Pereinamosios būsenos struktūra susietam surišimui ir netvarkingų baltymų domenų lankstymui | mokslinės ataskaitos

Pereinamosios būsenos struktūra susietam surišimui ir netvarkingų baltymų domenų lankstymui | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biofizinė chemija
  • Iš esmės netvarkingi baltymai
  • Baltymų lankstymas
  • Baltymai

Anotacija

Natūraliai netvarkingų baltymų yra gausu eukariotų baltymuose ir jie yra susiję su daugybe skirtingų ligų. Tačiau trūksta eksperimentinių duomenų apie tokių baltymų sujungto surišimo ir sulankstymo molekulines detales. Du sąveikaujantys ir gana gerai ištirti netvarkingi baltymų domenai yra p160 transkripcijos koaktyvatoriaus ACTR aktyvacijos domenas ir CREB rišančio baltymo branduolio koaktyvatorių rišimo sritis (NCBD). Baltymų inžinerijos ir kinetiniais eksperimentais išanalizavome jų sujungto surišimo ir sulankstymo pereinamąją būseną (Φ vertės analizė) ir nustatėme, kad tai susiję su silpna natūrine sąveika tarp ACTR ir NCBD N-galinių spiralių, tačiau kitaip yra „netvarkingas“ “. Daugybė natūralių hidrofobinių sąveikų abiejų domenų sąsajoje susidaro vėliau, po greitį ribojančio susivienijimo barjero. Linijiniai laisvosios energijos santykiai rodo, kad bendradarbiaujant gali kilti natūrali sąveika, primenanti branduolių kondensacijos mechanizmą baltymų sulankstyme.

Įvadas

Iš esmės netvarkingi baltymai (IDP) ir netvarkingos baltymų sritys yra labai svarbūs centriniuose ląstelių procesuose, tokiuose kaip receptorių signalizavimas, ląstelių ciklo kontrolė ir 1, 2, 3, 4, 5 transkripcija. Manoma, kad IDP lankstumas suteikia funkcinį pranašumą, pavyzdžiui, jis suteikia galimybę polipeptidą surišti išplėstine forma, turint didesnį sąsajos plotą kiekvienam liekanai nei rutuliniai baltymai 6 ir daug specifinių kontaktų. Lankstumas taip pat greičiausiai yra priežastis, dėl kurios IDP dažnai gali vystytis bendraudami su keliais partneriais, tokiais kaip, pavyzdžiui, p53 7 ir NCBD 8, 9, 10, 11 (žr. Toliau). Tačiau eksperimentinių duomenų apie IDP rišamosios reakcijos mechanizmų detales nėra daug, o daugelis hipotezių, kodėl sutrikimas yra naudingas, eksperimento metu neišbandytos.

Du netvarkingi domenai, dalyvaujantys formuojant daugiakomponentį baltymų rinkinį, kuris yra aktyvinamas ir reguliuojamas 12, 13 genų ekspresija, yra skydliaukės hormonų ir retinoidų receptorių (ACTR) transkripcijos koaktyvatoriaus p160 aktyvavimo sritis ir branduolys. CREB rišančio baltymo (CBP) koaktyvatorių surišimo sritis (NCBD). Šie baltymų domenai ir jų sąveika buvo išsamiai apibūdinta NMR 8, 14, 15, SAXS 14, 16 ir sustabdyto srauto spektroskopija 17 . ACTR yra labai netvarkingas, turėdamas tam tikrą antrinės struktūros laipsnį laisvoje būsenoje 15, 16, o NCBD turi išlydytų gaublių savybes, turinčias mažą hidrofobinę šerdį ir mažą stabilumą 14, 15, 18, 19 . Dviejų domenų bimolekulinis kompleksas parodo gerai apibrėžtą tretinę struktūrą 8 (1 pav.) Ir yra klasikinis susietų IDP sujungimo ir sulankstymo pavyzdys.

