Transplantacija ir taisymas: kombinuotas ląstelių implantavimas ir chondroitinazės perdavimas apsaugo nuo šlapimo pūslės funkcijos pablogėjimo žiurkėms, turinčioms visišką nugaros smegenų pažeidimą | nugaros smegenys

Transplantacija ir taisymas: kombinuotas ląstelių implantavimas ir chondroitinazės perdavimas apsaugo nuo šlapimo pūslės funkcijos pablogėjimo žiurkėms, turinčioms visišką nugaros smegenų pažeidimą | nugaros smegenys

Anonim

Anotacija

Studiju dizainas:

Papildomas egzaminas. Šiame tyrime mes pranešame apie šlapimo pūslės funkcijos pokyčius po kombinuoto gydymo, skirto aksonų regeneracijai tirti žiurkėms po visiško nugaros smegenų pažeidimo (SCI).

Tikslai:

Norėdami pranešti apie poveikį šlapimo pūslės funkcijai, paskyrus kombinuotą gydymą visiška PKP.

Nustatymas:

Albertos universiteto Reabilitacijos medicinos fakultetas, Edmontonas, Kanada

Metodai:

Aštuonios žiurkės gavo Schwann ląsteles Matrigel užpildytais orientaciniais kanalais, uoslę patepiančią glia ir chondroitinazės ABC pažeidimo vietoje po pilnos krūtinės ląstos SCI. Kontrolinės grupės ( n = 7) gavo tik „Matrigel“. Kasdien buvo atliekami šlapimo pūslės tyrimai. Po 14 savaičių buvo atlikta šlapimo pūslės dydžio, sienelių storio, III tipo aktino ir kolageno analizė.

Rezultatai:

Po SCI abiem grupėms po 3 savaičių pūslė ištuštėjo. Tačiau po 2 savaičių visoms negydytoms žiurkėms ir dviem gydytoms žiurkėms buvo nustatytas šlapimo nelaikymas. Pomirtinis šlapimo pūslės tyrimas parodė padidėjusį šlapimo pūslės dydį. Negydytoms žiurkėms buvo nustatytos storesnės šlapimo pūslės sienelės, sudarytos iš neorganizuotų lygiųjų raumenų skaidulų pluoštų, apsuptų dideliu kiekiu kolageno (III tipas).

Išvada:

Mes parodėme, kad kombinuotas gydymas apsaugo nuo kolageno nusėdimo šlapimo pūslės sienelėse ir palaiko žiurkės sugebėjimą efektyviai ištuštėti. Nors mechanizmas, atsakingas už šį pagerėjimą, yra neaiškus, mūsų tyrimas rodo, kad dabartinis kombinuotasis gydymas gali paveikti šlapimo pūslės funkciją ir taip išplėsti jų, kaip plataus masto reparacijos, svarbą.

Įvadas

Žiurkėms dėl stuburo smegenų pažeidimo (SCI), praradus R6 stuburo segmentą, sumažėja savanoriška šlapimo pūslės ir išorinio šlaplės sfinkterio kontrolė. Normaliai apatinių šlapimo takų funkcijai atlikti reikalinga centrinė nervų sistema, kad būtų koordinuojamas šlapimo pūslės ir išorinis šlaplės sfinkterio nutekėjimas. Žiurkių šlapinimosi metu normalus tuštinimasis priklauso nuo sinchroninio šlapimo pūslės susitraukimo aktyvavimo ir išorinio šlaplės sfinkterio sprogojo aktyvumo, tuo pačiu vykstant sudėtingai pontino šlapinimosi centro, simpatinės ir parasimpatinės nervų sistemos bei nugaros smegenų motoneuronų sąveikai. 1, 2 SCI iš pradžių sukelia šlapimo pūslės arefleksijos periodą su dideliais likusiais šlapimo kiekiais, sukeliančiais šlapimo pūslės hipertrofiją ir per didelį sudrėkimą, tačiau galiausiai po šio periodo atsiranda stuburo šlapinimosi refleksas, dėl kurio nuolat vyksta netyčinis šlapimo pūslės susitraukimas. 3 Tačiau dėl nuolatinių šlapimo pūslės ir sfinkterio susitraukimų (šlapimo pūslės ir sfinkterio dysenergija) susidaro neefektyvus tuštinimasis ir didelis likęs šlapimo tūris. Kiti veiksniai, lemiantys neefektyvų šlapimo pūslės ištuštinimą, yra šlapimo pūslės dydžio ir audinių sudėties pokyčiai, įskaitant III tipo kolageno kaupimąsi. 5, 6 Dėl nuolatinio vezikulinio slėgio ir šlapimo susilaikymo žiurkėms su stuburo atstatyta, tačiau neveiksminga šlapimo pūslės funkcija gali visiškai pabloginti šlapimo pūslės būklę / funkciją, užsikrėsti infekcijomis ir kitomis apatinių šlapimo takų komplikacijomis. 7

