Trpv4 reguliuoja krūties vėžio ląstelių ekstravazaciją, sustingimą ir aktino žievę | mokslinės ataskaitos

Trpv4 reguliuoja krūties vėžio ląstelių ekstravazaciją, sustingimą ir aktino žievę | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Krūties vėžys
  • Ląstelių migracija

Anotacija

Metastazės yra svarbi sveikatos problema. Standartinis priežiūros būdas yra chemoterapijos ir tikslinio gydymo derinys, tačiau 5 metų išgyvenamumas išlieka žemas. Reikia naujų / geresnių vaistų tikslų, galinčių pagerinti metastazavusiomis ligomis sergančių pacientų rezultatus. Metastazės yra sudėtingas procesas, kiekvienam žingsniui priskiriant genetinių aberacijų rinkinį. Su metastazėmis susijusių molekulinių pokyčių žemėlapių sudarymas pagerina mūsų supratimą apie šios ligos etiologiją ir prisideda prie tikslinės terapijos. Čia iš ksenografų gauto in vitro modelio, apimančio 4 izogenines ląstelių linijas, turinčias didėjančią metastazę, fosfoproteomika reiškia, kad pereinamasis receptorių potencialas gali būti vanilloido 4 potipis, sergant krūties vėžio metastazėmis. TRPV4 mRNR lygis krūties, skrandžio ir kiaušidžių vėžiuose koreliavo su prastais klinikiniais rezultatais, kas rodo didelį TRPV4 vaidmenį žmogaus epitelio vėžyje. Buvo įrodyta, kad TRPV4 reikalingas krūties vėžio ląstelių invazijai ir transendotelio migracijai, bet ne augimui / proliferacijai. Trpv4 sunaikinimas žymiai sumažino metastazavusių mazgelių skaičių pelių ksenografuose, nepalikdamas įtakos dydžiui. Dėl per didelio TRPV4 ekspresijos buvo skatinamas krūties vėžio ląstelių minkštumas, pūtimas ir aktino pertvarkymas. Rezultatai suteikia naujos įžvalgos apie TRPV4 vaidmenį ekstravazuojant vėžį, nes, mažinant ląstelių standumą, kontroliuojamas citoskeletas ląstelės žievėje.

Įvadas

Krūties vėžys yra antrasis paplitęs vėžys ir 5 -oji pagrindinė su vėžiu susijusių mirčių priežastis. Krūties vėžys nusineša apie 500 000 gyvybių, kurių pagrindinė priežastis yra metatastazės 1 . Pagalbinis gydymas išlieka pagrindiniu metastazavusio krūties vėžio (MBC) gydymo ramsčiu. Yra 4 pagrindiniai krūties vėžio potipiai, kiekvienas iš jų skiriasi savo natūralia istorija, molekuliniais portretais, klinikiniais rezultatais ir reakcijomis į gydymą 2, 3 . Įprasti į krūtį ir į juosmenis panašūs potipiai dažniausiai yra ER + / PR + ; Dažniausiai HER2 sukeliantis krūties vėžys yra ER - / PR - ir bazinis potipis, kuris vyrauja ER - / PR - / HER2 - dar vadinamas trigubai neigiamu fenotipu. Paaiškėjo, kad tikslinė terapija yra naudinga gydant kai kuriuos krūties vėžio potipius. Pavyzdžiui, ER + / PR + ir HER2 + navikai sudaro 75–80% ir 15–20% krūties vėžio atvejų ir yra gydomi atitinkamai anti-estrogenais ir Herceptin 4 . Tačiau ne visi pacientai teigiamai reaguoja į šiuos tikslinius vaistus, todėl vėžio metastazės dažnai pasitaiko.

Metastazavimo stadijoje yra daug nepatenkintų terapinės intervencijos poreikių. Metastazė yra sudėtingas procesas, reikalaujantis, kad vėžio ląstelės turėtų keletą bruožų, suteikiančių joms didesnį judrumą, plastiškumą ir invazines savybes, kad galėtų išeiti iš pirminių vietų, taip pat įsiveržti ir evakuoti kraujo skyrių ir limfinius kraujagysles, kad kolonizuotų tolimus organus 5 . Manoma, kad kiekviename iš šių žingsnių yra svarbių genų. Tarp jų yra baltymai, kontroliuojantys kalcio antplūdį / ištekėjimą (pvz., Orai1 ir STIM1) 6, 7, 8, epigenetiniai ir transkripcijos faktoriai, tokie kaip SATB1 9 ir Twist 10 . Neseniai vėžio ląstelių ir normalių ląstelių mechaninių savybių skirtumai buvo nustatyti įvairiais eksperimentiniais metodais 11, 12, 13 . Šie tyrimai rodo, kad ląstelių mechaninio vientisumo anomalijos yra susijusios su vėžio patogeneze ir progresavimu. Su metastazėmis susijusių genų identifikavimas ir tolesnis metastazių molekulinės etiologijos išaiškinimas yra būdai, kuriais siekiama padidinti vaistų kiekį.

Biologiniai modeliai, naudojami metastazių tyrimams, iki šiol neatspindi plataus metastazių proceso spektro. Priešingai, krūties vėžio metastazių (BCM) modelis, kurį sudaro 4 izogeninių navikinių ląstelių linijos 67NR, 168FARN, 4T07 ir 4T1, sukurtas Aslaksono ir kt . vis labiau tiriamas atsiradus didelio pralaidumo technologijoms 14, 15 . Tai patrauklus modelis, nes modelio izogeniškumas suteikia bendrą pagrindą lyginamiesiems tyrimams, leidžiantiems arba įgalinantiems pašalinti klaidinančius genetinius / epigenetinius fono variantus. 67NR vėžio ląstelių linija gali sudaryti pirminius vietinius navikus, ne kolonizuodama tolimų audinių, įskaitant kraują, limfmazgius ir plaučius. 168FARN linijos ląstelės pasklinda iš pieno riebalų pagalvėlių ir gali būti aptinkamos limfmazgiuose, tačiau retai aptinkamos kituose audiniuose, nurodant, kad jos gali patekti į kraujagysles, tuo tarpu ekstravazacija yra labai neefektyvi 14, 15 . 4T07 ląstelės gali plisti į plaučius, tačiau nesugeba nustatyti matomų metastazių mazgelių 14, 15 . Galiausiai 4T1 linijų ląstelės sugeba atlikti visus metastazių etapus ir efektyviai suformuoja matomus metastazinius mazgelius plaučiuose 14, 15 . Galima įsivaizduoti, kad šių izogeninių ląstelių linijų molekulinių pokyčių, turinčių didėjantį metastazavimą, žemėlapių sudarymas gali padėti nustatyti baltymus, kurie skatina vieną ar kelis pagrindinius metastazių etapus.

Fosfoproteomas yra patraukli sritis nustatant vėžio atradimus. Fosfoproteomika palengvina mažai tirozino fosforilintų baltymų identifikavimą, o tai kitaip neįmanoma naudojant įprastą ekspresijos proteomiką. Dėl krūties vėžio fosfoproteomikos buvo rastas naujas onkogenas 16, 17, suaktyvinantis tirozinkinazės mutacijas ir pateikęs naujų į taikinius nukreiptos terapijos 18, 19 įžvalgos. Šiame tyrime mes pateikiame savo duomenis apie BCM modelio fosfoproteominę analizę. Nustatyta, kad trumpalaikis receptorių potencialas Vanilloido 4 potipis (TRPV4), kalcio pralaidus kanalas, yra stipriai koreliuojamas su metastazavimo būsena.

