Padidėjęs sestrinų reguliavimas apsaugo triumius nuo oksidacinio pažeidimo ir fibrozės žmogaus ir eksperimentiniame prieširdžių virpėjime | mokslinės ataskaitos

Padidėjęs sestrinų reguliavimas apsaugo triumius nuo oksidacinio pažeidimo ir fibrozės žmogaus ir eksperimentiniame prieširdžių virpėjime | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Prieširdžių virpėjimas
  • Širdies ir kraujagyslių biologija

Anotacija

Prieširdžių virpėjimas (AF) yra dažnas senyvo amžiaus žmonėms, todėl, siekiant užkirsti kelią su amžiumi susijusioms patologijoms, buvo pasiūlyta sesterinų (Sesns). Šio tyrimo tikslas buvo ištirti Sesno poveikį AF. Buvo surinkti klinikiniai duomenys ir buvo paimtas nedidelis prieširdžių priedų ir prieširdžių mėginys iš pacientų, kuriems atliktas vožtuvo taisymas. Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 išraiška buvo žymiai didesnė pacientams, kuriems yra nuolatinis prieširdžių virpėjimas (PmAF), nei sinusiniam ritmui (SR), ir dar didesnė kairiajame prieširdyje, nei dešiniesiems, PmAF sergantiems pacientams. Superoksido anijonas ir malondialdehidas sustiprėjo ir teigiamai koreliavo su Sesn1 / 2/3 baltymo ekspresija. Reaktyvių deguonies rūšių (ROS) gamyba ir Ca 2+ perteklius žymiai sumažėjo, o ląstelių išgyvenimą pagerino per didelis Sesns 1/2/3 ekspresija kultūrinėse HL-1 ląstelėse. Atvirkščiai, Sesn1 / 2/3 numušimas žymiai padidino ROS ir Ca 2+ perkrovas. Be to, per didelis Sesn1 / 2 ekspresija žymiai sumažino fibroblastų dauginimąsi, taip pat sumažino kolageno ir fibronektino1 baltymų ekspresiją angiotenzino II stimuliuojamuose širdies fibroblastuose. Mūsų tyrimas pirmą kartą parodė, kad Sesno ekspresija yra labai sureguliuota AF, todėl tai gali apsaugoti širdis nuo oksidacinio pažeidimo ir prieširdžių fibrozės.

Įvadas

Prieširdžių virpėjimas (AF), dažniausiai pasitaikanti aritmija, pasireiškia <1% 50–59 metų asmenų ir 11–18% ≥85 metų amžiaus 1, 2 . Visą gyvenimą AF rizika yra 22–26% vyrų ir 22–23% moterų iki 80 metų JAV ir Europoje 3, 4 . Senėjimas yra lėtas, laipsniškas oksidacinio streso didėjimas, dėl kurio susikaupia oksiduoti ir modifikuoti baltymai 5 . AF savaime užsitęsia dėl prieširdžių struktūrinio ir elektrofiziologinio rekonstravimo, kurį padidina oksidacinis stresas. Žmogaus ir eksperimentiniuose AF modeliuose yra oksidacinis stresas, o antioksidantai silpnina prieširdžių elektrofiziologinę rekonstraciją 6, 7, 8 . Oksidacinis stresas skatina nuo Ca 2+ / nuo kalmodulino priklausomos baltymų kinazės II (CaMKII) paveikti tarpląstelinį Ca 2+ kiekį ir prisidėti prie AF 9 . Sestrinai (Sesns) yra citoplazminiai streso baltymai, kurie kaupiasi ląstelėse, patiriamose streso, hipoksijos ar DNR pažeidimo 5, 10 . Anksčiau buvo manoma, kad Sesns yra antioksidantai, kurie slopina reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) kaupimąsi išlaikydami peroksiredoksino aktyvumą 11, 12, 13 . Dėl per didelio Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 ekspresijos sumažėja ROS lygis, tuo tarpu Sesn1 ar Sesn2 išeikvojimas dėl RNR trukdžių kultūringose ​​ląstelėse arba „Sesn2“ išmušimo pelėse padidina ROS lygį 12, 13, 14 . Sesnai taip pat yra linkę sumažinti oksidacinį stresą pašalindami ROS 15, 16, 17 . Be to, bet kuri sąlyga, dėl kurios kaupiasi ROS, gali sukelti Sesno 10 išraišką. Todėl padidėjusi prieširdžių ROS AF gali padidinti Sesno ekspresiją. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti, ar Sesns sukelia žmogaus AF ir ar jos gali sušvelninti oksidacinį stresą, pagerinti ląstelių išgyvenimą ir sumažinti fibrozę pavienėse HL-1 ląstelėse ir širdies fibroblastuose.

