Ultrajautrus igg kiekybinis nustatymas naudojant dna nano-piramides | NPP Azijos medžiagos

Ultrajautrus igg kiekybinis nustatymas naudojant dna nano-piramides | NPP Azijos medžiagos

Anonim

Dalykai

  • Biomedžiagos
  • DNR nanostruktūros
  • Jutikliai ir biojutikliai

Anotacija

DNR yra ne tik genetinės informacijos saugykla, bet ir biopolimeras, kuris gali būti suformuotas į įvairias nanostruktūras. Šis gilus sugebėjimas sukonstruoti įvairias grupes išplėtė savo vaidmenį nuo duomenų saugojimo iki struktūrinės biomedžiagos, skirtos jutimui. Šiame tyrime DNR nanopiramidės (DP) pritvirtintos prie auksinių elektrodų, kad būtų galima nustatyti elektrocheminį imunoglobulino G (IgG), svarbaus antikūno, pagaminto reaguojant į infekciją, jutimą. Piramidinė DNR struktūra ne tik leidžia išvengti įsipainiojimo į kaimyninius zondus, naudojant erdviškai atskiriančius pakabinamus zondus, bet ir sumažina vietinį perpildymo efektą, padidindama bendrą taikinių pakavimą. Elektrocheminės varžos spektroskopijos matavimų rezultatai taip pat rodo, kad DP sluoksnio laidumas yra geresnis, o tuščiavidurė struktūra dar labiau palengvina elektronų perdavimą ir padidina elektrocheminio aptikimo jautrumą. Mes galime selektyviai nustatyti IgG esant kitiems baltymams analitės tirpale. Aptikimo riba buvo 2, 8 pg ml −1 . Mūsų ferrocenu pažymėtas sumuštinių imuninis tyrimas atliekamas 37 ° C temperatūroje, esant neutraliai pH aplinkai. Jis taip pat skleidžia stabilius ir atkuriamus signalus net 1 savaitę laikant 4 ° C temperatūroje, taip parodydamas šios jutimo sistemos galimybes klinikinėms reikmėms.

Įvadas

Diagnostiniai tyrimai yra neatsiejama bet kokio medicininio tyrimo dalis. Daugybė turimų diagnostinių tyrimų gali padėti gydytojams nustatyti ar pašalinti konkrečią ligą (ypač ankstyvoje pradžioje), nustatyti tam tikros ligos stadiją ir net įvertinti skirtingų gydymo būdų tinkamumą. Tam tikroms centrinės nervų sistemos ligoms, tokioms kaip bakterinės ir virusinės smegenų infekcijos bei uždegiminė išsėtinė sklerozė, reikalingas ypač jautrus kraujo ir smegenų skysčio imunoglobulino G (IgG) matavimas. 1, 2 IgG gamina diferencijuotos B ląstelės. Šie antikūnai kontroliuoja infekcijas, jungdamiesi prie svetimų mikrobų ar parazitų antigenų ir juos inaktyvuodami. Ankstesnės infekcijos atveju jautrus padidėjusio IgG kiekio nustatymas suteikia didelį klinikinį pranašumą, nes suteikiama galimybė skirti antibiotikus infekcijos proceso pradžioje. Tačiau dažnai sunku pasiekti greitą ir patikimą IgG tyrimą, nes ankstyvosiose infekcijos stadijose jie dažnai būna ypač žemi. Daug pastangų buvo skirta maksimaliam signalo perdavimui ir ultragarso diagnozės nustatymui, naudojant įvairias signalo stiprinimo strategijas, naudojant fermentus, nanodaleles ir polimerizaciją. 3, 4, 5, 6, 7 buvo pranešta apie naujausią ultragarsinio IgG baltymų aptikimo strategiją, naudojant dvigubo signalo amplifikacijos metodą, susidedantį iš polimerų ir tiramidų paženklintų kvantinių taškų, ir jie, palyginti su nepataisytais metodais, padidėjo beveik 10 kartų. ir galėtų pasiekti aptikimo ribas pikogramos lygyje. 8

Gerai žinoma, kad DNR kaupia genetinę informaciją, svarbią gyvenimui. Tačiau DNR taip pat gali būti traktuojama kaip biopolimeras arba biomedžiaga, nes ji turi tam tikrą grandinės plitimo ir materialistinių savybių nuspėjamumą. 9 Kartu su klasikinėmis „Watsons – Crick“ bazių poravimo taisyklėmis, galima suprojektuoti ir suderinti įdomias ir naudingas nanostruktūras. 10, 11, 12, 13, 14, 15 Keletas pritaikymo pavyzdžių yra biotetai įvairių medžiagų nanofabrikavimui, 12, 16 nanomašinų grįžtamai struktūrinei pertvarkai, 17, 18 platformos biojutėjimui, 19, 20 nanokranų, skirtų narkotikų tiekimui, 21, 22 ir įrankiai vaizdavimui in vivo ir ląstelių biologijai. 23, 24 Visų pirma pastaraisiais metais buvo sukurta elegantiška trimatė (3D) architektūra, kad būtų galima sukurti tiksliai apibrėžtą DNR tetraedrinę struktūrą su statramsčiais, sudarytais vien tik iš dvigubos grandinės DNR. 14 Taip pat nustatyta, kad tą pačią DNR struktūrą galima modifikuoti derinant stechiometriją. 15 DNR tetraedrinė struktūra gali būti laikoma viena iš praktiškiausių DNR nanostruktūrų, ir tai liudija greitą DNR tetraedro vystymąsi biojutėjimui. 25, 26, 27, 28, 29, 30