Image

(A) NCBD Y2108W ir ACTR mutanto L1048A eksperimentinio surišimo pėdsako pavyzdys. Parodyta pagrindinė (greitoji) fazė, o baltymų koncentracijos yra 1 μM NCBD Y2108W ir 10 μM L1048A-ACTR. (B) pagrindinės fazės k obs vertės, gautos iš jungimosi pėdsakų (tokių kaip A skyde), nubraižytos palyginti su [ACTR], kad būtų gautos asociacijos greičio konstantos, k , pritaikant duomenis prie bendrosios lygties, susijusios su dviejų molekulių grįžtamuoju ryšiu. antros eilės sąlygomis 46 (4 lygmuo). Esant didelėms ACTR koncentracijoms, lygtis artėja prie tiesinės funkcijos, kurios nuolydis yra lygus k . Raudona, NCBD Y2108W ir ACTR WT ; mėlyna, NCBD Y2108W ir ACTR L1048A . (C) Disociacijos greičio konstantos, netaikomos, buvo nustatytos poslinkio eksperimentuose, kuriuose NCBD WT buvo naudojamas varžyti NCBD Y2108W iš komplekso. Ištisinė linija yra tinkama vienai eksponentinei lygčiai. Esant didelei NCBD WT koncentracijai, NCBD Y2108W / ACTR atsiribojimas yra praktiškai negrįžtamas, o k obs nuo kreivės tvirtinimo yra lygus k off programai . Raudona, NCBD Y2108W / ACTR WT ; mėlyna, NCBD Y2108W / ACTR L1048A . (D) Komplekso tarp ACTR (žalia) ir NCBD (žalsvai mėlyna) struktūra, L1048 paryškinta tamsiai mėlyna spalva. Paveikslas buvo sukurtas naudojant PyMol („PyMol“ molekulinės grafikos sistemą, 1.3 versija, „Schrödinger“, LLC).

Visas dydis

Norėdami išsiaiškinti ACTR ir NCBD sujungto surišimo ir sulankstymo reakcijos molekulines detales, mes panaudojome baltymų inžineriją kartu su kinetiniais eksperimentais (Φ vertės analizė 20, 21 ), kad nustatytume pereinamosios būsenos struktūrą, atsižvelgiant į formavimosi formavimąsi. Natūralūs hidrofobiniai tretiniai kontaktai rišamojoje sąsajoje. Mūsų tyrimas, kuris pirmasis buvo pateiktas apie sistemą, kurioje vienas iš komponentų yra visiškai netvarkingas (ACTR), o kitas - su išlydyto gaublio charakteristikomis (NCBD), rodo, kad labai nedaug vietinių sąveikų formuojasi perėjimo būsena įpareigojanti. Tačiau buvo nustatyta, kad branduolys, iš dalies formuojantis natūralias hidrofobines sąveikas, yra tarp abiejų IDP domenų N-galo sraigtų.

Rezultatai

Į vietą nukreiptų mutantų projektavimas

Ankstesniame tyrime apibūdinome kinetinio ACTR ir NCBD jungimosi reakciją, naudodami inžinerinius Trp likučius kaip fluorescencinius zondus 17 . Dabartiniame tyrime mes atlikome dešimt delecijų mutacijų (tariamai neardomųjų šoninių grandinių sutrumpinimų) prie hidrofobinių liekanų ACTR WT ir dar dešimt iš pseudo laukinio tipo NCBD (NCBD Y2108W ). Mutacijos buvo padarytos jungiančioje dviejų sričių sąsajoje, remiantis paskelbta 8 komplekso NMR struktūra. ACTR WT yra labai netvarkingas 8, 15 tirpale, ir nesitikima, kad mutacijos ardys bet kokią hidrofobinę šerdį. NCBD, kita vertus, rodo didelę likutinę struktūrą, kaip parodyta BMR ir apskrito dichroizmo (CD) 11, 14, 15, 19 . Far-CD kompaktinis diskas buvo naudojamas įvertinti mutacijų poveikį antrinei NCBD struktūrai (papildomas S1 pav.). Šešių iš mutantų CD spektras buvo identiškas NCBD Y2108W spektrui, tuo tarpu keturiems pasirodė, kad jie prarado α-spiralės struktūrą. Yra žinoma, kad trimetilamino N -oksidas (TMAO) perkelia pusiausvyrą į sulenktą 22 ir 0, 7 M būseną, iš dalies arba visiškai atkurdamas šių keturių mutantų CD spektrus (papildomas S1 pav.).