Rezultatai

Tiriamųjų pacientų klinikinės charakteristikos

Klinikinės pacientų charakteristikos pateiktos 1 lentelėje. Nebuvo nustatytas reikšmingas skirtumas tarp grupių amžiaus, lyties, reumatinės širdies ligos santykio, kairiojo skilvelio galinio diastolinio skersmens ir išstūmimo frakcijos. Tačiau kairiojo prieširdžio matmenys PmAF grupėje buvo didesni nei SR grupėje ( P <0, 05), o varfarino ir digoksino vartojimas buvo dažnesnis PmAF grupėje nei SR grupėje. Visi kiti vaistai buvo panašūs tarp dviejų grupių. Vidutinė AF trukmė PmAF grupėje buvo 4, 6 ± 3, 4 metų.

Pilno dydžio lentelė

Sesno reguliavimas PmAF pacientams ir ląstelėms

Sesns baltymų vieta prieširdyje buvo nustatyta imunofluorescencijos būdu. Raudona fluorescencija, rodanti Sesns baltymų ekspresiją, buvo plačiai matoma PmAF grupės ląstelių citoplazmoje ir branduolyje. Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 buvo išreikšti didesniu kiekiu PmAF nei SR (1 pav. A). Kaip parodyta 1A pav., „Sesn1“, „Sesn2“ ir „Sesn3“ išraiška taip pat padidėjo spartų HL-1 ląstelių ir AngII stimuliuotų širdies fibroblastų citoplazmoje ir branduolyje. Be to, „Sesns“ ekspresija Western blot'ais patvirtino, kad PmAF reikšmingai padidino Sesn1 ( P <0, 01), Sesn2 ( P <0, 01) ir Sesn3 ( P <0, 01) (1 pav. B). PmAF grupėje Sesn1 ( P <0, 01), Sesn2 ( P <0, 01) ir Sesn3 ( P <0, 05) išraiška LA buvo reikšmingai didesnė nei RA. Be to, Sesn 2 bazinės išraiškos lygis SR sergantiems pacientams yra daug mažesnis nei Sesn 1 (0, 39 ± 0, 13 palyginti su 0, 60 ± 0, 15, P <0, 01) ir „Sesn 3“ (0, 39 ± 0, 13 palyginti su 0, 63 ± 0, 24, P <0, 01). Tačiau Sesn2 smarkiai padidėjo daugiau nei keturis kartus AF sergantiems pacientams, tuo tarpu Sesn 1 ir Sesn 3 tiek nepakito.

Image

( A ) Sesns baltymų, išreikštų prieširdžiuose, vieta, aptinkama imunofluorescencijos būdu. Sesns baltymai dažomi raudona fluorescencija. Branduoliai nudažyti mėlyna fluorescencija. Didinimas: × 100. „Sesns“ baltymų, išreikštų HL-1 ląstelėse, ir širdies fibroblastų, nustatytų imunofluorescencijos būdu, vieta. Sesns baltymai dažomi žaliąja fluorescencija. Branduoliai nudažyti mėlyna fluorescencija. Didinimas: × 400. ( B ) Sesns baltymo išraiška, aptikta naudojant „Western blot“. 1 juosta: molekulinio svorio standartai; 2 juosta: kairysis prieširdis SR grupėje; 3 juosta: dešinysis prieširdis SR grupėje; 4 juosta: kairysis prieširdis PmAF grupėje; 5 juosta: Dešinysis prieširdis PmAF grupėje. Juostų, SR grupės n = 23, PmAF grupės n = 19 * P <0, 05, ** P <0, 01, palyginti su SR grupe, santykinio imunoreaktyvumo kiekybinis įvertinimas; # P <0, 05, ## P <0, 01, palyginti su LA PmAF grupėje. SR = sinuso ritmas; PmAF = nuolatinis AF; LA = kairiajame prieširdyje, RA = dešiniajame prieširdyje.

Visas dydis

Morfologiniai pokyčiai ir seansų ryšys su oksidaciniu stresu pacientų atriume

Kolagenas, aptiktas dažant Masson, parodė, kad SR grupės kolageno tūrio dalis (CVF) buvo 2, 24 ± 0, 29% ir 2, 00 ± 0, 27%, ir padidėjo iki 8, 67 ± 0, 53% ir 8, 22 ± 0, 84% (visi P <0, 01, prieš SR gruopą) AF grupės LA ir RA (2 pav.). O 2 · - gamyba prieširdyje buvo didesnė PmAF sergantiems pacientams, palyginti su SR sergantiems pacientams ( P <0, 01, 3A pav.). Malondialdehidas, kaupiantis iš LA ir RA, taip pat žymiai padidėjo PmAF grupėje, palyginti su SR grupe ( P <0, 01, 3 pav. B). O2 · kiekis buvo teigiamai koreliuojamas su Sesn1 (r = 0, 55, P <0, 01), Sesn2 (r = 0, 57, P <0, 01) ir Sesn3 (r = 0, 49, P <0, 01) baltymų ekspresija (pav. . 3C). Panašus ryšys pastebėtas tarp MDA ir Sesn1 (r = 0, 48, P <0, 01), Sesn2 (r = 0, 52, P <0, 01) ir Sesn3 (r = 0, 34, P <0, 01) (3D pav.).

