Ežiuko išraiškos bangos, susijusios su vorų galvos segmentacija, sklidimas ir padalijimas | gamtos komunikacijos

Ežiuko išraiškos bangos, susijusios su vorų galvos segmentacija, sklidimas ir padalijimas | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Korinio signalo tinklai
  • Embriologija
  • Genų išraiška
  • Zoologija

Anotacija

Vystymo metu segmentacija yra procesas, sukuriantis erdvinį periodinį modelį. Didžiausias genų ekspresijos bangų padalijimas yra matematiškai nuspėjama, paprasta strategija, atspindinti šio tipo procesą, tačiau ji nebuvo gerai apibūdinta biologiškai. Čia parodomas laikinai pasikartojantis genų ekspresijos suskaidymas į juosteles, susijęs su galvos ašies augimu vorinio Achaearanea embrione. Ankstesniame segmentavime stebima gyvatvorės homologo geno išraiškos banga, einanti užpakaliniu 6 vystymosi etapu. Ši juostelė, kartu išreiškianti ortodiktinę homologą, išgyvena du padalijimo ir pasislinkimo ciklus kartu su konvergentu pratęsimu, tarnaujančia kaip generatyvinė galvos sritis. segmentai. Du ortodiktiniai ir nelyginiai poros homologai yra identifikuojami kaip Ežio signalizacijos taikiniai, ir įrodymai rodo, kad jų veikla tarpininkauja grįžtamojo ryšio ryšiui palaikyti galvos generacinę zoną ir skatinti juostų suskaidymą šioje zonoje. Mes siūlome, kad „juostos padalijimo“ strategijoje būtų naudojami genetiniai komponentai, bendri su Drosophila blastoderm poskyriu, kurie reikalingi norint dalyvauti autoreguliaciniame signalizacijos tinkle.

Įvadas

Gyvūnų segmentacija, sukurianti erdvinį, periodinį modelį, buvo ištirta naudojant įvairius organizmus 1, 2, 3 ir naudojama kaip paprasta platforma, leidžianti ištirti biologinį modelio susidarymo matematinį pagrindą 4, 5, 6, 7 . „Skirstymas į dalis“ ir „virpesiai“ yra dvi pagrindinės gyvūnų segmentavimo strategijų kategorijos (1a, b pav.). Pirmasis apibūdinamas kaip ilgojo gemalo vabzdžio Drosophila blastodermos suskaidymas, o tam reikia palyginti sudėtingo morfogenų gradientų, iš anksto nustatytų gana dideliame lauke, ir genų sąveikos hierarchijos 8, 9 . Pastarąjį apibūdina stuburo paraksialinio mezodermos segmentacija, kuriai reikalinga tam tikru laiku atidėta autorepresijos sistema, kuri pasiekia ritminį virpesį, kad iš eilės būtų generuojamos naujos vienišos, judančios bangos. Panašus virpesių mechanizmas gali būti susijęs su segmentacija, vykstančia nuosekliai užpakalinėje augimo zonoje trumpojo gemalo nariuotakojų, tokių kaip vorai, embrionuose 14 .

Image

Mėlynos išlenktos linijos nurodo autentiškos arba hipotetinės segmentinės genų ekspresijos profilius išilgai lauko ašies. Pastebimi skirtumai, kaip atsiranda naujos bangos. a ) Drosophila blastodermos embriono segmentacija. Motinos morfogenų hierarchinės kaskados (pavaizduotos oranžine ir šviesiai žalia spalvomis), tarpo genai (pavaizduoti raudona, violetinė ir tamsiai mėlyna spalva) ir poros taisyklių genai (pavaizduota žalia ir geltona spalva) padalija embrioną į laipsniškai mažesnius domenus ir ilgainiui lemia segmentų poliškumo genų ekspresijos inicijavimas beveik tuo pačiu metu visuose formuojančiuose segmentuose 8, 9 . Paprastumo dėlei kai kurie segmentai praleisti. b ) Pelės paraksialinio mezodermos segmentas „svyravimas“. Naujų vienišų keliaujančių HES / plaukuotos šeimos genų, tokių kaip HES1 , raiškos kartos išsivysto į erdvinį periodinį modelį 1, 10, 11, 12, 13 . Skaičius kiekvienos bangos smailėje rodo bangų gimimo tvarką. c ) Aktyvatorių smailių „įterpimas“, kuris pastebėtas aktyvatoriaus-inhibitoriaus tipo reakcijos difuzijos sistemų skaitmeniniame modeliavime augančiame lauke 19, 20, 21 . Atminkite, kad naujoji banga kyla per atstumą nuo esamų bangų. d ) Aktyvatorių smailių „padalijimas“, kuris buvo pastebėtas atliekant skaitmeninius aktyvatoriaus nusodinto substrato tipo reakcijos difuzijos sistemų modeliavimus augančiame lauke 6, 19, 22, 35 . Kiekvienas padalijimo ir perėjimo ciklas reiškia savotišką replikaciją.

Visas dydis

Nors buvo bandoma matematiškai modeliuoti Drosophila ir stuburinių segmentus, remiantis eksperimentiniais stebėjimais 15, 16, 17, 18, tolesni teoriniai metodai, ypač skaitinė cheminių reakcijų ir difuzijos analizė, paskatino pasiūlyti skirtingas modelio formavimo sistemas, kurios galėtų būti taikomas gyvūnų segmentavimui. Dviejų komponentų autokatalitinės reakcijos difuzijos sistemos gali sukelti nuoseklų naujų aktyvatoriaus smailių įterpimą tarp esamų aktyvatoriaus smailių 19, 20, 21 (1c pav.) Ir pakartotinių esamų aktyvatorių smailių dalijimo ir perjungimo ciklų 6, 19, 22. (1d pav.). Aktyvatoriaus smailių įterpimą ir suskaidymą skatina lauko augimas. Nors beicuoti embrionai, kurie rodo, kad genų ekspresijos sritis per palyginti trumpą laiką išsiskiria į keletą juostelių ar pleistrų, buvo aprašyti 23, 24, „susiskaidymo“ įvykiai gyvūnų segmentacijos kontekste nebuvo gerai apibūdinti ląstelėse ir molekuliniai terminai.

Šiame darbe pagrindinis dėmesys skiriamas voratinklio Achaearanea tepidariorum embrionų galvos segmentacijai. Šiuose embrionuose ląstelė yra baigta 16 branduolio 25 stadijoje arba prieš ją, tai rodo, kad visi jų segmentų procesai vyksta ląstelinėje aplinkoje. Embrionų segmentinė gemalo juosta yra padalinta į tris sritis, atitinkančias galvą (cefaloną), krūtinę ir opisthosomą. Galvoje yra dvi poros priedų, chelicerae (Ch) ir pedipalps (Pp), o krūtinėje yra keturios poros priedų, kurios yra vaikščiojančios kojos (L1-4). A. tepidariorum genas At-ežiukas ( At-hh ) 26, Drosophila segmento poliškumo hh geno, koduojančio išskiriamą signalinį baltymą, homologas, yra ekspresuojamas būsimoje embriono priekinėje pusėje 27 . At-hh išraiška prasideda maždaug nuo ankstyvos 3 stadijos (nuoroda 27), o vėliau At-hh tarnauja kaip ankstyvasis galvos ir opisthosomų segmentų molekulinis rodiklis 23, 26, 27 . Nesant At-hh aktyvumo, atsiranda sunki kaukolė 27 . Pradinei Drosophila galvos plyšį primenančio ortodiktinio ( Od ) geno A. tepidariorum homologo, išreikšto At-otd 28, ekspresijai reikia stiprių Hh signalų įėjimo 27 . Ši tiksli išraiška yra būtina apibūdinant visą galvos sritį 23 . Tačiau apie juostelių formavimo procesus, susijusius su vorų galvos segmentacija, mažai žinoma.

