Dirbtinio muskarininio ir dopaminerginio ligandų turinčio kalio kanalų allosterinio reguliavimo derinimas, nustatant baltymų sujungimo receptorių baltymus | mokslinės ataskaitos

Dirbtinio muskarininio ir dopaminerginio ligandų turinčio kalio kanalų allosterinio reguliavimo derinimas, nustatant baltymų sujungimo receptorių baltymus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ligandu sujungti jonų kanalai
  • Kalio kanalai
  • Baltymų dizainas
  • Įtampos spaustukas

Anotacija

Ligandu sujungti jonų kanalai įgalina tarpląstelinį veikimo potencialą per sinapses perduoti biocheminiams pasiuntiniams į elektrinį signalą. Mes suprojektavome dirbtinius ligandais sujungtus jonų kanalus, sujungdami G baltymais sujungtus receptorius su kalio kanalu Kir6.2. Šie dirbtiniai kanalai, vadinami receptoriais, sujungtais su jonų kanalais, pasižymi papildomomis savybėmis natūraliems kanalams, išplėsdami ligandų repertuarą tiems, kuriuos atpažįsta sulieti receptoriai, sukurdami patvaresnius signalus ir suteikdami kalio selektyvumą. Pirmieji dirbtiniai kanalai, pagrįsti muskarino M2 ir dopaminerginiais D2 L receptoriais, buvo atidaryti ir uždaryti atitinkamai acetilcholinu ir dopaminu. Čia pastebime, kad šis priešingas vartelių reguliavimas yra susijęs su receptoriaus C-galo ilgiu ir kad C-galo inžinerija gali tiksliai valdyti ligando vartojimo mastą ir kryptį. Šie atradimai nustato projektavimo taisykles, kaip gaminti pritaikytus kanalus su ligandu sintetinėje biologijoje.

Įvadas

Ligandu sujungti jonų kanalai arba jonotropiniai receptoriai sudaro specifinę jonų kanalų šeimą, kuriai būdingi dideli tarpląsteliniai ligandą surišantys domenai, fiziškai ir funkciškai sujungti su transmembraninėmis poromis. Jie vaidina svarbų vaidmenį atliekant daugybę fiziologinių funkcijų, perkeldami tarpląstelinius biocheminius pranešimus į elektrinį signalą, moduliuodami membranos potencialą. Stuburinių LGIC šeima yra padalinta į pogrupius pagal jų sekų panašumą ir vėliau pagal jų specifiškumą endogeniniams ligandams. C-ciklo pogrupio nariai atpažįsta γ-aminobutano rūgšties (GABA), glicino (Gly), serotonino, acetilcholino ir cinko ligas, o glutamatas ir ATP atpažįstami atitinkamai pagal gliutamatą ir P2X receptorius. Atradus bestuburius LGIC, tokius kaip nematodas GluCl 1, 2, jonų kanalų, gautų iš gliutamato, jonų selektyvumas padidėjo iki Cl -, o prokariotiniai LGIC išplėtė endogeninio tarpląstelinio ligando repertuarą iki protonų 3, 4 . Šių prokariotinių LGIC vaidmuo vienaląsčiuose organizmuose dar nėra aiškiai suprantamas. Stuburiniuose gyvūnuose suaktyvinus anijoninius LGIC, tokius kaip GABA A ir glicino receptorius, susidaro vidinis chlorido jonų srautas, hiperpolarizuojamas ląstelė ir slopinamas veikimo potencialo perdavimas nervų sistemoje, o katijoninių LGIC aktyvacija depoliarizuoja ląstelę, kad ji galėtų skleisti veikimo potencialą. . Katijoninių LGIC jonų selektyvumas yra ne toks griežtas kaip anijoninių, nes jie yra pralaidūs tiek Na +, tiek K +, o kai kuriems - Ca 2+ . Mūsų žiniomis, pranešta apie tik vieną selektyvųjį kalio LGIC - prokariotinį glutamato receptorių GluR0 iš Synechocystis 5 .

