Tiropeptinai, proteasomų inhibitoriai, kuriuos gamina kitasatospora sp. mk993-df2 | žurnalas apie antibiotikus

Tiropeptinai, proteasomų inhibitoriai, kuriuos gamina kitasatospora sp. mk993-df2 | žurnalas apie antibiotikus

Anonim

Dalykai

  • Tikslinė terapija

Anotacija

Tiropeptinai yra nauji proteasomų inhibitoriai, išskirti iš Kitasatospora sp. MK993-dF2. Tiropeptinai prasiskverbia pro ląstelių membranas, slopina tarpląstelines proteasomas ir mažina visur esančių baltymų skilimą žinduolių ląstelėse. Norėdami gauti vertingos informacijos apie darinius, atlikome tiropeptino darinių struktūros pagrindu sukurtus vaistus ir struktūros bei aktyvumo ryšius. Tarp susintetintų tiropeptino darinių kai kurie boro rūgšties dariniai turėjo stiprų priešnavikinį poveikį žmogaus išsėtinei mielomai. Šioje apžvalgoje apibendriname tiropeptinų atradimą ir tiropeptino darinių vystymąsi.

Įvadas

Ubiquitin – proteasomų sistema yra pagrindinė tarpląstelinių baltymų skilimo sistema eukariotų ląstelėse. Ši sistema selektyviai skaido trumpaamžius reguliavimo baltymus, susijusius su homeostatiniu ląstelių valdymu, taip pat nenormalius baltymus, kurių struktūros yra klaidingai sulankstytos. 1 Ubikvitino konjugacija su tiksliniais baltymais yra signalas, kad proteasoma skiltų. Baltymų sunaikinimas pradedamas kovalentiškai prijungiant ubiquitino grandinę (grandinę, apimančią daugiau nei keturis ubikvitino monomerus), atliekant nuoseklų baltymų tinklo, įskaitant E1 (ubikvititiną aktyvinantį), E2 (konjuguojantį ubikvitiną) ir E3 (ubikvititiną), veiksmus. liguojančius) fermentus, o po to polubikvitinti baltymai skaidomi 26S proteasomos. 2, 3 26S proteasoma yra neįprastai didelis multienzimas ir nuo ATP priklausomas proteolitinis kompleksas, kurį sudaro tuščiavidurė cilindrinė 20S proteolitinė šerdis (20S proteasoma) ir viena ar dvi 19S reguliuojančios dalelės (1 paveikslas). 4, 5, 6 polubiquitinuoti baltymai atpažįstami pagal 19S reguliuojančią dalelę, dedami į 20S proteasomos branduolį ir suskaidomi į mažus peptidus. 20S proteasomą sudaro 28 baltymų subvienetai ir jis yra išdėstytas kaip du išoriniai α žiedai ir du vidiniai β žiedai ašiniame krūvyje (ββα). Kiekvienas žiedas susideda iš septynių skirtingų subvienetų, sudarančių α 1–7 β 1–7 β 1–7 α 1–7 struktūrą. 20S proteasoma pasižymi trimis skirtingais proteazių aktyvumais: į kaspazę panašiais / peptidil-glutamilpeptido hidrolizės, į tripsiną ir į chimotripsiną panašiais aktyvumais, kuriuos skatina atitinkamai β1, β2 ir β5 subvienetų aktyviosios vietos. Visose aktyviose vietose yra N- galinis treoninas, kuris veikia kaip katalizinis nukleofilas peptidinių ryšių hidrolizėje. 7

Image

Scheminis proteasomos modelis.

Visas dydis

Proteasoma daro įtaką naviko augimui kontroliuodama reguliuojančių baltymų skilimą. Pavyzdžiui, proteasoma skaido baltymus, susijusius su ląstelių ciklo reguliavimu, tokius kaip ciklinai, nuo ciklino priklausomi kinazės inhibitoriai (pavyzdžiui, p21 ir p27), naviko slopintuvus (pavyzdžiui, p53) ir branduolio faktoriaus (NF) -KB inhibitorius ( pavyzdys, IκB-α). 8, 9, 10, 11 Iš tikrųjų, daug veiksmingų proteasomų inhibitorių, stabilizuojančių šiuos reguliuojančius baltymus, buvo sukurti 12, 13, 14, 15, 16 ir sukeliantys ląstelių ciklo sustojimą, endoplazminį retikulinį stresą ir apoptozę, taip slopindami naviko augimą. 17, 18 Tai daro proteasomą patraukliu taikiniu gydant vėžį, o proteasomų inhibitoriai yra perspektyvūs priešnavikiniai vaistai. 19, 20 Iš natūralių produktų buvo rasta keletas proteasomų inhibitorių. Laktacistinas, kurį atrado profesorius S Omura, iš pradžių buvo išskirtas iš Streptomyces sp. kaip naujas neurito augimo induktorius neuroblastomos ląstelėse. 21, 22 atlikti išsamūs jo veikimo mechanizmo tyrimai parodė, kad laktacistinas veikia kaip proteasomų inhibitorius. Be to, laktacistinas neensimematiškai hidrolizuojamas iki aktyvaus laktacistino analogo, klastolaktacistino β-laktono, vadinamo omuralidu. 24, 25, 26