Anksčiau pranešėme, kad atlikus žiurkių pilną krūtinės ląstos (Th8) nugaros smegenų operaciją, pažeidimo sujungimas su Schwann ląstelėmis užpildytais orientaciniais kanalais, uoslės, užtikrinančios glia implantavimą, ir chondroitinazės ABC tiekimas skatino serotonerginių skaidulų regeneraciją į juosmens stuburo smegenis ir pagerėjęs lokomotorių atsistatymas. 8 Taip pat parodėme, kad proprospinaliniai interneuronai ir pluoštai iš įvairių smegenų kamieninių branduolių, įskaitant vestibuliarinius, retikulinius ir raphe branduolius, regeneruojami per audinio tiltą į kaukolės stuburo smegenis. 9 Šių tyrimų metu, kurie iš pradžių buvo skirti ištirti variklio atsigavimą ir aksonų regeneraciją, mes supratome, kad kombinuotas gydymas taip pat paveikė ilgalaikę šlapimo pūslės funkciją. Taigi, atlikus suplanuotus eksperimentus, buvo ištirtos tų pačių žiurkių pūslės ir lyginamos pooperacinės priežiūros metu atliktos pastabos. Kadangi mūsų pirminis tikslas nebuvo tirti šlapimo pūslės funkciją, mes suprantame, kad visų norimų rezultatų nustatymo priemonių atlikti negalima. Tačiau manome, kad gautos išvados yra reikšmingos ir galėtų sudominti šią sritį.

medžiagos ir metodai

Nugaros smegenų pažeidimai ir kombinuotas gydymas buvo atlikti pagal Fouad ir kt. 8 naudojant 19 suaugusių moterų Fišerio žiurkių (Charles River, Wilmington, MA, JAV). Vietos valdžios institucijos patvirtino visas procedūras pagal Kanados gyvūnų globos tarybos gaires.

Schwanno ląstelės ir uoslę uždengianti glia buvo paruoštos, kaip aprašyta anksčiau. 10 Prieš operaciją gyvūnai buvo anestezuojami Hypnorm (fentanilio citratas, 120 μl 200 g kūno svorio; Janssen Pharmaceutics, Beerse, Belgija) ir Midazolam (0, 75 mg, 150 μl 200 g kūno svorio; SC; Sabex, Boucherville, QC). Kanada). Atlikus T7-9 stuburo segmento laminektomiją, buvo pašalintas 1 mm nugaros smegenų taškas ties Th8. Abiejose grupėse stuburo smegenų kelmai buvo įkišti į 4 mm ilgio tuščiavidurį kreipiamąjį kanalą (2, 6 mm vidinis skersmuo, 3, 0 mm išorinis skersmuo; pateikė „T Hazlett“, „CytoTherapeutics“, Providence, RI, JAV), todėl buvo užtikrintas pažeidimo išsamumas. Neapdorota grupė gavo Matrigelyje 60:40 (tūris / tūris) Dulbecco modifikuoto Eagle terpės / F-12 tirpalą. Apdorotoms žiurkėms į kanalą buvo įšvirkšta 30 μl Schwann ląstelių suspensija ir uoslę patepanti glia, suspenduota santykiu 60:40 (t / t). Dulbecco modifikuota Eagle terpė / F-12 Matrigelyje buvo įšvirkšta į kanalą, procedūra skyrėsi nuo anksčiau taikytos, į kurias virkštelės kelmais buvo įšvirkšta uoslės gleivinės. 8 chondroitinazės ABC (2 μl 10 μg ml −1, cABC; Seikagaku America, East Falmouth, MA, JAV) buvo skiriama, kaip aprašyta anksčiau, 4 savaičių laikotarpiui. Kontroliniais tikslais buvo naudojami 8 nepažeisti gyvūnai ( n = 4).

