Ubikvitino ligazės smurf2 slopina tgfβ sukeltą epitelio ir mezenchiminį perėjimą sumoiluojamu būdu | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Ubikvitino ligazės smurf2 slopina tgfβ sukeltą epitelio ir mezenchiminį perėjimą sumoiluojamu būdu | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Dalykai

  • Adherens sankryžos

Anotacija

Epitelinis – mezenchiminis perėjimas (EMT) yra pagrindinis ląstelių procesas vystant epitelinį audinį ir gali būti suaktyvinamas vėžiui prisidedant prie naviko invaziškumo ir metastazių. Citokinus transformuojantis augimo faktorius β (TGF β ) yra pagrindinis EMT induktorius, tačiau TGF β sukeltą EMT reguliuojantys mechanizmai išlieka nevisiškai suprantami. Čia mes pranešame, kad ubiquitino ligazės Smurf2 numušimas skatina TGF β gebėjimą indukuoti EMT trimačiame ląstelių kultūros modelyje, kuriame yra NMuMG pieno liaukų epitelio ląstelės. Kituose tyrimuose Smurf2 nustatėme kaip mažą į ubikvitiną panašių modifikatorių (SUMO) taikinį. Mes nustatėme, kad SUMO-E2 konjuguojantis fermentas Ubc9 ir SUMO E3 ligazė PIAS3 asocijuojasi su Smurf2 ir skatina jo sumoilinimą atskirose Lizinų 26 ir 369 vietose. Smurf2 sumoilinimas padidina jo gebėjimą sukelti TGF β receptorių ir tokiu būdu slopina EMT NMuMG ląstelėse. Bendrai iš mūsų duomenų matyti, kad „Smurf2“ veikia sumoilinimo būdu, kad būtų slopinamas TGF β sukeltas EMT. Šie atradimai daro didelę įtaką mūsų supratimui apie epitelio audinių vystymąsi ir vėžį.

Pagrindinis

Epitelinis – mezenchiminis perėjimas (EMT) yra pagrindinis epitelinio audinio morfogenezės procesas besivystančiame organizme ir prisideda prie postnatalinių įvykių, įskaitant pieno liaukų vystymąsi po gimdymo, taip pat žaizdų gijimą. 1, 2 Svarbu tai, kad EMT gali būti suaktyvinta vėžio metu ir gali prisidėti prie naviko invaziškumo. 3 Epitelio ląstelės, kurioms atliekama EMT, fenotipiškai keičiasi iš kuboidinės į fibroblastinę morfologiją, praranda epitelio žymenis, įskaitant E-kadheriną, įgyja mezenchiminius žymenis, padidėja ląstelių judrumas ir invaziškumas. 4, 5 Išskirtas faktorius, keičiantis augimo faktorių β (TGF β ), tapo stipriu EMT induktoriu, atliekančiu pagrindinius vaidmenis vystymosi ir vėžio srityse. Taigi atsirado susidomėjimas TGF β sukeltą EMT tarpininkaujančiais mechanizmais.

Smurf2 (Smad (Sma ir proto) ubikvitinaciją reguliuojantis faktorius-2) yra HECT (homologijai su E6 karboksigrupės galiniu domenu), turintis E3 ubikvitino ligazę, nurodančią baltymų ubikvitinimo ir skaidymo substratus. 7, 8 „ Smurf2“ reguliuoja pagrindinius biologinius procesus vystymosi ir homeostazės metu, įskaitant ląstelių poliškumą, ląstelių ciklą ir senėjimą, priklausomai nuo E3 ligazės arba nuo jos. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Smurf2 biologinės funkcijos atsiranda reguliuojant signalizacijos kelius, įskaitant TGF β – Smad signalizacijos kelią. 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, tačiau Smurf2 vaidmuo TGF β sukeltoje EMT dar liko nustatyti.

Sumoilinimas reiškia kovalentinį mažo į ubikvitiną panašaus modifikatoriaus (SUMO) prisijungimą prie baltymų substratų SUMO keliu. 24 SUMO yra sujungtas su jo substratais izopeptidiniu ryšiu tarp SUMO C-galo karboksilo grupės ir substrato lizino liekanos ɛ-aminogrupės . SUMO E2 konjuguojantis fermentas Ubc9, antrasis trijų pakopų katalizinės kaskados fermentas, kovalentiškai sudaro tioesterinį ryšį su SUMO ir selektyviai siejasi su SUMO perdavimu substratams ir skatina jų pernešimą. Pvz., 25 SUMO E3 sujungia aktyvuotų STAT baltymų inhibitorius (PIAS šeimos baltymai) ir su substratu, ir su Ubc9, sudarydami kompleksus, tokiu būdu palengvindami SUMO pernešimą iš E2 į substratą. Sumoilinimas yra grįžtamasis procesas, atsirandantis dėl specifinių sentrinui priklausančių proteazių (SENP), desumoiluojančių SUMO baltymo substratus. 25, 26 Kadangi sumoilinimas daro pagrindinius funkcinius padarinius jo tiksliniams substratams, buvo didelis susidomėjimas naujų SUMO substratų identifikavimu.

Šiame tyrime mes atskleidėme naują nuo ubikvitino ligazės Smurf2 sumoilinimo priklausomą funkciją TGF β indukuotame EMT. Knockdown ir funkcijos padidėjimo analizės rodo, kad Smurf2 slopina TGF β sukeltą EMT NMuMG pieno epitelio ląstelėse, plačiai naudojamoje EMT ląstelių modelių sistemoje. Kituose eksperimentuose mes parodome, kad SUMO E2 konjuguojantis fermentas Ubc9 ir SUMO E3 ligazė PIAS3 asocijuojasi su Smurf2 ir skatina jo sumoilinimą 26 ir 369 lizinose skirtinguose ląstelių tipuose. Smurf2 sumoilinimas padidina jo gebėjimą sukelti TGF β receptorių T β RI skilimą ir taip slopina EMT. Apibendrinant, mūsų išvados atskleidžia intymų naują ryšį tarp sumoilinto Smurf2 ir EMT reguliavimo. Mūsų tyrimai rodo svarbų Smurf2 sumoilinimo vaidmenį audinių morfogenezėje ir vėžio progresavime.

Rezultatai

„Smurf2“ slopina EMT

EMT yra pagrindinis vystymosi procesas, turint vis daugiau įrodymų, kad jis vaidina pagrindinį vaidmenį vėžio ląstelių invazijoje ir metastazėse. 27, 28, 29 TGF β yra stiprus EMT induktorius vystymuisi ir vėžiui gydyti, 3, 30, o kanoninis Smad signalizacijos kelias prisideda prie TGF β gebėjimo skatinti EMT. 31, 32, 33 E3 ubikvitino ligazė Smurf2 asocijuojasi su signalinių baltymų Smad šeimos nariais ir taip reguliuoja TGF β tarpininkavimą. 34, 35 Tačiau Smurf2 vaidmuo ir reguliavimas TGF β sukeltame EMT liko neištyrinėtas.