Pradiniu tikslu suprojektuoti universalius įvairių ligandų biosensorius, sukūrėme dirbtinius LGIC, sulydydami metabolitus (G baltymų sujungtus receptorius, GPCR) su žinduolių kalio selektyviu kanalu (Kir6.2). Šiuose sulietuose baltymuose, vadinamuose su jonų kanalų sujungtais receptoriais (ICCR), Kir6.2 vartojimas kontroliuojamas GPCR konformaciniais pokyčiais, kai jie jungiasi su ligandu. ICCR ne tik gali išplėsti pripažintų ligandų specifiškumą dideliame GPCR ligandų repertuare, bet ir pasižymi kalio selektyvumu per Kir6.2. Kir6.2 yra poras formuojantis natūralių ATP jautrių kalio (K ATP ) kanalų subvienetas, sudarytas iš homotetramerinių Kir6.2 porų, apsuptų keturių sulfonilkarbamido receptorių (SUR). Tie kanalai veikia kaip ląstelės metaboliniai jutikliai, paversdami tarpląstelinio ADP / ATP santykio pokyčius membranos potencialo pokyčiais. „Kir6.2“ yra ląstelių ATP slopinamosios ribojimo vietos ir ICCR viduje rodo šimto mikromolių 6 intervale esančią IC50, sukeliančią iš dalies atidarytą kanalą ramybės būsenoje ląstelinėje aplinkoje. Šis bazinis aktyvumas leidžia stebėti kanalo uždarymą ar atidarymą, kurį sukelia GPCR ligadai. Šie du priešingi reglamentai buvo pastebėti pirmuosiuose ICCR, sudarytuose iš žmogaus Makarino M2 receptorių, kurie atidarė kanalą esant acetilcholinui, arba žmogaus dopaminerginių D2 L receptorių (D2), kurie uždarė kanalą esant dopamino 6 ( 1a pav.). Šio darbo tikslas buvo suprasti, kaip šie du receptoriai iš to paties GPCR pošeimio (A klasė) ir, pageidautina, sujungti su tais pačiais heterotrimeriniais G baltymais (Gi / o), priima agonistą kanalų nukreipimą priešingomis kryptimis. - apribota būsena.

Image

( a ) Dirbtiniai jonų kanalais sujungti receptoriai sukuriami suliejus Kir6.2 N-galą su C baltymo sujungtų receptorių (GPCR) C-galu. Rodomas tik vienas pilno ilgio subvienetas ir antrojo subvieneto kanalas. M2 ICCRS agonistai padidina Kir6.2 reguliavimą, o D2 ICCR - žemyn. Išorės: tarpląstelinė pusė, Mb: membrana, cito: citoplazminė pusė. ( b ) M2 ir D2 receptorių C-galų suderinimas.

Visas dydis

Norėdami išspręsti šį klausimą, mes postuluojame, kad M2 ir D2 receptoriai patiria panašius agonistų sukeltus konformacijos pokyčius, kaip pastebėta keliose A klasės GPCR kristalografinėse struktūrose jų aktyviose būsenose 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ir iškėlė hipotezę, kad sekos skirtumai ICCR regione, jungiančiame receptorius ir kanalą, turėjo įtakos receptoriaus tarpininkaujant Kir6.2 vartai. M2 ir D2 C-galų suderinimas rodo, kad M2 C-galas yra 9 likučiais ilgesnis nei D2 C-galas (1b pav.). Taikydami baltymų inžinerijos metodą, mes ištyrėme, ar šis GPCR C-galo ilgio skirtumas yra susijęs su priešingu Kir6.2 vartelių reguliavimu.

Rezultatai ne tik parodo GPCR C-galų vaidmenį reguliuojant vartojimą, bet ir apibūdina priemones, kaip suderinti GPCR tiksliai suderinti Kir6.2 vartojimą. Mūsų darbas parodo, kad dirbtiniai kalio selektyvieji LGIC gali būti sukonstruoti taip, kad užtikrintų reguliuojamą ir įvairiapusį natūralių ligandų atsaką ir atvertų kelią naujoms sintetinės biologijos taikymo sritims.

Rezultatai

Kir6.2 nukreipimo reguliavimas apverstas sumažinant M2 C galą

Norėdami nustatyti, ar M2 ir D2 C galų skirtumas yra susijęs su priešingu kanalo nukreipimo reguliavimu, pirmiausia pašalinome paskutinius 9 M2 receptoriaus likučius, kad jie atitiktų D2 C galo ilgį (2a pav.). Mes panaudojome šią nomenklatūrą: M2 = K-9-25 žymi M2 ir Kir6.2 (K) susiliejimą ištrynus paskutinius 9 liekanų C2 galus M2 ir išbraukus pirmuosius 25 liekanas iš N- Kir6.2 galas.