Atsigavimo laikotarpiu (12 savaičių) sužalotos ir negydytos žiurkės buvo laikomos grupėse, sumaišytos jūrų kiaulytės narvuose. Jų pūslės pirmas 3 savaites buvo rankomis ištuštinamos tris kartus per dieną, paskui - du kartus per dieną, kol prireikė tuštinimosi (tai yra, kai rankiniam išrašui liko tik nedidelis likusio šlapimo kiekis). žiurkių gydymas. Šlapimo pūslės funkcija buvo įvertinta kasdien pagal šlapimo pūslės užpildymą: visiškai tuščia (šlapimo negalėjo būti išmesta), vidutiniškai užpildyta ar pilna, ar žiurkės tarpvietė buvo šlapia, ar sausa. Duomenys iš šių 1 paveiksle pateiktų užrašų buvo pasirinkti iš kiekvieno savaitės trečiadienio. Pirmąją savaitę po sužalojimo žiurkės du kartus per dieną vartojo antibiotikus (natrio ampicilino 100 mg kg –1, Novopharm, Torontas, Kanada). 12 savaičių gyvūnai buvo nužudyti pentobarbitaliu (Euthanyl, Bimeda-MTC, Cambridge, ON, Kanada; 70 mg / 100 mg kūno svorio) ir transkardialiai perfuzijuoti 4% paraformaldehido (0, 1 M, pH 7, 4). Visos pūslės buvo pašalintos ir ištuštinamos; buvo išmatuotas ilgis (išilginis - nuo pagrindo / trigono iki viršūnės) ir plotis (apskritimas - plačiausioje pūslių dalyje), norint apskaičiuoti bendrą šlapimo pūslės dydį (cm2). Tada pūslės buvo išpjaustytos ir per naktį fiksuotos formaline, po to 2 dienas trunkant 30% sacharozės fosfato buferiniu tirpalu.

Image

Šlapimo pūslės funkcijos pokyčiai, atsižvelgiant į kasdienius gyvūnų duomenis. Parodomos pastabos iš kiekvienos trečiadienio dienos po atkūrimo. Tiesiogiai po sužalojimo tiek išgydyti (balti apskritimai, n = 8), tiek neapdorotos žiurkės (juodi deimantai, n = 7) negalėjo ištuštėti. Abi grupės atsigavo per 4 savaites. Žymus šlapimo pūslės funkcijos skirtumas išsivystė po 7 savaičių po sužalojimo, kaip nurodo žvaigždės.

Visas dydis

Šoninės šlapimo pūslės sienos dalys (36 mm 2 ) (tiesiai virš pagrindo) buvo pašalintos iš kiekvienos pūslės ir užšaldytos 60 ° C temperatūroje. Histologinei analizei iš kiekvieno gabalo buvo surinkta iki 20 iš eilės skersinių kriozekcijų 25 μm atstumu.

Šlapimo pūslės skyriai buvo dažomi α-lygiųjų raumenų aktinu (FITC konjuguotas, 1: 200, Sigma, Oakville, ON, Kanada) ir III tipo kolagenu (1: 200, Cedarlane Laboratories Ltd, Burlington, ON, Kanada). Trumpai tariant, sekcijos buvo dehidratuotos inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje 1 valandą ir du kartus 10 minučių plaunamos 50 mM Tris buferiniu druskos tirpalu (TBS), pH 7, 4, po to du 45 minutes plaunant TBS, turinčiu 0, 5% Tritono X- 100. Po to skaidrės buvo inkubuotos su 10% normalaus ožkos serumo TBS (Vector Laboratories, Burlingame, CA, JAV). Po to 48 valandas buvo inkubuojama su pirminiu antikūnu prieš α lygiųjų raumenų aktiną (kambario temperatūroje). Po plovimo TBS, stikleliai buvo inkubuojami 24 valandas kambario temperatūroje pirminiame III tipo kolageno antikūne. Kolageno vizualizavimui buvo naudojamas Texas Red konjuguotas antrinis antikūnas (1: 200, Vector Laboratories). Skaidrės buvo dehidratuotos alkoholiu, nuvalytos ksilenu ir uždengtos Permount mieste (Fisher Scientific Ltd, Otava, ON, Kanada).