Image

Prieširdžių kolagenas nulemtas Masson dažymo. Prieširdžių kolagenas dešiniajame ir kairiajame prieširdžiuose pacientams, sergantiems PmAF, buvo žymiai didesnis nei pacientams, sergantiems SR. Parodytas prieširdžių kolageno kiekybinis įvertinimas. SR grupė n = 23, PmAF grupė n = 19, ** P <0, 01, palyginti su SR grupe. SR = sinuso ritmas; PmAF = nuolatinis AF; LA = kairiajame prieširdyje, RA = dešiniajame prieširdyje. Didinimas: × 100.

Visas dydis

Image

( A ) O 2 · - kiekis SR ir PmAF. ( B ) malondialdehido kiekis SR ir PmAF. PmAF grupėje žymiai padidėjo O2 · - ir MDA gamyba iš LA ir RA, palyginti su SR grupe. ( C ) O 2 · kiekis teigiamai koreliuoja su Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 baltymų ekspresija. ( D ) Panašus ryšys pastebėtas tarp MDA ir Sesn1, Sesn2 ir Sesn3. SR grupė n = 23, PmAF grupė n = 19, ** P <0, 01, palyginti su SR grupe. SR = sinuso ritmas; PmAF = nuolatinis AF; LA = kairiajame prieširdyje, RA = dešiniajame prieširdyje.

Visas dydis

Sesns slopina ROS susidarymą pavienėse HL-1 ląstelėse

Ankstesnėse ataskaitose nurodoma, kad ROS vaidino svarbų vaidmenį kuriant AF 6 . Norėdami ištirti „Sesns“ poveikį ROS ląstelėse, kurių tempas yra greitas, HL-1 ląstelėse mes išreiškėme „Sesns“ cDNR arba „Sesns“ siRNR paeiliui veikiančiose HL-1 ląstelėse (4A pav.). Sesnų per didelis ekspresija ir numušimas buvo užfiksuoti Vakarų blotomis (4 pav. B). ROS kiekis buvo analizuotas srauto citometrija (5A pav.). Temperatūra padidino ROS generavimą HL-1 ląstelėse nuo 4, 5 ± 0, 8% kontrolinėje grupėje iki 28, 8 ± 0, 5% tempų grupėje ( P <0, 01), o Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 siRNR padidino ROS kiekį iki 71, 1 ± 0, 3%., Atitinkamai 73, 3 ± 3, 3% ir 65, 3 ± 0, 4% (5B pav., P <0, 01). Be to, laikinai išreikštos Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 cDNR sumažino ROS kiekį atitinkamai 26, 1 ± 2, 7%, 23, 2 ± 2, 3%, 32, 7 ± 3, 3% atitinkamai HL-1 ląstelėse (5B pav., P <0, 01).

Image

( A ) Kairysis skydelis: YC-2-S stimuliatorius ir šešių šulinėlių plokštelės su elektrodo pjūviais; Dešinysis skydas: Žemas skydas: Du lygiagrečiai platinos elektrodai; Ląstelės buvo stimuliuojamos 600 kartų per minutę. ( B ) Sesns baltymo išraiška, aptikta naudojant „Western blot“. Reprezentatyvios imunoblotų juostos. 1 juosta: valdymas; 2 juosta: tempimo grupė; 3 juosta: „Sesns“ grupės ekspresija; 4 juosta: „Sesns“ grupės numušimas. Juostų, n = 6, ** P <0, 01, santykinio imunoreaktyvumo kiekybinis įvertinimas, palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

Image

( A ) srauto citometrija buvo naudojama ROS kiekiui analizuoti tempuotose HL-1 ląstelėse, laikinai transfekuojant Sesns siRNR ir Sesns cDNR 24 valandas. Laikinai ekspresuota Sesn1 / 2/3 siRNR padidino ROS kiekį. Laikinai ekspresuota Sesn1 / 2/3 cDNR sumažino ROS kiekį. ( B ) Santykinės ROS kiekybinis įvertinimas. n = 6, ** P <0, 01, palyginti su kontroline grupe; ΔΔ P <0, 01, palyginti su tempimo grupe; ## P <0, 01, palyginti su tempuojančia + siRNR C grupe; && P <0, 01, palyginti su pacing + pcDNA3.1 grupe.

Visas dydis

„Sesns“ neleidžia Ca 2+ perkrovai spartiose HL-1 ląstelėse

Tarpląstelinis Ca 2+ taip pat buvo stebimas fluorescuojančiai HL-1 ląstelėse. 6 paveiksle parodyti Ca2 + koncentracijos pokyčiai HL-1 ląstelėse. Kontroliuojamomis sąlygomis buvo pastebėti nedideli Ca 2+ koncentracijos pokyčiai. Tempas žymiai padidino Ca 2+ koncentraciją HL-1 ląstelėse ( P <0, 05). Pereinamasis Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 siRNR transfekcija reikšmingai padidino Ca 2+ lygį pagydomose HL-1 ląstelėse ( P <0, 01). Tarpukąstelinio Ca 2+ padidėjimas buvo dramatiškai sumažintas, laikinai ekspresuojant Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 cDNR tempuotose HL-1 ląstelėse ( P <0, 01).