TRPV4, TRP (trumpalaikio receptoriaus potencialo) narys, katijonų kanalas, yra daugiausiai polimodinis TRP kanalas, integruojantis tiek cheminius, tiek fizinius dirgiklius. Ilgalaikiai eksperimentiniai įrodymai parodė jo fiziologinę reikšmę kūno osmoliariškumui reguliuoti, mechanosensibilizacijai, temperatūros jutimui, kraujagyslių reguliavimui ir, galbūt, klausai 20, 21 . Neseniai atliktas tyrimas apėmė TRPV4 naviko angiogenezėje, nes Florio Pla ir bendradarbiai pranešė, kad nuo AA priklausomas TRPV4 sąlygotas Ca 2+ antplūdis selektyviai skatina ląstelių migraciją, pertvarkydamas aktino citoskeletą krūties naviko endotelio ląstelėse, bet ne kontrolinėse ląstelėse, priklausančiose žmogaus odai. mikrovaskulinė endotelio ląstelių linija 22 . Taigi TRPV4 yra įdomus naujas ląstelių migracijos veikėjas. Ar TRPV4 prisideda prie krūties vėžio epitelio ląstelių biologijos, nežinoma. Čia buvo ištirtas TRPV4 funkcinis vaidmuo ir veikimo būdas migruojant, invazuojant ir ekstravazuojant krūties vėžio ląsteles. Mūsų išvados atskleidė, kad TRPV4 ekspresuojančios vėžinės ląstelės yra minkštesnės ir kad TRPV4 suteiktas ląstelių deformavimas buvo susijęs su aktino depolimerizacija, VASP fosforilinimu ir atvirkščiai koreliuotas su ERM ir Cofilino aktyvacija. Apibendrinant, šis tyrimas patvirtina TRPV4 vaidmenį metastazėse, reguliuojant vėžio ląstelių standumą ir citoskeletas ląstelės žievėje.

Rezultatai

Krūties vėžio metastazių fosforproteomika atskleidė nenormaliai išreikštus fosfoproteinus, kurie labiausiai susiję su ekstravazacija

Kadangi vėžio ląstelės kaupiasi genetinėms aberacijoms progresuojant ligai, mes manome, kad jų fosfoproteomai keičiasi, nes įgyja vis didėjantį metastazavimo potencialą. Todėl mes ištyrėme ląstelių linijų fosfotirozino proteomas per BCM modelį po apdorojimo 1 mM pervanadatu 15 minučių, kurie pagerino fosforilintų baltymų pateikimą. Iš tikrųjų imunoblotai su anti-fosfotyrosino antikūnais (PY20H) atskleidė, kad šios ląstelių linijos turėjo skirtingus modelius (1a pav.). Taigi mes atlikome BCM fosfoproteominę analizę, kaip aprašyta 1b pav. Trumpai tariant, tirozino fosforilinti baltymai buvo užfiksuoti naudojant anti-fosfotyrosino antikūnų 4G10 kloną po apdorojimo pervanadatu. Tada paimti fosforilinti baltymai suardomi naudojant tripsiną, peptidai žymimi iTRAQ ir tiriami LC-MS / MS. Neapdoroti duomenys pateikti 1 papildomoje lentelėje, tačiau tik tie baltymai, kurių iTRAQ santykis yra statistiškai reikšmingas, yra apibendrinti 1 lentelėje. ITRAQ santykiai atspindi santykinį baltymų kiekį 168FARN, 4T07 ir 4T01, palyginti su 67NR. Išradingumo kelių analizė (IPA) atskleidė, kad statistiškai reikšmingiausias kanoninis kelias, susijęs su 49 baltymų genų sąrašu, buvo leukocitų ekstravazacijos signalizacija (1c pav.), Kuri apima dinaminį aktino, židinio ir ląstelių adhezijos kompleksų, turinčių, bet tuo neapsiribojant, rekonstravimą. Šiame tyrime nustatyta 11 baltymų. Jie apima paxilliną (PXN), β-kateniną (CTNNB1), ezriną (EZR), ACTN1 ir ACTN4 (F-aktino kryžminius baltymus). Ligos ir molekulinės funkcijos požiūriu duomenų rinkinys labiausiai susijęs su vėžiu ir ląstelių surinkimu / organizavimu (2 papildoma lentelė).

Image

(a) Pervanadato sukeltos tirozino fosforilinimo ląstelių linijos profiliai pagal krūties vėžio metastazių (BCM) modelį. b) Schema, rodanti iTRAQ pagrįstų eksperimentų, skirtų fosfotiroziną turinčių baltymų identifikavimui krūties vėžio metastazių (BCM) modelyje, eigą. c) Fenoproteomikos genų rinkinio išradingumo kelio analizė. (d) Imuninis nusėdimas rodo, kad TRPV4 yra tirozino fosforilinamas ir per daug ekspresuojamas 4T07 ir 4T1 krūties vėžio ląstelėse. Taip pat parodyta brūkšninė diagrama, parodanti vidutines (n = 3, ± sd) ir p reikšmes iš nesuporuotų Studentų t- testo. (E) Q-PCR, rodanti padidėjusius TRPV4 nuorašo lygius visame BCM modelyje. Brūkšninė diagrama buvo nubraižyta iš 3 techninių pakartojimų ir p- verčių, gautų nesuporuotų Studentų t- testo metu.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Padidėjęs TRPV4 baltymo ir mRNR reguliavimas pelių krūties vėžio metastazių modelyje

Nežinoma, kad kai kurie 1 lentelės baltymai būtų susiję su metastazėmis. TRPV4 yra ypač įdomus, nes jo ekspresija vos nebuvo 67NR ir 168FARN ląstelėse, bet labai didelis 4T07 ir išliko 4T1 ląstelėse. Patvirtinamieji duomenys, rodantys 3 TRPV4 unikalių peptidų, naudojamų santykiniam „iTRAQ“ kiekybiniam įvertinimui, MS 2 spektrą, yra parodyti 1 papildomame paveiksle. TRPV4 buvo pasirinktas tolesniam tyrimui, nes jo reguliavimas koreliavo su ekstravazacijos bruožo įgijimu (turi tik 4T07 ir 4T1). ). Be to, nors buvo pranešta, kad jis daro didelę įtaką įvairiems fiziologiniams procesams, įskaitant nocicepciją, šilumos pojūtį ir uždegimą, TRPV4 vaidmuo vėžyje nėra žinomas.

Imuninės nuosėdos eksperimentais, naudojant anti-TRPV4 antikūnus, ir paskesnės imunobloto analizės su anti-TRPV4 ir anti-fosfotirozino antikūnais patvirtino diferencinę TRPV4 raišką ir jos tirozino fosforilinimą per BCM modelio ląstelių linijas (1d pav.). QPCR duomenys taip pat atskleidė padidėjusį Trpv4 nuorašą 4T0 ir 4T1, palyginti su 67N krūties vėžio ląstelėmis (1e pav.). Nors padidėjęs tirozino fosforilinimo lygis TRPV4 gali būti susijęs su padidėjusiu baltymo ekspresijos lygiu, mes negalime atmesti galimybės, kad kinazių / fosfatazės mutacija nėra atsakinga už padidėjusį fosforilinto TRPV4 lygį.