Šlapimo pūslės sienelių storio, aktino ir III tipo kolageno dažymo intensyvumo analizė atlikta naudojant „Leica DM6000“ fluorescencinį mikroskopą (Leica Microsystems, Wetzlar, Vokietija). Didinant x 100, šlapimo pūslės sienelės storis buvo matuojamas naudojant „Leica LAS AF 6000“ programinę įrangą. Šlapimo pūslės sienelių maksimalaus pločio matavimai atlikti penkiuose atsitiktiniuose pjūviuose. Tada buvo užfiksuoti skaitmeniniai vaizdai iš trijų atsitiktinių pjūvių kiekvienoje pūslėje („Leica DFC350FX R2“ skaitmeninė kamera, „Leica Microsystems“) ir naudojant apibrėžtą sritį, naudojant histogramos funkciją, buvo nustatyti aktino ir kolageno fluorescencijos lygiai iš apibrėžtos srities, apimančios visą šlapimo pūslės sienos skersmenį. „Photoshop“. Skaičiuodami kolageno / aktino santykį, mes panaudojome išmatuoto fluorescencijos intensyvumo vidurkį.

Norint įvertinti serotonerginius pluoštus juosmens stuburo smegenyse, virvelės buvo ekstrahuojamos po perfuzijos, per naktį fiksuotos 4% formalino (su 5% sacharozės kiekiu), krito apsaugotos, laikant audinius 3 dienas 30% sacharozėje, įdėtoje į audinių Tek ( „Sakura Finetek USA Inc.“, Torrance, CA, JAV) ir užšaldytas 2-metilbutane virš sauso ledo (–60 ° C). Tada audinys buvo laikomas -80 ° C temperatūroje iki tolesnio apdorojimo. Atliekant analizę, juosmens stuburo smegenys (L1-5) buvo suskirstytos į 25 μm storio horizontalias dalis, naudojant kriostatą, pritvirtintos prie skaidrių („Fisherbrand ColorFrost“ mikroskopo stikleliai, „Fisher Scientific Ltd“) ir laikomos –80 ° C temperatūroje, kol buvo atlikta dažymo procedūra. . Kiekviena antroji dalis buvo dažyta 5-HT pagrindiniu anti-serotonino antikūnu (1: 1000, Sigma) per naktį 4 ° C temperatūroje, po to biotiniliniu antriniu antikūnu (1: 200) ir vizualizuota naudojant ABC / DAB metodą, vadovaujantis Vektorių rinkinys, SK4100, (Vektorių laboratorijos). Po to stikleliai buvo plaunami distiliuotu vandeniu, kad sustabdytų reakciją, ir po to du kartus 10 minučių plaunami TBS. Skyriai buvo dehidratuoti sumažinta alkoholio koncentracija, nuvalyti ksilenu ir uždengti Permount (Fisher Scientific Ltd).

Norint apskaičiuoti bendrą pluošto ilgį, serotonino teigiamų skaidulų nuotraukos buvo padarytos padidinant × 400, naudojant „Leica“ mikroskopo sistemą.

Statistiniai palyginimai buvo atlikti naudojant Mann-Whitney testą („GraphPad Prism“, San Diegas, CA, JAV).

Rezultatai

Iškart po SCI visos žiurkės negalėjo ištuštėti, todėl joms reikėjo rankinio šlapimo pūslės ekspresijos. Nors šlapimo pūslės buvo ekspresuojamos tris kartus per dieną, rankinio raiškos fazėje buvo pastebėtas visų gyvūnų pūslių išsiplėtimas. Per pirmąsias dvi pooperacines savaites trims gydomų žiurkių ( n = 8) ir dviem iš negydytų grupių ( n = 7) žiurkėms pasireiškė laikina hematurija. Po 3 savaičių visoms žiurkėms pasireiškė savaiminis tuštinimasis, nes rankiniu būdu išreikštos jų pūslės buvo tuščios (1 paveikslas), o apatinės pilvo ir tarpvietės sritys buvo sausos. Šeši gyvūnai, kuriems buvo skirtas gydymas (ty 75%), išlaikė šią būklę per likusį bandymo laikotarpį (tai yra 12 savaičių po sužalojimo). Priešingai, likusių dviejų gydytų žiurkių ir 100% neapdorotų žiurkių savaiminis tuštinimasis sumažėjo po 2 savaičių - skirtumas buvo reikšmingas tarp grupių (1 paveikslas). Kai šių žiurkių šlapimo pūslės buvo palpuojamos ar išreikštos rankiniu būdu, pastebėjome šlapimo pūslės dydžio sumažėjimą, palyginti su pirmosiomis 2 savaitėmis po pažeidimo. Tuo pačiu metu buvo stebimas nuolatinis šlapimo nutekėjimas, dėl kurio apatiniai pilvo ir tarpvietės plotai buvo šlapi, nors jie sulaikė nedidelį šlapimo kiekį.