Šiame tyrime, pasinaudoję vorų modeliu, mes nustatėme „juostelėmis dalijantį“ segmentą, susietą su konvergentu, kuris pailgina voro galvos ašį. Remdamiesi stebėjimais ląsteliniu ir molekuliniu lygiais, mes apibrėžėme naują segmentų strategijos kategoriją - „split-type“ segmentaciją. Funkcinė analizė leidžia manyti, kad suskaidyto tipo vorinių galvų segmentacijai reikalingas autoreguliacinis signalizacijos tinklas, kuriame dalyvauja At-hh , At-otd ir kiti Drosophila segmentacijos genų homologai.

Rezultatai

At-hh juostos keliavimas

Norėdami nustatyti, kur tariama galvos ektoderma yra ankstyvos stadijos 5-lytinių gemalų diske, mes mikroinjektavome fluorescencinį dekstraną į atskirus blastomerus. Stebint paženklintus ląstelių klonus, paaiškėjo, kad galvos ektoderma, atitinkanti Ch ir Pp segmentus, buvo gauta iš gemalo disko ląstelių, esančių 5–5 ląstelėse nuo gemalo disko kraštų ankstyvoje 5 stadijoje (2a, b pav.). Gyvas stebėto žymėto ląstelių klono stebėjimas ir in situ hibridizacija parodė, kad pradinės ratlankio ląstelės buvo internalizuotos nuo 5-osios stadijos iki 6 -osios stadijos, ir daugelis, bet ne visos šios ląstelės tapo „Twist“ ( At-twi ) ekspresuojančia mezoderma. ląstelės 26, 29 (papildomas S1 pav. ir 1 papildomas filmas).

Image

a ) Mažo ląstelių klono, pažymėto RITC – dekstrano (raudona) mikroinjekcijomis, stebėjimas. Gyvas embrionas buvo fotografuojamas nurodytais etapais. Ligos disko, esančio šalia klono, kraštas yra taškinis (ankstyva 5 stadija). Rodyklės rodo besivystančius Ch ir Pp segmentus. b ) Achaearanea vystymosi schema, parodanti gemalo disko virsmą segmentine gemalo juosta. Stebimas ląstelių klonas, pavaizduotas ženkle, pavaizduotas raudonai. Parodomas apytikslis laikas po kiaušinių padėjimo. c ) At-hh (purpurinė) ir At-otd (raudona) nuorašų išraiška ankstyvame 5 etape prie lytinio akies disko krašto (balti taškai). Apatiniame skydelyje parodytas DNR fluorescencinis vaizdas. Įdėtyje yra embriono iliustracija, parodanti orientaciją ir padidintą sritį. ( d ) At-hh (purpurinė) ir At-otd (raudona) nuorašų išraiška 6-osios stadijos viduryje besiformuojančios gemalo juostos priekiniame kraštiniame regione. Kairiajame skydelyje yra padidintas dešinėje skydelyje esančios dėžutės srities vaizdas, o apatinėje - DNR fluorescencinis vaizdas. Baltos spalvos taškai rodo priekinę paraštę. e ) At-hh juostos aptikimas stebimo ląstelių klone. Embrionas, turintis ląstelių kloną, pažymėtą FITC – dekstranu (žalia) daugiau nei dviem ląstelėmis nuo gemalo disko krašto (balti taškeliai) ankstyvoje 5 stadijoje (kairiajame skydelyje), buvo fiksuotas 7 ankstyvoje stadijoje ir dažomas At-hh nuorašai (purpurinė) ir FITC – dekstranas (rožinė) (vidurinė ir dešinė plokštės). Vidurinis skydelis yra padidintas dėžutės srities vaizdas dešinėje skydelyje. Baltos spalvos taškai rodo priekinę paraštę. Rodyklių galvutės nurodo At-hh juostą ( c - e ). Mastelio juostos, 100 μm a, 50 μm c - e . A, priekinis; Ce, cefalo skilties; Ch, cheliceros; Ex, ekstraembrioninis audinys; L, koja; P, užpakalinė; Pp, pedipalp.

Visas dydis

Mes ištyrėme erdvinius ryšius tarp At-hh ir At-otd raiškos modelių ankstyvojo galvos vystymosi metu. Ankstyvame 5 etape At-hh ir At-otd nuorašai buvo išreikšti per 1–2 ląsteles (pločio) ties gemalo disko kraštu (2c pav.). Nepaisant ląstelių internalizacijos, At-hh ir At-otd išraiška išliko gemalo disko krašte iki 6 stadijos pradžios. Ankstesni tyrimai parodė, kad gemalo diske pradeda vykti morfologiniai pokyčiai, kad susidarytų gemalo juosta, At-hh juostelė keičia savo santykinę padėtį nuo besiformuojančios gemalo juostos priekinės kraštinės (gemalo disko kraštas) užpakalinės dalies (gemalo disko centro) link 23, 27 . Šiame tyrime dvigubas At-hh ir At-otd dažymas atskleidė, kad besikeičianti At-hh juostelė buvo išlaikyta ties At-otd ekspresijos srities užpakaline riba (2d pav.), Besiplečiančia išilgai anteroposterior (AP). ašis. Nors ankstesniame tyrime 23 ši At-hh išraiška buvo laikoma dinamiška, 23 autoriai neatmetė galimybės, kad santykinis At-hh juostos pasislinkimas gali atsirasti dėl ląstelių judėjimo ar ląstelių įdarbinimo.

Norėdami ištirti At-hh- geno raiškos juostos dinamines savybes, mes panaudojome ląstelių klonų sekimo ir molekulinio dažymo derinį. Pažymėtas ląstelių klonas, buvęs daugiau nei per dvi ląsteles nuo gemalo disko krašto ankstyvojoje 5 stadijoje, buvo susikirtęs At-hh juostele, aptinkama spėjamoje galvos ektodermoje ankstyvoje 7 stadijoje (2e pav.). Šis rezultatas, kartu su aukščiau pateiktais išraiškos duomenimis, leido manyti, kad nuo ankstyvos 5 stadijos iki 7 ankstyvos stadijos labiau centrinės (arba užpakalinės) ląstelės palaipsniui pradėjo reikštis At-hh , o ląstelės, esančios periferinėse (arba priekinėse) padėtyse, turbūt apimančios būsimas mezodermos ląsteles, nustojo ekspresuoti At-hh . Taigi mes padarėme išvadą, kad bent jau per 6 etapą At-hh juosta eina tam tikru atstumu užpakalyje kaip banga. Vis dėlto nebuvo lengva nustatyti, kada ir kur sustoja At-hh juostos užpakalinis judėjimas, nepaisant to, kad tarp galvos ir krūtinės ląstos yra suformuota genų ekspresijos riba (žr. Žemiau).

Pakartotinis At-hh geno ekspresijos juostelės padalijimas

Norėdami stebėti keliaujančios At-hh juostos likimą vorinio galvutės ektodermoje, pasinaudojome tuo pačiu metu brolių ir seserų embrionų vystymuisi kiaušinių maišelyje. Embrionai buvo fiksuojami 2 valandų intervalais nuo 7 stadijos pradžios (laiko momentas apibrėžtas kaip 0 h) per 10 h (iki 8 ankstyvos stadijos) ir po to buvo dvigubai dažomi At-hh ir At-otd. arba Deformuotas ( At-Dfd ) 27 (3 pav.). At-Dfd yra patikimas šlaunies srities 30 žymeklis, o jo ekspresijos domenas buvo papildomas At-otd ekspresijos domenu ankstyvoje 7 stadijoje, bet ne 8 stadijoje (3a pav.). 0 val. Laiko taške At-hh juostelė buvo išdėstyta arkos formos cells 2–4 langelių pavidalu, kurie sutapo su At-otd-išsireiškimo srities užpakaline riba, greta At-Dfd-ekspresijos domeno. (3b – d pav.). Vėlesniais laiko momentais At-hh juosta, sutapusi su At-otd raiškos domenu, išsiplėtė ir beveik tuo pačiu metu arba vėliau buvo įterptas At-hh neigiamas domenas, dažnai pasižymintis panašiu į atvirą burną modeliu (3b pav. d, 2, 4 h). Embrionuose, fiksuotuose 2 ir 4 valandų laiko taškuose, buvo stebimi įvairūs laikini modeliai (papildomas S2 pav.), Rodantys, kad At-hh išraiška dingo iš juostos vidurinių sričių - procesas, kurį mes vadiname „ padalijimas '. Po šio padalijimo įvyko gautų juostų santykinės padėties pasislinkimas išilgai AP ašies. Svarbu tai, kad priekinė juostelė išliko teigiama, o kita - neigiama. Tik „ Ot-otd“ pozityvioji „ At-hh“ juostelė išgyveno kitą skilimo ciklą (3b pav., 6–10 h). Šie du genų ekspresijos juostelių padalijimo ciklai, kurių kiekvienas užtruko maždaug po 4 h, sudarė tris At-hh juosteles, vėliau pastebėtas galvos ektodermoje (3b – d pav., 10 h), o trys juostelės atitiko užpakalinės Pp ir Ch segmentų dalys ir cefalinės skilties (šia tvarka pradedant nuo užpakalinės pusės).