ACTR ir NCBD mutantų rišamoji kinetika

Dešimties ACTR mutantų surišimo kinetika buvo išmatuota naudojant NCBD Y2108W, o dešimties NCBD Y2108W mutantų kinetika išmatuota naudojant ACTR WT, naudojant sustabdyto srauto metodą (1 pav. Ir papildoma S1 lentelė, S2 ir S3 pav.). . Dvi iš mutacijų (L1064A ir L1071A ACTR) buvo labai destabilizuojančios bimolekulinį kompleksą ir jų kinetika buvo išmatuota esant 0, 7 M TMAO, kad sumažėtų stebimos greičio konstantos ( k obs ) iki tokio lygio, kokį pasiekia sustabdyto srauto instrumentas. . Taip pat buvo išmatuoti keturi mutantai su pakitusiais CD spektrais, esant 0, 7 M TMAO, kad būtų išvengta įtakos žemės būsenai stebimoje kinetikoje. Taip pat buvo išgryninti dar du mutantai - L2090A NCBD ir L1052A ACTR, tačiau nepateikė patikimų kinetikos duomenų dėl padidėjusių k obs reikšmių, net esant TMAO.

Beveik visų mutantų surišimo kinetika buvo dvifazė, greita faze, kuri buvo tiesinė didėjant ACTR koncentracijai, ir lėtai fazei, kuri pasirodė gana pastovi per visą išmatuotą koncentracijos intervalą. Panaši kinetika buvo stebėta anksčiau NCBD Y2108W ir ACTR WT, ir buvo paskelbta išsami analizė 17 (taip pat žr. Papildomos informacijos tekstą, jei norite toliau diskutuoti apie lėtą fazę). Iš greitosios fazės mes ištraukėme tariamą asociacijos greičio konstantą ( k pagal programą ) kaip stebimos greičio konstantos nuolydį k obs, palyginti su ACTR koncentracija (1 pav., Papildoma S1 lentelė, S2 pav.). Akivaizdi disociacijos greičio konstanta ( k off app ) mutantų ACTR / NCBD kompleksams buvo nustatyta atskirais poslinkio eksperimentais (1 pav., Papildoma S1 lentelė), kaip išsamiai aprašyta skyriuje Medžiagos.

Eksperimentuojant su TMAO, vienam mutantui L2067A ( k obs ~ 19 s −1 ) buvo aiškiai matoma papildoma tarpinio stiprumo fazė. Įdomu tai, kad panaši fazė anksčiau buvo nustatyta dvigubam mutantui, apimančiam užkastą druskos tiltą, bet taip pat laukiniam tipui, turinčiam didelį jonų stiprumą 17 . Kruopščiai ištyrus NCBD Y2108W ir laukinio tipo ACTR (ty mūsų laukinio tipo porą) jungimosi pėdsakus 0, 7 M TMAO, paaiškėjo, kad panaši tarpinė fazė gali būti pritaikyta duomenims. Šį rezultatą galima paaiškinti sukeltos formos scenarijumi, kai tarpinio produkto populiaciją skatina TMAO, didelis druskos kiekis ir tam tikros mutacijos. Taigi, TMAO ir druska gali būti naudojami suderinti ACTR / NCBD energetinio kraštovaizdžio formą, kad jie būtų surišti ir sulankstyti. Tačiau nors TMAO gali pakeisti laisvojo ACTR ir NCBD populiacijų pasiskirstymą ir energetinių barjerų aukštį, mažai tikėtina, kad tai paveiks pereinamosios būsenos struktūrą ir bendrą mechanizmą, kaip parodyta tiesinėse laisvosios energijos schemose (Brønstedo grafikas)., kuriame duomenys, surinkti esant ir neturint TMAO, patenka į tą pačią liniją (2 pav. ir papildomas S4B pav.).