Natūralūs mikrobų metabolitai dažnai pasižymi terapine veikla, kuri gali pagerinti bendrą sveikatą ir gali būti naudojama ligoms gydyti. Dėl didžiulės cheminės įvairovės jie yra viltingas narkotikų atradimo šaltinis. Umezawa ir Aoyagi iš mikrobų metabolitų išskyrė įvairius proteazės inhibitorius, tokius kaip leupeptinas, antipainas, pepstatinas ir chmostatinas. 27, 28 Taip pat mes ištyrėme naujus proteasomų (kelių proteazių komplekso) inhibitorius, gautus iš mikrobų metabolitų, ir iš aktinomicetų kultūros sultinio išskyrėme naujus proteasomų inhibitorius, vadinamus tiropeptinais. Šioje apžvalgoje mes pranešame apie tiropetinų atradimą ir tiropeptino darinių vystymąsi.

Tiropeptinų atradimas

2000 m. Tiropeptinai buvo rasti dirvožemio Actinomycete padermės MK993-dF2 kultūros sultinyje (2a paveikslas). 29 Taksonominiai tyrimai parodė, kad tiropeptiną gaminantis štamas MK993-dF2 yra glaudžiai susijęs su kitos, 30, 31, genties nariais, kuriuos profesorius Omura išskyrė kaip setamiciną (bafilomiziną B1) gaminančią bakteriją. Prognozuojama, kad „ Kitasatospora setae NBRC 14216 T“, priklausanti „ Kitasatospora“ genčiai, turės 24 genus arba genų grupes, dalyvaujančius antrinių metabolitų biosintezėje. 32 Todėl Kitasatospora yra gerai žinoma kaip svarbi gentis tiriant antrinius metabolitus. Nors Kitasatospora gentis morfologiškai yra labai panaši į Streptomyces gentį, jas galima atskirti pagal ląstelių sienelių sudėtį ir 16S rDNR seką. Kadangi MK993-dF2 padermė parodė taksonomines „ Kitasatospora“ genties savybes, ji buvo klasifikuojama kaip tos genties narė, o štamas buvo pažymėtas „ Kitasatospora sp. MK993-dF2.

Image

A ir B tiropeptinai. A) Kitasatospora sp. MK993-dF2. b ) A ir B tiropeptinų struktūros. c ) A tiropeptino alkoholio dariniai.

Visas dydis

Tiropeptinai A ir B buvo išgryninti iš kitoatospora sp. MK993-dF2, naudojant įvairių tipų kolonėlių chromatografiją (2b paveikslas). Tiropeptinų struktūros buvo nustatytos naudojant spektroskopinę analizę ir cheminę konversiją. Tiroptinai, naudodami plonasluoksnę chromatografiją, teigiamai reaguoja su Rydon HN ir Smith PWG reagentais, parodydami, kad yra peptidų jungčių. 34 Be to, tiropeptinai, naudojant plonasluoksnę chromatografiją, sukelia teigiamas spalvų reakcijas su 2, 4-dinitrofenilhidrazino reagentu, o tiropeptinų infraraudonieji spektrai rodo absorbcijos smailę 1730 cm – 1, rodantį, kad yra aldehido grupė. Tyropeptinų 1 H ir 13 C branduolio magnetinio rezonanso spektrai yra žymiai komplikuoti dėl epimerizacijos asimetriniame centre. Visi šie požymiai rodo, kad tiropeptinai yra peptido aldehido inhibitoriai. Todėl tiropetinus pavertėme jų alkoholio dariniais, kad gautume priskirtinus branduolinio magnetinio rezonanso spektrus (2c paveikslas). Aminorūgščių liekanų konfigūracija buvo nustatyta naudojant laisvųjų aminorūgščių, gautų tiropeptino – alkoholio darinių rūgštinėje hidrolizėje, skysčių chromatografijos / masės spektroskopijos analizę. Be to, buvo susintetinti tiropetinai, kad būtų galima patvirtinti jų struktūras. Sintetinių tiropeptinų spektroskopiniai duomenys ir proteasomas slopinantis aktyvumas yra tokie patys kaip natūralių tiropeptinų. Todėl tiropeptinų A ir B struktūros buvo atitinkamai sudarytos kaip izovaleril-L-tirozil-L-valil-DL-tirozinalios ir n- butiril-L-tirozil-L-leucil-DL-tirozinalinės.