Netransformuotos pieno pieno NMuMG epitelio ląstelės yra nusistovėjęs ir tinkamas EMT tyrimo modelis. Vis daugiau įrodymų rodo, kad epitelio ląstelių auginimas tarpląstelinės atramos sistemos, tokios kaip Matrigel, kontekste suteikia trimatę (3D) aplinką ląstelėms, primenančioms stromos bazinę membraną labiau „fiziologinėmis“ sąlygomis. 38, 39, 40 Taigi, iš liaukinių epitelio ląstelių 3D matricoje susidaro acini su tuščiaviduriais centrais, panašiais į šių struktūrų morfologiją in vivo . Svarbu tai, kad EMT sutrikdo acinarinę morfologiją, pasireiškiančią tuščiavidurių centrų užpildymu, invazyvumu į išorę ir epitelio žymens baltymo E-kadherino gausos ar lokalizacijos sutrikimu. 38, 40, 41, 42, 43

Norėdami nustatyti Smurf2 vaidmenį EMT, mes paskatinome Smurf2 numušimą dėl RNR trukdžių (RNR) NMuMG ląstelėse, naudojant trumpalaikį transfekciją. Trumpų plaukų segtukų RNR (shRNR), nukreipti prieš du atskirus Smurf2 regionus, atskirai arba kartu, tvirtai sumažino išorinį Smurf2 293T ląstelėse ir NMuMG pieno epitelio ląstelėse (papildomi S1A ir B paveikslai). Svarbu tai, kad dvi „Smurf2“ shRNR, atskirai arba kartu, taip pat reikšmingai sumažino endogeninės „Smurf2“ gausą NMuMG ląstelėse (1a pav. Ir papildoma S1C nuotrauka). Toliau mes nustatėme Smurf2 numušimo įtaką TGF β gebėjimui sukelti EMT NMuMG ląstelėse. Kaip ir buvo galima tikėtis, 3D kultūrų NMuMG ląstelės buvo pavienės ląstelės, susiformavusios organizuotuose tuščiaviduriuose acinuose, ir veikimas TGF β privertė užpildyti ir dezorganizuoti šias daugialąstelines struktūras (1b pav.). 40 Priešingai, mes nustatėme, kad „Smurf2“ numušimas, naudojant shRNR-1 ir shRNR-2, atskirai arba kartu, paskatino NMuMG ląstelių išgautų acinų užpildymą, kai nėra TGF β , ir padidino TGF β gebėjimą sukelti liumenų užpildymą ir dezorganizavimą. NMuMG ląstelių acini (1b pav. ir papildomas S1D ​​paveikslas). Atlikus imunocitocheminius tyrimus, E-kadherinas buvo lokalizuotas kontrolinių ląstelių tarpląstelinėse sankryžose (1c paveikslas ir duomenys nepateikti), o TGF β sumažino E-kadherino kiekį arba suklasifikavo netinkamai, atsižvelgdamas į EMT indukciją. 40 Smurf2 numušimas, naudojant shRNR-1 ir shRNR-2, atskirai arba kartu, dar labiau padidino TGF β gebėjimą sureguliuoti E-kadherino ekspresiją (1c paveikslas ir duomenys nepateikti). Šie duomenys rodo, kad endogeninis Smurf2 slopina TGF β sukeltą EMT epitelio ląstelėse.

Image

„Smurf2“ slopina TGF β sukeltą EMT 3D NMuMG kultūrose. ( a ) NMuMG ląstelių lizatai, transfekuoti RNR plazmidėmis, koduojančiomis trumpų plaukų smeigtukų RNR (shRNR), nukreipiančius į vieną iš dviejų unikalių Smurf2 sekų (Smurf2i-1 arba Smurf2i-2), pridedami atskirai arba kaip telkinį (Smurf2i), arba atitinkamą kontrolinės U6 RNR plazmidės, buvo imunoblotuojamos smurf2 arba aktino antikūnais, pastarieji tarnavo kaip įkrovos kontrolė. b ) Tipiški DIC vaizdai (viršutinė plokštė) ir acini kolonijų morfologijos kiekybinis įvertinimas (apatinė plokštė, vidurkis ± SEM, n = 4) 10 dienų 3D NMuMG ląstelėms, perkeltoms kaip a punkte ir paliktoms neapdorotoms arba inkubuotoms su 100 pM TGF β . TGF β sumažino acini su tuščiaviduriais centrais dalį (ANOVA, P <0, 001). Smurf2 numušimas NMuMG ląstelėse sumažino acini su tuščiavidurėmis struktūromis proporciją net neturint TGF β , palyginti su ląstelėmis, ekspresuojančiomis vektorių kontrolę (ANOVA, ** P <0, 01). ( c ) 3D NMuMG kultūros, kaip aprašytos b punkte, buvo tiriamos imunocitochemija, naudojant E-kadherino (raudoną) antikūną ir Hoechst 33258 (mėlyną). ( d ) Vektorių kontrolės lizatai arba „Smurf2“ transfekuotos NMuMG ląstelės, likusios neapdorotos arba inkubuotos su TGF β, buvo imunoblotai su Smurf2 arba aktino antikūnais, pastarieji žymi įkrovos kontrolę. e ) 10 dienų amžiaus 3D NMuMG ląstelių, perkeltų ir apdorotų kaip b punkte, reprezentatyvūs DIC vaizdai (viršutinė plokštė) ir acini kolonijos morfologijos kiekybinis įvertinimas (apatinė plokštė, vidurkis ± SEM, n = 4). Laukinio tipo „Smurf2“ reikšmingai slopino TGF β gebėjimą sumažinti tuščiavidurių acinų dalį (*** P <0, 001). ( f ) 3D NMuMG kultūros, kaip aprašytos e punkte, buvo tiriamos imunocitochemija, naudojant E-kadherino (raudoną) antikūną ir Hoechst 33258 (mėlyną). ( g ) NMuMG ląstelių lizatai, transfekuoti RNR plazmidėmis, koduojančiomis Smurf2 shRNA-1 arba kontrolinę U6 RNR plazmidę, kartu su ekspresijos plazmidėmis, koduojančiomis RNAi atsparų MYC pažymėtą „Smurf2“ (Smurf2 (r1)) arba „Smurf2“, užkoduotą WT cDNR, arba atitinkamą vektoriaus kontrolę, buvo imunoblotuoti MYC arba aktino antikūnais. h ) Reprezentatyvūs DIC vaizdai (kairysis skydelis) ir acini kolonijų morfologijos kiekybinis įvertinimas (dešinysis skydelis, vidurkis ± SEM, n = 3) 10 dienų senumo 3D NMuMG ląstelėse, transfekuotose RNAi plazmidėje, koduojančioje Smurf2 shRNA-1 (Smurf2i- 1) kartu su ekspresijos plazmidė, koduojančia RNAi atsparų MYC pažymėtą „Smurf2“ („Smurf2 (r1))“ arba „Smurf2“, koduojamą WT cDNR arba atitinkamos plazmidės kontrolės, arba su kontrolinėmis plazmidėmis ir apdorojamomis kaip ( b ) punkte. „Smurf2“ (r1), bet ne „WT Smurf2“ ekspresija panaikino „Smurf2i-1“ sukeltą NMuMG ląstelių gautą acini užpildymą, jei nėra arba nėra TGF β (ANOVA, *** P <0, 001). Masto juosta = 50 μm ( b, c, e, f ir h ). Rodyklės ir strėlių galvutės rodo nepažeistus ir sutrikusias acinas