Image

( a ) M2 = K0-25 reiškia 0 liekanų, išbrauktų iš M2 C galo, ir 25 liekanų, išbrauktų iš Kir6.2 N-galo. Diagramoje parodytas reprezentatyvus dviejų elektrodų įtampos spaustuko (TEVC) ICCR, heterologiškai išreikšto Xenopus oocitais, esant –50 mV, simetriškos K + koncentracijos. ACh: 5 μM acetilcholino. Ba 2 + (3 mM) yra kalio kanalų blokatorius. 9 liekanų ištrynimas M2 C gale (M2 = K-9-25) apvertė kanalo reguliavimą. b ) bazinės srovės, parodančios reikšmingą muskarininių ICCR išraišką. Histograma rodo vidurkį ± sem su eksperimentų skaičiumi virš juostų. * rodo reikšmingą skirtumą (P <10 –9 ) nuo neįšvirkštų oocitų. c ) 5 μM ACh sukeltos srovės amplitudės vidurkis%. Teigiamos ir neigiamos vertės atspindi kanalo atidarymą ir uždarymą. M2 + Kir6.2Δ: M2 ekspresija kartu su Kir6.2, apipjaustytais paskutiniais 36 likučiais. Skaičius virš juostų = eksperimentų skaičius (n). *: reikšmingas skirtumas (P < 10–7 ) nuo M2 + KΔ. d ) MTP = K0-25 (kontrolinis) ir M2 = K-9-25 ATP koncentracijos ir efekto kreivės, gaunamos didinant ATP koncentracijas citoplazminiuose iškirptų vidinių pleistrų paviršiuose. ATP yra endogeninis kanalo blokatorius, tiesiogiai jungiantis su Kir6.2.

Visas dydis

Funkcinis apibūdinimas buvo atliktas naudojant dviejų elektrodų įtampos spaustuką (TEVC) Xenopus oocitams, heterologiškai išreiškiantiems ICCR. Mes panaudojome bazinę srovę, kurią generuoja sulietas Kir6.2, kaip M2 = K-9-25 išraiškos plazmos membranoje reporterį. 2b paveiksle parodyta 16 kartų didesnė bazinė srovė, kai M2 = K-9-25, nei neinjekuotų oocitų, rodančių reikšmingą ICCR paviršiaus išraišką. Norėdami įvertinti Kir6.2 reguliavimą C-gale sutrumpintu M2, mes ištyrėme ICCR reakciją į 5 μM acetilcholino (ACh), endogeninio M2 agonisto, taikymą. TEVC įrašai M2 = K-9-25 aiškiai parodė, kad ACh sumažino Kir6.2 kanalo aktyvumą, o viso ilgio M2 turinčio ICCR (M2 = K0-25) padidino (2c pav.). Taigi paskutinių 9 M2 likučių sutrumpinimas apvertė vartelių reguliavimą. M2 C-galo vaidmuo yra tiesioginis, vykstant konformacijos pokyčiams iš M2 ligandą rišančios vietos į Kir6.2 vartus (-us), arba netiesioginis, turintis įtakos dviejų sulydytų baltymų ar jų vidiniam aktyvumui. sąveika ne linkerio regione.

Norėdami ištirti pastarąją hipotezę, mes kontroliavome vidinį dviejų sulietų baltymų aktyvumą išmatuodami Kir6.2 ATP jautrumą ir G baltymų aktyvaciją M2.

Kir6.2 yra blokuojamas tarpląstelinio ATP, kurio IC50 yra ~ 100 μM, kai jis išreikštas atskirai 21 arba ICCR 6 . ATP jautrumas yra patikimas Kir6.2 aktyvumo rodiklis, nes vartelių pokyčiai daro įtaką akivaizdžiam giminingumui ATP. Naudodamiesi vidinio tvirtinimo spaustuku metodu, mes išmatuojome M2 = K-9-25 ATP koncentracijos ir poveikio santykį ir nustatėme, kad jis yra identiškas M2 = K0-25 (2d pav.), Parodydamas, kad M2 C-galas neturi įtakos „Kir6.2“ atitvaros savybėms.

Norėdami įvertinti sutrumpinto M2 receptoriaus aktyvumą, mes panaudojome Kir3 kanalus kaip Gi / o baltymų aktyvavimo pranešėjus (3a pav.). Fiziologiškai neuromediatoriaus ACh prisijungimas prie M2 receptorių suaktyvina heterotrimerinius Gi / o baltymus, dėl kurių Gβ subvienetai suaktyvina G baltymų suaktyvintus kalio kanalus (Kir3). Mes kartu išreiškėme M2 = K-9-25 su mutavusiu Kir3 kanalu (Kir3.4 *), galinčiu sudaryti aukšto aktyvumo homotetramerius 22 . Kadangi Kir3.4 * kanalai rodo didesnę bazinę srovę (> 2 kartus) nei lydytoji Kir6.2, užfiksuotą kalio srovės pokytį daugiausia sukelia Kir3 kanalai ir aiškiai pranešama apie baltymų suaktyvinimą. Pritaikius 5 μM karbacholį (CCh), sintetinį muskarininį ligandą, aiškiai suaktyvintą Kir3.4 * (3b pav.), Parodantį, kad ICCR viduje sutrumpintas M2 receptorius išlaiko gebėjimą suaktyvinti baltymus. Kaip ir tikėtasi, Kir3.4 * aktyvaciją panaikina M2 antagonistas atropinas. Šie rezultatai rodo, kad M2 gebėjimas surišti ligandus ir suaktyvinti G baltymus nepablogina jo C-galo sutrumpinimas ICCR.

