiai: 2108 genai, gauti iš „ChipInspector“ analizės FFPE1 duomenų, ir 2180 genų, gauti iš FFPE2 duomenų (naudojant natūralų logaritmą normalizuotų išraiškos signalų santykis iš „GeneChip CEL“ failų). Genai iš FFPE1 duomenų buvo paženklinti mažomis juodomis dėžutėmis, o mažos baltos dėžutės etiketės nurodo genus iš FFPE2 duomenų. Šis tinklas buvo sukonstruotas ant 28 genų, likusių po filtro „ligos“, naudojant MeSH kategorijos „prostatos neoplazmą“, ir filtro „audiniai“, naudojant MeSH kategoriją „prostata“. Bendrosios citatos lygis buvo ribojamas įvestų genų (IN). Įvestiniai genai yra visi genai, kurie buvo reikšmingai sureguliuoti eksperimentuose: jungiamosios linijos buvo nubraižytos dėl dviejų genų bendro citavimo viename sakinyje. Žalios arba iš dalies žalios jungčių linijos rodo transkripcijos faktoriaus (TF) surišimo vietos atitiktį šios linijos sujungto geno tiksliniame promotoriuje. ST rodo, kad genų produktas yra „Genomatix“ signalo perdavimo kelio dalis. Spalvų kodavimas: raudona spalva nurodo genus, kurių auglyje yra padidėjęs reguliavimas, palyginti su gerybiniais, o mėlyna spalva - genus, kurių auglyje yra sumažinta, palyginti su gerybiniais. FFPE, fiksuotas formalinu ir parafinas.

Visas dydis

Diskusija

Mūsų tyrimas sutinka su Tomlins ir kt. , 17, kurie neseniai pranešė apie perspektyvius pasaulinės genų ekspresijos duomenis iš FFPE CaP egzempliorių.

CaP yra žinomas dėl savo daugialypiškumo ir nevienalytiškumo. Remiantis šiuo tyrimu, FFPE CaP pavyzdžiai gali būti efektyviai panaudoti visuotinėms genų ekspresijos strategijoms. Dvi nepriklausomos globalios genų ekspresijos analizės, pradedant nuo šešių FFPE-WMRPS lazeriu gautų mikrodalelių gautų gerybinių ir piktybinių epitelio ląstelių RNR, atskleidė prostatos naviko ląstelėms būdingus genų ekspresijos pokyčius, kurie buvo nušviečiami ankstesniuose CaP globalių genų ekspresijos vertinimuose naudojant užšalusius audinius. iš mūsų ir kitų laboratorijų. 9, 11, 12 Nepaisant mažo mėginio dydžio ir riboto ištirtų ląstelių skaičiaus viename mėginyje, gerybinės ir piktybinės ląstelės buvo atkuriamos reprodukciniu požiūriu pagal navikinių ląstelių genų ekspresijos profilį.

Be to, kaip parodyta 1 paveiksle, abiejuose tyrimuose pastebėti labai sureguliuoti genai yra to paties genų tinklo dalis, kaip matyti iš „BiblioSphere“ kaitacijos analizės. Stebėtina ir tai, kad genai, kurie buvo rasti tik vienoje iš FFPE grupių, dažnai buvo to paties tinklo dalis, patvirtindami požiūrį, kad du eksperimentai išryškino šiek tiek skirtingas detales iš esmės to paties bendro vaizdo.

Šis tyrimas pabrėžia ląstelių tipui būdingų genų ekspresijos / kelio parašų išsivystymo iš archyvinių FFPE-WMRPS audinių potencialą, kuris gali suteikti daugybę naujų biomarkerių ir terapinių taikinių, susijusių su ligos progresavimu ir agresyviomis CaP formomis. Ateityje reikalingi tyrimai, siekiant nustatyti FFPE CaP audinių vertę ir apribojimus nustatant kliniškai reikšmingus biomarkerius, naudojant audinius iš pacientų, kurių klinikinio progreso ypatybės ar terapiniai rezultatai jau žinomi.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma S1 lentelė

  2. 2.

    Papildomas S1 paveikslas

    Autorių atskleista informacija apie galimus interesų konfliktus

    Autoriai nenurodė jokių galimų interesų konfliktų.

    Papildoma informacija pridedama prie prostatos vėžio ir prostatos ligų tinklalapio (//www.nature.com/pcan).