Visas dydis

Atliekant papildomus eksperimentus, Smurf2 ekspresija NMuMG ląstelėse blokavo TGF β gebėjimą sutrikdyti acinarinę morfologiją ir E-kadheriną sureguliuoti 3D NMuMG ląstelių struktūrose (1d – f pav.). Svarbu tai, kad cDNR užkoduotos „Smurf2“, užkoduotos atsparios „Smurf2 RNAi-1“ ((„Smurf2 (r1))“ arba „Smurf2 RNAi-2“ („Smurf2 (r2)“), bet ne „Smurf2“, užkoduoto laukinio tipo cDNR, gelbėjimo formos ekspresija pakeitė „Smurf2“ sugebėjimas numušti RNAi-1 arba RNAi-2, atitinkamai, skatinti iš NMuMG gaunamų acini užpildymą, jei nėra arba nėra TGF β (1g ir h paveikslai bei papildomi S1E ir F paveikslai). „Smurf2“ (r1) išraiška. ) arba „Smurf2“ (r2) taip pat panaikino „Smurf2“ numušimo gebėjimą sustiprinti TGF β gebėjimą sumažinti arba netinkamai įvertinti E-kadheriną NMuMG išgauntuose acini (papildomi S1G ir H paveikslai). Visi šie duomenys rodo, kad endogeninis „Smurf2“ slopina TGF. β indukuotas EMT netransformuotose epitelio ląstelėse.

„Smurf2“ yra naujas SUMO kelio substratas

Išvada, kad Smurf2 slopina TGF β sukeltą EMT, iškėlė klausimą, kaip ši nauja Smurf2 funkcija yra reguliuojama epitelio ląstelėse. Buvo siūloma, kad „Smurf2“ būtų nukreiptas į ubiquitin – proteasomų kelią. 44 Tačiau mes neradome pastebimo Smurf2 gausumo sumažėjimo NMuMG ląstelėse, kuriose vyksta TGF β sukeltas EMT (1d pav.). Todėl mes paklausėme, ar „Smurf2“ funkciją EMT gali reguliuoti sumoilinimas. Tikslinių baltymų sumouliavimas daro didelę įtaką tikslinių baltymų funkcijoms. Trijų fermentų, SUMO E1 aktyvinančio fermento, SUMO E2 konjuguojančio fermento Ubc9 ir SUMO E3 ligazės, kaskada skatina kovalentinį baltymo SUMO prisijungimą prie tikslinių baltymų. Kita vertus, SENP desumoilazių šeimos nariai pašalina SUMO iš baltymų substratų. 25, 26 izopeptidazės inhibitorius N- etilmaleimidas (NEM) yra įtrauktas į lizės buferį, kad slopintų SENP ir išsaugotų substratų sumoilinimą. 45, 46, 47 Nors laisvojo SUMO dydis yra ∼ 11 kDa, jo konjugacija prideda tariamą molekulinę masę ≥20 kDa prie substrato molekulinės masės atliekant imunoblotologinius tyrimus. 25, 46, 48

Norėdami nustatyti, ar Smurf2 gali būti sumoiluotas, mes panaudojome NMuMG ląstelių lizatus, paruoštus natrio dodecilsulfato (SDS) turinčiame lizės buferyje, jei nėra arba nėra NEM, kad būtų galima nusodinti su Smurf2 antikūnu, po to imti imunoblotus su SUMO ir Smurf2 antikūnais. Paprastai galima aptikti tik nedidelę sumoilinto baltymo substrato dalį. Taigi, be endogeninės „Smurf2“ sumoilinimo įvertinimo NMuMG ląstelėse (2a paveikslas, 1 ir 2 juostos), į šias analizes įtraukėme ir ląsteles, kurios išreiškia egzogeninę „Smurf2“ (2a paveikslas, 4 ir 5 juostos). Mes nustatėme NEM jautrią 100 kDa SUMO imunoreaktyvią juostą endogeniniame „Smurf2“ ir išoriniuose „Smurf2“ imuniniuose produktuose (2a pav.). Be to, Smurf2 imunoprecipitatuose (2a paveikslas, 5 juosta) atsirado didesnės molekulinės masės SUMO imunoreaktyvių baltymų juostos, leidžiančios manyti, kad Smurf2 yra sumoilintas ir polisumilintas NMuMG ląstelėse. Pažymėtina, kad nemodifikuotas „Smurf2“ buvo aptiktas kaip 80 kDa baltymas (2a pav.). Patvirtinant šiuos rezultatus, atlikus „Smurf2“ imunoplotų ir NMuMG ląstelių lizatų analizę su „Smurf2“ antikūnu, paaiškėjo NEM jautrios, didesnės molekulinės masės endogeninės, taip pat egzogeninės „Smurf2“ imunoreaktyviosios juostos (2a paveikslas, vidurinė plokštė ir 2b paveikslas). Kituose eksperimentuose imuninis nusėdimas iš endogeninio Smurf2 ir po to atliktas imuninis apipjaustymas SUMO antikūnu arba Smurf2 antikūnu parodė, kad endogeninis Smurf2 sumoiluojamas NMuMG ląstelėse (2c paveikslas). Norėdami gauti daugiau Smurf2 sumoilinimo įrodymų, mes atlikome in vivo sumoilinimo testus 293T ląstelėse, kurios plačiai naudojamos sumoilinimo analizėse. Mes kartu su 293T ląstelėmis išreiškėme MYC pažymėtą Smurf2, HA pažymėtą SUMO arba abu baltymus ir atlikome jų lizatų imuninį nusodinimą su MYC antikūnu, po to atlikome imunoblotus su HA arba MYC antikūnais. SUMO ekspresija naudojant „Smurf2“ lėmė, kad NEM jautriu būdu atsirado 100 kDa, taip pat ir poli-sumoilintas „Smurf2“ (2d pav.). Visi šie duomenys leidžia manyti, kad „Smurf2“ yra modifikuotas SUMO keliu ląstelėse.