Atlikus perfuziją ir vėliau išmatavus šlapimo pūslės dydį, buvo akivaizdu, kad nepažeistos kontrolinės pūslės buvo žymiai mažesnės (plotas: 0, 54 ± 0, 07 cm 2, n = 4) nei sužeistoms žiurkėms, kurių plotas 1, 69 ± 0, 21 cm 2 neapdorotoms žiurkėms ( P <0, 01) ir 2, 14 ± 0, 19 cm 2 ( P <0, 001) apdorotoje grupėje. Šlapimo pūslės dydžio skirtumas tarp dviejų sužeistų grupių nebuvo statistiškai reikšmingas (2b paveikslas). Neapdorotų žiurkių šlapimo pūslės taip pat buvo labai standžios ir turėjo storus raukšlėtas šlapimo pūslės sienas. Šie stebėjimai buvo įvertinti kiekybiškai išmatuojant šlapimo pūslės sienelės storį. Neapdorotų žiurkių (881, 2 ± 57, 6 μm) šlapimo pūslės sienos buvo žymiai storesnės, palyginti su gydytais gyvūnais (481, 9 ± 92, 4 μm) ir nepažeistais kontroliniais (466 ± 51, 6 μm, 3 paveikslas).

Image

Šlapimo pūslės dydis - 12 savaičių po visiško nugaros smegenų perskirstymo. a ) Reprezentatyvūs apdorotos ir neapdorotos šlapimo pūslės vaizdai iškart po perfuzijos iliustruoja storesnes ir standžias šlapimo pūslės sienas ir mažesnį neapdorotos grupės dydį. b ) šlapimo pūslės dydžio nustatymas parodė, kad žaibiškai padidėjęs šlapimo pūslės kiekis; tačiau nebuvo pastebėtas statistinis skirtumas tarp gydytų ir negydytų žiurkių. Duomenys yra pavienių gyvūnų grupėje (vidurkis ± pusė). ** P <0, 01, *** P <0, 001.

Visas dydis

Image

Imunoreaktyvumas α lygiųjų raumenų aktinui šlapimo pūslės sienelėse iš neapdoroto kontrolinio ( a ), apdoroto ( b ) ir negydyto ( c ) gyvūno rodo, kad negydytų žiurkių sienelių storis padidėjo. d ) Kontrolinės ( n = 4), apdorotos ( n = 8) ir negydytos ( n = 7) grupių šlapimo pūslės sienelės storio (μm) matavimai rodo, kad žaizdotai neapdorotoms žiurkėms šlapimo pūslės sienelės storis žymiai padidėjo. Masto juosta = 250 μm. ** P <0, 01. Duomenys yra pavienių gyvūnų grupėje (vidurkis ± pusė).

Visas dydis

Imunohistocheminė α lygiųjų raumenų aktino, esančio šlapimo pūslės sienelės audinio skerspjūvyje, analizė parodė, kad neapdorotoje grupėje padidėjo α lygiųjų raumenų pluoštų storis ir netvarkingumas, tuo tarpu gydytoje grupėje buvo plonesni, labiau organizuoti ir išlyginti α lygieji raumenys. pluošto sudėtis (4 paveikslas). Nors atrinktų ir negydytų pacientų grupėje padidėjo aktino imunoreaktyvumas, palyginti su nelegionuotu kontroliniu tirpalu, šis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas.