Image

a ) At-otd (violetinė) ir At-Dfd (raudona) ekspresijos domenų palyginimas embrionuose ankstyvoje 7 stadijoje (kairėje) ir 8 stadijoje (dešinėje). b ) Embrionai iš vieno kiaušinio maišelio, pritvirtinti kas 2 valandas ir dažomi At-hh (purpurinė) ir At-otd (raudona) spalvoms . Pirmasis fiksavimas buvo atliktas ankstyvoje 7 stadijoje (0 val.). Rodyklių galvutės rodo At-hh juostų skaičiaus padidėjimą spėjamoje galvos ektodermoje. Taškai rodo „L - segmentą“ atitinkančią „ At-hh“ juostelę. c ) penkių regionų, pažymėtų b punkte, diferencinių trukdžių kontrastiniai vaizdai. Mėlynos ir raudonos linijos kiekvienos plokštės dešinėje nurodo atitinkamai At-hh ir At-otd išraiškos domenų diapazonus. d ) Embrionai iš tų pačių grupių, kaip ir b, dažyti At-hh (purpurinė) ir At-Dfd (raudona) nuorašams . „ At-hh“ juostos ženklinamos taip pat, kaip ir b punkte . e ) Embrionai, dažyti At-en (purpurinė) ir At-otd (raudona) nuorašais. 6 etapas (kairėje), vidurinis 7 etapas (viduryje) ir ankstyvasis 8 etapas (dešinėje). Rodyklės rodo At-en juostą, kuri greičiausiai atitinka L1 segmentą. Visi embrionai yra nukreipti iš priekio į viršų. Ce, cefalo skilties; Ch, cheliceros; Pp, pedipal. Mastelio juostos, 100 μm, a, b, d, e ; 20 μm c .

Visas dydis

Skirtingai nei galvos srityje, nepastebėta jokio skilimo modelio, susijusio su At-hh raiška krūtinės srityje. Trys At-hh genų ekspresijos juostelės, atitinkančios L1-L3 segmentus, pasirodė beveik tuo pačiu metu nuo 7 stadijos vidurio iki ankstyvos 8 stadijos (3b pav., D, 8, 10 h). „ At-hh“ juostelė, atitinkanti L4 segmentą, suformuota At-Dfd ekspresijos srities užpakaliniame gale 6 stadijoje (3d pav., 0 h). Atrodė, kad opisthosominių segmentų At-hh juostelių kilmė yra susijusi su At-hh išraiškos atsiradimo ir išnykimo ciklais kaukolės skilties centre (3b pav., D). Šie stebėjimai rodo, kad segmentacijos būdas skiriasi galvos, krūtinės ląstos ir opisthosominėse srityse. Be to, priešingai nei At-hh , kito segmentinio poliškumo geno homologo „Atgraviruotas ( At-en ) 31“ išraiška pirmą kartą buvo aptikta 7-ojo etapo viduryje ir pabaigoje (3e pav.). Atrodė, kad ši „ At-en“ juosta atitinka L1 segmentą. Galvos ir opisthosominiuose regionuose At-en ekspresijos iniciacijos buvo daug vėlesnės nei At-hh ekspresijos, tai rodo, kad At-en nedalyvauja ankstyvuose vorinių galvų segmentacijos etapuose.

Juostelių padalijimas yra lygiagretus pratęsimas

Norėdami apibūdinti skilimo procesą, susijusį su At-hh geno išraiškos juosta galvos ektodermėje ląstelių lygiu, mes stebėjome ląstelių judėjimą ir ląstelių dalijimąsi, naudodami gyvus embrionus, lokaliai išreiškiančius sulietą baltymą, susidedantį iš branduolio lokalizacijos signalo (NLS) ir tdEosFP ( NLS-tdEosFP) ( n = 4). „TdEosFP“ fotokonversija palengvino ląstelių sekimą. Mes išanalizavome tipinį duomenų rinkinį, kuris apėmė 14, 5 val. Raidos, pradedant nuo vėlyvojo 5 etapo (4a pav., B; 2 papildomas filmas). Ši analizė atskleidė, kad tarp dviejų 5 valandų laikotarpių įvyko 4, 5 h (nedaug ląstelių dalijantis), per kurį ląstelių skaičius beveik padvigubėjo (4c pav.). Per šiuos tris laikotarpius iš eilės laipsniškai didėjo pažymėtos srities kraštinių santykis (ilgis / plotis). Svarbu tai, kad ląstelių skaičius per pažymėto ploto plotį (dorsoventralinę ašį) sumažėjo per pastaruosius du laikotarpius, tai rodo, kad orientuotas ląstelių pertvarkymas epitelyje prisidėjo prie galvos ektodermos AP ašies pailgėjimo, būdingo konvergento pratęsimo judesio.

Image

a ) NLS-tdEosFP ekspresuojančio ląstelės klono stebėjimas greitaeigėje galvos ektodermoje. „TdEosFP“ buvo iš dalies pakeista iš žalios spalvos (parodyta žalia spalva) į raudoną (parodyta purpurine spalva) ląstelės klono dalyje prieš pat stebėjimo, kuris prasidėjo 5 pabaigoje, pradžią. 10 optinių sekcijų serija. (7, 76 μm storio) buvo renkama kas 10 min., Ir parodytos optinių sekcijų, surinktų nurodytu laiku (h: min), projekcijos. Rodyklių galvutės nurodo dvi ląsteles, kurios buvo pertvarkomos, kad taptų greta viena kitos. Kad būtų lengviau suskaičiuoti ląsteles, žemiau nuotraukų parodyti fluorescencijos intensyvumo profiliai išilgai oranžinės ir mėlynos linijų. b ) At-hh juostelių aptikimas pastebėtame embrione, kuris buvo įdėtas į fiksatorių maždaug 14:30 val., ty 10 minučių po paskutinių vaizdų surinkimo. Kairiajame skydelyje parodyta At-hh nuorašų (purpurinė) ir ląstelių linijos žymiklio biotino – dekstrano (ruda) raiška, o dešinėje - DNR fluorescencijos vaizdas. At-hh teigiamos ir neigiamos ląstelės pažymėtoje srityje pažymėtos atitinkamai šviesiai mėlynais ir geltonais taškais, nors rodyklėje nurodytas langelio signalas buvo dviprasmiškas. Tarp dviejų At-hh juostelių At-hh neigiamame domene buvo 22 pažymėtos ląstelės. Žvaigždutės nurodo ląsteles At-hh neigiamos srities kampuose tarp dviejų At-hh juostelių ( b ) ir jų protėvių ląstelių ( a ), o apskritimai nurodo ląsteles, esančias priekiniame ir užpakaliniame abiejų juostelių gale ( b ) ir jų protėvių ląstelės ( a ). Balti taškai rodo besiformuojančios gemalo juostos priekinę kraštą. Svarstyklės, 50 μm. c ) Grafikas, rodantis bendro ląstelių skaičiaus ir kraštinių santykio (ilgio / pločio) pokyčius stačiakampiuose, parodytuose pažymėtos srities a ir b punktuose .