Kaip minėjome anksčiau, 20S proteasoma turi tris skirtingus proteolitinius veiksmus: panašų į chimotripsiną, panašų į tripsiną ir į kaspazę. Panašus į chimotripsiną aktyvumas pirmiausia skaldo peptido amido ryšius po didelių hidrofobinių aminorūgščių liekanų (pavyzdžiui, tirozino, triptofano ir fenilalanino). Panašu, kad į tripsiną panašus aktyvumas skaido peptidinius ryšius po bazinių aminorūgščių (pavyzdžiui, lizino ir arginino), o į kaspazę panašus aktyvumas tradiciškai vadinamas „peptidil-glutamilo peptido hidrolazės aktyvumu“, nes jis pirmiausia skaido peptidinius ryšius po rūgščių liekanų. Peptidil-glutamilo peptido hidrolazės aktyvumas reiškia, kad asparto rūgšties liekanos suskaidomos greičiau nei po glutamo rūgšties liekanų, kas rodo, kad šis aktyvumas yra panašus į kaspazę. Tiropeptinų struktūros yra panašios į substratų, turinčių panašų į chimotripsiną, poveikį, todėl tiropeptinai A ir B stipriai slopina į 20S proteasomos chimotripsiną panašų aktyvumą, kai pusės maksimali slopinamoji koncentracija (IC 50 ) yra 0, 2 ir 0, 39 μM. atitinkamai (1 lentelė). Linijinio audėjo – Burko grafikai rodo, kad tiropeptinai konkurencingai slopina į chimotripsiną panašų aktyvumą. Proteasomų inhibitorius MG132, benziloksikarbonil-leucil-leucil-leucinalis, 35 slopina tris proteolitinės 20S proteolizės veiklas, tačiau tiropeptinai negali slopinti jo panašaus į tripsiną.

Pilno dydžio lentelė

Norėdami išsiaiškinti, ar tiropeptinas A prasiskverbia pro ląstelių membranas ir slopina tarpląstelinį proteasomų aktyvumą, mes ištyrėme tiropeptino A poveikį žiurkių feochromocitomos PC12 ląstelėms. Gydymas tiropeptinu aiškiai sumažino proteasomų aktyvumą PC12 ląstelėse ir padidino ubikvitintų baltymų, kaip endogeninių proteasomos substratų, kaupimąsi priklausomai nuo dozės. 36 Be to, tiropeptinas A sukėlė PC12 ląstelių neurito augimą, panašų į nervo augimo faktorių. Reikėtų pažymėti, kad proteasomų inhibitoriai, tokie kaip MG132 ir laktacistinas, taip pat sukelia neurito augimą PC12 ląstelėse. 35, 37 Šie pastebėjimai rodo, kad tiropeptinas A prasiskverbia į ląstelių membranas ir slopina PC12 ląstelių tarpląstelinį proteasominį aktyvumą.