TRPV4 ekspresija koreliuoja su prastais žmonių epitelio vėžio rezultatais

Norėdami ištirti TRPV4 reikšmę klinikiniams žmonių vėžiams, pasinaudojome viešųjų duomenų bazių metaanalizėmis, naudodamiesi daugiafunkcine internetine priemone GOBO (//co.bmc.lu.se/gobo), leidžiančia atlikti skirtingas analizes 1881 m. - duomenų apie krūties naviką duomenų rinkinys ir 51 mėginio krūties vėžio ląstelių linijos rinkinys. Duomenų rinkiniuose yra visa informacija apie pacientą ir transkriptominiai duomenys, sugeneruoti Affymetrix U133A mikrotraumuose 23 . Naudojant genų rinkinio analizę (GSA) - naviko taikymą, kad būtų galima apklausti TRPV4 raišką 1881 m. Krūties naviko mėginiuose, nustatyta, kad TRPV4 ekspresija yra žymiai didesnė baziniame potipyje, palyginti su HER2, Lum A ir Lum B navikų potipiais (p < 0, 001) (2a pav., Viršutinė kairioji plokštė). Be to, TRPV4 raiška buvo žymiai didesnė ER-neigiamame, palyginti su ER teigiamais navikais (p <0, 001) (2a pav., Viršutinė vidurinė skydinė dalis). Šie duomenys patvirtino nuostatą, kad TRPV4 ekspresija yra susijusi su agresyvesniu fenotipu, koreliuojančiu su prastesniu atstumu be metastazių (DMFS) daugiamatėse analizėse (2a pav., Viršutinis dešinysis skydas). Norėdami išvengti duomenų bazės šališkumo, mes taip pat atlikome išgyvenimo analizę, naudodami Kaplan Meier braižiklį (//kmplot.com/analysis), kurio analizė paremta genų ekspresijos duomenimis ir GEO (tik Affymetrix mikrotraumų), EGA ir TCGA išgyvenimo informacija. Mėginiai padalijami į dvi grupes, naudojant viso duomenų rinkinio vidutinę vertę. Rezultatai rodo, kad TRPV4 ekspresija reikšmingai koreliuoja su DMFS, n = 1609 su p = 0, 0047 ir pavojaus santykis 1, 39. (2a pav., Apačioje kairėje pusėje esančiame skydelyje), atsižvelgiant į visus krūties navikus, taip pat pacientams, sergantiems B liumenu (n = 361, HR = 1, 98, p <0, 0, apatinė vidurinė skiltis1) ir HER-2 neigiamais (n = 82, HR = 7, 19, p <0, 01, apačioje dešinėje) potipiai.

Image

a ) Viršutinė dalis: 1881 mėginio krūties naviko ir 51 mėginio krūties vėžio ląstelių linijų genų rinkinio analizė naudojant GOBO. Apatinė dalis: TRPV4 ekspresijos koreliacija su DMFS, naudojant KMplotter, iš viso 361 krūties vėžiui su visais krūties vėžio navikais, B pakaušio ar HER2 potipiais. b ) Viršuje kairėje: EMT balų koreliacija su TRPV4 ekspresija krūties navikuose. Kaplan Meier analizuoja koreliuojančią TRPV4 raišką su bendru ir (arba) be ligos išgyvenimu kiaušidžių (viršuje dešinėje) ir skrandžio navikuose (apatinės plokštės).

Visas dydis

Be to, iš mūsų anksčiau atliktų DNR mikrorajonų tyrimų, atliktų su kiaušidžių (papildomos medžiagos ir metodai) ir skrandžio 24 vėžiu, Kaplan-Meier analizė parodė, kad TRPV4 - aukštoji grupė koreliuoja su prastesniu bendru ir (arba) be ligos išgyvenimu, palyginti su TRPV4 maža grupe ( 2b pav.). Galiausiai, atliekant epitelinio-mezenchiminio pereinamojo laikotarpio (EMT) balo [papildomos medžiagos ir metodai] ir TRPV4 geno ekspresijos analizę Spearman, paaiškėjo, kad TRPV4 raiška reikšmingai koreliuoja su EMT balais (Spearman Rho = 0, 1534, p = 1, 4E-22) (2b pav., viršutinis kairysis skydelis).

TRPV4 dalyvauja metastazavusiuose krūties vėžio ląstelių procesuose in vitro ir in vivo

Aukščiau pateikti duomenys patvirtino nuostatą, kad TRPV4 vaidina svarbų vaidmenį vėžio progresavime. TRPV4 prisideda prie epitelio ląstelių normalaus pralaidumo reguliavimo, moduliuodamas sandarius jungiamuosius baltymus 25 . Be to, tarpląstelinis TRPV4 lokalizavimas pakito iš intraląstelinių skyrių į plazmos membraną epitelio-mezenchiminio perėjimo (EMT) metu. Tai gali turėti įtakos vėžio ląstelių metastazėms 26 . Taigi mes atlikome žaizdų gijimo, chemotaksio, matrigelio invazijos ir transendotelinės migracijos tyrimus, kad gautume tiesioginių įrodymų apie TRPV4 vaidmenį metastazėse.

4T07 buvo pasirinkta ląstelių linija BCM modelyje migracijos, invazijos ir ekstravazacijos tyrimams, atlikus RNAi pagrįstus funkcijos tyrimų praradimus, nes 4T07 ląstelės pasižymi įvairiais metastazių bruožais, įskaitant ekstravazacijos žingsnį 14, 15 . Be to, šioje ląstelių linijoje labai ekspresuojamas TRPV4. Buvo patikrintos trys „ Trpv4“ specifinės siRNR, o tolimesniems tyrimams panaudotos dvi iš siRNR, S1 ir S3, kurios efektyviausiai numušė TRPV4 raišką (3a pav., Viršutinė kairioji plokštė). Vėlesni ląstelių tyrimai in vitro parodė, kad TRPV4 numušimas nuolat mažina žaizdų gijimą (50–60%), chemotaksį (40–50%), matrigelo invaziją (70–80%) ir transendotelio migraciją (50%). (3a, b pav.). Priešingai, toks slopinantis poveikis ląstelių migracijai nebuvo pastebėtas, kai 67NR ląstelėse buvo nutildyta TRPV4 siRNR, kurios TRPV4 ekspresijos lygis yra žemas (2 papildomas paveikslas). Trpv4 nutildymo poveikis šiems metastazavusiems procesams nebuvo susijęs su sumažėjusiu ląstelių skaičiumi / gyvybingumu, nes Trpv4 raiškos slopinimas neturėjo reikšmingos įtakos ląstelių proliferacijai, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (3b pav., Apatinė dešinė panelė). Norėdami dar labiau išaiškinti TRPV4 jonų kanalo funkciją metastazėse su vėžiu, mes panaudojome Ruthenium Red (RR) ir RES019–29 (RES) junginį, kad slopintume TRPV4 funkcijas. Jau daugelį dešimtmečių RR dažniausiai naudojama kaip TRPV4 inhibitorius, kad blokuotų jo jonų kanalo funkcijas. Be RR, RES019–29 (RES) junginys turi selektyvumo TRPV4 atžvilgiu (3 papildomas paveikslas). Buvo nustatyta, kad abu inhibitoriai veiksmingai slopina 4T07 ląstelių migraciją (3c pav.) Ir invaziją (3d pav.). Priešingai, poveikis buvo vos pastebimas 67NR ląstelėse, kurių TRPV4 lygis yra nenustatomas.

Image

( a) Viršutiniame kairiajame skydelyje rodomas efektyvus TRPV4 išraiškos nutildymas. Apatinė kairioji ir dešinė plokštės rodo, kad Trpv4 siRNR slopino 4T07 ląstelių migraciją. (b) Trpv4 siRNR slopino 4T07 ląstelių chemotaksį, invaziją, transendotelinę migraciją, bet ne proliferaciją. Iš esmės, išskyrus proliferaciją, Trpv4 numušimas davė statistiškai reikšmingą poveikį tirtiems ląstelių procesams, p <0, 05. c) parodo slopinantį RR ir RES poveikį ląstelių migracijai ir (d) invazijai į 4T07 ląsteles, bet ne į 67NR ląsteles. Parodytos trijų biologinių pakartojimų vidutinės vertės (n = 3, ± sd) ir p vertės iš nesuporuotų Studentų t- testo.

Visas dydis

Pirmiau RNAi pagrįsti funkcijų praradimo pelių vėžio ląstelėse tyrimai patvirtina mintį, kad TRPV4 vaidina svarbų vaidmenį metastazėse. Norėdami nustatyti, ar tai tiesa žmogaus krūties vėžio ląstelėse, atlikome padidėjusios funkcijos ekspresijos tyrimus. (MB468) ir MCF7 krūties vėžio ląstelių linijos buvo naudojamos, nes jos pasižymi mažu migracijos gebėjimu in vitro . Išorinis V5 žymėtas žmogaus TRPV4 pasirodė kaip 2 rūšys, o didesnė MW forma yra glikozilinta, nes ši rūšis yra jautri glikozilinimo inhibitoriams PNGaseF ir EndoH (4a pav.). Tokios dvigubos TRPV4 rūšys, pastebėtos vykstant egzogeninei ekspresijai žmogaus BC ląstelėse, pelių BC ląstelėse nebuvo pastebimos. Šio pastebėjimo priežastis yra neaiški. Išorinis TRPV4 veikė gebėjimo tarpininkauti kalcio sraute atžvilgiu (4b pav.).