Image

( A ) Srauto citometrija buvo naudojama analizuoti Ca 2+ kiekį spartiose HL-1 ląstelėse, laikinai transfekuojant Sesns siRNR ir Sesns cDNR 24 valandas. Laikinai ekspresuota Sesn1 / 2/3 siRNR padidino Ca 2+ kiekį . Laikinai ekspresuota Sesn1 / 2/3 cDNR sumažino Ca 2+ kiekį . ( B ) Santykinio Ca 2+ kiekybinis įvertinimas. n = 6, ** P <0, 01, palyginti su kontroline grupe; ## P <0, 01, palyginti su tempuojančia + siRNR C grupe; & P <0, 05, && P <0, 01, palyginti su pacing + pcDNA3.1 grupe.

Visas dydis

Sesns pagerintas pagyvenusių HL-1 ląstelių išgyvenimas

HL-1 ląstelių išgyvenamumas buvo stebimas srauto citometrija. Kontroliuojamomis sąlygomis HL-1 ląstelėse buvo pastebėti labai maži fluorescencijos pokyčiai. Lyginimas su PcDNA3.1 transfekcija žymiai sumažino HL-1 ląstelių išgyvenamumą (67, 5 ± 2, 1%, palyginti su 87, 8 ± 4, 1%, P <0, 01) ir laikinai išreikštos Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 cDNR žymiai padidino išgyvenamumą. Paced HL-1 ląstelės sudaro atitinkamai 67, 5 ± 2, 1% iki 78, 1 ± 0, 5% ( P <0, 01), 80, 0 ± 1, 7% ( P <0, 01), 76, 4 ± 0, 5% ( P <0, 01) (7 pav.). Netikėtai Sesns sunaikinimas dėl laikino Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 siRNR transfekcijos nesumažino tempuotų HL-1 ląstelių išgyvenamumo.

Image

( A ) HL-1 ląstelių išgyvenimas po laikino Sesns siRNR ir Sesns cDNR transfekcijos buvo stebimas srauto citometrijos metodu. B ) Kiekybinis išgyvenamumo rodiklis. Kontrolinėmis sąlygomis HL-1 ląstelėse buvo labai mažų fluorescencinių variacijų. Stūmimas reikšmingai nepakeitė HL-1 ląstelių išgyvenamumo. Sesnų nutildymas atliekant laikiną Sesn1 / 2/3 siRNR transfekciją nesumažino tempuotų HL-1 ląstelių išgyvenamumo. Laikinai ekspresuota Sesn1 / 2/3 cDNR žymiai pagerino pagyvenusių HL-1 ląstelių išgyvenimą. n = 6, ΔΔ P <0, 01, palyginti su tempimo grupe; && P <0, 01, palyginti su pacing + pcDNA3.1 grupe.

Visas dydis

Sesns slopina AngII sukeltą širdies fibroblastų proliferaciją ir kolageno sintezę

Norėdami ištirti Sesns poveikį širdies fibrozei, mes panaudojome CCK-8 metodą širdies fibroblastų (CF) proliferacijai nustatyti. Kaip parodyta 8A pav., Per didelis Sesn1 ir Sesn2 ekspresija širdies fibroblastuose žymiai sumažino fibroblastų proliferaciją ( P <0, 05). Toliau mes išanalizavome mRNR raiškos lygius COL I / III ir FN1. Kaip parodyta 8B – D pav., Ang II sukėlė COL I / III ir FN1 mRNR ekspresijos padidėjimą ( P <0, 01). Priešingai, padidėjusi Sesn1 ir Sesn2 ekspresija reikšmingai susilpnino Ang II sukeltą COL I ir FN1 mRNR raišką ( P <0, 05). Norėdami patvirtinti mRNR radinius, mes nustatėme Sesn1 ir Sesn2 poveikį baltymų ekspresijai COL I / III ir FN1. Kaip parodyta 8E – H pav., AngII sukeliamai stipriai padidėjo COL I / III ir FN1 ( P <0, 05), o poveikį aiškiai slopino „Sesn1 / 2“ perreguliavimas ( P <0, 05). Šie rezultatai parodė, kad Sesn1 ir Sesn2 neigiamai reguliuoja AngII tarpininkaujamų CF proliferaciją.