Image

Morfologiniai šlapimo pūslės sienelių pokyčiai po SCI atskleidžia padidėjusį III tipo kolageno nusėdimą. III tipo kolageno (raudonas) ir α-lygiųjų raumenų aktino (αSMA, žalias) imunofluorescencija yra nepažeista kontrolinė ( a ), pažeista - apdorota ( b ) ir negydyta ( c ) - šlapimo pūslės sienelės skerspjūvis. d ) Vidutinis αSMA lygis šlapimo pūslės sienelėje rodo tik nereikšmingą abiejų sužeistų grupių padidėjimą. e ) III tipo kolageno / αSMA santykiai rodo, kad sužalotose negydytose žiurkėse kolagenas padidėjo αSMA, palyginti su kontrolinėmis ir tirštomis žiurkėmis. Masto juosta = 250 μm. * P <0, 05. Duomenys pateikiami kaip grupės vidurkis ± sem

Visas dydis

Nors aktino lygis buvo palyginamas, panaši III tipo kolageno imunoreaktyvumo analizė parodė reikšmingą kolageno kaupimąsi negydytos grupės šlapimo pūslėse, palyginti su gydytais gyvūnais po SCI. Tai rodo sumažėjusį šlapimo pūslės sienelių elastingumą sužeistiems, negydytiems gyvūnams ir atitinka stebėtą šlapimo nutekėjimą, šlapimo pūslės standumą ir dėl to nesugebėjimą kaupti didelių šlapimo kiekių. Neapdorotos SCI grupės šlapimo pūslėse III tipo kolageno ir α-lygaus aktino santykis (1, 6 ± 0, 1), kuris rodo žymiai padidėjusios fibrozės laipsnį, buvo didesnis, palyginti su gydytomis SCI žiurkėmis (1, 1 ± 0, 15) ar neišsišakojusių kontrolinių pūslių (0, 97 ± 0, 2; 4 paveikslas).

Kadangi kaukolės serotonerginės inervacijos atkūrimas atrodė patikimas šlapimo pūslės funkcijos pagerinimo mechanizmas, mes išanalizavome bendrą serotoninu teigiamų skaidulų ilgį gydytų ir negydytų žiurkių stuburo juosmeninėje dalyje (5a pav.). Nesigilinant į bendrą įsitikinimą, kad atlikus pilną perpylimą, virvelės kaudalinėje į pažeidimo vietą nėra serotonerginių skaidulų, kontrolėse ir apdorotose žiurkėse aptikome trumpų ir nedaug skaidulų. Pluoštai atrodo nedaug ir yra gana trumpi (žr. Žemiau), su rutuliškais pavidalais, būdingi serotonerginiams pluoštams. Šios išvados patvirtina ankstesnius mūsų laboratorijos stebėjimus ir Niutono ir Hamilio tyrimus. 11 Analizuodami bendrą šių skaidulų ilgį, neradome statistinio skirtumo tarp kontrolinės (94 μm ± 34, 4) ir gydytų žiurkių (77 μm ± 33, 6; 5b paveikslas).

Image

Serotonerginiai pluoštai nugaros smegenyse. Apdorotų ir negydytų žiurkių nugaros smegenyse buvo rasti trumpi serotonino teigiamų skaidulų segmentai, turintys briaunuotą išvaizdą ( a ). Kiekybiškai įvertinant pluošto ilgį kiekvienoje kitoje sekcijoje, bendras šių pluoštų ilgis abiejose grupėse nesiskiria ( b ).

Visas dydis

Diskusija

Šlapimo pūslės valdymas pacientams, sergantiems SCI, stengiasi sumažinti infekcijas, išsaugoti inkstų funkciją ir pagerinti paciento gyvenimo kokybę. Pagrindinis veiksnys, prisidedantis prie dažno infekcijų pasireiškimo, yra nepilnas šlapimo pūslės tuštinimasis. Taigi gydymas, galintis nuolat atkurti ar palaikyti šlapimo pūslės tuštinimąsi po SCI, galėtų iš esmės pagerinti paciento savarankiškumą. Keletas tyrimų, susijusių su gydymu, skirtu sužeistam stuburo smegenims atkurti, pranešė, kad pagerina šlapimo pūslės funkciją SCI gyvūnų modeliuose. 12, 13, 14 Tačiau iki šiol nė vienas tyrimas neįrodė, ar ląstelių skiepijimas gali paveikti šlapimo pūslės funkciją po visiško nugaros smegenų perskirstymo. Eksperimentuose, kuriuose buvo atkuriami visiško SCI metodai, daugiausia dėmesio buvo skiriama variklio atsigavimui, todėl nebuvo pamiršta ištirti galimos šių strategijų terapinės naudos šlapimo pūslės funkcijai.