Image

(A) log k off app palyginti log K d ir (B) log k programoje vers log log d d . Kietieji apskritimai rodo duomenis, gautus iš 20 mM fosfato (pH = 7, 4), 150 mM NaCl, tuo tarpu konstantos, gautos tame pačiame buferyje, bet papildytos 0, 7 M TMAO, parodytos kaip atviri apskritimai.

Visas dydis

Trims iš keturių mutantų TMAO visiškai neatstatė CD signalo stiprumo, tačiau jie yra artimi - 90%, 88% ir 81% laukinio tipo CD signalo, esant 222 nm. Tačiau, kaip galima spręsti iš 2 pav., Šių mažų skirtumų nepakanka, kad būtų padarytas reikšmingas nukrypimas nuo bendros linijinės Brønstedo grafiko tendencijos. Taigi šių ir kitų mutantų, matuojamų esant TMAO, duomenų ataskaita apie tą pačią pereinamąją būseną.

ACTR ir NCBD sąsajos struktūrinės detalės

3D komplekso tarp ACTR ir NCBD 8 struktūra rodo, kad NCBD / ACTR leucinu turtinga rišamoji sąsaja yra gerai supakuota ir joje yra specifinės hidrofobinės sąveikos. Atitinkamai, kelios konservatyvios delecijos mutacijos sąlygojo žymiai sumažintą surišimo afinitetą (1 lentelė ir papildoma S1 lentelė), ypač tuos, kurie eina nuo Leu iki Ala LXXLL / LLXXL motyvuose. Šie rezultatai gerai sutaria su ankstesniais NCBD ir ACTR 19 ar TIF2, ACTR homologo 23, taip pat kitų NCBD rišančių baltymų, sąveikos su mutacijomis, tyrimais 24, 25 . Kita vertus, V2109A NCBD ir V1077A ACTR mutacijos nebuvo destabilizuojančios, bet rodė dar mažesnes k off app ir K d reikšmes nei laukinio tipo (papildoma lentelė S1). Abi šios mutavusios liekanos yra išdėstytos atitinkamo domeno C galinėje spiralėje ir, kaip parodyta NCBD / ACTR struktūroje 8, jos taip pat sąveikauja viena su kita. Nors šių pokyčių termodinaminė kilmė nėra aiški, anksčiau buvo parodyta, kad nesurišto NCBD C-galinė spiralės trečioji spiralės dalis rodo didelę greitą stuburo dinamiką 15, palyginti su likusia NCBD, ir surišto ACTR sritis, kuri sudaro C-galinė spiralė neturi labai mažo sraigtinio turinio, nesusijęs su ACTR 15, 16 . Galima spėlioti, kad sutrikimą, kuris yra atitinkamoje spiralėje, moduliuoja mutacija, pavyzdžiui, stabilizuodama spiralę taip, kad gaunamas šiek tiek didesnis afinitetas, palyginti su laukiniu tipu.

Pilno dydžio lentelė

Φ rišamųjų verčių apskaičiavimas

Linijiniai laisvosios energijos santykiai aiškiai parodo, kad mutacijų poveikis iš esmės yra disociacijos greičio konstanta (2 pav.). Tačiau kelios mutacijos paveikė asociacijos greičio konstantą (papildomas S2 pav.), Kas rodo, kad kai kurios šoninės grandinės pradėjo formuoti natyvią sąveiką ribojantį pereinamosios būsenos greitį. Norėdami kiekybiškai įvertinti natūrinio kontakto formavimo laipsnį ir taip susidaryti susietų surišimo ir ACTR / NCBD sulankstymo pereinamosios būsenos struktūros vaizdą, apskaičiavome binding surišimo reikšmes, Φ surišimo 21, 26 reikšmes (1 lentelė, žr. Papildoma informacija, skirta išsamiai aptarti Φ jungimosi vertes, susijusias su k, naudojant programą, „ k off“ programą ir lėtą kiekvienos tikėtinos reakcijos schemą, ir įvertintos pagal šių dviejų baltymų komplekso struktūrą (3 pav.) . Φ rišamosios vertės buvo apskaičiuotos susiejant rišimo greitį ribojančios kliūties laisvosios energijos pokyčius (ΔΔ G TS, apskaičiuotas pagal k vertes) su bendru laisvosios energijos pokyčiu rišamosios reakcijos pusiausvyroje (ΔΔ G Eq, apskaičiuota iš K d vertės, kurios, savo ruožtu, buvo apskaičiuotos iš k off programos, padalytos iš k programoje (1–3 lygtys, papildoma informacija).