Image

( A ) CCK8 metodas buvo naudojamas širdies fibroblastų proliferacijos, sukeltos AngII ar / ir Sesn1 / 2 cDNR trumpalaikio transfekcijos, analizei. Širdies fibroblastų ( B - D ) mRNR lygiai širdies fibroblastų indukuotame dėl AngII ar (ir) laikino Sesn1 / 2 cDNR transfekcijos buvo matuojami RT-PCR. ( E - H ) COLI, COLIII ir FN1 baltymų kiekis širdies fibroblastų indukuotame dėl AngII ar (ir) laikino Sesn1 / 2 cDNR transfekcijos buvo matuojami Western blot metodu. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM (n = 6). ** P <0, 01, palyginti su kontroline grupe; # P <0, 05, palyginti su Ang II grupe.

Visas dydis

Diskusija

Pagrindinės tyrimo išvados

Šis tyrimas pirmą kartą įrodė, kad Sesns ekspresija RA ir LA yra žymiai labiau sureguliuota PmAF pacientams, palyginti su SR. Didesnis O 2 · ir MDA yra susijęs su aukštesne Sesns išraiška. Be to, apsauginį Sesns poveikį patvirtino padidėjęs genų ekspresija ir numušimas pavienėse HL-1 ląstelėse ir širdies fibroblastuose. „Sesns“ perdėta ekspresija žymiai sumažino oksidacinį stresą ir pagerino ląstelių išgyvenimą tempo HL-1 ląstelėse, tuo tarpu „Sesns“ numušė siRNR sukeltą ROS kaupimąsi. Be to, per didelis Sesn1 ir Sesn2 ekspresija slopino Ang II stimuliuotų širdies fibroblastų proliferaciją ir kolageno sintezę. Taigi, sukeltas kaip endogeninis apsauginis faktorius Sesns, gali apsaugoti nuo oksidacinio pažeidimo ir fibrozės AF.

Palyginimas su ankstesniais tyrimais

Sesnai yra citoplazminiai streso baltymai, kurie kaupiasi ląstelėse, patiriamose streso, hipoksijos ir DNR pažeidimo 5, 10 . Čia mes nustatėme, kad pacientams, sergantiems PmAF, išreikštas žymiai didesnis Sesns lygis nei SR, o tai gali būti priskiriama padidėjusiam PmAF pacientų oksidaciniam stresui (3 pav.). Tas pats padidėjimas pastebėtas ir tempo HL-1 ląstelėse (5 pav.). Tyrimais įrodyta, kad pats AF sukelia virpančiame prieširdžių audinyje ROS ir oksidacinį stresą 18, 19, taigi, esant tokiai būsenai, Sesns gali pakilti. Šie rezultatai atitinka ankstesnį tyrimą, kuris parodė, kad bet kokia būklė, dėl kurios kaupiasi ROS, gali sukelti Sesno išraišką 10, 20 . Įdomu tai, kad Sesns išraiška buvo didesnė LA nei RA PmAF, o tai iš dalies dėl AF gali sukelti didesnius O 2 · - produkcijos pokyčius LA ar LAA, nei RA ar RAA 18 . Mūsų tyrime taip pat buvo pastebėta tendencija, kad MDA pasiūlė daugiau oksidacinio streso padidėjimo LA nei PmAF, bet RA, nors statistinio skirtumo nepastebėta (P = 0, 07). Prieširdžių audinio AF tyrimas su gyvūnais rodo oksidacinio streso gradientą su didesniu oksidaciniu stresu kairėje 18, tačiau tai nėra 21, 22 žmonėms. Taigi, be oksidacinio streso, turėtų būti apsvarstyti ir kiti mechanizmai, tokie kaip slėgis, endokrininė funkcija ir Ca 2+ homeostazė LA 19, 23, kuria LA skiriasi nuo RA, ir kuriuos reikia ištirti toliau.

Pažymėtina, kad mūsų tyrimas rodo, kad Sesnos yra reikšmingos bazinės išraiškos lygio skirtumai. SR sergantiems pacientams „Sesn 2“ išraiška yra daug mažesnė nei „Sesn 1“ ir „Sesn 3“, tačiau AF padidėja labiau nei „Sesn 1“ ir „Sesn 3“. Tai leistų manyti, kad Sesn 2 yra pagrindinis potipis, kurį sukelia AF oksidacinis stresas. Panašiai ta pati tendencija buvo pastebėta ir pagreitėjusių HL-1 ląstelių tyrime. Kituose tyrimuose taip pat buvo įrodyta, kad „Sesn 2“ yra pagrindiniai streso baltymai, kuriuos sukelia oksidacinis pažeidimas ir kurie suteikia didelę apsaugą nuo širdies ir kraujagyslių ligų 24, 25 . Todėl AF sukeliamos skirtingos Sesns potencijos, todėl gali būti, kad Sesn 2 vaidina svarbesnį vaidmenį patologiniame AF procese, tuo tarpu Sesn 1 ir Sesn 3 veikia tiek fiziologinėmis, tiek patologinėmis sąlygomis.