Image

a ) G baltymo aktyvacijos Xenopus oocituose funkcinio tyrimo schema, naudojant G baltymo aktyvuotus Kir3 kanalus. mRNR, koduojanti ICCR ir Kir3 kanalą, kartu suleidžiama Xenopus oocituose. Acetilcholino surišimas su M2 aktyvina endogeninius Gi / o baltymus. Išleidus Gβγ subvienetus, atsidaro Kir3 kanalai. Kir3 kanalų generuojama srovė yra kelis kartus didesnė už srovę, kurią sukuria Kir6.2 ICCR, slopinantis agonisto poveikis M2 = K-9-25 yra maskuojamas aktyvinančiu poveikiu Kir3. b ) Reprezentatyvus TEVC užfiksavimas iš oocito, kartu išreiškiančių M2 = K-9-25 ir Kir3.4 *, parodantis Kir3 kanalų aktyvaciją karbacholiu (CCh, 5 μM) (mėlyna rodyklė) ir antagonistinį 1 μM atropino poveikį. (raudona rodyklė). c ) vidutinis srovės pokytis, kurį sukelia 5 μM CCh (mėlyna juosta) ir 5 μM CCh + 1 μM atropinas (raudona juosta). *: P = 4, 10 −3 tarp dviejų juostų. n = 4.

Visas dydis

Todėl vidinis Kir6.2 ir M2 aktyvumas nepasikeičia M2 = K-9-25. Šie rezultatai patvirtina hipotezę apie tiesioginį M2 C-galo vaidmenį vartant atvirkščiai.

Išplečiant D2 C galą, vartai taip pat apverčiami

Norėdami patvirtinti GPCR C-galo vaidmenį reguliuojant Kir6.2 vartelius, suprojektavome grįžtamąjį konstrukciją, išplėsdami D2 C-galą su paskutiniais 9 M2 likučiais (D2 = K + 9 M2 -25) (pav. .4a). D2 = K + 9M2-25 paviršiaus išraiškos nebuvo galima aptikti, bazinė srovė buvo panaši į neįšvirkštų oocitų (4b pav.). Šis paviršiaus ekspresijos trūkumas jau buvo pastebėtas naudojant β2-adrenerginius 23 ir opsino 24 ICCR ir buvo išspręstas kartu išreiškiant sulfonilkarbamido receptoriaus SUR1 25 pirmąjį transmembraninį domeną (TMD0), kuris spontaniškai sąveikauja su Kir6.2. Jei D2 = K + 9 M2 -25, bendra raiška su TMD0 taip pat padidino jo paviršiaus išraišką, padidindama 8 kartus didesnę vidutinę bazinės srovės amplitudę (4b pav.), Leidžiančią apibūdinti jo funkcinę savybę.

Image

( a ) D2 = K0-25 yra slopinamas 5 μM dopamino (Dopa). D2 = K + 9M2-25 turi prailgintą D2 C galą, kuriame yra paskutiniai 9 M2 likučiai, ir yra aktyvinamas 5 μM dopamino. Pirmasis SUR1 transmembraninis domenas (TMD0) yra ekspresuojamas kartu, siekiant padidinti ICCR paviršiaus išraišką. ( b ) Dopaminerginių ICCR bazinės srovės rodo D2 = K + 9M2-25 paviršiaus išraiškos trūkumą. Bendra ekspresija su SUR1 (TMD0) N-galo transmembraniniu domenu atkuria paviršiaus ekspresiją. Pažymėtas išplėstas D2 C-galas su 9 alaninais D2 = K + 9Ala-25, o su 9 C-galo liekanomis iš žmogaus β2 adrenerginio receptoriaus pažymėta D2 = K + 9β2-25. *: palyginti su nešvirkštu P <0, 02; ns (nereikšmingas) P = 6, 10 −2 . c ) 5 μM dopamino sukeltos srovės amplitudės vidurkis%. *: P <10 –3 (nuoroda: D2 + K∆). d ) Žmogaus receptorių M2 (mėlynas), D2 (žalias) ir β2 adrenerginių (rudų) receptorių C-galų seka suderinimas. VIII spiralės padėtis parodyta virš sekų, o galiniai cisteinai yra sunumeruoti ir pavaizduoti palmitoilinti. Iš dalies pateiktas ilgas β2 adrenerginio receptoriaus C galas. Apatiniame skydelyje parodyti 3 skirtingi D2 C galo išplėtimai. e ) D2 = K + 9M2-25 + Kir3.4 * TEVC registravimas, parodantis D2 sąlygojamą Kir3.4 * kanalo aktyvaciją 5 μM dopaminu (žalia rodyklė) ir antagonizmą (raudona rodyklė) 5 μM sulpiridu. f ) vidutinis srovės pokytis, kurį sukelia 5 μM dopaminas (žalia juosta) ir 5 μM dopaminas + 5 μM sulpiridas (raudona juosta) D2 = K + 9M2-25 + Kir3.4 *. * P = 9, 10 –3 tarp dviejų juostų. n = 6.