Image

„Smurf2“ yra naujas SUMO kelio substratas. ( a ) NMuMG ląstelės, stabiliai ekspresuojančios Smurf2 arba transfekuotos vektoriaus kontrole, buvo lizuojamos, jei nėra bendrojo izopeptidazės inhibitoriaus NEM, ir buvo imunoprecipiduotos Smurf2 antikūnu (Smurf2 IP), po to atlikus imunoblotus (IB) su SUMO arba Smurf2 antikūnais, kad vizualizuotųsi. sumoilinti-Smurf2 baltymų rūšys (viršutinė ir vidurinė plokštės) ir nemodifikuotas Smurf2 (apatinis skydelis) Smurf2 imunokompleksuose. Rodyklė viršutiniame taške rodo NEM jautrias SUMO imunoreaktyviąsias baltymų rūšis Smurf2 imunokomplekse iš NMuMG ląstelių, ekspresuojančių endogeninį Smurf2 (1 ir 2 juostos) arba egzogeninį Smurf2 (4 ir 5 juostos), lizatų, kurių molekulinė masė ∼ 100 kDa. . Rodyklė viduriniame taške rodo į NEM jautrią Smurf2 imunoreaktyviųjų baltymų juostą, veikiančią apytiksliai 100 kDa molekulinės masės. ( b ) Endogeninio ir ekspresuoto Smurf2 ekspresija NMuMG ląstelių lizatuose, kaip aprašyta a punkte, buvo patvirtinta imunoblotu naudojant Smurf2 antikūną. Aktyvinimo blotinimas ląstelių lizatuose buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Viršutinis blotas rodo NEM jautrias Smurf2 imunoreaktyviąsias baltymų rūšis, kurių at 100 kDa yra aiškiai matomas ląstelėse, kurios smarkiai ekspresuoja Smurf2 (rodyklė). ( c ) NEM apdoroti NMuMG ląstelių lizatai buvo nusodinti Smurf2 arba IgG, po to imant SUMO imunoblotus. Imuninis nusėdimas buvo patvirtintas atliekant imunoblotus, naudojant Smurf2 antikūnus. ( d ) 293T ląstelių lizatai, išreiškiantys vien HA HA pažymėtą SUMO arba kartu su MYC pažymėtu Smurf2 ir paruošti nesant ar neturint NEM, buvo imunoprecipituojami MYC antikūnu, po to imamasi biologinio žymėjimo (IB) su HA antikūnu, kad vizualizuotų sumoilintą. baltymų rūšys (viršutinė panelė). Blotai buvo tiriami MYC antikūnais, kad būtų galima nustatyti nemodifikuoto Smurf2 (apatinė panelė) ir modifikuoto Smurf2 gausą MYC imuniniame nusėdime (vidurinis skydelis). Rodyklės viršutinėje ir vidurinėje dėmėse rodo kartu migruojančias NEM jautrias sumoilintas Smurf2 rūšis. M r rodo žymenų molekulinį dydį

Visas dydis

SUMO E2 fermentas Ubc9 skatina sumoilinimą, susijungdamas su jo substratais. 25 Atlikdami koimuninio nusodinimo analizę, mes nustatėme, kad Ubc9 ląstelėse sudaro kompleksą su Smurf2 (3a pav.). Toliau mes nustatėme laukinio tipo Ubc9 arba SUMO konjuguojančio neaktyvaus Ubc9 mutanto, kuriame katalitinis cisteinas 93 yra pakeistas serinu (CS), 49, 50, ekspresijos poveikį išorinei Smurf2 sumoilinimui 293T ląstelėse. Laukinio tipo Ubc9, bet ne Ubc9 (CS) ekspresija sustiprino egzogeninio Smurf2 sumoilinimą 293T ląstelėse (3b ir c paveikslai). Ubc9 ekspresija taip pat lėmė tvirtą endogeninio Smurf2 sumoilinimą NMuMG ląstelėse (papildomas S2A paveikslas). Visi šie duomenys rodo, kad „Ubc9“ yra susijęs su „Smurf2“ ir skatina jo sumoilizaciją.

Image

SUMO E2 fermentas Ubc9 ir SUMO E3 ligazė PIAS3 skatina, o SUMO izopeptidazės SENP1 / 2 slopina Smurf2 sumoilinimą. ( a ) 293T ląstelių lizatai, išreiškiantys vien tik MYC pažymėtą „Smurf2“ ir HA pažymėtą „Ubc9“, arba kartu buvo atlikti Ubc9 imunoprecipitacija (HA IP), po to atliktas „Smurf2“ (MYC) ir Ubc9 (HA) imuninis žymėjimas. Smurf2 baltymų gausa lizatuose buvo patvirtinta atlikus Smurf2 imunoblotus (MYC IB). Apkrovos kontrolei buvo naudojami imuninės sintezės aktai lizatuose. LC, lengvoji grandinė. ( b ) NEM apdoroti 293T ląstelių lizatai, išreiškiantys MYC pažymėtą Smurf2, HA pažymėtą SUMO, WT Ubc9 arba E2 SUMO, konjuguojantį neaktyvų Ubc9, kuriame cisteinas 93 virsta serinu (CS), buvo in vivo sumoilinti, aprašytas 2d paveiksle. MYC / Smurf2, mono / di HA / SUMO arba HA / Ubc9 ekspresija buvo patvirtinta imunologiniais tyrimais su MYC ir HA antikūnais. Aktyvinis imunoblotas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Pastaba SUMO yra konjuguotas su baltymų substratais ir gali būti aptinkamas kaip didesnės molekulės rūšys, palyginti su nemodifikuotu substratu. „Ubc9“ skatina „Smurf2“ sumoilinimą. * Nurodo nespecifinę juostą. c ) Brūkšninė diagrama parodo sumoilinto Smurf2 santykį su nemodifikuotu Smurf2, jei nėra WT ar CS Ubc9, ir išreikštą Smurf2 sumoilinimo proporcija, kai nėra Ubc9 (vidurkis ± SEM, n = 4). ( d ) Buvo tiriami 293T ląstelių lizatai, ekspresuojantys vien tik MYC pažymėtą „Smurf2“ arba kartu su Ubc9 ir SUMO arba atskirai arba kartu su maža (+) ir aukšta (++) SUMO E3 ligazės PIAS3 (FLAG-PIAS3) koncentracijomis. į „Smurf2“ sumoilinimo testą, kaip aprašyta 2d paveiksle (viršutinė plokštė). FLAG pažymėto PIAS3 ekspresija buvo patvirtinta ląstelių lizatuose. Actinas buvo naudojamas kaip krovimo kontrolė. ( e ) Brūkšninė diagrama parodo SUMO konjuguoto Smurf2 santykį, kai nėra arba nėra PIAS3, išreikštą sumoilinto Smurf2 santykiu, kai nėra PIAS3 (vidurkis ± SEM, n = 4). ( f ) Ląstelių lizatams, kurie atskirai arba kartu išreiškia FLAG pažymėtą PIAS3 ir MYC pažymėtą „Smurf2“, buvo atliktas imuninis nusodinimas, norint gauti „Smurf2“ (MYC IP) arba PIAS3 (FLAG IP), po to imamasi imunologinio tyrimo dėl PIAS3 (FLAG IB, pirmoji panelė) arba „Smurf2“ („MYC IB“, šeštoji plokštė). Buvo patvirtintas Smurf2 (MYC IB, antrasis skydelis) ir PIAS3 (septintasis FLAG IB) nusėdimas. Smurf2 (MYC IB) ir PIAS3 (FLAG IB) ekspresija lizatuose buvo įvertinta imunoblotų metodu, o aktyvinimas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. ( g ) 293T ląstelių lizatai, ekspresuojantys vien Ubc9 ir SUMO arba kartu su skirtingais MYC pažymėtais Smurf2, FLAG pažymėtais SENP1 ar SENP2 deriniais, buvo atlikti Smurf2 sumoilinimo tyrimu (viršutinė plokštė). MYC pažymėto „Smurf2“ ekspresija buvo patvirtinta ląstelių lizatuose, kaip aprašyta a punkte. * Nurodo nespecifinę juostą. h ) Brūkšninė diagrama rodo sumoilinto Smurf2 santykį, normalizuotą iki nemodifikuoto Smurf2 ir išreikštą sumoilinto Smurf2 santykiu, jei nėra SENP1 ar SENP2 koekspressijos (vidurkis ± SEM, n = 4). ( i ) SUMO E2 konjuguojantis fermentas Ubc9 veikia kartu su SUMO E3 ligaze PIAS3, kad susietų ir skatintų Smurf2 sumoilinimą ląstelėse. Reikšmingas skirtumas ** P <0, 01 ir *** P <0, 001 (ANOVA arba t- testas)