Tiropeptino darinių projektavimas

Nors tiropeptinas A yra stiprus proteasomų inhibitorius, jo slopinamasis poveikis į 20S proteasomos chimotripsiną panašų aktyvumą yra silpnesnis nei MG132 (1 lentelė). Norėdami sustiprinti tiropeptino A slopinamąją galią, atlikome vaisto struktūrą. Tuo metu žmogaus 20S proteasomos kristalų struktūra dar nebuvo nustatyta; tačiau mielių ( Saccharomyces cerevisiae ) ir žinduolių (galvijų ir pelių) 20S proteasomų kristalų struktūra buvo žinoma. 38, 39, 40, 41 Įrišimo vieta, atsakinga už į 20S proteasomos panašų chimotripsiną susijusį aktyvumą, susidaro sujungiant β5 ir β6 subvienetus, 40 ir galvijų 20S proteasomos β5 ir β6 subvienetų aminorūgščių sekas. parodyti 100% tapatumą su žmogaus 20S proteasomos. Todėl mes sukūrėme tiropeptino A struktūros, sujungtos su 5 / β6 vieta, modelį, suteikiantį galvijų 20S proteasomos chimotripsinu panašų aktyvumą, kad gautume vertingos sterilios informacijos derivatizacijai (3a pav.). 42 Alfahido tiropeptino A grupė gali sudaryti pusacetalio adduktą su β5 subvieneto kataliziniu Thr 1 likučiu. Be to, tiropetino A tirozinalinės, valininės ir tirozino liekanos gali imituoti atitinkamai P1, P2 ir P3 aminorūgščių, susijusių su natūralių proteasomų substratų surišimo vietomis, vaidmenį. Mes ištyrėme palankiausią tiropeptinos A orientaciją β5 / β6 rišamosios vietos modelyje ir nustatėme, kad tiropeptinas A gerai tinka β5 / β6 vietai (3b paveikslas). Šis surišimo modelis pasiūlė atviros erdvės buvimą šalia tiropetino A N- terminalo. Mes spėliojome, kad junginys, galintis užpildyti atvirą erdvę, pasižymės sustiprintu slopinamuoju poveikiu prieš 20S proteasomos chimotripsiną panašų aktyvumą. Todėl mes sukūrėme tiropeptino A darinius, turinčius didelių gabaritų N- terminą, ir susintetinome kelis tiropeptino A darinius su modifikacijomis N- terminalo dalyje (2 lentelė). 43 Pakeitus tiropeptino A izopropilo grupę cikloheksilo grupe (TP-101), keturgubai padidėjo jos slopinamasis poveikis į chototripsino panašų aktyvumą, palyginti su originaliu tiropeptinu A. Dėl cikloheksilo grupės (TP-102) aromatinimo atsirado penkis kartus padidinantis į chototripsiną panašaus aktyvumo slopinamąjį poveikį, palyginti su tiropeptinu A. Be to, TP-103, turintis du aromatinius žiedus (tai yra 2-naftilo grupę), parodė 10 kartų padidėjusį panašaus į chototripsiną slopinamąjį poveikį. veikla. TP-104, turintis 1-naftilo grupę, pasižymi stipresniu slopinamuoju aktyvumu nei TP-103, turintis 2-naftilo grupę. Tačiau TP-105, turintis pentilo grupę, slopina mažesnį aktyvumą nei TP-104. Tarp jų, stipriausias į chimotripsiną panašaus aktyvumo junginys buvo 1-naftilo darinys TP-104, pasižymintis 20 kartų didesne slopinančiąja galia, palyginti su pradiniu tiropeptinu A. Kaip parodyta 3c paveiksle, TP-104 papildytas. formos atviros erdvės, esančios netoli tiropeptino A N- terminalo, ir suformavo naują CH / π sąveiką su 20S proteasomos β5 / β6 vieta (3d pav.). Todėl labai didelis TP-104 afinitetas β5 / β6 vietai padidino 20S proteasomų, panašių į tiropeptiną, chimotripsinui panašaus aktyvumo slopinamąją galią. Bendrai tariant, mūsų galvijų 20S proteasomos surišimo modelis leido tinkamai suprojektuoti stiprus 20S proteasomos inhibitorius.

Image

Tiropeptino A surišimo modelis, surištas su vieta, atsakinga už 20S proteasomos chimotripsinu panašų aktyvumą. a ) Įrišimo modelio apžvalga. Β5 subvienetas, pilkas; β6 subvienetas, žalias; ir tiropeptino A, geltonos spalvos. b ) Dalies padidinimas. c ) TP-104, surišto į 5 / β6 vietą, surišimo modelis. TP-104, purpurinė. d ) TP-104 struktūra.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

TP-104 slopino į 20S proteasomų, susijusių su citotripsinu, aktyvumą, kai IC50 vertė buvo 0, 007 μM didesnė nei MG132, kai IC 50 vertė buvo 0, 068 μ M. Paskatinti dėl puikaus proteasomą slopinančio TP-104 aktyvumo, toliau sintetinome įvairius tiropeptino A darinius. Tiropeptino A darinys TP-110 slopino į 20S proteasomos chimotripsiną panašų aktyvumą, kurio IC50 vertė buvo 0, 027 μM, tačiau neslopino į tripsiną ir kaspazę panašaus aktyvumo, kai koncentracija 100 μM, o tai rodo padidėjusį specifiškumą. dėl chimotripsinui būdingos veiklos. Aktyvioji į tripsiną panašaus aktyvumo vieta yra suformuota sujungiant β2 ir β3 subvienetus ir yra siauresnė, nei reikalinga į chimotripsiną panašiam aktyvumui. 39 Todėl TP-110 gali netinkamai įsitvirtinti β2 / β3 vietoje, todėl jis yra stiprus ir selektyvus 20S proteasomos chimotripsinui panašaus aktyvumo inhibitorius. Be to, TP-110 slopino žmogaus daugybinės mielomos RPMI8226 ląstelių, kurių IC50 vertė buvo 0, 012 μM, augimą ir parodė stipresnį citotoksiškumą įvairių žmogaus vėžio ląstelių atžvilgiu nei TP-104. 43