Dabartinio tyrimo pabaigoje mes nustatėme, kad negydyti gyvūnai turėjo šlapimo pūslės funkciją, kuri buvo aiškiai kitokia nei gydomoms žiurkėms. Priešingai nei gydytų žiurkių sausas tarpvietės plotas, negydyti gyvūnai dažnai būdavo šlapi, nurodydami nuolatinį šlapimo nutekėjimą, o ne skirtingus tuštinimosi laikotarpius. Galima teigti, kad šiam rezultatui daugiau įtakos turėjo lokomotorių atsigavimo skirtumai, o ne šlapimo pūslės funkcijos pokyčiai (pavyzdžiui, negydytos žiurkės yra mažiau judrios ir ilgiau laikosi vienoje vietoje). Tačiau tai atrodo mažai tikėtina, nes mes anksčiau parodėme 8, kad užpakalinių kojų funkcijos atsigavimas yra ribotas ir mažai prisideda prie varomosios jėgos judėjimo metu. Be to, net ir naudodamos tik priekines kojų žiurkes, jos yra labai judrios ir gali (priklausomai nuo traukos) pasiekti stulbinantį lokomotorinį greitį (nepaskelbtas stebėjimas). Galiausiai tuštinimosi skirtumas atsirado po fazės, kurios metu abiejų žiurkių grupių tirpalai buvo panašūs, o abiejų grupių žiurkės buvo sausos. Taigi atrodo labai mažai tikėtina, kad negydomoje grupėje progresą į kitokį tuštinimosi pobūdį lėmė prastesnis šių gyvūnų aktyvumas.

Išvada, kad šlapimo pūslės dydis padidėjo po traumos negydytai grupei, ir tai, kad SCI trikdo įvairius apatinių šlapimo takų funkcijos aspektus, patvirtina ankstesnį tyrimą, kuriame 2 savaites po sužalojimo buvo parodytas dvigubas šlapimo pūslės dydžio padidėjimas. 15 Mūsų stebėjimai šlapimo pūslės ekspresijos metu (per 2 savaites po pažeidimo) parodė, kad šlapimo pūslės dydis iš pradžių padidėjo visiems gyvūnams pirmosiomis savaitėmis, tačiau vėliau sumažėjo negydytiems gyvūnams. Šie duomenys kartu su stebėtu tuštinimosi veiksmingumu abiejose grupėse rodo, kad tuštinimasis ir šlapimo pūslės disfunkcija nebūtinai turi įtakos padidėjusiam šlapimo pūslės dydžiui, o antriniai pokyčiai (tai yra dydžio sumažėjimas). Šią mintį sustiprina anatominiai atradimai, kad negydytos žiurkės turėjo raukšlėtas pūsles, padidėjusias sienelių sieneles ir kurių sienelėse buvo didesnis procentas III tipo kolageno. III tipo padidinto kolageno nusėdimas laikomas sumažėjusio šlapimo pūslės atitikties rodikliu ir anksčiau buvo pranešta tiek eksperimentiniuose gyvūnų modeliuose, tiek žmonėms, sergantiems SCI. 16, 17 Šią mintį palaiko mūsų neapdorotos grupės stebėjimai, kurie parodė sumažintą šlapimo pūslės talpą (tai yra nepilnas šlapimo ištuštinimas kartu su dažnu šlapimo pašalinimu). Šlapimo pūslės sienelių storio padidėjimo ir sumažėjusio atitikimo / padidėjusio kolageno priežastys yra neaiškios, tačiau jas gali sukelti šlapimo pūslės sfinkterio disinergija, sukelianti nuolatinį vezikulinį spaudimą, dėl kurio buvo nuolatinis tuštinimasis / nutekėjimas.

Sužeistų gydytų žiurkių pailgintos pūslės ir palyginamasis sienos su nepažeistomis žiurkėmis sienelių storis yra šiek tiek priešingas. Tai galbūt rodo, kad gydomoje grupėje padidėjo bendras šlapimo pūslės audinio kiekis. Rezultato matas, kuris būtų išsprendęs šią problemą, galėjo būti šlapimo pūslių svėrimas. Jei šlapimo pūslės audinio padidėjimą lėmė bendras gydytų gyvūnų aktino padidėjimas, galima teigti, kad tai yra priežastis didesniam kolageno ir aktino santykiui negydytų žiurkių pūslėse. Tačiau tai atrodo mažai tikėtina, nes statistiškai nesiskyrė aktino kiekis identiškose histologinių pjūvių vietose tarp gydytų žiurkių ir negydytų gyvūnų. Taigi galimas bendras aktino padidėjimas gydomoms žiurkėms būtų susijęs su visos šlapimo pūslės dydžio padidėjimu, bet ne dėl padidėjusio sienos skerspjūvio.