Oksidacinis stresas skatina elektrinę ir struktūrinę rekonstrukcijas, kurios prisideda prie AF vystymosi ir progreso. Priešuždegiminiai ir antioksidantai apsaugo prieširdžių elektrinį atstatymą gyvūnų modelių AF ir sumažina pooperacinio AF pasireiškimą žmonėms 6, 7, 8 . Šilumos šoko baltymai (HSP), citoplazminio streso baltymai, padidėja AF ir apsaugo nuo prieširdžių tachikardijos sukeltos rekonstrukcijos ląstelių ir gyvūnų modeliuose 26, 27, 28 . Gydymas HSP induktoriu geranilgeranilacetonu (GGA) padidina HSP ekspresiją, slopina ugniai atsparumą ir apsaugo nuo AF šunims, kuriems pasireiškia prieširdžių tachizavimas 26 . Tačiau duomenys yra prieštaringi. Ankstesnis tyrimas pasiūlė, kad vien tik GGA be išemijos nekeičia elektros laidumo ar AF trukmės 29 . Nors Hsp 27 ekspresija pastebimai padidėja paroksizminiame AF, palyginti su SR ir patvariu AF, daugumos HSP, pvz., Hsp40, Hsc70, Hsp70 ir Hsp90 28, ekspresijoje pokyčių nėra. Kaip ir HSP, Sesns taip pat yra citoplazminiai streso baltymai, pasižymintys oksidoreduktazės aktyvumu ir galintys veikti kaip antioksidantai 12 . Tačiau Sesnai yra plačiai išreiškiami net nesant egzogeninio streso. Drosofiluose brendimo metu dSesn ekspresija padidėja 10, 20 . Žmonėms visi Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 yra ekspresuojami prieširdžiuose be streso (parodyta 1 pav.). Be fiziologinių sąlygų, mes pirmą kartą parodome, kad visų rūšių seansai yra sureguliuojami žmogaus AF ar tempiant HL-1 ląsteles. Šie rezultatai atitiko ankstesnius tyrimus, kurie rodo, kad Sesns yra citoplazmos streso baltymai, kaupiantys ląstelėse, veikiamose oksidacinio streso 5, 12 . Taip pat „Sesns“ demonstruoja apsaugą nuo oksidacinio pažeidimo ir fibrozės eksperimentiniame AF, atitinkančiame tyrimus, kad „Sesns“ gali apriboti kepenų pažeidimus ir fibrozę esant lėtiniam ER stresui ir vėl apsaugoti inkstų kanalėlius nuo streso ūminio inksto pažeidimo metu .

Sesns kaip apsauginis faktorius

Sesnų fiziologinės funkcijos išlieka silpnai apibrėžtos. Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis tyrimas, kuriame pranešama, kad visi Sesnai stiprėja žmogaus AF ir reguliuoja širdies ritmo miocitus nuo oksidacinio streso. Čia parodyta, kad Sesns yra teigiamai koreliuoja su oksidaciniu stresu žmonėms ir tempia HL-1 ląsteles, o tai rodo, kad oksidacinis stresas gali būti Sesns padidėjusio reguliavimo tokiomis sąlygomis priežastis. Dėl to Sesno kompensacinis reguliavimas padidina žalą, kurią sukelia oksidacinis stresas. Tačiau tokio tipo kompensacinio mechanizmo nepakanka, kad būtų išvengta oksidacinio streso AF, atsižvelgiant į tai, kad ROS kaupiasi žmogaus AF ir tempia prieširdžių ląsteles nepaisant jų reguliacijos. Be to, per didelis Sesno ekspresija sumažina ROS kiekį, padidina ląstelių išgyvenamumą ir slopina fibrozę pavienėse HL-1 ląstelėse ir širdies fibroblastuose, kas rodo, kad egzogenetiniai Sesnai gali būti apsauginiai ir naudingi AF. Kai kurie kiti tyrimai taip pat rodo, kad Sesns gali atlikti svarbų vaidmenį reguliuojant širdies patofiziologiją ir suteikti apsaugą 24, 32, 33 . Drosophila širdyje būdingas dSesn išsekimas sukėlė širdies išsiplėtimą, aritmijas ir sutrikimus 10 . Buvo nustatyta, kad „Sesn2“ baltymai kaupiasi širdyje išeminių būklių metu, apsaugodami širdį nuo išemijos ir reperfuzijos sužeidimo 24 . Sesn1 slopina angiotenzino II sukeltą fibroblastų proliferaciją ir kolageno gamybą širdies ląstelėse34. Taigi padidėjęs Sesns skaičius AF sergantiems pacientams patvirtina nuostatą, kad ROS sukelti Sesns yra endogeninis kompensacinis mechanizmas, neleidžiantis vystytis AF.