Tada mes ištyrėme TP-110 poveikį žmogaus vėžio ląstelėms. 44 TP-110 stipriai slopino žmogaus prostatos vėžio PC-3 ląstelių augimą in vitro . Tai padidino p21 ir p27 baltymų lygius, kurie yra neigiami ląstelių ciklo progresijos reguliatoriai, ir padidino ląstelių skaičių G2 / M fazėje. Be to, TP-110 sukėlė apoptozę kartu su chromatino kondensacija ir DNR suskaidymu, o TP-110 sukelta apoptozė atrodė susijusi su kaspazės aktyvacija. TP-110 taip pat sukėlė apoptozę žmogaus daugybinės mielomos RPMI8226 ląstelėse, 45 be to, kad padidino citochromo c išsiskyrimą iš mitochondrijų į citozolį ir sumažino cIAP-1 ir XIAP, kurie yra vidiniai apoptozės baltymų inhibitoriai ir jungiasi, kiekį. slopinti kaspazes. Todėl kaspazė-8 ir -3 buvo suaktyvinta TP-110, todėl buvo skaidoma poli (ADP-ribozės) polimerazė, kuri yra pagrindinis kaspazės-3 skilimo tikslas. Kaip minėta anksčiau, TP-110 pasižymi įdomiu biologiniu aktyvumu, bet neturi priešnavikinio aktyvumo in vivo . Be to, TP-110 ištekėjo P-glikoproteinu (MDR1), kelių vaistų išleidimo srautu. 46 Todėl mes susintetinome efektyvesnius TP-110 darinius.

Tiropeptino – boro rūgšties darinių kūrimas

Bortezomibas (anksčiau žinomas kaip PS-341) buvo pirmasis terapinis proteasomų inhibitorius, sukurtas vėžiui gydyti (4a pav.). Jis stipriai slopina į 20S proteasomos panašų chimotripsiną poveikį ir slopina įvairių vėžio ląstelių ir ksenografinių navikų augimą gyvūnų modeliuose. 47, 48 bortezomibo ypatingas veiksmingumas kovojant su išsėtine mieloma. Kadangi daugybinės mielomos ląstelės gamina didelius kiekius baltymų, įskaitant imunoglobulinus, jos sukuria neįprastai didelę naštą proteasomai. Todėl platus imunoglobulino gaminimas padidina jų jautrumą proteasomų slopinimui 49, o išsiskleidusius baltymų atsakus gali lengvai sukelti proteasomų slopinimas. 50 Bortezomibo veiksmingumas gydant išsėtinę mielomą vėliau buvo patvirtintas I fazės klinikiniais III fazės tyrimais. 51, 52, 53, 54 Jungtinių Valstijų maisto ir vaistų administracija 2003 m. Patvirtino bortezomibą kaip pirmąjį savo klasės proteasomų inhibitorių, skirtą trečiosios eilės gydymui recidyvuojančiai ir ugniai atspariai daugybinei mielomai, ir jis buvo patvirtintas kaip pirmosios eilės gydymas. Naujai diagnozuota išsėtinė mieloma 2008 m. 55, 56, 57 m. Be to, 2006 m. bortezomibas buvo patvirtintas recidyvuojančios ir ugniai atsparios mantijos ląstelių limfomos gydymui. 58

Image

Bortezomibo ir TP-110 – boro rūgšties darinio struktūra. a ) bortezomibo. b ) TP-110 – boro rūgšties darinys.

Visas dydis

Bortezomibo C-gale yra boro rūgšties struktūra (P1); jis formuoja kovalentinius ryšius su nukleofiliniais pakaitais, tokiais kaip hidroksi grupė aktyviojoje vietoje, kurie lėtai disociuoja fiziologinėmis sąlygomis, todėl padidėja antiproteasominis aktyvumas, palyginti su aldehido giminingomis medžiagomis. Įkvėpti bortezomibo molekulinio projekto koncepcijos, mes susintetinome TP-110 – boro rūgšties darinį (4b paveikslas). Norint sintetinti TP-110 – boro rūgšties darinį, Matteson ir bendradarbių aprašyta tvarka buvo paruoštas O -Me tirozino boro rūgšties giminingumas. 59, 60 Gauta aminoborono rūgštis buvo kondensuota su dipeptidu, 1-naftilacetil-Tyr (Me) -Val-OH, kad būtų gautas TP-110 – boro rūgšties darinys. 61 TP-110 – boro rūgšties darinys slopino į chimotripsiną panašų aktyvumą, kurio IC50 vertė buvo 0, 0063 μM, kuris yra stipresnis nei aldehido giminingo junginio TP-110, kurio IC 50 vertė yra 0, 083 μ M (3 lentelė). Aldehido grupės pakeitimas TP-110 boro rūgštimi padidino daugiau nei 10 kartų didesnį slopinamąjį poveikį prieš chimotripsiną panašiam aktyvumui. TP-110 – boro rūgšties darinys taip pat parodė stipresnį slopinamąjį poveikį nei bortezomibo, kurio IC50 vertė yra 0, 024 μM.