Visas dydis

Be to, atlikus tiesioginį stebėjimą in situ hibridizavimas parodė, kad stebimą ląstelės kloną kerta dvi atskiros At-hh genų ekspresijos juostelės (4b pav.). Ląstelių aptikimas filme, kurio laikas buvo vienas po kito, parodė, kad ląstelės, kurios paskutiniu laiko momentu (14, 5 val.) Uždengė dvi At-hh juosteles, atsirado iš maždaug dviejų ląstelių pločio linijos 0-h laiko taške (atitinkančios vėlyvą stadiją) 5) ir maždaug keturių ląstelių pločio linija 5 h laiko taške (atitinkanti 6 vėlyvąją stadiją) (4a pav., B, apskritimai) ir panašiai, kad ląstelės, kurios sudarė At-hh neigiamą sritį tarp At-hh geno ekspresijos juostos atėjo iš maždaug dviejų ląstelių pločio linijos 5 h laiko taške (4a pav., b, žvaigždutės). Vėlyvajame 6 etape, prieš pradedant pirmąjį padalijimo ciklą, At-hh juostelė paprastai buvo stebima kaip cell 2–4 langelio pločio linija, iš esmės tokia pati, kaip parodyta 3b – d paveiksle, 0 h. Šie stebėjimai aiškiai rodo, kad At-hh neigiamo domeno atsiradimas tarp dviejų At-hh juostelių skilimo cikle yra dėl dinamiškos At-hh išraiškos slopinimo, lydimo ląstelių pertvarkymo paviršiaus epitelio sluoksnyje, o ne dėl naujų At-hh - neigiamos ląstelės iš kitų ląstelių sluoksnių. Iš At-hh raiškos modelių raidos eigos (3 pav.) Darome išvadą, kad At-hh geno raiškos juostos pirmojo skilimo įvykio laikas atitinka antrąjį proliferacinį periodą (tarp 9, 5-h ir 14, 5 val. Laiko taškai). Tačiau kadangi nebuvo pastebėta vietiniu mastu padidėjusių ląstelių dalijimosi greičių (4a pav., B; 2 papildomas filmas), mažai tikėtina, kad kylančio At-hh neigiamo domeno išsiplėtimas atsiranda dėl ląstelių dalijimosi modelių reguliavimo. Techniškai sunku nustatyti, kada kiekviena At-hh išraiškos juosta nusėda ribotos kilmės ląstelių populiacijose.

„ At-otd“ vaidmuo palaikant dinaminę At-hh išraišką

Tėvų RNR trukdžių (pRNRi) naudojimas paprastai yra ribotas tais atvejais, kai tikslinio geno sunaikinimas visame embrione neleidžia vystytis ankstesnėmis stadijomis, nei įvyksta dominantis vystymosi įvykis. Ankstesniame tyrime 23 buvo nustatyta, kad pRNAi numušęs At-otd sukelia nuolatinę At-hh juostos lokalizaciją besiformuojančios gemalo juostos priekinėje dalyje. Čia mes pastebėjome, kad At-hh juostos išsilaikymas buvo susijęs su normalios At-Dfd neigiamos galvos srities specifikacijos nesėkme (papildomas S3 pav.). At-otd pRNR atveju nebuvo įmanoma ištirti At-otd vaidmens keliaujant ir dalijantis At-hh juostele.

Norėdami ištirti voratinklinės galvos segmentacijos mechanizmus, pirmą kartą Achaearanea embrionams pritaikėme embrioninius RNR trukdžius (eRNR). Dvigrandės RNR (dsRNR) tiksliniams genams, kartu su ląstelių linijos žymikliais, buvo įvestos į viengubus blastomerus 32–128 ląstelių stadijose. Mes patvirtinome, kad eRNAi sukuria ląstelių autonominį poveikį Achaearanea , atsižvelgiant į taikinių nuorašų stabilumą citoplazmoje (papildomas S4 pav.). Kiekvienam genui buvo paruoštos dvi skirtingos dsRNR ir mikroinjekcijos, kad būtų galima patvirtinti genui specifinių fenotipų susidarymą (papildoma S1 lentelė; metodai). Parodomi tik vieno iš dviejų kiekvieno tikslinio geno dsRNR rezultatai. Kontroliniuose eRNRi eksperimentuose buvo įšvirkšta medūzų žaliųjų fluorescencinių baltymų geno ( gfp ) dsRNR , kuris neturėjo jokio poveikio tikslinių genų raiškos modeliams (5a pav.; Papildomas S5 pav.) Ar At-hh , neatsižvelgiant į vietą ląstelių klonų, į kuriuos buvo įvesta dsRNR (5b pav.; spėjama galvos ektoderma, n = 12 (įskaitant ląstelių klonus, uždengiančius gemalo disko kraštą, n = 7); krūtinės ir opisthosominę ektodermą, n = 8). Atliekant kitus eRNR eksperimentus, kai dsRNR buvo įvesta krūtinės ląstos ir opisthosominėse srityse, At-hh raiškos modeliai nebuvo paveikti (5c pav.; N = 7). Tačiau kai At-otd eRNRi ląstelių klonai uždengė gemalo disko kraštą, buvo pastebėti panašūs, nors ir lokalūs , defektai, palyginti su At-otd pRNAi sukeliamais defektais (5d pav .; 100%, n = 7). Ši išvada atitinka teiginį, kad At-otd nėra būtinas At-hh išraiškos inicijavimui, bet reikalingas santykiniam At-hh juostos poslinkiui priekinėje galinėje srityje 23 . Ši vietinė At-hh juostos judėjimo prevencija lėmė lygiagrečią galvos segmentacijos progresą dviejuose atskiruose regionuose, nepažeisdama krūtinės ląstos At-hh juostų vystymosi (5d pav.). Dar svarbiau, kai At-otd eRNAi ląstelių klonai buvo numatomoje galvos ektodermoje (šiek tiek pašalinta iš gemalo disko krašto), At-hh juostelei buvo leista pradėti keliauti, tačiau klonai ją suskaidė į dvi gretimas juosteles (pav. 5e; 100%, n = 10). Šis netikėtas fenotipas buvo paaiškintas paprasčiausiai At-hh ekspresijos praradimu At-otd eRNAi ląstelių klonuose. Atskirtos At-hh juostos savarankiškai sukūrė būdingus „suskaidymo“ modelius, kurių dydžiai buvo pritaikyti mažesniems laukams (5e pav.). Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad At-otd reikia išlaikyti At-hh išraišką judėjimo ir skaidymo fazėse, o At-otd - teigiama At-hh juostelė tarnauja kaip voratinklinės galvos segmentų generatyvinė zona.