Vienas iš didžiausių biosensorų iššūkių, kuris labai sumažina prietaiso jautrumą, yra ribota tikslinių molekulių prieiga prie imobilizuotų surišimo dalių, esančių aktyviajame jutiklio paviršiuje. Dėl neišvengiamo kryžminio rišamųjų jungčių maskavimo buvo sunku išlaikyti stabilią ir netrukdomą prieigą prie tikslinių molekulių (1 pav.). Anksčiau mes aprašėme DNR nano piramidę (DP), naudojamą kaip tvirtinimo pastoliai elektrocheminių jutiklių sistemai, kuri galėjo aptikti net 1 p M DNR taikinį. Šie DNR nanostruktūra dekoruoti paviršiai yra tinkami biologiniam tyrimui dėl kelių priežasčių. DP gali būti sintetinamas greitai ir ekonomiškai, savarankiškai surenkant oligonukleotidus skirtingose ​​temperatūrose ir suderinamas su esamais biologiniais tyrimais. Nanostruktūra taip pat stabilizuoja nukreipimo dalis ir sudaro galimybę erdvėje atskirti vieną tikslinį fragmentą nuo jo kaimynų bent 4 nm atstumu, 25 maksimaliai padidinant prieigą prie antigeno molekulių tikslinės dalies dėka ir apeinant paviršiaus pasyvavimo poreikį. Kovalentiniai ryšiai tarp Au elektrodo ir tioliuotos DNR viršūnių suteikia tvirtą inkarą, kuris gali atlaikyti griežtą plovimą, o tai dar labiau sumažina foninius signalus. Dvigubos spiralinės struktūros, apimančios DP statramsčius, standumas taip pat sumažina visos konstrukcijos šoninį lankstymą, o tai dar labiau padidina stabilumą.

Image

Schema, iliustruojanti, kaip lengva naudoti Ab1 imobilizuojant elektrodo paviršių, kai naudojami DP, palyginti su ilgos grandinės MUA molekulės inkaru. Šis prieinamumo paprastumas suteikia bendrą pagerėjimą formuojant sumuštinių kompleksą IgG antigenui aptikti (neparodyta šioje diagramoje).

Visas dydis

Šiame tyrime mes naudojame DP, kad aptiktume baltymų molekules per įprastą sumuštinį imuninę reakciją. Anti-IgG buvo kovalentiškai sujungtas su atskirai esančia karboksilo grupe piramidės viršutinėje viršūnėje, o elektrocheminiams signalams generuoti buvo naudojama ferocenkarboksirūgštis. Feroceno pagrindu veikiančios redokso aktyviosios rūšys ir jų aptikimas sulaukė daugiau dėmesio elektrocheminiam biojutėjimui dėl jų unikalių katalitinių savybių, puikių elektrocheminių reakcijų ir kontroliuojamo bei lengvo paruošimo. 31, 32, 33 Naudodamiesi šia sistema, mes nustatėme tik 2, 8 pg ml −1 IgG ir po savaitės saugojimo pademonstravome selektyvią ir stabilią jutimo sistemą. Mūsų koncepcijos įrodymo tyrimas rodo, kad šis metodas gali būti išplėtotas kaip biologiškai suderinamas, jautrus ir selektyvus analizės metodas, pagrįstas klinikinės diagnostikos DP.

Rezultatai ir DISKUSIJA

FeC-anti-IgG konjugato (FeC-Ab2) charakteristikos

FeC-Ab2 sintezės schema parodyta 2a paveiksle. Du jungiamieji agentai, EDC ir NHS, buvo naudojami amidų jungties tarp anti-IgG grupės su FeC-COOH karboksilo grupe susidarymo katalizuoti. Įvairių komponentų UV matomumo absorbcijos spektrai prieš ir po FeC-anti-IgG susidarymo yra parodyti 2a paveiksle. Grynas FeC-COOH parodė dvi absorbcijos viršūnes ties 310 ir 450 nm (1 kreivė, 2a pav.), Tuo tarpu būdinga smailė ties 250 nm buvo pastebėta dėl anti-IgG antikūnų (2 kreivė, 2a paveikslas). Tačiau po amido jungties susidarymo UV-viz spektras rodė tik vieną absorbcijos smailę esant 265 nm (3 kreivė, 2a pav.), Kurią galima priskirti dėl FeC-COOH (310 nm) ir anti-IgG (250 nm) smailės į vieną smailę. Tai parodė, kad FeC molekulė buvo sėkmingai imobilizuota anti-IgG (Ab2).