Image

a) Laukinio tipo žmogaus TRPV4 ekspresija stabiliai retrovirusiniu būdu perduodamu krūties vėžio ląstelių linijomis. Viršutinė plokštė: Egzogeninio TRPV4 ir endogeninio aktino imunoblotai (ląstelių kontrolė) ląstelių lizatuose. Apatinė plokštė: imunoblotas TRPV4 po apdorojimo tunikamicinu (5 ug / ml), PNGaseF ir Endo-H skaidymas (500 V / reakcija). b) TRPV4 stabilių keitiklių kalcio tyrimas po apdorojimo 10 μM 4α-PDD. c ) MB468-TRPV4 stabilių keitiklių FACS analizė. Kairysis skydelis: uždarius gyvas ląsteles, pavieniai langeliai buvo išverčiami naudojant pločio ir srities parametrus. Dešinysis skydelis: histograma, rodanti ląstelių procentinę dalį G1, S ir G2M fazėse. Parodytos dviejų biologinių pakartojimų vidutinės vertės (n = 3, ± sd) ir P vertės iš nesuporuotų Studentų t- testo. d) TRPV4 stabilių keitiklių fizinis patikrinimas. Viršutinė plokštė: MB468 ir MCF7 ląstelių morfologijos fazinio kontrasto mikrografijos, perkeltos pBABE arba pBABE- TRPV4, buvo gautos subkonfluentiniame tankyje, išaugintame standartinėje terpėje, kurioje yra 10% serumo. Apatinė kairioji plokštė: santykinis kontrolinių ląstelių paviršiaus plotas ir TRPV4 stabilūs keitikliai; apačioje dešinėje: parodytas kontrolinių ir TRVP4 stabilių keitiklių pasiskirstymas pagal dydį, remiantis FSC-A duomenimis iš FACS analizės, ir P vertės iš nesuporuotų Studentų t- testo. ( e) parodytas TRPV4 poveikis matrigelio invazijai ir chemotaksiui MB468 ląstelėse, perkeltose pBABE. arba pBABE- TRPV4 retrovirusinių dalelių, naudojant Boydeno kameros tyrimus. Ląstelės, kurios migravo ar įsiveržė per barjerą, buvo nudažytos hematoksilinu / eozinu ir suskaičiuotos (invazijos tyrimui) arba atliktos kolorimetriniai matavimai (chemotaksio tyrimas) per tris nepriklausomus eksperimentus. Duomenys išreiškiami kaip perkeltos / įsiveržusios ląstelės viename lauke (n = 3, reiškia ± sd), parodytos P vertės iš nesuporuotų Studentų t- testo.

Visas dydis

Pirmiausia, atlikdami FACS analizę, mes patvirtinome, ar TRPV4 per didelis ekspresija turi reikšmės žmogaus vėžio ląstelių dauginimuisi. Per didelis TRPV4 ekspresija akivaizdžiai nepaveikė MB468 (4c pav.) Ir MCF7 (papildomas 4 paveikslas) stabilių keitiklių ląstelių ciklo. Tai atitinka ankstesnį pastebėjimą, kad TRPV4 numušimas neturėjo įtakos pelių 4T07 krūties vėžio ląstelių proliferacijai. Tačiau pastebėta, kad MB468, bet ne MCF7 TRPV4 transduktantų ląstelės mikroskopiškai turi didesnį dydį, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (4d pav., Viršutinės plokštės). Ląstelės paviršiaus ploto analizė naudojant „ImageJ“ programinę įrangą taip pat patvirtina pastebėjimą, kad TRPV4 perreguliuojančios MB468 ląstelės buvo 20% didesnės nei kontrolinės ląstelės (4d pav., Apačioje kairėje). Tai patvirtina MB468-TRPV4 ląstelių priekinio sklaidos (FSC) fluorescencijos intensyvumo pokytis, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis FACS analizės metu (4d pav., Apačioje dešinėje). Neaišku, ką tai turi, tačiau tai gali atspindėti TRPV4 vaidmenį reguliuojant ląstelių osmosinį slėgį ir patinimą.

Toliau mes ištyrėme išorinės TRPV4 ekspresijos įtaką žmogaus krūties vėžio metastazėms. Nors per didelis TRPV4 ekspresija nepakeitė MCF7 invazinių ir chemotaksinių gebėjimų (duomenys nepateikti), TRPV4 ekspresuojančių MB468 ląstelių invaziškumas ir chemotaksis padidėjo maždaug 50–60%, palyginti su vektoriaus kontrole (4e pav.). TRPV4 per didelė ekspresija nepadidino transendotelinės migracijos galimybės nei MCF7, nei MB468 ląstelėse (duomenys nepateikti). Norėdami gauti daugiau fiziologinio ir bendro supratimo apie TRPV4 poveikį ekstravazacijai, metastazėms ir matomų metastazavusių mazgelių susidarymui plaučiuose, atlikome kontrolinės uodegos venų injekcijas ir „ Trpv4“ numušė 4T1 ląsteles SCID pelėms. 4T1 ląstelių linija yra tinkama šiam tikslui, nes ji išreiškia aukštą TRPV4 lygį, iš pradžių pranešama, kad ji yra pajėgi visam metastazavimo proceso spektrui nuo invazijos iki tolimų vietų kolonizacijos ir yra dažniausiai naudojama in vivo metastazių tyrimams. 6, 10, 14, 27, 28, 29 . Ląstelės buvo įvedamos per uodegos veną pelėms po to, kai TRPV4 buvo numuštos. Po 7 dienų injekcijos kiekvienos grupės pelės buvo paaukotos ir paimti plaučiai, kad būtų galima išmatuoti metastazių ląstelių kolonizaciją, dažant audinius hematoksilinu ir eozinu (H&E) (5a pav., Viršutinė plokštė). Pelių, parodžiusių skirtingą kategorinį mazgelių skaičių kiekvienoje būklėje, skaičius parodytas 5a pav., Apatiniame skydelyje. Akivaizdu, kad mažiau pelių atsirado mazgelių, tačiau kai jie atsirado, plaučiuose buvo mažesnis mazgelių skaičius, kai TRPV4 buvo nutildytas, palyginti su kontrole. Kaip parodyta 5b pav., Plaučių sekcijų imunohistochemija atskleidė, kad pelių, kuriems sušvirkštos Trpv4 numuštos 4T1 ląstelės, plaučiuose susidariusiuose mazgeliuose TRPV4 raiška buvo žymiai mažesnė, palyginti su kontrolinių pelių (p <0, 05). 5c pav. Viršutiniame skydelyje parodytas pagal dydį klasifikuotų metastazinių mazgelių, susidariusių pelėms, įšvirkštusoms su Luc kontrole arba Trpv4 numuštas 4T1 ląsteles, skaičius. Rezultatai parodė, kad nutildžius Trpv4 raišką, plaučių metastazių skaičius sumažėjo maždaug 80% (60 palyginti su 12 mazgelių). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp susidariusių mazgelių (5c pav., Apatinės plokštės) nebuvo. Tai atitinka ankstesnį pastebėjimą, kad TRPV4 nedaro įtakos vėžio augimui / proliferacijai. Išsamus mazgelių skaičiavimo sąrašas ir IHC rezultatai pateikti 3 papildomoje lentelėje. Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad TRPV4 prisideda prie krūties vėžio metastazių.