Mechanizmai, kuriais įvairių rūšių Sesns suteikia kardioprotekciją AF, nėra visiškai suprantami. Apsauginė „Sesns“ funkcija AF veikiausiai vykdoma dviem būdais. Vienu būdu Sesns antioksidacinis aktyvumas in vitro ir in vivo palengvina oksidacinį pažeidimą ir apsaugo AF 10, 11, 12, 13, 14 . Šiame tyrime Sesns perdėta ekspresija sumažino ROS gamybą 20–30% tempo HL-1 ląstelėse. Antrame būde Sesns slopina fibrozę, kuri yra svarbus struktūros indėlis į AF substrato formavimąsi. Mes parodome, kad Sesn1 ir Sesn2 slopina ląstelių proliferaciją ir fibrozę širdies fibroblastų stimuliuojamose AngII, tai atitinka kito tyrimo duomenis 34 . Rapamicino (TOR) ir TGF-beta signalų taikinys yra du galimi mechanizmai, susiję su Sesns antifibrozės funkcija 35, 36, 37 . TOR hiperaktyvumas yra susijęs su širdies fibroblastų aktyvacija patiriant 35 stresą, o TOR slopinimas gali palengvinti lėtinio slėgio sukeltą kairiojo skilvelio hipertrofiją ir širdies fibrozę36. Kaip TOR signalizacijos 10, 11 inhibitorius, Sesns, kaip spėjama, sušvelnina fibrozę AF.

Tačiau apsauginė Sesns funkcija gali būti nepriklausoma nuo oksidacinio streso, nes mūsų duomenys rodo, kad pagyvenusių HL-1 ląstelių išgyvenimas nepablogėjo, kai Sesnas numušė siRNR, nepaisant to, kad akivaizdus Sesns įvedimo poveikis oksidaciniam stresui ir išgyvenimui. Ankstesniame tyrime teigiama, kad ROS taip pat gali būti apsauginė, kaip apsauga nuo signalo ir galinti sukelti stresą, kuris lemia išgyvenimą 38 . Kiti apsaugos mechanizmai yra numatyti šiame tyrime ir ateityje turėtų būti toliau tiriami.

Potenciali Sesno regresijos reikšmė prieširdžių virpėjime

Sesns sukeliamos pacientams, sergantiems PmAF, kuris gali būti endogeninis apsauginis mechanizmas, siekiant išvengti AF. Oksidacinis stresas buvo susijęs su struktūriniu ir elektrofiziologiniu AF pertvarkymu, o antioksidantai užkerta kelią prieširdžių atstatymui ir AF dažniui 7, 8 . Taigi, kaip antioksidantai, „Sesns“ tikriausiai susilpnina AF substratą ir slopina prieširdžių persitvarkymą AF 11, 12, 13 . Čia parodyta, kad dėl per didelio Sesns ekspresijos sumažėja ROS kiekis, pagerėja ląstelių išgyvenimas pagreitėjusioje HL-1 ląstelėje, taip pat slopinamas proliferacija ir kolageno gamyba širdies fibroblastuose, kuriuos sukėlė AngII. Įrodyta, kad Sesns užkerta kelią su amžiumi susijusioms patologijoms, tokioms kaip vėžys ir II tipo diabetas. 10, 32, 39 . AF taip pat yra su amžiumi susijusi liga, todėl Sesns gali to išvengti. Taigi, kaip ir B tipo natriuretinio peptido poveikis širdies nepakankamumui 40, mūsų rezultatai pateikia naujų įrodymų, kad Sesns yra sukeltas ir apsaugo AF, ir jie gali būti naudojami kaip galimas terapinis taikinys klinikiniam AF gydymui.

Galimi apribojimai

Pirmiausia mes pademonstravome Sesns apsaugą HL-1 miocituose ir širdies fibroblastuose, bet ne tiesiogiai AF sergantiems pacientams. Nors HL-1 ląstelės plaka spontaniškai, jų elektrofiziologinės, funkcinės ir metabolinės savybės auginimo metu yra pakitusios. Antra, dauguma į šį tyrimą įtrauktų pacientų sirgo reumatine širdies liga. Nors grupės buvo gerai suderintos dėl reumatinės širdies ligos, reumatinis karščiavimas daro įtaką oksidaciniam stresui, todėl gali paveikti Sesno lygį. Trečia, mes nenustatėme priežasties ir pasekmės ryšio tarp ROS ir Sesns, taip pat išsiaiškinome, ar Sesns veiksmai daro tiesioginį ar netiesioginį poveikį oksidaciniam stresui. Ketvirta, transfekcija tuščiu vektoriu ar kontroline RNR sukelia reikšmingą oksidacinio streso padidėjimą, o tai turėtų įtakos tyrimo rezultatams. Turėtų būti naudojama kita priemonė nukleotidų įvedimui, kurie negalėjo paveikti oksidacinio streso. Penkta, ROS ir išgyvenimo prieštaravimai, rodantys papildomus Sesns kardioprotekto mechanizmus, nepriklausančius nuo oksidacinio streso, yra nurodyti šiame tyrime ir turėtų būti toliau tiriami ateityje.