Visas dydis

Norėdami įvertinti Kir6.2 reguliavimą C-gale išplėstu D2 receptoriumi, mes ištyrėme endogeninio agonisto dopamino poveikį Xenopus oocitams, kurie kartu išreiškia D2 = K + 9 M2 -25 ir TMD0. Pastebėjome, kad pailgintą dopaminerginį ICCR gali suaktyvinti agonistas, tai rodo, kad vartai atvirkščiai įvyko ir abipusiai (4c pav.). Norėdami patvirtinti, kad šį poveikį lemia C-galo ilgis, o ne įterptų aminorūgščių pobūdis, mes pakeitėme M2 C-galinę seką 9 alaninais (D2 = K + 9 Ala -25) arba 9 liekanomis iš β2-adrenerginio receptoriaus C galo (D2 = K + 9 β2 -25, suderinimas parodytas 4d pav.). Abiem konstruktams kanalas buvo aktyvuotas dopaminu tomis pačiomis amplitudėmis, kaip ir stebint D2 = K + 9 M2 -25 (4c pav.). Šie rezultatai patvirtina, kad vartai atvirkščiai atsiranda dėl D2 turinčių ICCR C-termino išplėtimo nepriklausomai nuo sekos.

Kalbant apie modifikuotą M2 pagrindu pagamintą ICCR, mes taip pat kontroliavome, ar D2 receptoriaus aktyvumui nedaro įtakos jo C-galo prailginimas, naudojant D2 = K + 9 M2 -25 kartu su G baltymų aktyvuota Kir3.4 *. kanalą. Kir3.4 * aktyvinimas dopaminu ir jo antagonizmas D2 antagonisto sulpirido būdu patvirtino išplėstinio receptoriaus funkcinį vientisumą D2 = K + 9 M2 -25 (4e pav., F).

Taigi, permutuodami M2 ir D2 C-galus, vartai buvo apversti nepažeidžiant vidinės receptorių ir kanalo veiklos.

Reguliuojamoji dalis neturi įtakos ICCR farmakologinėms savybėms

Mes taip pat kontroliavome, kad nepakeistos modifikuotų ICCR, rodančių atvirkštinį vartojimą, farmakologinės savybės. Kaip parodyta anksčiau, inžineriniai ICCR išlaikė savo jautrumą konkurencingiems antagonistams (5a – f pav.). Be to, inžinerinių ICCR priklausomybė nuo ligando koncentracijos buvo įvertinta nuosekliai didinant agonistų koncentraciją vienkartiniuose Xenopus oocituose ir pakartojant skirtinguose oocituose iš skirtingų partijų. Mes pastebėjome, kad ICCR vis dar rodo nuo ligando koncentracijos priklausomą signalą, net jei kanalo nukreipimas yra apverstas (5g pav., H). Įdomu tai, kad GPCR C-galų modifikavimas reikšmingai nepakeitė akivaizdaus afiniteto agonistams. Tai rodo, kad GPCR C-galo ilgio modifikavimas nepakeičia ligando surišimo savybių ir vėlesnių GPCR agonistų sukeltų konformacinių pokyčių.

Image

( a ) M2 = K-9-25 ICCR schema. b ) Tipinis M2 = K-9-25 TEVC registravimas, rodantis 5 μM ACh sukeltą slopinimą (mėlyna rodyklė) ir 1 μM atropino antagonistinį poveikį (raudona rodyklė). c ) Vidutinis srovės pokytis, kurį sukelia ACh 5 μM (mėlyna spalva) ir ACh 5 μM + 1 μM atropinas (raudona spalva) oocituose, išreiškiančiuose M2 = K-9-25. *: P = 3, 10 −4 (nuoroda: Ach). n = 8. ( d ) D2 = K + 9M2-25 ICCR diagrama. e ) TEVC įrašas, parodantis D2 = K + 9M2-25 + TMD0 aktyvavimą 5 μM dopamino (žalia rodyklė) ir jo antagonizmą (raudona rodyklė) 5 μM sulpirido. f ) Vidutinis dopamino ir sulpirido poveikis D2 = K + 9M2-25 + TMD0. *: P = 1, 10 −3 (nuoroda: dopaminas). n = 5. g ) Nurodytų konstrukcijų karbacholio (CCh) koncentracijos ir efekto kreivė. Kiekvienas taškas yra vidutiniškai nuo 8 iki 23 matavimų. h ) nurodytų konstruktų dopamino koncentracijos ir efekto kreivės. n = 4.