Visas dydis

Toliau mes nustatėme SUMO E3 dujų vaidmenį Smurf2 sumoilume. PIAS yra didžiausia „SUMO E3“ dujų šeima. 50, 51 Išmatuotas keturių PIAS šeimos narių PIAS1, PIAS2, PIAS3 ar PIAS4 ekspresijos poveikis Smurf2 sumoilinimui 293T ląstelėse. 25, 45, 51 Tarp PIAS baltymų PIAS3 sustiprino Smurf2 sumoilinimą (3d ir e paveikslai, duomenys nepateikti). Atlikdami abipusius koimunoprecipitacijos tyrimus nustatėme, kad Smurf2 ir PIAS3 ląstelėse sudaro kompleksą (3f pav.). Svarbu tai, kad mes nustatėme, kad PIAS3 sustiprino endogeninio Smurf2 sumoilinimą NMuMG ląstelėse (papildomas paveikslas S2B).

Sumoilinimas yra dinamiškas ir grįžtamasis procesas, atsirandantis dėl SUMO skaldančios SENP šeimos izopeptidazių. 25, 52 Atlikdami in vivo sumoilinimo testus, mes pastebėjome, kad SENP1 ar SENP2, bet ne SENP3 ekspresija sąlygojo 100 kDa ir didesnės molekulinės masės SUMO imunoreaktyviųjų juostų praradimą Smurf2 imunoprecipitatuose (3g ir h paveikslai, o duomenų nėra). parodyta), kas rodo, kad SENP1 ir SENP2 katalizuoja Smurf2 desumoilinimą ląstelėse. Visi mūsų rezultatai rodo, kad SUMO E2 fermentas Ubc9 ir SUMO E3 ligazė PIAS3 skatina, o SUMO izopeptidazė SENP1 / 2 slopina Smurf2 sumoilinimą (žr. Modelį 3i paveiksle).

Kitas žemėlapis sudarė Smurf2 lizino likučius, kurie yra kovalentiškai susieti su SUMO. SUMO konjuguojamas su substratais prie lizino liekanų, esančių pagal SUMO sutarimo motyvą ψKXD / E, kur ψ yra didelė hidrofobinė liekana, K yra lizino liekana, X reiškia bet kokią aminorūgštį, o E / D reiškia glutamo rūgštį arba asparto rūgštį., atitinkamai. Naudodamiesi „SUMOplot“ programine įranga (Abgent, San Diego, CA, JAV) ir SUMO sp2.0 (Guangdžou, Kinija), mes nustatėme du specifinius lizino likučius - K26 ir K369 - kaip numanomas sumoilinimo motyvų, kuriuos išsaugo žmogaus, pelės, konsensuso vietas. ir vištiena „Smurf2“ (4a pav.). Norėdami patikrinti, ar vienas ar abu lizino likučiai, atitinkantys žmogaus Smurf2 26 ir 369 liekanas, yra sumoilinti, mes 293T ląstelėse ekspresuojame žmogaus Smurf2 su Lizinu 26 (K26R) arba 369 (K369R) arba abiem likučiais (KdR), mutavusiais argininu. Lizinų 26 ir 369 mutacija, atskirai arba kartu, sumažino „Smurf2“ sumoilinimo lygį, darant prielaidą, kad šios lizinai yra pagrindinės SUMO akceptorių vietos Smurf2 (4b ir c paveikslai). Mes taip pat apibūdinome „Smurf2“ sumoilinimo vietas, kurios buvo ekspresuojamos kaip „ Renilla“ sulieto baltymo (Rluc-Smurf2) dalis 293T ir NMuMG ląstelėse. Nemodifikuoto „Rluc-Smurf2“ molekulinė masė buvo k 125 kDa, atitinkamai sumoilintas „Rluc-smurf2“ buvo aptiktas apytiksliai 145 kDa molekuline mase 293T ir NMuMG ląstelėse (papildomi S3A ir B paveikslai). Lizinų 26 ir 369 mutacija panaikino sumoilintą Rluc-Smurf2 šiose ląstelėse (papildomi S3A ir B paveikslai). Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad 26 ir 369 lizinai yra pagrindinės SUMO akceptorių vietos Smurf2 skirtingų tipų ląstelėse.

Image

26 ir 369 lizinai yra pagrindinės „Smurf2“ sumoilinimo vietos. ( a ) Žmogaus, pelės ir vištienos „Smurf2“ baltymų seka suderinta pagal regionus, kuriuose yra du konservuoti sumoilinimo sutarimo motyvai. ( b ) Smurf2 sumoilinimo tyrimai 293T ląstelėse, ekspresuojančiose HA pažymėtus SUMO ir Ubc9, atskirai arba kartu su laukinio tipo Smurf2 (WT) arba vienu iš trijų Smurf2 SUMO mutantų, kuriuose 26 ir 369 lizinai buvo paverčiami atskirai arba kartu argininu ( K26R), (K369R) arba (KdR). Smurf2 ekspresija buvo patvirtinta imunoblotavimo lizatais su MYC antikūnais. Imunoblotas aktinui buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Rezultatai, nurodyti b punkte, yra iš reprezentatyvaus eksperimento, kuris buvo pakartotas keturis kartus. c ) Brūkšninė diagrama parodo sumoilinto Smurf2 santykį, normalizuotą nepakeistą Smurf2 ir išreikštą WT Smurf2 kontrolinės dalies santykiu (vidurkis ± SEM, n = 4). Reikšmingas skirtumas ** P <0, 01 (ANOVA)

Visas dydis

Sumoilintas Smurf2 slopina TGF β sukeltą EMT

Toliau mes nustatėme „Smurf2“ sumoilinimo vaidmenį jo gebėjime slopinti EMT.

Palyginome laukinio tipo Smurf2 (Smurf2WT) arba SUMO funkcijų praradimo Smurf2 mutanto, kuriame 26 ir 369 lizinos buvo pakeistos argininu (Smurf2KdR), poveikį TGF β sukeltam acini morfogenezės sutrikimui 3D NMuMG kultūrose. 10 dienų nėra TGF β (100 pM). „Smurf2WT“ ekspresija slopino TGF β indukuoto liumeno užpildymą ir NMuMG acini dezorganizavimą (1e ir 5b paveikslai). Priešingai, „Smurf2KdR“ ekspresija nesugebėjo slopinti TGF β sukelto liumeno užpildymo ir NMuMG acini dezorganizacijos (5b paveikslas). Atvirkščiai, „Smurf2KdR“ raiška sustiprino NMuMG acini užpildymą liumenais, tokiu būdu parodydama Smurf2 numušimo poveikį (1b ir h bei 5b paveikslai bei papildomi S1D ir F paveikslai). Atitinkamai, imunocitocheminiai tyrimai, naudojant E-kadherino antikūną, parodė, kad Smurf2WT blokavo, tuo tarpu Smurf2KdR skatino TGF β gebėjimą sureguliuoti ir sutrikdyti E-kadherino lokalizaciją (5c paveikslas). Šie duomenys rodo, kad sumoilinimas yra labai svarbus Smurf2 gebėjimui slopinti TGF β sukeltą EMT 3D NMuMG išvestose acini struktūrose.