Image

Trpv4 numušimo poveikis 4T1 ląstelių metastazėms. Viršutinė plokštė: Pelių, įšvirkštų 4T1 ląstelių, peršvirkštų kontroline arba Trpv4 specifine siRNR, plaučių audinio atkarpų dažymas H&E. „T“ žymi naviko mazgelius, o „N“ - normalius plaučių audinius. Trys reprezentacinių H&E vaizdų padidinimai (40x, 200x ir 600x) (n = 10 kiekvienai grupei). Apatinis skydelis: Lentelė, rodanti pelių skaičių kontrolinėje ar Trpv4 numuštų gyvūnų grupėje , turinčių kategorinį mazgelių skaičių. b) Viršutinė plokštė: reprezentatyvūs IHC vaizdai, rodantys TRPV4 raišką pelių plaučiuose iš kontrolinės ir Trpv4 - užmerktomis sąlygomis. Apatinis skydelis: Dėžutės, parodančios TRPV4 ekspresiją metastazavusiuose mazguose plaučiuose iš pelių kontrolinės ir Trpv4 - užmerktos. (c) Viršutinis skydelis: Buvo išmatuotas visų kontroliuojamų pelių mazgelių dydis plaučiuose ir Trpv4- užfiksuotos sąlygos, užrašytas mazgelių skaičius 3 dydžio grupėse. Apatinis kairysis skydelis: Dėžutės, parodančios mazgelių dydžio pasiskirstymą pelėse, esant kontrolinėms ir Trpv4 sąlygoms. „n“ reiškia kiekvienos būklės mazgelių imties dydį. Apatinis dešinysis skydas: laukelio grafikai , nurodantys bendrą kiekvienos pelės mazgelių skaičių, esant kontroliuojamai ir „ Trpv4“ sąlygoms. „n“ reiškia pelių mėginio dydį.

Visas dydis

TRPV4 reguliuoja ląstelių standumą

Norėdami palengvinti ekstravazaciją, metastazavusios ląstelės įgytų keletą bruožų, įskaitant, bet tuo neapsiribojant, ląstelių sugebėjimą prilipti / pririšti prie molekulių endotelio ląstelių paviršiuje ir perbraukti endotelio ląstelių gleivinę nepažeidžiant vėžio ląstelių. Pastarasis visada susijęs su aktino citoskeleto pertvarkymu, pleiskanų susidarymu ar lamellipodija. Kadangi TRPV4 sugeba tarpininkauti Ca 2+ srautams, kurie, kaip žinoma, vaidina svarbų vaidmenį šiuose procesuose 8, ir suprasti TRPV4 funkcijos ląstelinį mechanizmą, mes iškėlėme hipotezę, kad transendotelio migracija ir metastazės buvo skatinamos per TRPV4 suteiktą ląstelių „minkštumą“. . Todėl mes atlikome mikropipetės aspiracijos eksperimentus ir stebėjome, kaip Trpv4 numuštuose 4T07 ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, susidaro membraninis pūslelinis. Ląstelės buvo suspenduotos auginimo terpėje ir veikiamos neigiamo slėgio, leidžiančios siurbti atskiras ląsteles įpūsti į mikropipetės angą. Kraujagyslės susidaro, kai ląstelės membranos dalis atsiskiria nuo apatinės žievės, veikiant citozoliniam slėgiui 30 . Pastebėta, kad ląstelių, kurios tyrimo pabaigoje suformavo pūsleles, skaičius buvo žymiai mažesnis Trpv4 numuštuose ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (6a pav.). Reprezentatyvūs vaizdai, rodantys, kad kontrolės ląstelėse susidarė pūslelinė, bet ne Trpv4 numuštuose ląstelėse, yra parodyti 6b pav. Be to, minimalus slėgis, reikalingas pūslelių susidarymui kontrolinėse ląstelėse, taip pat buvo žymiai mažesnis, palyginti su tuo, kuris reikalingas Trpv4 numušimo ląstelėms (6c pav.). Neapdoroti duomenys pateikiami 4 papildomoje lentelėje. Šioje svetainėje pateikiami reprezentatyvūs vaizdo įrašai apie kontroliuojamas, S1 ir S3- Trpv4 numuštas ląsteles, kurioms taikomi mikropipetės aspiracijos tyrimai (//www.med.nus.edu.sg/bch/pi / lyp / video. php, slaptažodis: video).

Image

a) 4T07 ląstelių, susidariusių pūslelėmis prieš ir po Trpv4 nutildymo, procentinė dalis. (b) Rodyklės rodo, kad kontrolinėse ląstelėse susiformavęs pūslelis, bet ne ląstelės, perkeltos S1- ir S3- Trpv4- specifinėmis siRNR. Buvo nubraižytas mažiausias slėgis, kurį esant kraujosruvos išsivystė c) 4T07 ląstelėse ir (d) MB468 ląstelėse. e) MB468 ląstelių šlyties modulis ( Pa ) buvo nustatytas naudojant tiesinį elastingo kieto modelį. Parodytos P vertės iš nesuporuotų Studentų t- testo.

Visas dydis

Atsižvelgiant į 4T07 pelių krūties vėžio ląstelių funkcijų tyrimų praradimą, padidėjusio funkcijos tyrimo, padidėjusio TRPV4 ekspresijai MB468, tyrimai parodė padidėjusį ląstelių pūtimą. Slėgis, kuriam esant kraujo krešumas buvo inicijuotas MB468-TRPV4 ląstelėse, buvo žymiai mažesnis nei kontrolinės grupės (6d pav.). Be to, TRPV4 poveikis ląstelės standumui buvo įvertintas išmatuojant ląstelės šlyties modulį (G) mikropipetės aspiracijos metodu (išsami medžiaga paminėta medžiagų ir metodų skyriuje). Kaip parodyta (6e pav.), TRPV4 perdėta ekspozicija sumažino šlyties modulį (Pa) daugiau kaip 2 kartus, palyginti su kontrole, ir tai rodo, kad ląstelėms deformuotis reikėjo mažesnės jėgos. Visi šie duomenys patvirtina mintį, kad fizinis „elastingumas“ yra potencialus mechanizmas, per kurį TRPV4 suteikia metastazavimo potencialą vėžio ląstelėms. Tai procesas, kuris gali apimti plazmos membranos tarnavimą citoskeleto baltymams ląstelių žievės srityje.

TRPV4 pagreitina aktino dinamiką ir sumažina ląstelių žievėje su citoskeletu susijusių baltymų reguliavimą.

Plazmos membranos ir citoskeleto sąsają užima jungiamieji baltymai, kurie fiziškai sujungia membraną su citoskeletu. Pavyzdžiui, žinoma, kad ERM baltymai (ezrinas, radiksinas ir moesinas) dalyvauja ląstelių mechanikoje ir plazmos membranos-aktino žievės sąveikoje 31, 32 . Po fosforilinimo ir aktyvavimo šie baltymai gali prisijungti tiek prie polimerizuoto aktino, tiek prie vientisų membranos baltymų, todėl sumažėja pūtimas 33 . Taigi, ląstelės tvirtumas greičiausiai priklauso nuo juxtamembrane pastolių, kuriuos sudaro ERM linkerio baltymai, tankio ir stiprumo. Norėdami ištirti molekulinį TRPV4 veikimo būdą reguliuojant ląstelių žievės baltymus, esant TRPV4 suteiktam ląstelės „minkštumui“, ištyrėme ERM baltymus kontrolinėse ir TRPV4 ekspresuojančiose ląstelėse. Izotoninės būklės, fosforilinto ERM lygis, parodytas kaip dviguba juosta, MB468-TRPV4 buvo 5–10% mažesnis, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (7a pav.). Tačiau kai kontrolinės ir MB468-TRPV4 ląstelės buvo veikiamos stimuliacijos hipoosmoziniu stresu, fosfo-ERM lygio sumažėjimas tarp MB468-TRPV4 ir kontrolinių ląstelių padidėjo iki 10–20%. ERM fosforilėjimo sumažėjimas buvo susijęs su ląstelių pūtimu ir sumažėjusiu aktino žievės stiprumu, o tai patvirtina mūsų pastebėjimą 34 . Todėl mūsų stebėjimai rodo silpnesnį ryšį tarp F-aktino ir trans-membraninių baltymų (7a pav.), Taigi, silpnesnis ląstelių membranos-žievės stipris TRVP4 ekspresuojančiose ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis.