Image

Image

Image

Laukinis tipas skaičiavimuose reiškia NCBD Y2108W ir ACTR WT sąveiką. Jei Φ jungties vertė lygi nuliui, tai reiškia, kad mutavusioji liekana nesukelia natūralios sąveikos pereinamojoje rišamosios reakcijos būsenoje. Kita vertus, Φ rišamoji reikšmė 1 reiškia, kad liekanos pereinamojoje būsenoje sukuria visišką natūrinę sąveiką. Tarpinėms vertėms taikomas 20 perspėjimas, tačiau jos paprastai aiškinamos kaip dalinis vietinių sąveikų susidarymas pereinamojoje būsenoje. Apskaičiavome Φ surišimo vertę, jei absoliuti ΔΔ G Eq reikšmė> 0, 16 kcal / mol. Tai gali pasirodyti kaip labai maža ribinė vertė, tačiau ji pagrįsta labai tiksliais k nustatymais programoje ir k off programose . Daugelio mutantų didžiausias klaidų šaltinis yra ACTR variantų koncentracijos nustatymas, kuris daro tiesioginį poveikį k programoje ir kuris mūsų vertinimu yra maždaug 5%. 1 lentelės Φ jungties vertės nurodo pereinamąją būseną, ribojančią greitį jungiantis 20 mM natrio fosfato (pH = 7, 4), 150 mM NaCl. Jei yra TMAO, tikėtina, kad stabilizavosi ta pati perėjimo būsena, todėl programos vertė k bus didesnė. Alternatyvus paaiškinimas yra tai, kad ankstesnė perėjimo būsena tampa (iš dalies) ribojanti normą. Nustatyta, kad kB NCBD Y2108W ir laukinio tipo ACTR, esant 0, 7 M TMAO, yra maždaug 45 μM −1 s −1, kuris buvo naudojamas apskaičiuoti Φ surišimo vertes 2 lentelėje.

Image

Φ 1 ir 2 lentelių privalomosios vertės pateikiamos pagal komplekso struktūrą tarp ACTR ir NCBD. ACTR rodomas tamsiai pilka spalva, o NCBD - šviesiai pilka spalva. Likučiai yra koduojami spalva pagal jų Φ surišimo reikšmių dydį, o nuolydis nuo 0 (raudona) iki 0, 3 (geltona). „ACTR L1055A“, turintis aukščiausią Φ įrišimo vertę, yra mėlynos spalvos. Neigiamos Φ surišimo vertės buvo artimos nuliui ir yra raudonos spalvos. A ir B skydeliai rodo tą pačią struktūrą iš dviejų skirtingų kampų. Vaizdai buvo sukurti naudojant PyMol („PyMol Molecular Graphics System“, 1.3 versija, Schrödinger, LLC).

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Sujungto surišimo ir sulankstymo pereinamosios būsenos struktūra

Vadovaujantis Fersht 20 gairėmis, naudinga ize reikšmes suskirstyti į žemas, vidutines ir aukštas. Mažos Φ jungimosi vertės (<0, 2) beveik visose vietose rodo, kad dauguma natūrinių hidrofobinių sąveikų ACTR ir NCBD sąsajoje nebuvo susiformavę jungimosi reakcijos pereinamojoje būsenoje, kas rodo, kad didžioji dalis pradinio susidūrimo komplekso neturi turi natūralią hidrofobinę sąveiką. Tačiau kelios ACTR mutacijos, esančios 1 spiralėje, daro tiesioginę sąveiką su NCBD ir parodo tarpines ar net aukštas Φ jungimosi vertes. Nors B surišimo vertės NCBD mutantams buvo žemos, dvi 1 spiralės mutacijos davė Φ surišimo reikšmes 0, 2, tai rodo, kad ACTR ir NCBD N-galiniai spiralės sudaro pradinius tarpmolekulinius kontaktus.