Image

DP ir susijusių elektrocheminių mazgų formavimas ir apibūdinimas. a ) UV spinduliuotės absorbcijos spektrai (1) feroceno karboksirūgšties, (2) anti-IgG ir (3) FeC-anti-IgG. ( b ) DNR tetraedro susidarymo gelinė elektroforetinė analizė. 1 juosta žymi tetraedrą, kurio pabaiga yra COOH. Kontrolinis eksperimentas su vienos grandinės (ss) DNR (12, 13, 14, 15 juostos) ir kitais deriniais, neturinčiais vienos krypties (2, 3, 4, 5 juostos) arba dviejų krypčių (6, 7, 8, 9 juostos), 10, 11). c ) Tipiški to paties aukso elektrodo Nyquist grafikai, esantys PBS-10 (pH 7, 4), kuriuose skirtinguose etapuose yra 5 mM [Fe (CN) 6 ] 3− / [Fe (CN) 6 ] 4− ir 0, 1 M KCl: (1) plikas Au elektrodas, (2) DP surinktas Au-DP elektrodas, (3) EDC / NHS aktyvuotas Au-DP elektrodas, (4) anti-IgG imobilizuotas Au-DP-Ab1 elektrodas, (5) IgG antigenu imobilizuotą Au-DP-Ab1-Atg elektrodą ir (6) ferozenu pažymėtą anti-IgG imobilizuotą Au-DP-Ab1-Atg- (FeC-Ab2) elektrodą. Pradėjimas: padidinta pliko Au elektrodo Nyquist diagramoje. d ) Sumuštinio imunologinio tyrimo, naudojant DP modifikuotą Au elektrodą, schema.

Visas dydis

Be to, FeC prisijungimas prie anti-IgG (Ab2) taip pat buvo įrodytas rentgeno fotoelektrono spektru (papildomas paveikslas S1). FeC spektras rodė Fe 2p smailės signalą esant 704, 8 eV jungties energijai (papildomas paveikslas S1, kreivė a). Silpnesnė N1 smailė pasirodė esant 397, 4 eV dėl galimos NH grupės iš tirpiklio HEPES. Kaip ir tikėtasi, anti-IgG XPS spektras parodė akivaizdžią N1s smailę esant 396, 8 eV ir jokio pastebimo Fe 2p smailės. Tačiau po tolesnio sujungimo su FeC, konjuguotojo FeC-Ab2 XPS spektrai parodė dvi reikšmingas N1 smailės ir vieną platesnę Fe 2p smailę, esant atitinkamai jungties energijai kaip atitinkamai anti-IgG ir FeC. Naujos N smailės atsiradimą gali lemti likęs NHS. Abiejų elementų buvimas patvirtino, kad mažos FeC molekulės buvo sėkmingai konjuguotos su antikūnu. Vėliau šis konjugatas bus naudojamas kaip ultra jautrus signalo žymuo elektrocheminiam aptikimui.

VB charakteristikos

DP gali būti laikoma viena iš paprasčiausių 3D DNR struktūrų. Sukurtos 25, 26 DP, sujungiant keturias DNR oligonukleotidų grandines. Gautas produktas buvo išanalizuotas naudojant 12, 5% poliakrilamido gelio elektroforezę (2b paveikslas). Kaip parodyta 2d paveiksle, tų pačių spalvų sekos buvo hibridizuotos, kad būtų suformuoti šeši piramidės kraštai arba briaunos. DP (2b paveikslas, 1 juosta) migravo lėčiau nei įvairios atskiros viengrandės DNR juostos (2b paveikslas, 12–15 juostos) ir kiti įvairūs deriniai (kuriuose nebuvo nei vienos, nei dviejų atskirų gijų grupių - 2b paveikslas, 2 juostos - 2 pav. 11). Mūsų rezultatai buvo gerai palyginti su santykiniu skirtingų rūšių dydžiu. Padidėjęs DP masės ir erdvinės struktūros sudėtingumas kliudė judėti per poliakrilamido gelio poras 25, tuo tarpu kitos struktūros su kompaktiškesnėmis ar linijinėmis struktūromis galėjo lengviau praeiti. Tai patvirtino sėkmingą sudėtingos DNR nanostruktūros surinkimą. 15, 25