Image

a ) At-otd nuorašų aptikimas embrionuose, įpuršktuose į kontrolinę gfp dsRNR (viršutinės plokštės) ir At-otdXE dsRNR (apatinės plokštės). Kiekvienas embrionas buvo nufotografuotas prieš dažant (kairėje) ir po (dešinėje) linijinės žymeklio FITC – dekstrano (rožinės) dažymo. Rodyklių galvutės nurodo sritis, kuriose buvo įvestos linijos žymuo ir, tikėtina, dsRNR. b ) Kontrolinis ( gfp ) eRNR embrionas, dažytas At-hh nuorašais (purpurinė) ir ląstelių linijos žymeklis FITC – dekstranas (rožinis), kuris buvo aptiktas spėjamame galvos ektodermoje. Embrionai, parodyti kitose plokštėse, buvo dažomi taip pat, kaip ir šis embrionas, jei nenurodyta kitaip. c ) netaikomas eRNR embrionas, kuriame pažymėtas ląstelių klonas (rausvas) tęsėsi nuo L4 segmento iki kaukolės skilties. ( d ) Du atskiri eRNR embrionai, kuriems pasireiškė pažymėtas klonas (rožinis) ties besiformuojančios gemalo juostos priekine riba 6 ir 7 stadijose. Embrionas kairiajame skydelyje buvo fiksuotas 7 stadijoje, o viduryje - embrionas. ir dešinei buvo leista vystytis iki 8 stadijos ir pritvirtinta dažymui. Dešiniajame skydelyje parodytas DNR fluorescencinis vaizdas. e ) Kiti eRNR embrionai, kuriuose pažymėtas klonas (rožinis) buvo šiek tiek pašalintas iš priekinės kraštinės (balti taškeliai). Dešinysis embrionas buvo šiek tiek senesnis nei kairysis. Dešiniajame skydelyje esančios rodyklių galvutės nurodo gretimas At-hh juosteles, kurių kiekviena turėjo būdingą skaldos modelį su dydžiais, pritaikytais laukams. ( f ) At-ci eRNR embrionai; apatinis buvo nudažytas At-otd nuorašais (purpurinė) ir ląstelių linijos žymikliu FITC – dextran (rausva). Visi šiame paveiksle esantys embrionai buvo gemalo juostos formavimo etapuose (atitinkantys 7 stadiją), išskyrus embrioną dešiniajame ir viduriniame d skydeliuose, kurie buvo 8 stadijoje. Viršutinių plokštelių dėžutės plotai padidinami apatinėse plokštėse ( b, c, e, kairysis d stulpelis. Baltos spalvos taškai žymi priekinę paraštę ( b, d, e ), o juodi taškai rodo At-hh juostą L4 segmente ( b - f ). Svarstyklės, 100 μm.

Visas dydis

Be to, fenotipai, panašūs į tuos, kurie buvo gauti iš At-otd eRNAi, buvo gauti, atliekant eRNAi prieš At-cubitus pertraukimą ( At-ci ) (5f pav.; 100%, n = 8 klonams, uždengiantiems gemalo disko kraštą, o n = 7 - klonai, pašalinti iš gemalo disko krašto galimoje galvos dalyje), Drosophila ci homologas (papildomas S6 pav.), kuris koduoja transkripcijos koeficientą, kuris tarpininkauja Hh signalizacijos transdukcijai 32 . At-ci eRNRi ląstelių klonuose At-ot ekspresija buvo panaikinta arba labai sumažinta (5f pav.; 100%, n = 12). Šie rezultatai rodo, kad At-hh aktyvumas skatina At-otd ekspresiją per At-ci , tuo tarpu At-otd aktyvumas skatina At-hh ekspresiją palaikyti galvos generacinę zoną.

Kito Hh signalizacijos taikinio vaidmuo skatinant skaldymą

Norėdami nustatyti kitus nei At-otd signalus apie Hh signalus, mes atlikome mikrotrauminį ekraną genams, kurie 5 - ojo etapo metu buvo sureguliuoti At-hh pRNR embrionuose (papildoma S2 lentelė). Šiame ekrane kaip numanomas Hh signalizacijos taikinys pasirodė Drosophila poros taisyklių geno, esančio nelyginant ( opa ) 33, „ At-opa“ (papildomas S6 pav.) Homologas. At-opa nuorašai buvo aptikti plačiame gemalinio disko kraštiniame regione, apimančiame spėjamą galvos ektodermą, vėlyvoje 5 stadijoje (6a pav.); atsižvelgiant į mikrotraumos duomenis, šios išraiškos trūko At-hh pRNR embrionuose (6a pav.). Vėliau santykinai stipri At-opos nuorašų raiška buvo atkakliai stebima ties At-otd pozityvia At-hh juostele ir šalia jos, tuo tarpu silpnesni juostelių raiškos lygiai pasirodė formuojant gemalo juostas (6b pav.; Papildoma S7 pav.). pRNAi prieš „ At-opa“ sukėlė ašinio pailgėjimo vėlavimą ir kartu sutrikdė galvos „ At-hh“ juostos suskaidymą, nepažeisdamas judėjimo proceso ar priekinio gnybto modeliavimo (6c pav.; papildomas S3 pav.). Ši situacija panaši į tai, kas matoma Drosophila poros taisyklių modeliavimo metu, kuris yra sujungtas su konvergentu 34 pratęsimu. Panašus ašinio pailgėjimo atidėjimas buvo stebimas ir At-otd pRNAi embrionuose (papildomas S3 pav.).

Image

a ) Kontroliniai ( gfp ) (kairėje) ir At-hh (dešinėje) pRNR embrionai vėlyvoje 5 stadijoje dažomi At-opų nuorašais. b ) 7-ojo ankstyvojo etapo embrionai, dažyti vienkartiniais At-opa nuorašais (kairėje), ir dvigubai dažyti At-hh (purpurinė) ir At-opa (raudonais) nuorašais (dešinėje). c ) Kontroliniai ( gfp ) (kairėje) ir At-opa (dešinėje) pRNR embrionai, dalelių formavimo etapuose dažyti At-hh (purpurinė) ir At-Dfd (raudona) nuorašais. Viršutinių plokščių dėžutės su dėžutėmis padidinamos apatinėse plokštėse; teisingi yra fluorescenciniai DNR dažymo vaizdai. Dešinysis embrionas turi ∼ 6 laikiklius nei kairysis embrionas (žr. Metodai). Atminkite, kad L4 (juodų taškų) ir daugiau užpakalinių segmentų „ At-hh“ juostelių skaičius yra alternatyvus vystymosi stadijos rodiklis. d ) At-opa nuorašų aptikimas embrionuose, įpuršktuose į kontrolinę gfp dsRNR (viršutinės plokštės) ir At-opaF dsRNR (apatinės plokštės). Kiekvienas embrionas buvo nufotografuotas prieš dažant (kairėje) ir po (dešinėje) linijinės žymeklio FITC – dekstrano (rožinės) dažymo. Rodyklių galvutės nurodo sritis, kuriose buvo įvestos linijos žymuo ir, tikėtina, dsRNR. e ) At- opos eRNR embrionas, dažytas At-hh nuorašais (purpurinė) ir ląstelių linijos žymuo FITC – dekstranas (rožinis). Kairėje skydelyje esanti dėžutės sritis padidinta dešinėje. f ) At-opos nuorašų aptikimas At-otd eRNAi (viršutinės plokštės) ir At-ci eRNAi (apatinės plokštės) embrionuose. Dažymas ir fotografavimas buvo atliekamas taip pat, kaip ir d . Balti taškai rodo gemalo juostos priekinę kraštą, o juodi taškai rodo At-hh juostą L4 segmente ( c, e ). Embrionai, pavaizduoti d - f, buvo ankstyvame ar viduriniame etape. Skalės juostos, 20 μm apatinėje c skydelyje, 100 μm kitose plokštėse.

Visas dydis

Norėdami tiksliau ištirti At-opos vaidmenį galvos segmentavime, mes panaudojome eRNR (6d pav.). Tariamo galvos ektodermoje esančiuose At- opos eRNRi ląstelių klonuose At-hh juostelei nebuvo įmanoma suskaidyti (6e pav.; 90%, n = 10). Šie rezultatai rodo, kad At-opa aktyvumas skatina juostelių suskaidymą galvos generacinėje zonoje.

At-opa dryžuoto modelio formavimo reguliavimas

Norėdami ištirti At-otd vaidmenį reguliuojant At-opos raišką, mes ištyrėme At-otd eRNAi ląstelių klonus. Ląstelių klonuose, esančiuose krūtinės ląstos ir opisthosomų srityje, At-opa ekspresija nepakito ( n = 8). Priešingai, tariamo galvos ektodermoje esančiuose ląstelių klonuose At-opa ekspresijos lygis buvo žymiai sumažėjęs, o galvos Opa- juostos atskirti nepavyko (6f pav .; 90%, n = 10), kas rodo, kad At Kad normalus At-opos išraiškos dryžuoto modelio vystymasis yra būtinas, galimoje galvos ektodermoje yra nereikšmingas aktyvumas. Panašūs fenotipai buvo pastebėti At-ci eRNRi ląstelių klonuose, esančiuose spėjamoje galvos ektodermoje (6f pav.; 100%, n = 11). Be to, At- opos transkriptų išeikvojimas At- opos pRNR leido gauti vienodą At-Opos transkripcijos modelį (papildomas S8 pav.). Tai rodo, kad norint nustatyti dryžuotą transkripcijos modelį, reikalingas At-opos aktyvumas.