Visas dydis

Tvirtinimo amplitudė ir ženklas koreliuoja su M2 C galo ilgiu

Ištrynus ar pridedant 9 likučius GPCR C terminale, visiškai pasikeičia vartelių reguliavimas, patvirtinantis šios srities svarbų vaidmenį kanalo reguliavime. Tačiau susiję molekuliniai mechanizmai nėra tiksliai nustatyti. Norėdami toliau tirti GPCR C-galo vaidmenį atliekant vienos likučio skiriamąją gebą, mes laipsniškai sutrumpinome M2 C-galo liekaną nuo liekanų nuo 0 iki -9 (6a pav.). Šis metodas galėtų suteikti nuorodų apie šios srities antrines struktūras, kurios neišspręstos paskelbtose M2 kristalų struktūrose 17, 26 . 3-4 likučių arba 2 likučių periodiškumas parodytų, kad yra atitinkamai α-spiralė arba β-lapas.

Image

( a ) M2 = K ICCR suliejimo zonos sekos su didėjančiomis delecijomis M2 C gale (mėlyna spalva). ( b ) Išskyrus 2 išimtis, visi M2 C gale sutrumpinti ICCR yra ekspresuojami į oocito plazmos membraną. ŠD: Nenustatyta dėl jų genų inžinerijos nesėkmės. *: reikšmingai išreikštas, palyginti su neįšvirkštais oocitais P <10 –2 . c ) Vidutinis 5 μM ACh poveikis kiekvienam konstruktui. Aktyvacija teigiama, slopinimas neigiamas. Kiekvienas taškas buvo nustatytas iš 8 ar daugiau eksperimentų. Punktyrinė linija parodo geriausią tiesinės koreliacijos atitikimą.

Visas dydis

Išskyrus konstrukcijas M2 = K-4-25 ir M2 = K-8-25, kurių nepavyko gauti nepaisant intensyvių pastangų, visi sutrumpinti ICCR buvo inžineriniai ir jų paviršiaus išraiška buvo pakankama funkciniam apibūdinimui (6b pav.).

Kanalo reakcija į sutrumpintus ICCR buvo įvertinta naudojant 5 μM ACh. Laipsniškas M2 C-galo sutrumpinimas sąlygojo laipsnišką ligando sukelto atsako evoliuciją žemyn nuo atidarymo iki uždarymo, kuris sekė tiesine tendencija (6c pav.). Šis stebėjimas, nepateikiantis jokių antrinių struktūrų įrodymų, patvirtino tiesioginį receptoriaus C-galo ilgio poveikį Kir6.2 gaubtui. Palaipsniui keičiant vartelius, receptorių reikia pakeisti iš naujo, atsižvelgiant į Kir6.2, nuo optimalios atidarymo padėties iki optimalios padėties jį uždaryti.

Diskusija

Pradinis šio tyrimo tikslas buvo nustatyti molekulinius determinantus, kurie yra priešingos Kir6.2 atotrūkio reguliavimo kilmę iš sulydytų M2 ir D2 receptorių. Sukeisdami M2 ir D2 C galus, sukūrėme jonų kanalus apverstu GPCR sukeltu reguliavimu. Taigi tas pats receptorius gali reguliuoti jonų kanalą priešinga kryptimi, kai yra sukonstruotas jo C-galas. Modifikuoti receptoriai suaktyvina G baltymus, nurodydami, kad C-galo modifikacijos neturi įtakos ligando sukeltiems konformacijos pokyčiams. Todėl priešingas jonų kanalo reguliavimas yra susijęs ne su skirtingais receptorių konformaciniais pokyčiais, bet su receptoriaus C galo ilgiu. Stebint tiesinę koreliaciją tarp M2 C-galo ilgio ir kanalo reguliavimo, iškelta hipotezė, kad progresyvūs M2 C-galo sutrumpinimai priartina du baltymus ir perorientuoja receptorius. Švytuoklės tarp ligandu suaktyvintų ir slopinamų konstrukcijų buvimas rodo, kad receptorius pasislenka aplink tam tikrą padėtį, priklausomai nuo GPCR C galo ilgio. Receptoriai, turintys ilgą C galą, užimtų padėtį jonų kanalo atžvilgiu, sukeldami atsivėrimą, kai jungiasi ligandas, o receptoriai, turintys trumpą C galą, pakeistų savo padėtį ir sukeltų uždarymą. Papildomame paveiksle S1 pavaizduota, kaip receptoriai su panašiais konformacijos pokyčiais gali generuoti priešingą sulydyto jonų kanalo reguliavimą.