DP pagrindu veikiančio imunosensoriaus paruošimas

Kaip parodyta 2d paveiksle, trys oligonukleotidų gijos buvo nutrauktos strategiškai išdėstytomis tiolių grupėmis trijose iš keturių DP viršūnių. Tada tiolių grupė kovalentiškai surišo DP ant Au elektrodo tiksliai tose bazėse. Prieš imobilizavimą, TCEP buvo įpilta į hibridizacijos tirpalą, kad suaktyvintų tiolintą DNR ir sumažintų disulfidų ryšius. TCEP buvimas netrukdė rinkti, todėl gautas produktas galėjo būti naudojamas vėlesniems eksperimentams be jokio gryninimo. Nors tikimasi, kad jokia reakcija negali būti tobulai stechiometrinė, perteklius nesumontuotų sruogų netrukdytų surinkti DP. 35 Likusi netioliuota viršūnė DP viršuje leido cheminiu būdu susieti su skirtingais pakabos zonais, kad būtų galima atlikti biodetekciją (2d paveikslas). Šiame tyrime mes panaudojome karboksilo grupę kaip atskirai esančią grupę viršuje, o netioliuota viršūnė buvo kovalentiškai sujungta su anti-IgG (Ab1). Atlikus imuninį Ab2 ryšį su Atg, šis įprastas sumuštinis imunoreakcija leido elektroaktyviąsias žymes (tai yra, FeC) per Ab2 mobilizuoti arti elektrodo paviršiaus, kad būtų generuojami reikšmingi elektrocheminiai signalai.

Kiekvienam konkrečiam jutiklio surinkimo proceso etapui panaudojome elektrocheminės varžos spektroskopiją. Kaip ir tikėtasi, varžos grafiko aukšto dažnio sritis rodo puslankio modelį. Pavaizduoti redokso zondo [Fe (CN) 6 ] 3−4–4 su puslankio skersmeniu signalai atspindėjo elektronų perdavimo varžą ( R et ). „Randles“ ekvivalentinė grandinė (įdėta papildomame S2 paveiksle) buvo pasirinkta atspindėti tikrąjį elektrocheminį procesą ir nustatyti montavimo varžos vertes, kurios apibūdino mūsų konkrečią sistemą. Šis pasipriešinimas kontroliavo redokso zondo elektronų perdavimo kinetiką elektrodo sąsajoje. Todėl R et vertė ( R2 papildomame S2 paveiksle) yra skirtinga, kai ant elektrodo imobilizuojamos skirtingos medžiagos.

„Nyquist“ brėžiniai parodyti 2c paveiksle. Plikas Au elektrodas, kaip ir tikėtasi, atskleidė labai mažą puslankiu domeną ( R et = 56, 4 Ω, 1 kreivė), reiškiantį santykinai mažą pasipriešinimą redokso zondui. Po elektrodo modifikavimo DP, atsparumas pastebimai padidėjo ( R et = 470, 2 Ω, 2 kreivė), palyginti su pliku Au elektrodu, dėl santykinai žemo DP laidumo. Tai dar kartą patvirtinama, kai viršutinė DP viršūnė buvo suaktyvinta su EDC / NHS tirpalu, dėl to sumažėjo atsparumas ( R et = 284, 1 Ω, 3 kreivė) dėl DP neigiamo krūvio neutralizavimo aktyvavimo proceso metu. Tai leido laidžiosioms [Fe (CN) 6 ] 3–4– rūšims priartėti prie aktyvuoto Au-DP paviršiaus ir pagreitino elektronų perkėlimą tarp redokso fragmentų ir elektrodo. Vėliau aktyvuotas Au-DP buvo inkubuotas Ab1 tirpale ir atsparumas vėl padidėjo ( R et = 708, 4 Ω, kreivė 4) dėl izoliacinio Ab1 baltymo apvalkalo. Tolesnis antigeno ir su ferrocenu pažymėto antikūno sujungimas sugeneruotų palaipsniui storesnį izoliacinį sluoksnį ir laipsniškai didėjančias atsparumo vertes (išsami iliustracija papildomame S2 paveiksle). Šie rezultatai patvirtino, kad sėkmingai pagaminamas elektrodas naudojant smulkius imuninės reakcijos atvejus. Įdomu tai, kad mes taip pat pažymėjome, kad atsparumo pokytis, kurį sukelia FeC-Ab2 surišimas (ΔR (65) = 284, 5 Ω), buvo mažesnis nei Ab1 (ΔR (43) = 624, 3 Ω). Išskyrus šiek tiek sumažėjusį antigeno imobilizuoto elektrodo (Au-DP-Ab1-Atg) rišamųjų vietų skaičių, palyginti su Au-DP- (EDC / NHS) elektrodais, tai greičiausiai yra feroceno kaip elektronų tarpininko naudojimo pasekmė, o tai galėtų paskatinti [Fe (CN) 6 ] 3–4– rūšių pernešimą tarp tirpalo ir elektrodo. Norėdami patvirtinti šią prielaidą, grynas anti-IgG be FeC-COOH buvo tiesiogiai užfiksuotas ant Au-DP-Ab1-Atg elektrodo paviršiaus. Dviejų elektrodų Nyquist diagramos rodo, kad feroceno pagalba modifikuoto elektrodo varža aiškiai mažėja (kreivė a, papildomas paveikslas S3). Tačiau šis rezultatas taip pat patvirtina sėkmingą kovalentinį feroceno sujungimą su antikūnais.