Diskusija

Genų ekspresijos juostelių suskaidymą nustatėme kaip A. tepidariorum segmentacijos būdą, kuris pasireiškia spėjamoje galvos ektodermoje, naudojant mikroinjekcijomis pagrįstus metodus, tokius kaip ląstelių ženklinimas ir eRNAi. Šis segmentacijos tipas turi keletą unikalių bruožų, palyginti su Drosophila blastodermos poskyriu ir stuburinių svyravimų segmentavimu (Palyginkite 7 pav. Su 1a, b pav.). Pirmiausia, genų ekspresijos bangos judėjimas yra kritinis žingsnis nurodant segmentacijos lauką. Tai buvo pasiūlyta stebint, kad juostos judėjimo defektai, kuriuos sukėlė At-otd pRNAi (nuoroda 23; papildomas S3 pav.) Ir eRNAi (5d pav.), Sukėlė galvos srities formavimo nesėkmes. Antra, yra siaura (juostelės formos) generatyvinė zona, iš kurios tam tikra seka formuojasi nauji pasikartojantys vienetai. Segmentacija šioje zonoje būtų panaši į stuburo embrionų presomitinę mezodermą ir trumpojo gemalo nariuotakojų embrionų užpakalinę augimo zoną, nes jie kartojasi laikinai. Trečia, segmentinių genų ekspresijos modelių vystymasis yra susijęs su suvienodėjusiu audinio ašies pailginimu. Ketvirta, kintantys genų raiškos modeliai, susiję su segmentavimu, imituoja bangų judėjimą ir smailių susiskaidymą, kurie buvo pastebėti atliekant skaitmeninius modelių augančio lauko autokatalitinės reakcijos difuzijos sistemų klasės modeliavimą (1d pav.). „Juostelės padalijimas“ - elgesys, panašus į savęs replikaciją (1d pav.), Skiriasi nuo svyruojančios naujų bangų generavimo terminalo srityje (1b pav.) Ir naujų bangų įterpimo per atstumą nuo esamų bangos (1c pav.). Remdamiesi šiais pastebimais bruožais, mes manome, kad vorinių galvų segmentacija yra ypač svarbi suprantant ryšius tarp skirtingų gyvūnų segmentų rūšių, ir mes ją priskiriame segmentinio tipo segmentacijai.

Image

Iliustruotos At-hh (mėlynos bangos), At-otd (rudos dėžės), At-opos (žalios dėžės) ir At-Dfd (violetinės spalvos dėžutės) išraiškos sritys išilgai AP ašies penkiuose iš eilės vystymosi etapuose. Parodytos tik galvos ir krūtinės dalys. At-hd teigiamos At-hh išraiškos banga, pažymėta „0“, yra apibrėžiama kaip generacinė Pp ir Ch segmentų zona, susidaranti juostelėmis padalijant ta tvarka ir žymimos „1“ ir „2“. ', atitinkamai. Taip pat nurodomos formuojančios gemalo juostos priekinės kraštinės (uždari trikampiai) ir At-hh išraiškos juostelė, susijusi su L4 segmentu (žvaigždutėmis). Neviena eRNR slopina At-hh raišką galvos generatyvinėje zonoje, o At-opa eRNR neleidžia At-otd pozityviajai At-hh juostai suskaidyti. Ankstesniais etapais (vėlyva 5 stadija ir ankstyva 6 stadija) At-otd eRNAi slopina At-hh juostelės pasitraukimą nuo gemalo disko krašto, tačiau šis faktas neįrodomas.

Visas dydis

Čia apibūdinome kai kuriuos molekulinius mechanizmus, susijusius su voratinklio galvos segmentacija. Kartu su ankstesnio tyrimo 27 rezultatais, šios išvados rodo, kad Hh signalizavimas vaidina pagrindinį vaidmenį AP ašies formavime ir vėlesniame galvos segmentavime. Mes nustatėme, kad nors At-otd ir At-opų ekspresiją kontroliuoja Hh signalizacija per At-ci , jų veikla reikalinga dinamiškai reguliuoti Hh signalizacijos šaltinių pasiskirstymo modelius. Šie atradimai paskatino mus pasiūlyti, kad vorų galvos suskaidymui reikalingas autoreguliacinis signalizacijos tinklas, kuriame dalyvautų At-hh , At-ci , At-Od ir At- Opa (8 pav.). Svarbu pažymėti, kad At-otd ekspresijos domeno užpakalinė riba ir toliau yra glaudžiai susijusi su priekine Athh - juostele (3b, c ir 7 pav.), Kas rodo, kad At-otd transkripcija suaktyvėja trumpa diapazono Hh signalizacijos aktyvumas. In contrast, at least at late stage 5 and late stage 6 (Figs 6a, b and 7), the posterior limit of the broad At-opa -expression domain is away from the At-hh -signalling source, suggesting that At-opa transcription is activated by longer range signals. Positive feedback regulation of Hh signalling by At-otd seems to contribute to maintaining the spider-head generative zone, whereas At-opa , encoding a Zic family transcription factor, may be a key gene required to generate stripe-splitting dynamics in the head generative zone.

Image

An autoregulatory signalling network in which At-hh , At-ci , At-otd , and At-opa participate is proposed. Expression of At-otd and At-opa is controlled by short- and longer range activities of At-hh , respectively, via At-ci , and activities of At-otd and At-opa are required for the dynamic regulation of At-hh expression during head segmentation. At-otd activity mediates positive feedback to maintain the head generative zone, and At-opa activity promotes the At-hh - At-otd circuit to enter the splitting phase through an as yet unknown mechanism in the head generative zone. The stripe splitting may involve coordinated regulation of gene expression and cell rearrangement. At-otd may directly and/or indirectly regulate levels of At-opa expression and the development of its pattern.

Visas dydis

Peak splitting of gene expression waves has been characteristically observed in numerical simulations of activator-depleted substrate systems, which assume local self-enhancement (autocatalysis) and depletion of a substance required for the self-enhancement 6, 35 . The At-hh - At-otd reciprocal positive regulation might mimic local self-enhancement, whereas At-opa may act as a cofactor involved in the self-enhancement. If the At-Opa protein is consumed, depletion of this product might promote the At-hh - At-otd circuit to enter the splitting phase. With respect to this possibility, mammalian Zic proteins may act synergistically with Gli proteins, which are Ci homologues, to enhance the transduction of Hh signalling 36 . Zic and Gli family proteins share a highly conserved zinc finger domain (Supplementary Fig. S6) and have cooperative roles in multiple developmental processes 37, 38 . Alternatively, the At-Opa product might have a substantial inhibitory effect on Hh signalling preferentially at sites where its signalling activities are saturated. Zic family proteins also act antagonistically with Gli family proteins 36 . These hypotheses need to be tested.

An important aspect of our findings is that the observed splitting of gene expression stripes may require coordinated regulation of gene expression and cell rearrangement. Knockdown of At-otd and At-opa appeared to delay convergent extension. At-otd and At-opa activities may mediate interactions of multiple signalling pathways that coordinate pattern formation and cell movements. The types of signalling pathways, other than Hh signalling, involved in this gene expression stripe splitting are a key issue to be studied in the future.