Image

„Smurf2“ veikia nuo sumoilinimo priklausomai nuo epitelio morfogenezės. ( a ) NMuMG ląstelių, ekspresuojančių WT Smurf2 arba SUMO funkcijų praradimo Smurf2, lizatai, kuriuose 26 ir 369 lizinos buvo paverčiamos argininu (KdR), arba ląstelės, transfekuotos vektoriaus kontrole, buvo imunoblotuojamos Smurf2 antikūnu. b ) Neapdorotų arba 100 pM TGF β inkubuotų 10 dienų senumo 3D daugialąsčių struktūrų (įskaitant acini) reprezentatyvūs DIC vaizdai NMuMG ląstelėse, išreiškiančiose WT arba SUMO funkcijų praradimą „Smurf2“, arba transfekuoti vektoriaus kontrole, kaip aprašyta ( a ). Brūkšninė diagrama parodo iš NMuMG gautų kolonijų, rodančių tuščiavidurius acinus, kaip kolonijų morfologijos rodiklį (vidurkis ± SEM, n = 3). Smurf2 smarkiai slopino TGF β gebėjimą sumažinti tuščiavidurių acinų dalį (ANOVA, * P <0, 05). Priešingai, SUMO funkcijų praradimas „Smurf2KdR“ mutantas sumažino acini su tuščiaviduriais centrais dalį, esant arba neturint TGF β (ANOVA, *** P <0, 001). ( c ) 3D NMuMG kultūros, kaip aprašytos b punkte, buvo tiriamos dėl adreno jungties baltymo E-kadherino gausos ir lokalizacijos. Ląstelės buvo identifikuotos dažant branduolį, kaip aprašyta 1c paveiksle. Mastelio juosta = 50 μm ( b ir c ). Rodyklės ir strėlių galvutės rodo nepažeistus ir sutrikusias acinas

Visas dydis

Toliau įvertinome TGF β – Smad kelio vaidmenį sumoilinto Smurf2 gebėjime slopinti EMT. TGF β suriša ir sujungia I ir II tipo Ser / Thr kinazės ląstelių paviršiaus receptorius į aktyvų heteromerinį kompleksą, tuo būdu aktyvuota I tipo receptoriaus kinazė stimuliuoja signalizacijos įvykius pasroviui ir iš jų kylančias reakcijas, įskaitant EMT. 53, 54 Palyginome mažos molekulės inhibitoriaus SB431542 I tipo kinazės receptorių blokados poveikį Smurf2 numušimui arba SUMO Smurf2 mutanto (Smurf2KdR) funkcijos praradimui, siekiant skatinti acini užpildymą ir dezorganizavimą (6a ir 6 pav. b ir papildomi paveikslai S4A ir B). Kaip ir buvo galima tikėtis, iš vektoriaus transfekuotų NMuMG ląstelių gautų 3D daugialąsčių organoidų inkubacija su TGF β receptorių kinazės inhibitoriumi paskatino acini susidarymą ir palaikymą bei padidino E-kadherino gausą esant arba nesant TGF β (6a ir b paveikslai bei papildomas paveikslas). S4A ir B paveikslai). 40 Pažymėtina, kad Smurf2 numušimo arba Smurf2KdR sukeltas acini užpildymas ir E-kadherino dezorganizavimas ir praradimas ar netinkamas kalkinimas buvo pakeisti TGF β Ser / Thr kinazės receptorių blokada, esant arba neturint TGF β (6a ir b paveikslai). Papildomos S4A ir B figūros, leidžiančios manyti, kad TGF β receptorių perduodama signalizacija yra sumoilinto Smurf2 taikinys, siekiant slopinti EMT.

Image

Sumoilintas Smurf2 slopina epitelio morfogenezę, reguliuodamas TGF β receptorius. a ) 10 dienų senumo 3D daugialąsčių struktūrų (įskaitant acini) reprezentatyvūs DIC vaizdai, atvaizduoti NMuMG ląstelėmis, perkeltomis į Smurf2 RNR plazmidę arba kontrolinę U6 RNR plazmidę, kurios liko neapdorotos arba inkubuotos su TGF β I tipo receptorių kinazės inhibitoriumi SB431542 (KI). ) (10 μM ) ir TGF β (100 pM), atskirai arba kartu. Brūkšninė diagrama parodo iš NMuMG gautų kolonijų, rodančių tuščiavidurius acinus, kaip kolonijų morfologijos rodiklį (vidurkis ± SEM, n = 4). TGF β receptorių inhibitorius (KI) reikšmingai slopino TGF β gebėjimą sumažinti tuščiavidurių acinų dalį kontrolinėse ląstelėse (ANOVA, *** P <0, 001). Be to, KI blokavo Smurf2 numušimo galimybę sumažinti acini su tuščiaviduriais centrais dalį, jei nėra ar nėra TGF β (ANOVA, ** P <0, 01, *** P <0, 001). b ) 10 dienų senumo 3D daugialąsčių struktūrų (įskaitant acini) tipiniai DIC vaizdai, transfekuoti tuščiu žinduolių vektoriu arba ekspresijos plazmidė, koduojančia Smurf2KdR ir apdoroti taip, kaip aprašyta a papunktyje. Brūkšninė diagrama parodo iš NMuMG gautų kolonijų, rodančių tuščiavidurius acinus, kaip kolonijų morfologijos rodiklį (vidurkis ± SEM, n = 4). TGF β receptorių inhibitorius (KI) reikšmingai slopino TGF β gebėjimą sumažinti tuščiavidurių acinų dalį kontrolinėse ląstelėse (ANOVA, *** P <0, 001) ir „Smurf2KdR“ galimybę sumažinti acinų, turinčių tuščiavidurius centrus, dalį TGF β buvimas ar nebuvimas (ANOVA, *** P <0, 001). Masto juosta = 50 μm ( a ir b ). Rodyklės ir strėlių galvutės rodo nepažeistus ir sutrikusias acinas

Visas dydis

Signaliniai baltymai Smad2 ir Smad3 yra pagrindiniai TGF β sukeltų atsakų tarpininkai, įskaitant EMT. 55 Atitinkamai, Smad2 ar Smad3 numušimas slopino, o skatindamas Smad2 arba Smad3 ekspresiją, TGF β sugebėjimą sukelti EMT sukelti 3D NMuMG ląstelių išgauntuose acini (papildomi S5A – D paveikslai). Svarbu tai, kad išsiaiškinome, kad Smad3 numušimas smarkiai slopina Smurf2 numušimo ar Smurf2KdR raiškos galimybes sukelti acini užpildymą ir dezorganizuoti NMuMG organoidus, jei nėra ar nėra TGF β (7a ir b pav.). Atliekant imunofluorescencinę analizę, Smad3 numušimas taip pat slopino E-kadherino žemėjimą ir jo netinkamą lokalizaciją Smurf2 numušimo metu arba išreiškiant Smurf2KdR (papildomi S5E ir F paveikslai). Visi šie duomenys leidžia manyti, kad sumoiluotas Smurf2 slopina EMT, reguliuodamas TGF β -Smad kelią.