DP pagrindu veikiančio imunosensoriaus voltampermetrinės savybės

Pagrindiniai biosensoriaus komponentai buvo piramidinės DNR nanostruktūra, įtvirtinusi atpažinimo vienetus ant elektrodo paviršiaus, ir FeC-paženklintas antikūnas signalui generuoti. Elektrolito tirpalo elektrolito tirpalo elektrocheminės savybės DP pagrindu pagamintame elektrode buvo ištirtos voltammetriniais matavimais. 3a paveikslas rodo įvairių modifikuotų PBS-10 elektrodų ciklines voltammogramas. Kai „sandwich“ formato reakcija buvo baigta, prie Au-DP-Ab1-Atg- (FeC-Ab2) modifikuoto elektrodo buvo galima pastebėti stabilių ir tiksliai apibrėžtų redokso smailių (5 kreivė, 3a pav.) Porą, kuri rodo efektyvų FeC – anti-IgG biokonjugato etikečių elektrocheminis aktyvumas. DP struktūra netrukdė elektronų ryšiui tarp feroceno fragmentų ir apatinio elektrodo. Tačiau pliko Au elektrodo (1 kreivė, 3a pav.), DP surinktų Au-DP elektrodų (2 kreivė, 3a pav.) Arba gaudymo antikūnų, sujungtų su Au-DP-Ab1elektrodų (3 kreivė, 3a pav.), Smailių nepavyko rasti. . Norint užtikrinti signalo šaltinį, buvo atliktas kontrolinis eksperimentas, naudojant anti-IgG, o ant elektrodo nebuvo imobilizuota FeC etiketė. Tai, kad iš Au-DP-Ab1-Atg-Ab2 elektrodo nebuvo pastebimų ciklinių voltampermetrų smailių (4 kreivė, 3a pav.), Patvirtino, kad anksčiau pastebėtos smailės atsirado dėl FeC, taip pat parodė sėkmingą ir išsamų imunologinį tyrimą. . Išnaudojant unikalią feroceno struktūrą ir elektronines savybes, jautriai galima aptikti specifinį antigeną. Be to, paruošto imunosensoriaus ciklinės voltamogramos skyrėsi skirtingais nuskaitymo greičiais (papildomas S4 paveikslas), kuris atitiko antikūnų pririšto feroceno oksidaciją į fericinio katijoną. 36 Be to, tiek anodinės, tiek katodinės smailių srovės tiesiškai padidėjo, kai nuskaitymo greičio kvadratinė šaknis buvo nuo 50 iki 500 mV s −1 (papildomo S4 paveikslo intarpas), ir tai patvirtino redokso difuzijos kontroliuojamą pobūdį. rūšių šiame procese. 36 Nepaisant ankstesnio darbo, kuris rodo, kad atskiras FeC, surinktas viršutinėje DP viršūnėje, duotų blogus srovės signalus, mes spėliojo, kad dabartinėje sistemoje gali būti įkrovos perdavimo mechanizmas, kad feroteno dalys ant Ab1-Atg- (FeC-Ab2). Kompleksai yra pakankamai lankstūs, kad fiziškai paveiktų elektrodo paviršių ir palaikytų pakankamai aukštą srovės signalą. 37

Image

DP pagrindu veikiantis jutiklis pasižymėjo dideliu IgG specifiškumu ir žemu foniniu signalu net esant nespecifiniams baltymams. a ) Cikliniai įvairių paviršiaus funkcionalizuotų Au elektrodų voltamogramos: (1) plikas Au elektrodas, 2) DP surinktas Au-DP elektrodas, 3) Au-DP-Ab1 elektrodas, (4) Au- DP-Ab1-Atg-Ab2 elektrodas ir (5) ferocenu pažymėtas Au-DP-Ab1-Atg- (FeC-Ab2) elektrodas, nuskaitymo greičiu 100 mv s –1 su PBS-10 palaikančiu elektrolitu (pH). 7.4). b ) DP nanostruktūros pagrindu veikiančios imuninės jautrumo sistemos SWV reakcija, paveikta skirtingais baltymais PBS-1 (pH 7, 4). Kiekvieno baltymo koncentracija yra 1 ng ml −1 .

Visas dydis

Tada SWV buvo naudojamas imunosensoriaus veikimui apibūdinti. Kontroliniai eksperimentai buvo atlikti su DP pagrindu sukurtu jutikliu įvairiuose baltymų tirpaluose. Kai Au-DP-Ab1 elektrodas buvo inkubuotas 1 ng ml –1 IgG antigeno 40 min., Po to inkubuojamas FeC-Ab2 suspensijoje dar 40 min., Buvo gauta nuostabi SWV atsako smailė - 2, 48 μA (kreivė a, Papildoma S5 pav.). Priešingai, po inkubacijos analitės tirpale be jokio baltymo, tačiau vėliau inkubuojant FeC-Ab2, pastebimo SWV atsakymo nepastebėta, o didžiausia srovė buvo tik 0, 034μA (fono signalo srovė; 3b paveikslas). Ultralaidų signalą gali sukelti nespecifinė, bet neišvengiama adsorbcija. Tada, norint patikrinti imunosensoriaus selektyvumą, į bandymo sistemas buvo pridedama netikslinio galvijų serumo albumino ir fibronektino po 1 ng ml −1 . Rezultatai rodė ypač žemus signalus, panašius į foną (3b paveikslas). Tuo pačiu metu, kai imuninis jutiklis buvo paveiktas skirtingais mišinių, turinčių du ar tris baltymus, deriniais, didžiausias srovės kitimas, atsirandantis dėl trukdančių baltymų, buvo <10%. Tai parodė aukštą DP pagrindu veikiančio imunosensoriaus specifiškumą antigeno taikinio atžvilgiu.