Pilno dydžio lentelė

Patvirtinę tiropeptino boro rūgšties darinių sampratą, atlikome struktūros ir aktyvumo santykio tyrimus, daugiausia orientuodamiesi į N- terminalo acilo funkcionalumo struktūrines modifikacijas, taip pat išankstinį P1 ir P2 variantų tyrimą (5 pav.). Įsivaizdavome, kad bortezomibo pirazilo fragmentas padidins jo biologinį aktyvumą, ir į N- galo vietą įvedėme įvairius aromatinius žiedus, įskaitant N- heterociklus. 4 lentelėje parodyta tiropeptino ir boro rūgšties darinių, slopinančių 20S proteasomą, slopinamasis poveikis ir citotoksiškumas RPMI8226 ląstelėms. Išskyrus AS-9, chinolilo ir izohinolilo dariniai (nuo AS-7 iki AS-13) veiksmingiau nei piridilo ir pirazilo giminingieji junginiai (nuo AS-14 iki AS-17) slopina chimotripsinu panašų 20S proteasomos aktyvumą. Tarp sintezuotų darinių AS-06, turintis fenoksifenilo fragmentą ties N- terminalo acilo fragmentu, pasižymėjo stipriausiu slopinančiu poveikiu, kurio IC50 vertė buvo 0, 0041 μM, palyginti su chimotripsinu panašiu aktyvumu; stiprumas buvo beveik devynis kartus didesnis nei bortezomibo, kurio IC50 vertė buvo 0, 039 μM. Deja, tačiau AS-06 parodė tik silpną citotoksiškumą žmogaus daugybinės mielomos RPMI8226 ląstelėms.

Image

Tiropeptino – boro rūgšties darinių struktūra.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Preliminarus tyrimas parodė, kad pikolininio amido darinys AS-15 turėjo in vivo priešnavikinį aktyvumą, ir buvo atliktas išplėstinis SAR tyrimas, paremtas šiuo junginiu, siekiant atskleisti pakaitalų poveikį piridino branduoliui (nuo AS-18 iki AS-43). Daugeliu atvejų, išskyrus hidroksilą turinčius analogus AS-36 ir AS-37, šios klasės junginiai turėjo mažesnes IC50 reikšmes nei pirminis junginys AS-15. Visų pirma, 3, 6-Cl2 (AS-29), 3-Br (AS-30) ir 6-MeO (AS-41) dariniai parodė panašią stiprumą kaip ir bortezomibo. Apskritai šio tipo dariniams buvo nustatytas geras citotoksiškumas. Be kita ko , 3-fluoro analogai AS-22 pasižymėjo stipriausiu citotoksiškumu, kai IC50 vertė buvo 0, 0049 μM. Analogai, kurių P2 padėtis buvo pakeisti glicinu AS-52 ir alaninu AS-53, nepakeitė biologinio aktyvumo. Įdomu tai, kad slopinamasis 20S proteasomos chimotripsino tipo aktyvumas ir citotoksiškumas neturi tiesioginio ryšio. Taigi, kadangi AS-29 biologinis aktyvumas buvo panašus į bortezomibo stiprumą tarp tiropetino ir boro rūgšties darinių, mes ištyrėme priešnavikinį AS-29 poveikį žmogaus daugybinės mielomos ląstelėms.

AS-29 slopino tarpląstelinį proteasominį aktyvumą ir sukėlė reikšmingą ubikvitintų baltymų kaupimąsi žmogaus daugybinės mielomos ląstelėse. Transkripcijos faktorius NF-κB kontroliuoja ląstelių augimą ir suteikia reikšmingą išgyvenimo galimybę esant įvairiems navikams. NF-κB aktyvacijos slopinimas proteasomų inhibitoriais laikomas pagrindiniu priešnavikinio aktyvumo veikimo mechanizmu. Todėl mes ištyrėme AS-29 poveikį NF-κB aktyvacijai RPMI8226 ląstelėse. AS-29 slopino NF-κB inhibitoriaus (IκB-α) sumažėjimą, kurį sukėlė naviko nekrozės faktorius α, ir padidino IκB-α fosforilinimą. Be to, AS-29 blokavo NF-κB p65 subvieneto branduolinę translokaciją po naviko nekrozės faktoriaus α stimuliacijos, o AS-29 slopino NF-κB p65 DNR surišimo aktyvumą. Šie rezultatai parodė, kad AS-29 slopina NF-κB aktyvaciją stabilizuodamas IκB-α.