Image

Sumoilintas Smurf2 slopina epitelio morfogenezę, reguliuodamas Smad3 signalus. a ) Neapdorotų arba 100 pM TGF β inkubuotų 10 dienų senumo 3D daugialąsčių struktūrų (įskaitant acini) reprezentatyvūs NMuMG ląstelių struktūros (įskaitant acini), perkeltos skirtingais Smurf2 ir Smad3 RNR plazmidžių deriniais arba atitinkama kontroline U6 RNR plazmidė. Brūkšninė diagrama parodo iš NMuMG gautų kolonijų, rodančių tuščiavidurius acinus, kaip kolonijų morfologijos rodiklį (vidurkis ± SEM, n = 4). Endogeninio Smad3 sunaikinimas reikšmingai slopino TGF β gebėjimą sumažinti tuščiavidurių acinų dalį kontrolinėse ląstelėse (ANOVA, *** P <0, 001). Be to, „Smad3“ numušimas blokavo „Smurf2“ sugebėjimą sumažinti acinų su tuščiaviduriais centrais dalį, esant arba neturint TGF β (ANOVA, *** P <0, 001). ( b ) Neapdorotų ir 100 pM TGF β inkubuotų 10 dienų senumo 3D daugialąsčių struktūrų (įskaitant acini) reprezentatyvūs NMuMG ląstelių, kartu transfekuotų su Smad3 RNAi plazmidė, ekspresijos plazmidė, koduojančios Smurf2KdR, arba jų kontrolinių vektorių DIC vaizdai. Brūkšninė diagrama parodo iš NMuMG gautų kolonijų, rodančių tuščiavidurius acinus, kaip kolonijų morfologijos rodiklį (vidurkis ± SEM, n = 4). Smad3 numušimas smarkiai slopino TGF β gebėjimą sumažinti tuščiavidurių acinų dalį kontrolinėse ląstelėse (ANOVA, ** P <0, 01), taip pat blokavo „Smurf2KdR“ galimybę sumažinti acini su tuščiaviduriais centrais dalį, esant arba nesant. TGF β (ANOVA, *** P <0, 001). Masto juosta = 50 μm ( a ir b ). Rodyklės ir strėlių galvutės rodo nepažeistus ir sutrikusias acinas

Visas dydis

„Smurf2“ skatina ubikvitino sukeltą I tipo TGF receptorių skilimą. 23, 35 Norėdami sužinoti apie mechanizmus, kuriais sumoiluotas Smurf2 slopina TGF β sukeltą EMT, mes palyginome Smurf2WT ir Smurf2KdR gebėjimą sumažinti I tipo TGF β receptorių (T β RI) gausumą. Kaip ir tikėtasi, „Smurf2WT“ iš esmės sumažino T β RI gausą ląstelėse (8a pav.). Priešingai, „Smurf2KdR“ ekspresija nesugebėjo efektyviai sumažinti T β RI lygio (8a pav.). Smurf2KdR nesugebėjimas efektyviai sumažinti T β RI lygio neatsirado dėl asociacijos stokos, nes koimunoprecipitacijos analizės parodė, kad Smurf2KdR sąveikauja, panašiai kaip Smurf2WT, su aktyvuota T β RI (T β RI (TD); 8b pav.)., teigdama, kad sumoilinimas skatina Smurf2 gebėjimą sukelti T β RI skilimą. „Smad7“ ir „Smurf2“ asocijuojasi dvišaliu būdu, kai „Smad7“ N-galinis domenas (NTD) ir PPXY motyvas sąveikauja atitinkamai su „Smurf2“ HECT ir WW domenais. Visų pirma, asociacija NTD – HECT skatina „Smurf2“ autoubiquinination veiklą įdarbindama E2s į Smurf2. 35, 44, 56, atliekant kontrolinę analizę, KdR mutacija turėjo mažai įtakos arba neturėjo jokio poveikio Smurf2 ryšiui su Smad7 arba Smad7 sukeltai Smurf2 žemyn reguliacijai (8c ir d paveikslai). Pažymėtina, kad „Lysine 369“ yra N-terminale prie HECT srities (8e pav.). Visi šie stebėjimai rodo, kad KdR mutacija neturi specifinio poveikio Smurf2 sąveikai su gimininiu E2 ar Smurf2 autoreguliacijai. C2 „Smurf2“ domenas susijęs su HECT domenu, kad slopintų „Smurf2“ automatinį reguliavimą. 44 lizinas 26 yra C2 domeno N-galo srityje (8e pav.). Atliekant papildomą kontrolinę analizę, lizino 26 arba 369 pavertimas argininu nesugebėjo sumažinti C2 ir HECT domenų sąveikos (8f pav.), O tai rodo, kad KdR mutacija neturi specifinio poveikio Smurf2 vidinei molekulinei sąveikai (8f pav.). C2 domenas reguliuoja „Smurf2“ lokalizaciją ląstelėse. 56, 57, atliekant kontrolinę imunofluorescencijos analizę, Smurf2WT ir Smurf2KdR parodė panašią tarpląstelinę lokalizaciją NMuMG ląstelėse (8g paveikslas). Bendrai kalbant, mūsų duomenys patvirtina mintį, kad Smurf2 sumoilinimas padidina jo gebėjimą skatinti TGF β receptorių skilimą ir taip slopina EMT.