Diskusija

Baltymų inžinerija ir išsami kinetinė analizė leido nustatyti susietų rišimo ir lankstymo greičio ribojimo pereinamosios būsenos struktūrinį modelį, apimant IDP, ACTR ir išlydytą rutulį, NCBD (3 pav.). Kalbant apie hidrofobinę sąveiką tarp dviejų netvarkingų domenų sąsajos, pirminės asociacijos pereinamojo laikotarpio būsena yra labiau netvarkinga nei natūrali. Apskritai gimtoji sąveika rišamojoje sąsajoje formuojama ir konsoliduojama po greitį ribojančio susivienijimo barjero. Tai sutinka su ankstesniais IDP ir netvarkingų regionų kinetinio surišimo mechanizmo tyrimais, naudojant NMR 27, MD 28 arba sustabdyto srauto spektroskopiją 17, 29, 30, 31, 32, kurių duomenys taip pat rodo, kad natūrali sąveika vėlyvoje reakcijos kelias. Paprastai labai sunku įrodyti daugelio pakopų rišimo reakcijas ir yra keletas galimų rišimo mechanizmų, skirtų ACTR ir NCBD susieti. Svarbu tai, kad mūsų Φ privalomosios vertės praneša apie bet kurio iš keturių mechanizmų (1–4 schema papildomame S5 pav.) Pereinamąją būseną, susijusią su produktyviu surišimo keliu, kurios iš esmės atitinka duomenų rinkinį, kaip išsamiai aptarta papildomoje informacijoje. . Naujausi NCBD duomenys rodo, kad jis egzistuoja mažiausiai dviem skirtingais pavidalais laisvoje būsenoje 33, 34, o tai palaiko S5 pav. 4 modelį. Taigi laisvose būsenose gali būti keletas skirtingų ACTR ir NCBD formų, turinčių skirtingą struktūros laipsnį ir įvairius jungimosi būdus, o išorinės sąlygos lemia srautą per kiekvieną kelią 35 . Tačiau keliai susilygins po jų pradinio susiejimo, o ACTR ir NCBD patirs natūralių obligacijų susiformavimą bendradarbiaujant, nes kliūtis yra peržengta, kaip parodyta tiesiniame laisvosios energijos santykyje (2 pav.).

Detaliau pažvelgus į pereinamąją būseną, tarp atitinkamo baltymo N-galinių spiralių, esančių pereinamojoje būsenoje, yra susiformavę keli natūralūs kontaktai. Tiesą sakant, tiesinis laisvosios energijos santykis (2 pav.) Primena tuos, kurie gauti baltymams, paklūstantiems kondensacijos mechanizmui baltymų sulankstyme 36 . Taigi, susiformavus kelioms vietinėms sąveikoms kertant pagrindinį greitį ribojantį barjerą, likę natūralūs kontaktai susidaro po pagrindinio barjero. IDP surišimas dažnai apima išplėstą baltymų konformaciją su rišamuoju paviršiumi, kuriame yra hidrofilinė ir hidrofobinė sąveika. Įdomu tai, kad regione su didžiausiomis Φ surišimo reikšmėmis yra LXXLL / LLXXL atpažinimo motyvai, kur X reiškia bet kurią aminorūgštį. Yra žinoma, kad šie motyvai, kuriuose bet kokia biri hidrofobinė liekana gali pakeisti Leu, tarpininkauja baltymų ir baltymų sąveikai transkripcijos reguliavimo 37 metu .