Norint dar labiau pagrįsti DP, kaip paviršiaus dengiančių stabilizuotų nanostruktūrų, naudojimo pranašumus, neigiama kontrolė buvo išbandyta naudojant MUA, tiesiogiai pritvirtintą prie Au elektrodo, naudojant tą pačią tio-Au jungties chemiją. Panašus į jutiklį, kurio pagrindą sudaro DP, karboksilo grupė MUA pateikė reaguojančias vietas, galinčias sujungti su užfiksuotu antikūnu (Ab1), taip pat su IgG ir ferrocenu pažymėtu antikūnu prieš elektrodo paviršių per panašias sumuštinių imunines reakcijas. Tačiau imobilizuotos FeC žymės sukūrė elektrocheminį SWV atsaką, kuris buvo daug mažesnis nei DP pagrįsto imunosensoriaus atsakas (4a paveikslas). Prastą MUA pagrindu veikiančio jutiklio veikimą greičiausiai lėmė netvarkingas ir nestabilus savarankiškai surinktas MUA monosluoksnis. Toliau mes hipotezavome, kad šis savarankiškai surinktas MUA viengubas sluoksnis sudaro atsitiktinę varžinę plėvelę virš elektrodo paviršiaus, užkertant kelią laisvam elektronų tekėjimui į paviršių (4a pav.). Buvo atlikti kiti kontroliniai eksperimentai, skirti ištirti šių dviejų tipų konstrukcijų skirtumus ant elektrodų paviršių. 4c paveiksle parodyta DP ir MUA modifikuotų Au elektrodų varža su imunologiniu tyrimu ir be jo. Kaip pastebėta, MUA įtvirtinto elektrodo atsparumas elektronų perdavimui buvo daug didesnis nei DP pritvirtinto elektrodo. Įdomu tai, kad tas pats rezultatas buvo gautas net ir atlikus sumuštinių analizę. Šis ryškus skirtumas leido manyti, kad Au-DP elektrodas turėjo puikias elektrocheminio perdavimo galimybes, pasinaudodamas tuščiavidurės struktūros, susijusios su piramidės DNR sąranka, pranašumais. Kadangi ši atvira struktūra leidžia elektronus persukti tarp elektrodo paviršiaus ir tirpalo, elektroaktyviosios dalys galėtų lengviau prasiskverbti į surinktą sluoksnį. 26 Be to, foninis signalas žymiai padidėjo iki maždaug 0, 19 μA, palyginti su 0, 034 μA iš DP pagrįsto imunosensoriaus. 1 ng ml –1 IgG SWV srovė buvo 1, 24 μA, signalo ir triukšmo santykis buvo tik ∼ 6, 5, parodydamas didesnį piramidinio DNR jutiklio jautrumą. Mes tai priskyrėme DP gebėjimui atstumti baltymus ir palengvinti geresnį antikūnų sujungimo orientavimąsi ir prieinamumą bei sumažinti nespecifinę adsorbciją. 25 Po imunologinio tyrimo MUA sluoksniuotojo elektrodo varža taip pat buvo didesnė nei DP modifikuoto elektrodo, kuris dar labiau palaikė aukščiau pateiktą požiūrį (4c paveikslas).

Image

DP buvimas padidino elektrocheminio signalo dydį ir jautrumą IgG aptikimui. ( a ) DP modifikuotų ir tiolintų MUA modifikuotų elektrodų palyginimas IgG imunologiniame tyrime. b ) DPV pagrindu veikiančio imunosensoriaus SWV atsako srovės esant skirtingiems DP ir f-DP santykiams ir pastoviai bendrajai DNR nanostruktūros koncentracijai. c ) Įprasti „Nyquist“ grafikai skirtingiems modifikuotiems Au elektrodams, esantiems PBS-10 (pH 7, 4), kuriuose yra 5 mM [Fe (CN) 6 ] 3− / [Fe (CN) 6 ] 4− ir 0, 1 M KCl: (1) Au-DP, (2) Au-MUA, (3) Au-DP-Ab1-Atg- (FeC-Ab2) ir (4) Au-MUA-Ab1-Atg- (FeC-Ab2). ( d ) DP nanostruktūros pagrindu veikiančios imuninės jautrumo sistemos SWV srovės kreivės esant skirtingoms IgG koncentracijoms: 0, 01, 0, 02, 0, 03, 0, 04, 0, 05, 0, 1, 0, 5, 1, 5, 10, 100 ir 1000 ng ml −1 . e ) inkubacinio tirpalo, kuriame naudojama ši imuninę jautrumo sistemą, schema apie SWV smailę, palyginti su IgG. Pradėjimas: tiesinis ryšys tarp esamo atsako pokyčio ir IgG koncentracijos žurnalo.