Image

( a ) Kontrolinių arba stabilių TRPV4 MB468 transduktantų lizatai, neapdoroti ar apdoroti dejonizuotu vandeniu 3 min., buvo imunologiškai užkrėsti nurodytais antikūnais. Pateikti duomenys yra vidutiniai ± sd ( n = 3) ( b ) Netirpūs (turi F-aktino) ir tirpios frakcijos (turinčios G-aktino), išskirtos iš visų lizatų, buvo tiriamos aktino atžvilgiu. Pateikti duomenys yra vidutiniai ± sd ( n = 4). ( c ) Kontrolinių arba stabilių TRPV4 MB468 transduktantų lizatai buvo imunoblotuojami fosfo-kofilino arba bendrojo kofilino antikūnais. ( d ) Lizatai iš MB468-Vector ir MB468-TRPV4 ląstelių, neapdorotų ar neapdoroti dejonizuotu vandeniu, buvo tiriami siekiant nustatyti bendrą VASP ir fosfo-VASP antikūnus. Baltymų ekspresijos lygiai buvo normalizuoti ir kiekybiškai įvertinti, kaip parodyta juostų diagramoje. GAPDH buvo naudojami kaip pakrovimo kontrolė. Parodytos trijų biologinių pakartojimų (n = 3, ± sd) vidutinės vertės ir p vertės iš nesuporuotų Studentų t- testo. ( e ) MB468-Vector ir MB468-TRPV4 ląstelės nebuvo iš anksto apdorotos ar apdorotos RR valandą prieš terpės pakeitimą dejonizuotu vandeniu arba šviežia augimo terpe. Atlikta densitometrija. Baltymų ekspresijos lygiai buvo kiekybiškai įvertinti ir pateikti kaip santykinis E-kadherino ekspresijos lygio pokytis įvairiomis sąlygomis, palyginti su jų atitinkamais negydytais mėginiais. β- tubulinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Parodytos trijų biologinių pakartojimų (n = 5, ± sd) ir p reikšmių iš nesuporuotų Studentų t- testų vidutinės vertės.

Visas dydis

Kadangi buvo įrodyta, kad TRPV4 tiesiogiai jungiasi su citoskeletiniais baltymais, įskaitant aktiną, tubuliną ir neurofilamentą 35, mes hipotezėme, kad TRPV4 gali pakeisti ląstelių biomechanines savybes reguliuodamas aktino tinklą. Taigi mes ištyrėme, ar TRPV4 sukeltas minkštumas yra susijęs su aktino depolimerizacija. Didelio greičio centrifugavimas buvo naudojamas atskirti G- ir F-aktino junginius nuo ląstelių lizatų, o po to - kiekybinė Western blot analizė, siekiant įvertinti G- ir F-aktino santykį. TRPV4 transfekuotose ląstelėse statistiškai reikšmingas vidutinis G ir F aktino santykis padidėjo 22%, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (2, 31 palyginti su 1, 89, n = 4) (7b pav.). Kofilinas yra vienas iš aktiną depolimerizuojančių veiksnių, tiesiogiai reguliuojančių aktino dinamiką 36, 37 . Kofilino fosforilinimas slopina jo aktiną depolimerizuojančias funkcijas 38, 39 . Kai buvo ištirta kofilino fosforilinimo būklė, fosfo-kofilino ekspresijos lygis MB468-TRPV4 buvo 1, 45 karto mažesnis ± 0, 04 (n = 3), palyginti su vektoriais transfekuotomis ląstelėmis (7c pav.). VASP skatina aktino polimerizaciją ribodamas aktino gijų ribojimą, tuo tarpu VASP fosforilinimas esant S239 pažeidžia aktino gijų susidarymą 40 . Nesant dirgiklio, VASP fosforilinimo skirtumų tarp vektorių kontrolės ir TRPV4 pažeistų ląstelių nebuvo pastebėta. Kai ląstelės patyrė osmosinį stresą, VASP fosforilinimas palaipsniui padidėjo vektorių kontrolės ląstelėse, bet drastiškai - TRPV4 transfekuotose ląstelėse (7d pav.). Tai gali paaiškinti ankstesnį pastebėjimą, kad TRPV4 transfekuotos ląstelės turėjo mažiau F aktino, palyginti su vektorių kontrolinėmis ląstelėmis. Galiausiai mes ištyrėme E-kadherino stabilumą kartu su TRPV4 hipoosmozinėmis sąlygomis, nes E-kadherinas yra adreno jungties baltymas, vaidinantis svarbų vaidmenį nustatant citoskeleto struktūrą ir sukibimą. 7e pav. Parodyta, kad baziniame lygmenyje MB468-TRPV4 buvo aptiktas E-kadherino ekspresijos sumažėjimas, palyginti su vektoriaus kontrole. Ir dar labiau sumažėjo hipo-osmosinės sąlygos, nes dejonizuotas vanduo padidino E-kadherino baltymų nestabilumą, kai TRPV4 buvo per daug ekspresuojamas. Galiausiai mes paklausėme, ar TRPV4 jonų kanalo funkcionalumas galėjo prisidėti prie pokyčių, stebėtų viršūninio baltymo ekspresijos lygiuose naudojant RR. Duomenys rodo, kad TRPV4 inhibitorius gali užkirsti kelią viršūninių baltymų praradimui baziniame lygmenyje (7e pav.). Hipo osmosinės būklės metu buvo pastebėtas dalinis E-kadherino ekspresijos atstatymas naudojant RR (7e pav.), Rodantis, kad dejonizuoto vandens sukeltas hipoosmozinis poveikis buvo iš dalies perduodamas per TRPV4 jonų kanalą. Visi šie duomenys rodo, kad TRPV4 skatina vėžio ląstelių ekstravazaciją / transendotelinę migraciją, nes sumažina ląstelių standumą reguliuodamas ląstelių žievės / citoskeleto baltymus.

Diskusija

TRPV4 yra katijoninių kanalų, susijusių su žmonių ligomis ir vėžiu, TRP (pereinamojo laikotarpio receptorių potencialas), šeimos, narys. Prostatos, kiaušidžių, krūties, kepenų ir šlapimo pūslės vėžiuose pastebėtas TRPM1, TRPM8, TRPC6, TRPV1, TRPV2 ir TRPV6 ekspresijos reguliavimas 41, 42, 43 . Nebuvo pranešta apie TRPV4 vaidmenį epitelio vėžio ląstelėse. Čia parodyta, kad eksperimentiniame krūties vėžio metastazių modelyje yra per daug išreikštas TRPV4 baltymas ir jo nuorašas, o jo per didelis ekspresija susijęs su krūties vėžio ląstelių ekstravazacijos bruožų įgijimu. Kliniškai didesnė TRPV4 transkripcijos išraiška yra susijusi su agresyvesniais krūties vėžio potipiais (pvz., ER ir bazinis) ir koreliuoja su prastesniu tolimojo metastazavimo periodu, kai pacientams, sergantiems krūties, kiaušidžių ir skrandžio vėžiu, išgyvenimas nėra didelis - tai reiškia, kad TRPV4 vaidmuo kietuose epiteliuose yra platus. vėžio. Pelių ir žmogaus krūties vėžio ląstelių funkcijų padidėjimas ir praradimas patvirtino TRPV4 vaidmenį metastazėse.