Image

Sumoilinimas reikalingas Smurf2 sukeltai T β RI skaidymui. ( a ) 293T ląstelių lizatai, transfekuoti ekspresijos plazmidėmis, koduojančiomis C-galinius HA pažymėtus TGF β I tipo receptorius (T β RI), C galo HIS žymėtus TGF β II tipo receptorius (T β RII) ir Smad7 kartu naudojant vektoriaus kontrolę arba plazmidę, koduojančią MYC pažymėtą WT Smurf2 (Smurf2WT) arba Smurf2KdR, buvo tiriami T β RI ( α -HA), T β RII ( α- T β RII), Smurf2 ( α- MYC) ir aktino imunoblotai, pastarasis tarnauja kaip įkrovos kontrolė. Kairysis, reprezentatyvus imunoblotas iš eksperimento, kuris buvo pakartotas penkis nepriklausomus kartus. Dešininis, aktino / normalizuotų T β RI lygių vidurkis (± SEM, n = 5). Ekspresija „Smurf2WT“ sumažino T β RI gausą, tuo tarpu „Smurf2KdR“ ekspresija nesugebėjo efektyviai sumažinti T β RI lygio (ANOVA, * P <0, 05, *** P <0, 001). ( b ) 293T ląstelių lizatai, transfekuoti ekspresijos plazmidėmis, koduojančiomis HA žymėtą konstituciškai aktyvų T β RI, kuriame treoninas 204 paverčiamas aspartate (T β RI (TD)) arba kontroliniu vektoriu kartu su MYC pažymėtais Smurf2WT arba Smurf2KdR išreiškiantys, arba jų kontrolinis vektorius buvo paveiktas Smurf2 imunoprecipitacija ( α- MYC IP), po to atliktas T β RI ( α -HA) ir Smurf2 ( α- MYC) imuninis žymėjimas. T β RI (TD) ekspresija buvo patvirtinta imunoblotu. c ) Ląstelių, perkeltų MYC pažymėtu Smurf2WT arba Smurf2KdR, vienkartiniu būdu arba kartu su HA pažymėtu Smad7, lizdai, arba tuščias vektorius buvo paveiktas Smurf2 ( α- MYC), Smad7 ( α -HA) ir aktinu. imunoblotai, pastarasis tarnauja kaip įkrovos kontrolė. Kairysis, reprezentatyvus imunoblotas iš eksperimento, kuris buvo pakartotas keturis nepriklausomus kartus. Dešininis, aktino / normalizuoto „Smurf2“ lygio vidurkis (± SEM, n = 4). Smurf2WT sumažėjimas yra panašus į Smurf2KdR lygio sumažėjimą, kai kartu ekspresuojama Smad7 (ANOVA, *** P <0, 001). ( d ) Ląstelių, perkeltų kaip c punkte, lizatams, buvo atliktas imuninis nusodinimas iš Smad7 ( α -HA IP), po to atliktas Smurf2 ( α- MYC) ir Smad7 ( α -HA) imunoblotas. Smad7 ekspresija buvo patvirtinta imunologiniais tyrimais. ( e, viršutinė) „Smurf2“ schema, rodanti C2 (geltona), WW (violetinė) ir HECT (žalia) sritis ir santykinę 26 ir 369 lizinų vietą C2 ir HECT domenų atžvilgiu. Vidurinėje ir apatinėje schemose pavaizduoti C2-WW (Smurf2C2) ir WW-HECT (Smurf2HECT) Smurf2 delecijos baltymai, išreikšti eksperimentais, parodytais f punkte. ( f ) Lizino 26 arba Lizino 369 mutacija argininui neturi įtakos C2-HECT asociacijai. Affinitetiniu būdu išvalytas FLAG pažymėtas „Smurf2C2“ (WT) arba „Smurf2C2“ (K26R), ekspresuojamas 293T ląstelėse, o kaip vektorius buvo transfekuotos ląstelės kaip kontrolė, naudojant anti-FLAG antikūnų imuninį nusodinimą, po kurio sekė FLAG peptido eliuacija su kiekvienu mėginiu, padalytu į tris lygias dalis ir inkubuotus su ląstelių, perkeltų kontroliniu vektoriu, MYC pažymėta „Smurf2HECT“ (WT) arba „Smurf2HECT“ (K369R) ekspresijos plazmidėmis, lizatai, kuriems atliktas anti-MYC imuninis nusodinimas ( α -MYC IP), po to atliktas FLAG ir MYC imunoblotas. Baltymų, pažymėtų FLAG, raiška buvo patvirtinta ląstelių lizatuose. HC žymi MYC antikūno sunkiąją grandinę. g ) TGF β apdorotų NMuMG ląstelių, reprezentuojančių Smurf2WT arba Smurf2KdR ir turinčių imunocitochemiją, naudojant anti-Smurf2 antikūną (raudonas), reprezentatyvūs vaizdai. Branduoliai buvo vizualizuoti naudojant DNR Hoechst dažymą (mėlyna spalva), mastelio juosta = 50 μm . „Smurf2WT“ ir „Smurf2KdR“ rodo panašią ląstelių lokalizaciją. h ) scheminis modelis, rodantis ryšį tarp „Smurf2“ sumoilinimo ir TGF β indukuoto EMT

Visas dydis

Kartu mes nustatėme naują PIAS3 – Smurf2 sumoilinimo grandį, slopinančią TGF β sukeltą EMT (žr. Modelį 8h paveiksle).

Diskusija

In this study, we have discovered a function for the ubiquitin ligase Smurf2 in the regulation of EMT. Employing 3D cultures of nontransformed mouse mammary epithelial NMuMG cells, knockdown of Smurf2 promotes whereas overexpression of Smurf2 suppresses the ability of TGF β to induce disruption of acinar morphogenesis of NMuMG cells. We have also found that Smurf2 undergoes sumoylation at Lysines 26 and 369 catalyzed by the SUMO E2 enzyme Ubc9 and the SUMO E3 ligase PIAS3. In mechanistic studies, we have found that sumoylation promotes the ability of Smurf2 to induce the degradation of T β RI and thereby suppresses TGF β -induced EMT. These findings advance our understanding of the mechanisms that regulate EMT.

Recent studies have shown that TGF β -induced EMT is regulated by diverse set of post-translational modifications including phosphorylation and ubiquitination. 53, 58, 59, 60, 61, 62 Phosphorylation of specific serine residues of the transcriptional regulator Twist1 activates EMT and cancer metastasis, whereas ubiquitin-mediated degradation of Smads inhibits these processes. 18, 63, 64 In other studies, we have found that sumoylation of the transcriptional regulator SnoN suppresses TGF β -induced EMT. 40, 65 In view of our new findings that Smurf2 suppresses TGF β -induced EMT, these studies suggest a pivotal role of sumoylation in the regulation of EMT.

Besides undergoing sumoylation, Smurf2 is autoubiquitinated and consequently degraded by the proteasome. 44 Both sumoylation and ubiquitination target specific lysine residues, raising the question of whether and how sumoylation and ubiquitination of Smurf2 might be coordinated. Notably, in our analyses we found no appreciable differences in the abundance of WT and SUMO loss-of-function Smurf2. Consistently, we have found that conversion of the lysine SUMO acceptor sites to arginine in Smurf2 does not significantly affect Smad7-dependent downregulation of Smurf2. In addition, our findings suggest that the lysine to arginine SUMO sites conversion within Smurf2 does not affect Smurf2 association with its adaptor Smad7, and presumably its cognate E2. These observations suggest that distinct lysine residues within Smurf2 are targeted by the SUMO and ubiquitination pathways.

Our study also reveals a mechanism by which sumoylated Smurf2 suppresses EMT. Sumoylation enhances the ability of Smurf2 to induce the degradation of T β RI, explaining how sumoylated Smurf2 opposes the actions of TGF β signaling in EMT. In future studies, it will be interesting to determine whether sumoylation regulates the ability of Smurf2 to regulate other pathways besides the canonical TGF β -Smad signaling pathway to control EMT.

Smurf2 regulates diverse biological processes in mitotic and postmitotic cells besides EMT. Smurf2 promotes senescence in fibroblasts, whereas in the nervous system Smurf2 may induce neuronal differentiation and promote neuronal polarization. 66, 67, 68 Whether sumoylation contributes to biological responses of Smurf2 besides EMT will be important to investigate in future studies.

TGF β -induced EMT plays an important role in regulating normal tissue morphogenesis during development as well as cancer invasiveness and metastasis in adults. Our findings that Smurf2 suppresses TGF β -induced EMT in a sumoylation-dependent manner raises the fundamental question of whether this novel link regulates normal epithelial tissue morphogenesis and affects invasiveness and metastasis of epithelial tumors.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

TGF β

transforming growth factor- β

EMT

epithelial–mesenchymal transition

SUMO

small ubiquitin-like modifier

Smurf2

Smad (Sma and mad) ubiquitination regulatory factor-2

PIAS

protein inhibitor of activated STATs (signal transducers and activators of transcription)

SENP

sentrin-specific protease

HECT

homology to E6 carboxy terminus domain

T β RI

TGF β receptor 1

NEM

N -ethylmaleimide

Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento ląstelių mirties ir diferenciacijos svetainėje (//www.nature.com/cdd)