Visas dydis

Ankstesniuose tyrimuose buvo naudojami skiedikliai, tokie kaip 11-merkapto-1-undekanolis ar merkaptoheksanolis, siekiant sumažinti paviršiaus įbrėžimą ir pagerinti bendrą elektrocheminių jutiklių jautrumą. Tačiau norint pasiekti tą patį efektą, kitos strategijos taip pat gali naudoti laisvą DP. 28 Mes ištyrėme praskiedimo įtaką tiolintam DP, neturinčiam -COOH funkcinės grupės (f-DP) (papildomas paveikslas S6). 4b paveiksle parodyta, kad SWV atsakai iš skirtingų DP paviršiaus tankių nustatant DP / f-DP santykį. Kaip tikėtasi, pastebimo reikšmingo srovės padidėjimo dėl praskiedimo nebuvo galima pastebėti. Galima priežastis yra ta, kad dėl nelankstaus ir didelių gabaritų DP susidaro mažas paviršiaus įbrėžimas, o anti-IgG yra tiesiogiai sujungtas su COOH įtvirtintu paviršiumi be jokios išplėstos DNR kaip tilto, jungiančio baltymus po hibridizacijos. Visų pirma, didesnis DP / f-DP praskiedimo santykis lėmė mažesnius signalus, atsirandančius dėl didėjančio paviršiaus pritvirtintų taikinių ir tyrimo zondų praradimo. Todėl DP platforma gali būti tiesiogiai naudojama baltymų aptikimui be jokių papildomų paviršiaus mikro- / nano-modifikavimo strategijų. Atsižvelgiant į šiuos pranašumus, buvo patvirtinta, kad DP pagrįstas imunosensorius gali pasiūlyti jautrų ir specifinį metodą patikimam kiekybiniam tikslinių baltymų aptikimui.

Imunosensoriaus analitinių sąlygų optimizavimas

Darbinio buferio pH turi įtakos imunosensoriaus elektrocheminiam atsakui. Imunokomplekso susidarymas ant elektrodo paviršiaus taip pat priklauso nuo inkubacijos laiko ir temperatūros. Todėl reikia ištirti visus šiuos parametrus, kad būtų galima optimizuoti antigenui būdingą atsaką. Norint rasti optimalų reakcijos pH, imunosensoriniams tyrimams atlikti buvo paruošta elektrolitų buferinių tirpalų serija, kurių pH svyruoja nuo 5, 0 iki 10, 0 (papildomas S7A paveikslas). Rezultatai parodė, kad SWV atsakai padidėjo pH diapazone nuo 5, 0 iki 7, 0, bet sumažėjo, kai pH toliau didėjo. Buvo nustatyta, kad ekstremalios pH sąlygos kenkia imobilizuotiems baltymams, ypač esant šarminėms sąlygoms. Taigi, optimalus šios aptikimo sistemos pH yra 7, 4, o tai yra įprastas pH lygis imunologijos srityje.

Kinetiškai buvo tikimasi, kad antigenai, paimti iš mėginio tirpalo, priklausė nuo inkubacijos laiko, kol nepasiekė termodinaminės pusiausvyros. Papildomas S7B paveikslas parodo tyrimo SWV signalo kitimą, kai reakcijos laikas yra iki 60 min. Didžiausias srovės intensyvumas padidėjo inkubacijos metu iki 40 minučių prieš pasiekiant plokščiakalnį, tai rodo, kad sąveika tarp IgG ir jo giminingų anti-IgG antikūnų pasiekė sotumą. Dėl to šiam imunosensoriui buvo nustatytas 40 minučių inkubacijos laikas.

Papildomas S7C paveikslas parodė bandymo temperatūros poveikį biojutiklio veikimui 20–50 ° C diapazone. SWV srovės kitimas laipsniškai didėjo iki 35 ∼ 37 ° C, bet vėliau smarkiai sumažėjo aukštesnėje temperatūroje. Kadangi didžiausias analitinis signalas atsiranda esant 37 ° C, visi kiti imunologinio tyrimo eksperimentai buvo atlikti 37 ° C temperatūroje.