Šis darbas atskleidė vyraujantį GPCR C-terminalo vaidmenį reguliuojant Kir6.2 vartojimą per ICCR. Tai taip pat parodė, kaip tiksliai sureguliuoti Kir6.2 nukreipimą, atsižvelgiant į reguliavimo amplitudę ir kryptį, modifikuojant keletą liekanų M2 ir D2 receptorių C gale. Originalios šių dirbtinių LGIC taikymo sritys yra numatytos sintetinės biologijos srityje, ypač kuriant pritaikytas ląstelių reakcijas ir sumažinant sintetinių organizmų genomą.

Pritaikant ląstelių atsaką, šie inžineriniai ICCR yra dirbtiniai LGIC, galintys hiperpoliarizuoti arba depoliarizuoti ląstelės membraną skirtingomis amplitudėmis, reaguodami į endogeninius agonistus acetilcholiną ir dopaminą. Nors natūralūs LGIC greitai nukenčia, ICCR atsakas išlieka keletą minučių. Fiziologinėmis sąlygomis M2 ir D2 aktyvacija endogeninių ligandų sukelia hiperpolarizaciją, kurią sukelia G baltymų suaktyvinti Kir3 kanalai. Agonistų blokuoti M2 ir D2 ICCR gali būti naudojami šiam atsakymui apversti, nes jie suteikia galimybę depoliarizuoti ląstelės membraną endogeninių ligandų arba egzogeninių farmakologinių agonistų pagalba. ICCR yra nepriklausomi nuo ląstelių signalizacijos 27, jie geba modifikuoti bet kurios ląstelės, turinčios skirtingą G baltymo potipių ekspresijos modelį, membraninį potencialą ir net neturi G baltymų ekspresijos. ICCR taip pat galėtų būti naudojamas atkurti K + įsisavinimą tokiose ląstelėse kaip Saccharomyces cerevisiae kamienas, kuriame nėra K + pernešėjo Trk1p ir Trk2p. Išimtis yra prokariotinės ląstelės, kuriose nėra fosfatidilinozitolio 4, 5-bisfosfato (PIP2) lipido, reikalingo žinduolių Kir kanalų, tokių kaip Kir6.2, aktyvumui. Egzogeniniai arba modifikuoti membranos baltymai plazmos membranoje dažnai būna prastai ekspresuojami. Kai kuriose ląstelėse dėl ICCR ekspresijos paviršiuje gali reikėti ištrinti endoplazminio retikulumo susilaikymo signalą kanalo C gale (nuo 26C26 iki ΔC36) 21, 29, 30 . Šis manevras nebuvo būtinas Xenopus oocituose, išskyrus ICCR, turinčius inžinerinę trečiąją tarpląstelinę kilpą, užimančią G baltymų jungimosi vietą 27, 31 .

Norint sumažinti fono K + sroves ir padidinti ICCR generuojamo srovės pokyčio amplitudę, optimalios sąlygos būtų sintetinės biologijos sistemos, suprojektuotos be endogeninių K + kanalų. Tačiau nuotėkio kalio kanalai yra gyvybiškai svarbūs daugybei ląstelių, kad būtų išlaikytas neigiamas ramybės membranos potencialas. Tokiose ląstelėse ICCR raiška kaip unikalūs kalio kanalai yra įmanoma dėl susiliejusio Kir6.2 bazinio aktyvumo, kuris pakeičia endogeninių nuotėkio kanalų aktyvumą.

Išvada

Šis tyrimas parodo M2 ir D2 C-galo ilgio vaidmenį reguliuojant Kir6.2 vartą ICCR. Jame pateikiamos instrukcijos, kaip tiksliai sureguliuoti kanalą, kad būtų galima sureguliuoti M2 ir D2 agonistų sukelto reguliavimo amplitudę ir ženklą. Todėl šie dirbtiniai ligandų turimi jonų kanalai yra unikali priemonė sintetinės biologijos taikymui chemogenetikoje 32, pasižyminti kalio selektyvumo savybėmis, tarpląstelinės signalizacijos nepriklausomumu ir atvirkštiniu signalu į fiziologines sąlygas.

Metodai

Medžiagos

Visos cheminės medžiagos buvo įsigytos iš „Sigma-Aldrich“. Pradiniai tirpalai buvo: acetilcholino chloridas 5 mM (vanduo); karbacholio chloridas 250 mM (vanduo); atropinas 1 mM (etanolis); dopamino hidrochloridas 5 mM (vanduo); (S) - (-) - 5 mM sulpirido (DMSO).