Be to, BMR ir CD tyrimai 15, 16 parodė, kad regione, kuris sudaro spiralę viename surištame ACTR, iš tikrųjų pasireiškia trumpalaikis spiralės susidarymas laisvoje būsenoje. Ankstesniuose 38, 39, 40, 41 tyrimuose pabrėžiama iš anksto suformuotų konstrukcinių elementų funkcinė svarba ir mūsų pastebėjimas, kad tokie elementai sudaro pradinius kontaktinius ryšius tarp ACTR ir NCBD, patvirtina šią hipotezę.

Pradiniame tyrime su ACTR / NCBD 17 mes apibūdinome palaidoto druskos tiltelį mutagenezės būdu (R2104L NCBD ir D1068L ACTR). Akivaizdu, kad poveikis asociacijos greičio konstancijai buvo didelis (~ 20 kartų), o k off programa buvo panaši į laukinio tipo baltymų. Tai reikštų Φ rišamąją reikšmę, tačiau R2104L mutacija turi aiškų poveikį NCBD 19 pagrindinei būklei, o dvi Leu liekanos, pakeičiančios druskos tiltą, greičiausiai prisidės prie surišimo, sudarydamos naujas hidrofobines sąveikas. Taigi, nors druskos tilto mutacija daro stiprų poveikį k programoje, ir tai rodo, kad druskos tiltas stabilizuoja jungimosi pereinamąją būseną, mes negalime įvertinti šios sąveikos Φ jungimosi vertės. Ankstesni sąveikos su IDP 42 arba sulankstytais baltymais 43 tyrimai parodė, kad pakrautų likučių mutacija gali paveikti asociacijos greičio konstantą, kad būtų gautos aukštos Φ jungimosi vertės. Taigi įkrautos liekanos turi didesnę tendenciją nei hidrofobinės aminorūgštys, sudarydamos jungimosi pereinamojoje būsenoje natūralią natūrinę sąveiką dėl tolimojo elektrostatinio poveikio 21, 44 .

Neseniai atliktame molekulinės dinamikos modeliavimo tyrime 38 padaryta išvada, kad NCBD galinės spiralės α1 ir α3, kurios dominuoja kontakto su ACTR komplekse skaičiumi, yra lengviausiai suformuotos laisvojoje būsenoje, turinčios panašią į surištą būseną. Čia parodome, kad α1 NCBD formuoja silpną natyvią sąveiką su ACTR pereinamojoje būsenoje, o dvi iš keturių α3 mutacijų NCBD turi tarpinę Φ reikšmę (1 lentelė). Reikėtų pažymėti, kad šios mutacijos apima hidrofobinius pakeitimus, tuo tarpu α3 NCBD taip pat turi įkrovusių liekanų, kurios, kaip jau buvo aptarta anksčiau, paprastai turi aukštesnes Φ reikšmes nei hidrofobinės padėtys 21 . Taigi gali būti, kad ši sritis gali atlikti tolimąsias natūralias elektrostatines sąveikas greičio ribojimo pereinamojoje būsenoje.

Apibendrinant, remiantis turimais eksperimentiniais duomenimis, mes siūlome šį produktyvios ACTR ir NCBD sąveikos scenarijų. Sraigtas vienas iš labai netvarkingų ACTR formuoja laikinai 15, 16, sulankstant ir atsiskleidžiant tikriausiai ns-μs laiko intervale 45 . Į spiralę panaši būsena sukelia pradinę silpną natyvią sąveiką su viena iš NCBD spiralėmis, ribojančią rišamosios reakcijos greitį. Pradinį susiejimą taip pat skatina R2104 NCBD ir D1068 ACTR 17, kurie gali nukreipti abu baltymų domenus į teisingą orientaciją, kai susidaro natūralios druskos tiltas. Natūralių hidrofobinių kontaktų formavimas rišamojoje sąsajoje vyksta bendradarbiaujant, pereinant greitį ribojančią pereinamąją būseną asociacijai. Tikėtina, kad šis mechanizmas yra įprastas IDP susietų surišimo ir sulankstymo reakcijų metu.