Proteasomų inhibitoriai, tokie kaip bortezomibas, sukelia apoptozę, suaktyvindami ir išorinius (kaspazės-8 tarpininkaujamus), ir vidinius (kaspazės-9 tarpininkaujamus) apoptozės kelius. 64, 65 AS-29 sukeltą apoptozę lydi kaspazės-8 ir -9 aktyvacija. Taigi AS-29 suaktyvina du pagrindinius apoptozės kelius: mirties receptorių kelią ir mitochondrijų kelią. Kita vertus, pranešama, kad bortezomibas suaktyvina endoplazminį retikulinį kaspazę-12 gyvenančią daugybinės mielomos ląstelėse. 64 Todėl mes ištyrėme, ar kaspazę-12 suaktyvina AS-29, ir nustatėme, kad bortezomibas suaktyvino kaspazę-12, o AS-29 - ne.

Genomo transkripcijos ekspresijos analizė yra galinga strategija apibūdinant biologiškai aktyvių mažų molekulių biologinį aktyvumą, atsižvelgiant į tai, kad bioaktyvios mažos molekulės, turinčios panašų veikimo mechanizmą, gali sukelti panašius genų ekspresijos profilius. 66, 67, 68 genomo transkripcijos ekspresijos analizė, naudojant hierarchinę klasterizaciją, parodė teigiamą koreliaciją tarp viso genomo genų ekspresijos parašų AS-29 ir bortezomibo, kas rodo, kad AS-29 biologinis aktyvumas yra panašus į bortezomibo poveikį daugybinės mielomos ląstelėse. COMPARE analizė, naudojant žmogaus vėžio ląstelių liniją JFCR39, 69, parodė, kad tiropeptino ir boro rūgšties darinių augimo slopinimo modeliai buvo panašūs kaip bortezomibo, bet nebuvo identiški (Peasono koreliacijos koeficientas 0, 706). 63 Visų pirma, de-dichlor-AS-29 darinys parodė stipresnį citotoksiškumą žmogaus glioblastomos SF-539 ląstelėms nei bortezomibo. Todėl tiropeptino ir boro rūgšties dariniai gali turėti unikalių proteasomų inhibitorių, kurių mechanizmai skiriasi nuo bortezomibo mechanizmų.

Be to, AS-29 priešnavikinis aktyvumas in vivo buvo ištirtas naudojant RPMI8226 ląstelių ksenografinius modelius. Mes nustatėme, kad intraveninis AS-29 (4 mg kg – 1 ) vartojimas du kartus per savaitę 4 savaites reikšmingai slopina poodinių navikų augimą (6a pav.). Todėl AS-29 gali būti pagrindinis junginys kuriant naujus naujos kartos prieš daugybinę mielomą sukeliančius agentus.

Image

AS-29 priešnavikinis aktyvumas ir proteasomų slopinimo in vivo vaizdavimas. a ) priešvėžinis aktyvumas RPMI8226 ksenografams. RPMI8226 ląstelės po oda buvo inokuliuotos į SCID peles 0 dieną. AS-29 ir bortezomibo buvo skiriamos į veną du kartus per savaitę 4 savaites nuo 13 dienos. ( B ) Proteasomoms jautrių fluorescuojančių baltymų kaupimasis AS-29. HEK293PS ląstelės, ekspresuojančios proteasomoms jautrius fluorescencinius baltymus, buvo inkubuojamos su AS-29 18 val. c ) In vivo atliekamas proteasomų slopinimo AS-29 tyrimas. Pelėms, turinčioms HEK293PS navikus, į veną buvo švirkščiamas AS-29. Navikai buvo stebimi naudojant in vivo vaizdo sistemą per 24 valandas po vartojimo.