Genetinė inžinerija

Visi genai buvo iš pGEMHE gautų vektorių, optimizuotų baltymų ekspresijai Xenopus oocituose. Šablonas M2 = K0-25 ir D2 = K0-25 buvo sukurtas ankstesniame tyrime naudojant dviejų pakopų PGR, kaip anksčiau aprašyta 6, 31 . M2 C-galo sutrumpinimai buvo atlikti vienpakopiu PGR su QuikChange į vietą nukreipto mutagenezės rinkiniu (Agilent), naudojant pradmenis, persidengiančius išbraukta seka. D2 C-galo prailginimui asimetriniai pradmenys buvo suprojektuoti kaip hibridinės sekos su įterpta seka (M2 C-galas) 5 ′, o šablono seka 3 ′ 33 teigiamuose klonuose buvo patikrinta sekos nustatymu. DNR buvo amplifikuota naudojant „Qiagen MidiPrep Kit“, linearizuota 3A poliA uodegos srityje, išgryninta standartiniu fenolio: chloroformo ekstrakcija ir perrašyta mRNR, naudojant „T7 mMessage mMachine Kit“ („Thermo Fisher Scientific“). mRNR buvo išgrynintos naudojant klasikinį fenolio: chloroformo protokolą, išanalizuotos agarozės-gelio elektroforezės būdu ir kiekybiškai įvertintos spektrofotometrijos metodu 34 . Tie patys protokolai buvo naudojami žiurkėno TMD0 (SUR1) -F195 25 ir mutavusio kanalo Kir3.4 S143T, pažymėto Kir3.4 * 22, atvejais .

Elektrofiziologiniai įrašai

Ksenopo oocitai buvo paruošti, kaip anksčiau buvo pranešta 6, 31 . Elgesys su gyvūnais ir eksperimentai visiškai atitiko Europos reglamentus ir buvo patvirtinti Komisijos komisariato etikos komiteto „Atomique et aux Energies Alternatives“ (etikos patvirtinimas Nr. 12-040 CJM). Pašarų prefektas išdavė leidimą gyvūnų laikymo vietai (leidimas Nr. D 38 185 10 001).

Trumpai tariant, po chirurginio tyrimo oocitai defolikuliuojami pagal 1 A tipo kolagenazę. Kiekvienam oocitui buvo įšvirkšta 50 nl vandens, be RNazės, kuriame yra norimos mRNR. Vienam oocitui sunaudoti kiekiai buvo: ICCR 4, 3 ng, TMD0 1 ng, Kir3, 4 * 2, 5 ng. Mikroinjektuoti oocitai buvo inkubuojami daugiau nei 2 dienas 19 ° C temperatūroje Barth'o tirpale (mM: 1 KCl, 0, 82 MgSO 4, 88 NaCl, 2, 4 NaHCO 3, 0, 41 CaCl2, 16 Hepes, pH 7, 4), papildyta 100 U. .ml −1 penicilino ir streptomicino ir 0, 1 mg.ml −1 gentamicino. Visų ląstelių srovės buvo užfiksuotos dviejų elektrodų įtampos gnybtu (TEVC) metodu. Mikroelektrodai buvo užpildyti 3 M KCl, o oocitai buvo malami tokiu tirpalu (TEVC vonia, mM): 91 KCl, 1, 8 CaCl 2, 1 MgCl 2, 5 HEPES, 0, 3 nifluminė rūgštis (siekiant blokuoti endogenines Cl sroves), pH. 7.4. TEVC įtampos protokolą sudarė 500 ms žingsniai iki -50, 0 ir + 50 mV, per kuriuos buvo matuojama srovė, atskirtas 5 s, esant 0 mV laikymo potencialui. Paveiksluose parodytos vertės, įrašytos esant –50 mV.

Vidutinės vertės pateikiamos kaip vidurkis ± sem Ba 2+ (3 mM) buvo naudojamas kaip bendras kalio kanalų blokatorius kalio srovių amplitudėms nustatyti. Ligando sukeltas kalio srovės pokytis buvo apskaičiuotas kaip bazinė srovė.

Atliekant ekscizinius vidinius išorinius pleistrų spaustukus, eksperimentai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau 35, esant simetriškai K + koncentracijai (150 mM) ir esant –50 mV.

Neigiama kontrolė buvo atlikta su nekondensuotais baltymais M2 + KΔC36 ir D2 + KΔC36. Šiose kontrolėse Kir6.2 buvo apipjaustytas paskutiniais 36 likučiais (KΔC36), kad būtų pašalintas žinomas endoplazminio retikulumo susilaikymo signalas ir būtų galima vien kanalo paviršiuje ekspresuoti 21 .

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Moreau, CJ ir kt . Derinant allosterinį dirbtinių muskarininių ir dopaminerginių kalio kanalų, gautų iš ligandų, reguliavimą, baltymų inžinerijos būdu sujungiant receptorius, susijusius su G baltymais. Mokslas. Rep. 7, 41154; „doi“: 10.1038 / srep41154 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.