Identification of shared genetic components suggests an evolutionary link between spider stripe-splitting segmentation and Drosophila Bicoid-based segmentation. The proposed autoregulatory signalling network for the stripe-splitting segmentation contrasts with the hierarchical cascades of maternal, gap and pair-rule genes associated with Drosophila blsastoderm subdivision while sharing Hh-signalling components with the segment polarity network. The activities of the Drosophila pair-rule genes prepattern the segments and activate the segment polarity gene network 17, in which the Hh and Wingless signalling pathways have reciprocal regulatory interactions to determine correct cell fates within each segment 39, 40 . Importantly, roles of these signalling pathways are restricted to the terminal steps in Drosophila segmentation. Curiously, the gene expression stripe splitting is somewhat similar to pair-rule patterning that has been observed in some short-germ arthropod embryos, where domains of gene expression are progressively resolved into segmental stripes 23, 24 . Our findings and these facts may provide hints about the evolution of mechanisms of pair-rule patterning. Mutations affecting network structures of segmentation genes could have led to diversification of strategies for arthropod segmentation 4 . As mentioned above, the spider embryo exhibits at least three distinct modes of segmentation depending on the body part. Intriguingly, Drosophila subdivision is achieved by distinct mechanisms in the head and trunk regions 3, 41, 42 . Increases in the number of stripes or patches of segment polarity gene homologue expression have been observed in the developing head region of Drosophila and other arthropod embryos 43, 44, 45, 46, 47, where split-like patterning events may occur. Furthermore, the spider-head generative zone is analogous to the vertebrate midbrain–hindbrain boundary zone, which is considered the head organizer, in which both zones are defined by the posterior limits of the expression domains of the otd / otx homologues 48 . Animal segmentation will continue to be a challenging subject in studying how developmental strategies diversified during animal body plan evolution.

Metodai

Spiders

This work was performed according to institutional animal care and use committee guidelines. Laboratory stocks of the house spider A. tepidariorum were maintained at 25 °C. The development of sibling embryos was monitored to evaluate the quality of the embryos used in our experiments. Developmental stages were described previously 25, 28, 29 .

Embryo staining

Embryos from a single egg sac were fixed at 2-h intervals from the beginning of stage 7 and pooled as a series of 0 h to 10 h samples. Embryos shown in Figures 3b–d and 6b, and Supplementary Figures S2 and S7 were derived from this series. Embryo fixation and whole-mount in situ hybridization were performed, as described previously 28, 31 . Fluorescein isothiocyanate (FITC)–dextran in fixed samples was visualized using an alkaline phosphatase-conjugated sheep anti-FITC antibody (1:1000, dilution; Roche) and the Vector Red substrate (Vector). Biotin–dextran was visualized using the VECTASTAIN Elite standard ABC kit (Vector). Most samples were counterstained with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich). Embryos were examined using an SZX12 fluorescence stereomicroscope (Olympus) equipped with a colour charge-coupled device camera (C7780-10; Hamamatsu Photonics) and/or an Axiophot2 fluorescence microscope equipped with differential interference contrast optics (Carl Zeiss).

Mikroinjekcija

Embryos at appropriate stages were dechorionated with commercial bleach, placed on glass slides, covered with halocarbon oil 700 (Sigma), and subjected to microinjection as described 25 . A 1 μg μl −1 solution of FITC–dextran (MW 500, 000, Sigma-Aldrich) or rhodamine B isothiocyanate (RITC)–dextran (MW 70, 000, Sigma-Aldrich) was injected into 32- to 128-cell stage embryos. Live embryos were photographed using the fluorescence stereomicroscope.

Plasmid construction and mRNA preparation

The pSP64 poly(A) vector (Promega) was modified to replace the Eco RI site after the poly A sequence with a Not I site. This plasmid was designated pSP64-polyA-NotI+. A blunt-ended Xho I- Bam HI fragment of the pcDNA3-Flag1-td-EosFP plasmid (Molecular Biotechnology) was inserted into the Sma I site of pSP64-polyA-NotI+ to produce pSP64-tdEosFP-polyA-NotI+. A Hind III (blunt-ended)- BamHI fragment encoding the NLS (the amino acid sequence, MAKIPPKKKRKVED) was inserted between the Hinc II and Bam HI sites of pSP64-tdEosFP-polyA-NotI+. The resulting plasmid was designated pSP64-NLS-tdEosFP-polyA-NotI+ and was cut with Not I for use as a template for in vitro transcription. Capped sense messenger RNA was synthesized using the mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit (Ambion) according to the manufacturer's instructions.

Time-lapse observations

Embrionai 32 ląstelių stadijoje buvo įšvirkšti NLS-tdEosFP mRNR (0, 25 μgμl −1 ) mišiniu. ir biotino – dekstrano (MW 70 000, Sigma-Aldrich, 1, 0 μg μl −1 ). Norėdami atlikti „tdEosFP“ fotokonversiją, maži embrionų plotai buvo švitinami ultravioletiniu spinduliu mažiau nei 3 minutes, naudojant „Axiophot2“ fluorescencinį mikroskopą, naudojant juostos praleidimo žadinimo filtrą (Chroma Nr. 31022, BP 395 ± 20) ir objektyvą X40. Nei NLS-tdEosFP ekspresija, nei ultravioletinė švitinimas nepadarė jokio pastebimo toksinio poveikio vystymuisi. Laiko mikroskopija buvo atlikta naudojant TCS SPE konfokalinę sistemą (Leica). Vaizdai buvo apdoroti naudojant „Leica LAS-AF ver“. 2.21, „ImageJ“ ver. 1, 44 (NIH) ir „Adobe Photoshop CS2“ programinė įranga.

Voratinklinių genų ekranas, paremtas mikrorajonu

Iš penkių A. tepidariorum embrionų komplementariųjų DNR (cDNR) bibliotekų mes gavome 22 812 išreikštos sekos žymes (EST), paeiliuotas iš 5 'galo. Šios sekos buvo deponuotos Japonijos DNR duomenų banke registracijos numeriais FY216297 – FY225483 ir FY368221 – FY381845. Norint suprojektuoti mikrotrauminius zondus, iš EST duomenų buvo parinkta 13 655 nereikalingos sekos. Naudojant šias sekas ir keletą papildomų sekų, buvo sukurti 40 mer oligonukleotidų zondai, naudojant „OligoArray 2.1“ programinę įrangą 49, ir įterpti į „CombiMatrix“ pasirinktinius mikrotraumus (12K × 2). Bendra RNR buvo ekstrahuota iš dviejų skirtingų 5 vėlyvos stadijos embrionų, gautų iš skirtingų kiaušinių maišelių, populiacijų, pagamintų vienos patelės prieš dieną (normalią) ir 20 dienų po ( At-hh pRNR) po pirmosios At-hh1 dsRNR injekcijos. Šiai moteriai buvo iš viso atliktos keturios ∼ 1, 5 μl At-hh1 dsRNR tirpalo (2 μg μl −1 ) injekcijos 2–3 dienų intervalu. cRNR, pažymėti Cy3 (normaliu) arba Cy5 ( At-hh pRNR), buvo paruošti iš 2 μg visos RNR, naudojant RNR transkripcijos „SureLABEL Core Kit“ (TaKaRa). cRNR zondai buvo hibridizuoti hibridizacijos buferyje (5x druskos-natrio citrato buferis, 0, 1% natrio dodecilsulfatas, 10% formamidas) mikrotraumuose 42 ° C temperatūroje 16–20 h. „Microarray“ skaidrės buvo nuskaitytos naudojant „GenePix 4000B“ skaitytuvą (molekuliniai įrenginiai), o gauti vaizdai buvo analizuojami naudojant „Array-Pro Analyzer 4.5“ versiją („Media Cybernetics“). Kiekybiniai duomenys buvo normalizuojami. Norėdami patvirtinti šį mikrotraumos eksperimentą, At-hh ir At-otd zondai buvo naudojami kaip teigiami kontroliniai mėginiai ; zondai α-katenino homologui, pailgėjimo faktoriaus 1α homologui ir H3 histono homologui buvo naudojami kaip neigiami kontroliniai bandymai (papildoma S2 lentelė). Dviejų EST klonų, reprezentuojančių sekas, homologiškas Drosophila opa , eS6_d1_54_H12 (FY376203) ir eS7_SB_031_C08 (FY380182), intensyvumo santykio vertės taškuose buvo tokios žemos, kaip teigiamos kontrolės atveju. Šie EST klonai buvo sujungti su kitu EST klonu At_eW_022_A24 (FY223306). Mikro matricos duomenų rinkinys buvo dedamas į „Gene Expression Omnibus“ duomenų bazę, prisijungimo numeriu GSE26468.