Metodai

Baltymų išraiška ir gryninimas

Žmogaus NCBD ir ACTR buvo ekspresuojami ir išgryninami, kaip aprašyta anksčiau 17 . Trumpai tariant, BL21 (DE3) pLysS ląstelės buvo panaudotos NCBD arba ACTR ekspresijai sujungti su N-galo His pažymėto lipoilo suliejimo baltymu, kurio trombino vieta atskiria lipoilo ir NCBD arba ACTR sekas. Sulietas baltymas pirmiausia buvo tiriamas Ni-sepharose greito srauto (GE Healthcare) kolonėlės gryninimo etapu, po to trombino skaidymu, po kurio lipoilo baltymui ir kitoms priemaišoms pašalinti buvo panaudotas antrasis Ni-sepharose greito srauto gryninimo etapas. Po to buvo atlikta atvirkštinės fazės chromatografija, naudojant C-8 (Grace Davison Discovery) kolonėlę. Mutacijos buvo sugeneruotos apverstos PGR pagalba, o mutantai buvo ekspresuojami ir išgryninami, kaip aprašyta laukinio tipo baltymams 17 . Kiekvieno mutanto tapatumas buvo patikrintas naudojant MALDI-TOF. NCBD koncentracija buvo nustatyta matuojant absorbciją esant 280 nm bangos ilgiui, o ACTR, kurioje nėra Tyr ir Trp liekanų, koncentracija buvo nustatyta išmatuojant absorbciją esant 205 nm ir naudojant ekstinkcijos koeficientą 31, 9 ml mg −1 cm −1. gautas atlikus aminorūgščių analizę.

Įrišimo kinetika

NCBD / ACTR surišimo kinetika buvo matuojama naudojant patobulintą SX-17MV sustabdyto srauto spektrometrą (Applied Photophysics, Leatherhead, UK) ir stebint Trp fluorescenciją 17 . Sujaudinimas buvo prie 280 nm, o emisijai stebėti buvo naudojamas 320 nm ilgio praleidžiamasis filtras. Matavimai atlikti 277 K temperatūroje 20 mM natrio fosfatu (pH = 7, 4), 150 mM NaCl arba tuo pačiu buferiu, papildytu 0, 7 M TMAO. Norint gauti NCBD Y2108W / ACTR mutanto ir NCBD Y2108W mutanto / ACTR WT asociacijos greičio konstantas ( k pagal programą ), ACTR koncentracija buvo keičiama išlaikant NCBD koncentraciją pastovią 1 μM. Stebimos greičio konstantos buvo pavaizduotos grafike, palyginti su [ACTR], ir duomenys buvo pritaikyti prie bendrosios dviejų molekulių 46 grįžtamojo sujungimo lygties, kad būtų galima nustatyti k pagal programą (1 pav.) (4 ekvivalentas).

Image

[NCBD] 0 ir [ACTR] 0 yra bendros atitinkamų rūšių koncentracijos. Atminkite, kad lygtis suskaido iki tiesinės funkcijos pseudo-pirmosios eilės sąlygomis, tai yra, kai [ACTR] 0 0 [NCBD] 0 .

Matomos disociacijos greičio konstantos buvo nustatomos atliekant poslinkio eksperimentus, maišant iš anksto suformuotą NCBD Y2108W / ACTR mutantą arba NCBD Y2108W mutantų / ACTR WT kompleksą (1, 1–2, 5 μM NCBD, sumaišytą su 1–2 μM ACTR) su [NCBD WT pertekliumi]. ], toks, kad ACTR yra įstrigęs spektroskopiškai tyliame komplekse. Norint pagerinti kinetinio pėdsako amplitudę, buvo panaudota didesnė mutantų NCBD / ACTR komplekso koncentracija mažo afiniteto mutantams. Stebima greičio konstanta esant aukštai [NCBD WT ] yra lygi k nut.

Žiedinės dichroizmo spektroskopija

CD spektrai buvo registruojami naudojant JASCO-810 spektrometrą su peltier temperatūros kontrolės sistema. Spektrai buvo užregistruoti tarp 260 nm ir 200 nm, esant 298 K arba 277 K ir 20 mM fosfato (pH = 7, 4), 150 mM NaCl, su arba be 0, 7 M TMAO.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.