IgG aptikimas SWV

Tada imunosensorius, kurio pagrindą sudaro DP, buvo tiriamas skirtingomis IgG tirpalo koncentracijomis. Buvo užregistruotos atitinkamos elektrocheminės srovės. 4d paveikslas rodo imunosensoriaus SWV kreives, inkubuotas su daugybe IgG koncentracijų, apimančių penkių didumo laipsnių diapazoną (nuo 10 pg ml –1 iki 1000 ng ml – 1 ) tomis pačiomis optimaliomis sąlygomis. Didžiausios srovės monotoniškai didėjo su IgG tirpalo koncentracija, tai parodo mūsų imunosensoriaus sugebėjimą kiekybiškai įvertinti skirtingas IgG koncentracijas. Svarbu tai, kad atsižvelgiant į neišvengiamą nespecifinę adsorbciją, neigiamos kontrolės, naudojant PBS-1 tirpalą, trūkstant IgG, buvo gautas 0, 034 μA foninis signalas. Tai neturėjo įtakos imunosensoriui, nustatant ultragarsinį IgG, nes dabartinis atsakas, gautas nustatant mažiausią IgG koncentraciją 10 pg ml –1, buvo didesnis nei tuščiame PBS-1 mėginyje. Kitaip tariant, signalą iš 10 pg ml – 1 IgG (0, 6 μA) buvo galima lengvai atskirti nuo foninio triukšmo. Kalibravimo grafikai parodė gerą tiesinį ryšį tarp SWV smailių srovių ir analitės koncentracijos logaritmo, esant IgG linijinei vertei nuo 10 pg ml – 1 iki 10 ng ml – 1 . Tiesinė kreivė buvo pritaikyta prie regresijos lygties I p /μA=2.516+0.9564 log (c / ng ml −1 ), kurios koeficientas yra R = 0, 996, kur I p yra oksidacijos srovė, o c yra IgG koncentracija. inkubavimo tirpale (4e paveikslo intarpas). Aptikimo riba 2, 8 pg ml −1, remiantis šio darbo signalo ir triukšmo santykiu 3, buvo žemesnė, nei buvo pranešta anksčiau, naudojant imunostatorius IgG aptikti. 7, 38, 39 Nepaisant to, kad į mūsų sistemą nebuvo įtraukta signalo stiprinimo chemija, mums pavyko pasiekti aptikimo ribą, kuri yra panaši į kitas sistemas, kurios naudojo signalo stiprinimo strategijas. 8, 39, 40

Imunosensoro atkuriamumas ir stabilumas

Šis imuninis jutiklis IgG yra labai dauginamas, kaip matyti iš didelio tikslumo vidiniame tyrime ir tarp tyrimų. Vidinis tyrimo tikslumas buvo nustatytas nustatant bendrą IgG koncentraciją, naudojant penkis nepriklausomai paruoštus imunosensorių replikatų matavimus, tuo tarpu tarp tyrimų tikslumas buvo įvertintas nustatant bendrąsias IgG koncentracijas, naudojant penkis imunosensorius ant to paties elektrodo. Giminaitis s.ds. vidiniam ir tarpiniam tyrimams buvo gauta atitinkamai 9, 23% ir 8, 55%, tai rodo gerą tikslumą ir atkuriamumą. Po to, kai modifikuotą elektrodą 1 savaitę laikėme PBS-1 4 ° C temperatūroje, mes toliau tyrėme Au-DP-Ab1-Atg- (FeC-Ab2) elektrodo stabilumą. Nebuvo pastebėta jokio reikšmingo SWV signalo kitimo, kai naudojant saugomus ir šviežiai modifikuotus elektrodus buvo aptikta 1 ng ml –1 IgG tirpalo, tai rodo, kad paruošti imunosensoriai turi aukštą laikymo stabilumą ir yra perspektyvūs praktiniam pritaikymui.

Išvados

Šiame darbe mes sėkmingai pasiūlėme universalią labai jautrių IgG imunologinių tyrimų plėtojimo strategiją, naudojant naujus 3D DP – FeC sumuštinių imuninius tyrimus Au elektrodais. Šių DP viršūnės yra chemiškai modifikuotos, kad būtų sudarytos lanksčios dalys, užtikrinančios stabilų paviršiaus tvirtinimą ir lengvą jutiklio jungtį. Puikiems elektrocheminiams signalams generuoti buvo naudojamas ferocenu pažymėtų antikūnų sąranka. Visų pirma, piramidinė struktūra padėjo substrato paviršių su mažesniu perpildymo padengimu ir tiesiogiai padidino analitės prieinamumą. Paaiškėjo, kad paviršiaus tankio skiedimas papildomais reagentais nėra reikšmingas. Dėl didesnio DP standumo ir gebėjimo atstumti baltymus susidarė vienodi ir orientuoti paviršiaus komponentai, taip pat mažesni fono trukdžiai. Be to, tuščiavidurė piramidės struktūra padeda lengvai pernešti elektronus tarp elektroaktyviųjų rūšių ir elektrodo paviršiaus, todėl ši imunologinė analizės sistema leidžia ultragarsiškai nustatyti baltymus. Atsižvelgiant į gerą biologinį suderinamumą ir lankstų cheminį DP modifikavimą, šis IgG aptikimo koncepcijos įrodymo tyrimas rodo, kad ši strategija siūlo jautrų ir perspektyvų metodą būsimiems klinikinės diagnozės tyrimams ir galėtų būti naudojama kuriant biojutiklius, kad būtų perkeltos aptikimo ribos. kitų biologinių taikinių.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „NPG Asia Materials“ svetainėje (//www.nature.com/am)