Be formuojamų lamellipodijų ar filopodijų, ląstelių migraciją ir invaziją gali paskatinti ir labai skirtingas mechaninis procesas - pūtimas, kuris, kaip žinoma, susijęs su amebioidiniu judėjimu invazinėse vėžio ląstelėse. Kraujagyslės yra specializuotos suapvalintos membranos iškyšos, kurios iš pradžių buvo nustatytos kaip morfologinis 44, 45 apoptozės požymis . Tik iki paskutinių dešimtmečių duomenų rinkimas parodė, kad pūslelių susidarymas yra ypatingas ląstelių judrumo tipas dėl padidėjusio tarpląstelinio slėgio, ir šios ląstelės neparodė jokių apoptozės požymių 46 . Manoma, kad kraujavimas iš plazmos membranos yra susijęs su EMT 47 ir gali būti sukeltas onkogeno, pavyzdžiui, c-MET, sukeliančio amoeboidinių ląstelių judrumą ir invaziją 48 . Kitas tyrimas rodo, kad krūties vėžio ląstelės, įsiveržusios į 3D kolageną tokiomis sąlygomis, kai blokuojamas matricos skaidymasis, naudojo amoeboidinį invazijos režimą, sudarydamos į pūslelinius panašius susiaurėjimo žiedus 49 . Įdomu tai, kad įrodyta, kad ir TRPV4 ekspresija, ir aktyvacija sukelia ryškius morfologinius pokyčius, turinčius įtakos lamellipodial ir filopodial struktūroms 35 .

Amoeboidinis judesys, susidarantis dėl pūslelinės formavimo, yra žinomas priklausomai nuo ląstelių deformacijos (standumo laipsnio) - parametro, kurį mes ištyrėme mikropipetės aspiracijos būdu. Mes suprantame, kad šiame tyrime sukeltos lemputės atsirado dėl išorinės fizinės jėgos. Vis dėlto šiuos stebėjimus mes pavertėme biomechaniniais matavimais, naudodami linijinį elastingo kieto modelio modelį. Modelis buvo pagrįstas vienpusiu pūtimo dinamikos suderinimu, kad būtų galima sužinoti apie ląstelių tvirtumą. Tiek pelių, tiek žmonių modeliuose nustatyta, kad TRPV4 ekspresija koreliuoja su sumažėjusiu šlyties moduliu ir padidėjusiu deformacija. Sumažėjęs žievės ir membranos ryšys, kurį rodo mažiau fosfo-ERM, galėjo paskatinti pūtimą 50 . Visai neseniai Thodeti et al . 51 parodė, kad mechaninės jėgos, kurios aktyvuoja TRPV4 ir fiziškai deformuoja ECM, gali padėti kapiliarų ląstelėms perorientuoti. Autoriai parodė, kad cikliškai tempiančios kapiliarų endotelio ląstelės, prilipusios prie lanksčių ECM substratų, suaktyvina TRPV4, o tai savo ruožtu skatina nuo PI3K priklausomą papildomų beta-1 integrinų aktyvaciją ir surišimą, o tai skatina citoskeleto atstatymą ir ląstelių perorientavimą angiogenezės metu. Kitas Alessandri-Haber N et al tyrimas. 52 parodyta, kad alfa2beta1 integrinas ir Src tirozino kinazė, kurie buvo įtraukti į mechaninį virsmą, yra svarbūs mechaninei hiperalgezijos raidai ir kad jų indėlis reikalauja TRPV4. Gali būti, kad TRPV4 fiziškai ir funkciškai bendradarbiauja su integrinais vėžio ląstelėse ir gali suaktyvinti signalo perdavimo perdavimo kaskadą, kuri lemia ląstelių mobilumą. Kiti mechanizmai, kurių mes netyrėme, yra miozino II sukeltas aktomiozino susitraukimas, kuris galėtų paskatinti kraujavimo susidarymą padidindamas hidrostatinį slėgį, dėl kurio gali susidaryti židinys - aktino žievė 50 . Įdomu būtų papildomai ištirti, kaip mechaniškai jautrus TRPV4 moduliuoja citoskeleto atstatymą, naudodamas imunofluorescencinį įrankį, kad ištirtų TRPV4 sukeltą aktino organizavimą ir žievės baltymų (pvz., ERM ir miozino) lokalizaciją pūslelių išsiplėtimo ir atitraukimo metu.

Be ERM ląstelių žievės baltymų, aktino polimerizacija yra dar vienas veiksnys, turintis įtakos mechaniniam ląstelių standumui. TRPV4 per didelis ekspresija MB468 padidino tirpaus G-aktino ir filamentinio F-aktino santykį, pakartodamas TRPV4 vaidmenį mažinant ląstelių standumą. Tai buvo daroma kartu su padidėjusiu fosforilinto VASP lygiu, todėl, matyt, dėl to mažiau ribojamas aktino gijų ribojimas, todėl mažiau polimerizuojasi aktinas. Be to, kofilino fosforilinimo sumažėjimas, kuris slopina jo aktino depolimerizacijos funkciją, MB468-TRPV4 ląstelėse galėjo „suminkštinti“ ląsteles susilpnindamas aktino žievę. Apskritai, per didelis TRPV4 ekspresija MB468 ląstelėse suteikė fizinį minkštumą krūties vėžio ląstelėms, nes sumažėjo ląstelių žievės baltymų pastoliai ir padidėjo G iki F aktino santykis. Išvados pirmą kartą suteikia naujų įžvalgų apie molekulinę ir ląstelinę TRPV4 funkcijos įtaką vėžio metastazėms. Šie stebėjimai atitinka nurodytą TRPV4 vaidmenį reguliuojant normalų epitelio ląstelių pralaidumą ir tūrį, veikiant jo veikiamoms mikrosiudų dinamikai 25, 53 .

Įsivaizduojama, kad vėžinėms ląstelėms vis labiau invazuojant, jos pasižymi švelnesnėmis mechaninėmis savybėmis, palengvinančiomis ląstelių deformaciją ir formos pokyčius, tinkančius metastazavusiai populiacijai. Šį modelį patvirtina ir mūsų, ir kitų, kurie parodė, kad labai metastazavusioms epitelio ląstelėms (pvz., Kiaušidžių, plaučių ir krūties latakams) buvo sumažintas standumas, susijęs su aktino citoskeleto rekonstrukcija, palyginti su mažiau invazinėmis ląstelėmis 12, 13, 54., 55, 56 . Tačiau taip pat buvo pranešta apie padidėjusį prostatos piktybinių navikų vėžio ląstelių standumą ir deformaciją 57, 58, 59 . Tokį akivaizdų ginčą gali lemti keli veiksniai, įskaitant tirtus vėžinių ląstelių tipus, susijusius onkogenus, sąlygas, kuriomis buvo atlikti tyrimai, ir naudojamus metodus. Pro metastazavusių vėžinių ląstelių standumo ar elastingumo pokyčiai daugiausia buvo tiriami izoliuotose ląstelėse arba in vitro ląstelių kultūros sistemose. Neseniai Fenner ir kt . tiesiogiai susieja santykinį auglių standumą su vėžio progresavimu, naudodamas metastazavusio krūties vėžio pelės modelį kartu su šviežių iškirptų, nepažeistų navikų tūrinių modulių matavimais ex vivo 60 . Šis metodas atkuria chirurginę pieno naviko rezekciją su vėlesniais vietiniais pasikartojimais ir metastazėmis. Remdamasis mūsų išvadomis, šis dokumentas parodė, kad labiau atitinkantys navikai buvo siejami su dažnesniais, didesniais vietiniais pasikartojimais ir išplitusiu metastazavimu nei pelės, turinčios palyginti standžius auglius.

Ar supratimas apie TRPV4 veikimo būdą paaiškina jo poveikį nagrinėjamiems metastazavimo procesams? TRPV4 per didelis ekspresija skatino MB468 invaziją ir migraciją, bet ne MCF7 ląsteles. Be to, priešingai nei 4T07 funkcijų praradimo tyrimai, padidėjęs TRPV4 ekspressija nepadidino transendotelinės migracijos MB468. 4T07 yra fibroblastinės ir labai invazinės, tuo tarpu MB468 ląstelės yra epitelio pobūdžio. Galima įsivaizduoti, kad nors reikalingas TRPV4, tam tikrose ląstelėse gali nepakakti metastazių. Tai tikėtina, nes pagrindinis šiame tyrime nustatytas TRPV4 veikimo būdas yra ląstelių aktino žievės ir standumo reguliavimas. Nepaisant to, tai neatmeta TRPV4 kaip potencialaus narkotikų tikslo. Taip pat gali būti įdomu ištirti TRPV4 fosforilinimo vaidmenį aktino žievės valdyme ir ląstelių minkštume.