Savo tyrime pirmą kartą pranešame apie efektyvios šlapimo pūslės funkcijos palaikymą po visiško SCI nustatymo žiurkėms, gavusioms ląstelių transplantato ir randą mažinančio fermento derinį - tai būdas skatinti aksonų regeneraciją. 8 Yra įvairių galimybių, galinčių paaiškinti skirtumą tarp grupių, įskaitant mažėjančios grandinės atkūrimą arba neuromoduliacinių aksonų, įskaitant serotonerginius pluoštus, regeneravimą, kaip buvo siūloma anksčiau, 18, 19 po sumušimo sužeidimo 13 arba visišką pažeidimą. 20 Ankstesniuose tyrimuose, kuriuose teigiama, kad serotonerginės skaidulos gali būti naudojamos stebint šlapimo pūslės funkciją, pritariama ankstesniuose tyrimuose, kuriuose serotonerginiai pluoštai, kilę iš rapso branduolių, galėjo atsinaujinti per ląstelinį tiltą ir į nugaros smegenų raiščius. iki sužalojimo. 8 Be to, ankstesnė literatūra parodė, kad transneuroninio pėdsakų (Pseudorabies viruso) injekcija į išorinius šlaplės sfinkterio ar šlapimo pūslės paženklintus ląsteles Raphe Magnus ir Raphe pallidus. 3 Galiausiai įrodyta, kad raphe magnus ir gigantocellular retikulinio branduolio stimuliavimas slopina spontanišką šlapimo pūslės susitraukimą. 21 Taigi, kaukolės serotonerginės inervacijos atstatymas atrodo patikimas šlapimo pūslės funkcijos pagerinimo mechanizmas šiame tyrime. Tačiau trūksta stuburo juosmens smegenų serotonerginės inervacijos skirtumų, susijusių su gydomomis ir negydytomis žiurkėmis. Tai rodo, kad pastebėti funkciniai pokyčiai buvo susiję su kitais mechanizmais. Atsižvelgiant į mūsų ankstesnį serotonerginių skaidulų, augančių per transplantatą ir iš jo, 8 atradimą, dabartiniai rezultatai leidžia daryti dvi išvadas. Pirma, jei yra koks nors serotonerginių skaidulų regeneravimas per atstumą tarp greitojo kaukolės galo ir toli į juosmeninę stuburo slankstelį, tai yra nereikšminga, nes skaidulų kiekis buvo panašus į neapdorotų kontrolinių medžiagų kiekį. Antra, kadangi neapdorotų kontrolinių organų juosmens stuburo smegenyse buvo serotonerginio pluošto, jie turi būti ne supraspinalinės kilmės, kaip aprašyta anksčiau. 11

Alternatyvusis šlapimo pūslės funkcijos palaikymo mechanizmas, t. Y. Atsinaujinanti mažėjanti kontrolė, paremtas ankstesniais atradimais, kad po mūsų bendro gydymo aksonai, kilę iš smegenų kamieno branduolių, tokių kaip tinklainės formavimas, taip pat stuburo interneuronai, atsinaujino skersai. pažeidimo vieta. 9 Kadangi iš retikulinio formavimosi atsirandantys aksonai tiesiogiai ar per stuburo interneuronus moduliuoja juosmens motoneuronų aktyvumą, jų regeneracija gali būti atsakinga už motoneuronų išgyvenimo pratęsimą, o tai savo ruožtu galėtų išlaikyti veiksmingą šlapimo pūslės funkciją gydomoje grupėje. 2

Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas išplečia mūsų kombinuoto gydymo funkcinį naudingumą ir parodo, kad ląstelių transplantacija ir chondroitinazės perdavimas gali būti naudingi šlapimo pūslės funkcijai, kai žiurkėms atlikta visiška SCI. Pagrindinių mechanizmų išsiaiškinimas suteiks naują pagrindą būsimiems tyrimams, orientuotiems į sužeisto nugaros smegenų atstatymą ir šlapimo pūslės reabilitaciją.