cDNR ir genominės DNR klonavimas

EST klonas At_eW_022_A24 ir papildomas cDNR klonas, gautas atliekant greitą 5D amplifikaciją cDNR galus (RACE), buvo naudojami visos At-opos kodavimo srities sekai nustatyti. Trumpa seka, homologiška Drosophila ci, iš pradžių buvo rasta EST klone eS6_d1_31_A04 (FY374226). Viso ilgio cDNR klonas, skirtas At-ci, buvo gautas atrenkant 5 ′ ir 3 ′ RACE ir cDNR biblioteką. Atlikti tyrimai su BLASTP ir „Mega 4.0“ (nuoroda 50) patvirtino, kad numatomi baltymai, užkoduoti At-opa ir At-ci, buvo cinko piršto baltymai, priklausantys atitinkamai Opa / Zic ir Ci / Gli pogrupiams (papildomas S6 pav.) . cDNR klonai, apimantys visą šešių3 A. tepidariorum homologo, pažymėto At-six3-1 , koduojančią sritį, buvo gauti PCR, naudojant išsigimusius pradmenis ir 5 ′ ir 3 ′ RACE. Sekas galima rasti Japonijos DNR duomenų bazėje, kurios registracijos numeriai yra At-opa , AB605264; „At-ci“ , AB605263; ir „ At-six3-1“ , AB605265.

Genominis DNR klonas, turintis seką su At-opa cDNR klonu, buvo gautas tikrinant šio tyrimo metu sukonstruotą A. tepidariorum genomo biblioteką (λdash II). Šis klonas apėmė bent dalį introno, einantį po egzono ir introno ribos, kuri evoliuciškai yra išsaugota 3 ir 4 cinko pirštų kodavimo srities 51 sankryžoje. 1 kb fragmentas šiame introne buvo naudojamas paruošti introno zondą At-opos pre-mRNR aptikti.

RNR

DNR šablonai dsRNR sintezei buvo paruošti PGR naudojant pradmenis, turinčius T7 arba Sp6 promotoriaus seką. dsRNR buvo susintetinta naudojant MEGAscript rinkinį (Ambion), kaip aprašyta 52 punkte . gfp dsRNR buvo naudojama kaip kontrolė. Norėdami patvirtinti RNRi efektų specifiškumą, kiekvienam genui paruošėme dvi skirtingas dsRNR, kurios buvo gautos iš nepersidengiančių cDNR sričių arba regionų, kuriuose minimalus persidengimas (keturi nukleotidai). At-otd ir At-opa RNR taip pat buvo paruoštos ir išbandytos ilgesnės dsRNR, siekiant patvirtinti rezultatų nuoseklumą. Informacija apie šiame tyrime naudojamas dsRNR yra apibendrinta papildomoje S1 lentelėje. Sumažėjęs tikslinių transkriptų ekspresijos lygis buvo patvirtintas hibridizavimu in situ ir (arba) kiekybine atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandinine reakcija (papildoma S1 lentelė).

pRNR buvo atliktas įšvirkščiant dsRNR į moterų opisthosomą, naudojant ištrauktą stiklinį kapiliarą, kaip aprašyta ref. 31. Pavienėms patelėms buvo kartojamos 1, 5–2, 0 μl dsRNR tirpalo (2 μg μl −1 ) injekcijos 2–3 dienų intervalu ( At-opa1 , At-opaF , At-otd1 , At-otdXE , At -hh1 ir At-hh2 dsRNR, keturios ar penkios injekcijos; At-opaH ir gfp dsRNR, septynios injekcijos). At-opa pRNAi ir At-otd pRNAi sumažino perėjimo iš gemalo disko į gemalo juostą greitį. Norėdami atmesti galimybę, kad šių pRNR embrionų aprašyti defektai atsirado dėl vėlavimo vystytis, mes šiuos embrionus ištyrėme šiek tiek vėliau nei kontroliniai embrionai. Embrionai, pavaizduoti 6c paveiksle (dešinėje) ir papildomame S3a, d, f paveiksle, buvo h 6 val. Senesni nei kontroliniai embrionai, parodyti 6c paveiksle (kairėje) ir papildomame S3e paveiksle, g.

„ERNAi“ eksperimentuose buvo naudojamas dsRNR (0, 3–0, 4 μg μl −1 ) ir FITC – dekstrano (0, 4–0, 8 μg μl −1 ) arba dsRNR (0, 4 μg μl −1 ) ir RITC-dekstrano (0, 8 μg) mišinys. μl −1 ) ir biotino – dekstrano (MW 10 000, „Sigma-Aldrich“, 0, 4 μg μl − 1 ) (eksperimentui parodyta papildomame S4 ​​pav.) buvo mikroinjektuoti į 32–128 ląstelių stadijos embrionus. Injekcijos metu injekuotų ląstelių likimai nebuvo numatomi dėl ankstyvojo Achaearanea embriono sferinės simetrijos. Vėlyvoje 5 stadijoje, naudojant fluorescencinį mikroskopą, buvo atrinkti morfologiškai normalūs embrionai, kuriuose pažymėti ląstelių klonai buvo lytiniuose gemalo disko epitelio vietose. Kadangi nebuvo įmanoma griežtai kontroliuoti injekcijos tūrio, į embrionines ląsteles integruoto dsRNR kiekis (tai rodo įterpto FITC – dekstrano fluorescencijos intensyvumas) šiek tiek skyrėsi nuo embriono iki embriono. Tačiau tokie pokyčiai turėjo mažai įtakos eksperimentų rezultatams.

Atliekant kiekvieno geno pRNAi ir (arba) eRNAi eksperimentus, tie patys rezultatai buvo gauti nepriklausomai iš dviejų dsRNR. Čia pateikti rezultatai buvo gauti naudojant vieną iš kiekvieno geno dsRNR: At-opaF , At-otdXE , At-ci1 ir At-hh1 (palyginti su At-opa , At-otd , At-ci ir At-hh , atitinkamai). Atlikdami eRNAi eksperimentus, gavome tuos pačius rezultatus 80% ar daugiau tirtų embrionų ( n ≥ 5) su kiekviena geno kita dsRNR.

Prisijungimai

DDBJ / „GenBank“ / EMBL

  • AB605263
  • AB605264
  • AB605265
  • FY216297
  • FY225483
  • FY368221
  • FY381845

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomos figūros ir lentelės

    Papildomi S1-S8 paveikslai ir papildomos lentelės S1-S2

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas filmas

    Ląstelių internalizavimas nuo gemalo disko krašto. Laiko ląstelių klono, išreiškiančio NLS-tdEosFP, stebėjimas gemalo disko krašte. Prieš įrašymą ląstelių klono dalyje „tdEosFP“ iš žalios spalvos (parodyta žalia spalva) į raudoną (parodyta purpurine spalva) buvo pradėta fotokonvertuoti - ji prasidėjo ankstyvoje 5 stadijoje (0 min.) ir baigėsi 7 ankstyvoje stadijoje (900 min.). .

  2. 2.

    2 papildomas filmas

    Konvergenciniai pailginamieji judesiai spėjamoje galvos ektodermoje. Laiko ląstelių klono, išreiškiančio NLS-tdEosFP, stebėjimas spėjamoje galvos ektodermoje. „TdEosFP“ buvo fotokonvertuota ląstelės klono dalyje. Įrašymas prasidėjo vėlyvuoju 5 etapu (0 min.) Ir baigėsi 7 vėlyvuoju etapu (860 min.). Priekis yra viršuje.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.