TRPV4 yra per daug ekspresuojamas baziniame krūties vėžio potipyje, kuris dažniausiai būna agresyvus ir trigubai neigiamas. TRPV4 yra perspektyvus vaisto taikinys, nes tai ląstelės paviršiaus katijono kanalas, kurį gali slopinti mažos molekulės, tokios kaip Ruthenium Red 25 . TRPV4 may be exploited as a drug target for management of triple negative, metastatic breast cancers. However, TRPV4 does not seem to be required for cancer cell growth/proliferation. A rational cancer therapy strategy would require combining anti-TPRV4 inhibitors (to potentially block metastasis) with cytotoxic drugs (to kill cancer cells). Anti-TRPV4 antibody-drug conjugate may also be designed to target metastatic cancer cells with improved specificity and efficacy.

In conclusion, a novel role for TRPV4 in metastasis has been established. Regulation of cell stiffness and cell cortex dynamics are putative modes of actions through which TRPV4 promotes cancer cell extravasation. TRPV4 may be a viable drug target for management of metastatic breast cancers.

Medžiagos ir metodai

Reagentai

TRPV4 rabbit polyclonal antibodies were generated in Dr Christian Harteneck's laboratory using a TRPV4-derived peptide sequence (N terminus-CENPHKKADMRRQDS-C-terminus). 4α-alpha-phorbol 12, 13-didecanoate and Ruthenium Red were from Merck KGaA (Darmstadt, Germany). RES019-29 was provided by Martin Johansson (Respiratorius AB, Sweden). The rest of the reagents are detailed in Supplementary Materials & Methods.

Cell lines and lysis

The breast cancer metastasis model cell lines (67NR, 168FARN, 4TO7 and 4T1) were obtained from Dr. Fred Miller at the Barbara Ann Karmanos Cancer Institute (Detroit, MI). The culture conditions were as previously described 14 . Culture conditions for other commercially available cell lines and the lysis method are provided in Supplementary Materials & Methods.

LC-MS/MS of 4G10-purified phosphoproteins – detection and relative quantification

Serum-starved cells were treated with 1 mM pervanadate (PV) for 15 min to increase the representation of tyrosine phosphorylated proteins and lysed. Preparation of 1 mM PV was as previously described 61 . From big scale preparations of cell lysates, one portion was used for phosphoproteomics analysis and a smaller portion retained for subsequent validation. For the former purpose, sixty milligrams of total protein from each cell lines were used for purification via 4G10 anti-phosphotyrosine antibodies-based immunoaffinity purification. This was performed and processed for iTRAQ labeling as previously reported 16 . The samples were then pooled and cleaned-up by the cation exchange cartridge provided in the kit. Two biological replicates were prepared and the samples desalted, lyophilized and analyzed using MALDI-TOF-TOF (see Supplementary Materials & Methods for details).

TRPV4 knock down and overexpression

Mouse Trpv4 -specific siRNA oligonucleotides were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA) and the siRNA sequences are as following: Luciferase GL2: 5′-CGUACG CGGAAUACUUCGA-3′; Trpv4 siRNA1: 5′-AGAAGCAGCAGGUCGUACAUCUUGG-3′; Trpv4 siRNA3: 5′-AAACUUGGUGUUCUCUCGGGUGUUG-3′. Transduction protocols for TRPV4 overexpression in human breast cancer cells are provided in Supplementary Materials & Methods.

In vivo model

The protocol for the xenograft study was reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the National University of Singapore in compliance with international guidelines on the care and use of animals for scientific purpose. All methods were carried out in accordance with the relevant guidelines. 4T1 (1 × 10 6 ) cells in 150 μL PBS were injected into the tail vein of eight-weeks-old female severe combined immunodeficiency mice. After 5, 7, 10 and 14 days of injection, mice were euthanized and examined for the metastasis of the lungs. The optimal duration of the assay was determined to be 7 days. To count the number of metastatic nodules, mouse lungs were collected and fixed with 10% neutral buffered formalin (Sigma) for 16 hr at 4 °C, processed by Thermo Shandon tissue processor and embedded in paraffin. Sections were warmed in a 60 °C oven, dewaxed in three changes of histoclear and passaged through graded ethanol (100%, 95%, and 70%) before a final wash in double distilled H 2 O. The nodules size was recorded for each Hematoxylin and Eosin (H&E)-stained section using the Olympus BX-41 light microscope (Center Valley, PA) at high-power field (HPF; x400). The maximum diameter of viable nodule was calculated by summing the largest uni-dimensional diameter of each fragment of nodule using the Olympus BX-41 microscope and the micrometer (the view field area with a 20x objective would be 1.1 mm). Immunochemistry of TRPV4 is described in the Supplementary Materials & Methods.

Micropipette aspiration

Micropipettes were pulled from borosilicate glass capillaries (B100-75-10, Sutter instruments) using a micropipette puller (Model P-97, Sutter Instruments) and forged to the required diameter (~7 μm) using a micropipette forge (MF-900, Narishige, Japan). To prevent non-specific adhesion between the capillary wall and the cell, micropipettes were filled with 3% BSA solution using a micropipette filler (Microfil TM, World Precision Instruments, Fl). The micropipette was then mounted on a micromanipulator (Eppendrof) and connected to water columns. Cells were first trypsinized, centrifuged and re-suspended in culture medium. A large drop of culture medium was placed on a hydrophobic glass cover slip and mounted on an inverted microscope (Leica). About 5 μl of the cell suspension was added to this drop of the culture medium. A single suspended cell was aspirated into the micropipette. Pressure was applied to the cell at a rate of 2 Pa/sec for 200 seconds (or max of 400 Pa). Images of the cell were captured every 2 seconds using a 63X dry objective (Leica). The shear modulus was calculated using the proportionality relation between applied suction pressure and aspirated length of the cell in the micropipette. The equation below describes the relation

Image

Here, L is the aspirated length, R P the pipette radius, G the shear modulus, and Φ P is a function of the ration of the pipette wall thickness to the pipette radius, Φ P = 2.0–2.1 when the ration is equal to 0.2–1.0. In this case, based on the ratio value between 0.2–0.4 in different experiments, we chose Φ P = 2.0.

Intracellular Ca 2+ measurement

Cells were loaded with 5 μM fura-2-AM (Molecular Probes) for 30 min at 37 °C in the measuring buffer contained 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 9 mM glucose, 0.2% BSA, 10 mM HEPES and 1 mM CaCl 2 (pH 7.4 with NaOH), dislodged with Trypsin-EDTA before assaying for intracellular calcium concentration in a cuvette under constant, gentle stirring (1 ml final volume). 0.5% Triton-X was added to get R max (as a positive control) and 20 mM EDTA was added to get R min (as a negative control). Fluorescent emission was monitored at 510 nm with alternate excitation at 340 and 380 nm using a RF-5301PC Intracellular Ion Measurement System Spectrofluorophotometer (Super Ion Probe); Shimadzu Corporation. [Ca 2 + ] i was calculated based on Grynkiewicz's two wavelength method 62 .

Statistiniai metodai

Cell-based assays and xenograft were analyzed by unpaired two-tailed Student's t-test. Statistical analysis for other experiments done are described in the supplementary Materials and Methods.

Papildoma informacija

How to cite this article : Lee, WH et al . TRPV4 Regulates Breast Cancer Cell Extravasation, Stiffness and Actin Cortex. Mokslas. Atstovas 6, 27903; doi: 10.1038/srep27903 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildoma S1 lentelė

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.