Visas dydis

Perspektyva

Kažkada buvo manoma, kad pagrindinė ląstelių sistema, tokia kaip proteasoma, negali būti perspektyvus priešnavikinių vaistų molekulinis taikinys. Tačiau įspūdinga klinikinė bortezomibo gydymo sėkmė rodo, kad proteasoma yra viltingas vėžio terapijos taikinys. Gydymas bortezomibu žymiai pagerina pacientų, sergančių išsėtine mieloma, baigtį ir tapo pacientų, kuriems yra recidyvas / refrakcija, arba anksčiau negydyta išsėtine mieloma, priežiūros standartu. Tačiau bortezomibas sukelia daug šalutinių poveikių, įskaitant skausmingą periferinę neuropatiją, ortostatinę hipotenziją, karščiavimą, širdies ir plaučių sutrikimus, nepageidaujamus virškinimo trakto įvykius, mielo slopinimą ir trombocitopenijos asteniją. 52, 70, 71, 72. Be to, ilgesnis gydymas bortezomibais yra susijęs su atsparumo vaistams vystymusi. 73 Šie klausimai pabrėžia poreikį kurti naujus proteasomų inhibitorius. 2015 m. Buvo patvirtintas geriamasis proteasomų inhibitorius ixazomibas, skirtas vartoti pacientams, sergantiems recidyvuojančia / refrakterine daugybine mieloma. Iksazomibas greitai hidrolizuojasi plazmoje iki biologiškai aktyvios formos - MLN2238. Ikiklinikinių tyrimų metu jis parodė didesnį aktyvumą prieš daugybinės mielomos ląsteles nei bortezomibo. 75 Naujausi bandymai sukurti naujos kartos proteasomų inhibitorius sutelkė dėmesį į geriamuosius junginius, tokius kaip ixazomibas.

Norint sukurti naujus peroraliai aktyvius proteasomų inhibitorius, reikalingi veiksmingi priešnavikinio aktyvumo įvertinimo metodai. Kadangi proteasomas slopinantis navikų aktyvumas yra labai susijęs su pelių priešnavikiniu aktyvumu, pelių auglių proteasominio aktyvumo stebėjimas in vivo yra naudingas būdas įvertinti priešvėžinį aktyvumą. Buvo sukurtas ubiquitin-luciferazės bioliuminescencijos vaizdavimo reporterio metodas, skirtas tiesiogiai įvertinti proteasomos aktyvumą gyvų pelių navikuose. Liuminescencinis reporteris yra sulietas baltymas, turintis žvirblinę luciferazę ir keturias mutanto ubiquitino G76V kopijas, atsparias skilimui ubiquitino hidrolazėmis. Žurnalistė nenustatoma pastovios būklės, nes proteasomos greitai suardo. Tačiau jis išlieka stabilus ir nepažeistas esant proteasomų inhibitoriams. Todėl šis reporteris buvo naudojamas proteasomų inhibitorių veikimui pelių modeliuose įvertinti. 77 Tuo tarpu fluorescenciniai reporteriai taip pat buvo sukurti siekiant įvertinti proteasomų aktyvumą gyvose ląstelėse. 78, 79 Šie fluorescenciniai reporteriai (pavyzdžiui, žali fluorescenciniai baltymai) leidžia realiu laiku vaizduoti proteasomos aktyvumą, nes nereikia specialių reagentų (pavyzdžiui, D-fluciferino). Tačiau in vivo proteasomų aktyvumo vaizdavimas naudojant fluorescencinius reporterius gyviesiems gyvūnams nebuvo gautas. Todėl, remdamiesi proteasomoms jautriu fluorescenciniu reporteriu ZsProSensor-1, sukūrėme proteasomų aktyvumo in vivo vaizdavimo gyvų pelių navikuose sistemą. 80 Šis reporteris yra sulietas baltymas, turintis fluorescencinį baltymą ZsGreen ir pelių ornitino dekarboksilazę, kurį proteasoma skaido be ubiquitino konjugacijos. Stabiliai transfekuotose ląstelėse, ekspresuojančiose „ZsProSensor-1“, fluorescencinis reporteris stabilios būklės sąlygomis greitai suyra, tuo tarpu stabilizuojamas esant proteasomų inhibitoriams, tokiems kaip AS-29, ir kaupiasi ląstelėse (6b paveikslas). Po poodinėmis transkripcinių ląstelių, ekspresuojančių ZsProSensor-1, inokuliacija į nuogas peles lėmė auglio susidarymą, o į auglį turinčioms pelėms į veną suleistas AS-29 paskatino ZsProSensor-1 baltymo kaupimąsi ir fluorescencinio signalo sklidimą gyvų pelių auglyje 6c pav.). Intraveninis bortezomibo vartojimas reikšmingai slopino naviko augimą ir padidino fluorescencinį baltymą navikuose, o geriamasis vaistas neturėjo priešnavikinio poveikio ir nesukėlė fluorescencinio baltymo kaupimosi navikuose. 80 Be to, geriamasis delanzomibo, geriamojo proteasomų inhibitoriaus, 82, 83 vartojimas, žymiai sumažino naviko augimą ir skleidė fluorescencinį signalą navikuose. Todėl, naudojant šią in vivo vaizdo gavimo sistemą, galima lengvai ištirti naujus oraliniu būdu aktyvius proteasomų inhibitorius. Šiuo metu kuriame geriamus tiropetino ir boro rūgšties darinius ir jau turime keletą perspektyvių kandidatų. Mūsų būsimose ataskaitose bus pateikta daugiau informacijos.