Santrauka

Sesnos yra indukuojamos kaip endogeninis AF apsauginis faktorius, kuris apsaugo prieširdžius nuo oksidacinių pažeidimų ir fibrozės. Tačiau kompensacinio Sesns padidėjimo AF nepakanka norint užkirsti kelią šios rūšies ligai, todėl manoma, kad papildomos egzogenetinės Sesns yra būtinos ir naudingos AF gydymui. Šis identifikavimas suteikia įžvalgos apie molekulinį AF pagrindą ir siūlo terapinius įprastų ritmo sutrikimų taikinius.

Medžiagos ir metodai

Pacientų

Audinių mėginiai iš dešiniojo prieširdžio (RA) ir kairiojo prieširdžio (LA) priedų buvo paimti iš 42 pacientų, kuriems nuo 2011 iki 2013 m. Atlikta širdies operacija dėl vožtuvų pakeitimo Pirmojoje dukterinėje ligoninėje ir Antrojoje dukterinėje ligoninėje, Harbino medicinos universitete. Visi pacientai. sirgo vožtuvų širdies liga ir nemaža dalis pacientų sirgo reumatinėmis širdies ligomis. Pacientai buvo suskirstyti į dvi grupes: nuolatinės AF grupės (PmAF, n = 19), kurioje pacientų AF istorija buvo> 6 mėnesiai, o operacijos metu atlikta elektrokardiografiškai dokumentuota AF; ir sinuso ritmo grupė (SR, n = 23), kurioje pacientai neturėjo dokumentais užfiksuoto AF ir neturėjo anamnezės. Visiems pacientams prieš operaciją buvo pašalinti kepenų ir inkstų funkcijos sutrikimai, neoplastinės ligos ir uždegimas. Širdies dydis ir funkcija buvo matuojami atliekant echokardiografiją („Philips iE33“, Olandija). Hitopatologiniam tyrimui viena prieširdžio ir pakaušio audinių dalis buvo fiksuota 4% formalinu, o likęs audinys buvo užšaldytas skystame azote ir laikomas –80 ° C temperatūroje imunofluorescencijai, Western blot tyrimui ir kitoms analizėms atlikti. Tyrimą patvirtino Harbino medicinos universiteto Pirmojo klinikinio kolegijos etikos komitetas, ir visi pacientai davė informuotą sutikimą. Visi metodai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių.

HL-1 ląstelių kultūra ir tempas

HL-1 prieširdžių miocitus, gautus iš suaugusių pelių prieširdžių, padovanojo profesorius Williamas Claycombas (Luizianos valstijos universitetas, Naujasis Orleanas, LA, JAV). Ląstelės buvo auginamos pilnoje „Claycomb“ terpėje (JRH Biosciences, JK), pridedant 100 μmol / L norepinefrino (sudaryto iš 10 mmol / L norefininefrino (Sigma, JAV), ištirpinto 0, 3 mmol / L L-askorbo rūgšties (Sigma, JAV))., 4 mmol / L L-glutamino (Gibco, Nyderlandai) ir 10% FBS (Gibco, Nyderlandai). Miocitai buvo inkubuojami kolbose, padengtose 0, 02% želatinos (Sigma, JAV) ir 12, 5 μg / ml fibronektino (Sigma, JAV) 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 atmosferoje. Bazinis HL-1 ląstelių dažnis buvo apie 0, 5 Hz. AF ląstelių modeliai buvo sukurti stimuliuojant lauką 600 kartų per minutę 12 h (10 Hz / 5 ms, 1, 0 V / cm; YC-2-S stimuliatorius, Čengdu instrumentų gamykla, Kinija). Du platinos elektrodai, kurie buvo išdėstyti lygiagrečiai, buvo naudojami HL-1 elementų tempimui lauke (parodyta 4 pav.).

Širdies fibroblastų izoliacija ir kultūra

Širdies fibroblastai buvo išskirti iš naujagimių SD žiurkių (iš Harbino medicinos universiteto Antrosios dukterinės ligoninės gyvūnų laboratorijos centro). Visas eksperimentines su gyvūnais procedūras patvirtino Harbino medicinos universiteto (Kinija) etikos komitetas ir jos atitinka paskelbtas NIH tyrimų su gyvūnais gaires (NIH leidinio Nr. N01-OD-4–2139, 8 -asis leidimas, 2011 m.). Širdelės buvo supjaustytos gabalėliais ir į ląsteles 20–30 kartų pridedama 0, 25% „trippson-EDTA“ tirpalo („Beyotime“ biotechnologija, Kinija). Virškinamieji skysčiai buvo suderinti vienas su kitu HG-DMEM (Dulbecco modifikuotos Eagle terpės dideliu gliukozės kiekiu, Gibco, Nyderlandai), papildyta 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS, Gibco) ir 1% 1X penicilino-streptomicino tirpalu (Gibco, Olandija). Tada ląstelės filtruojamos ir 5 minutes centrifuguojamos esant 2000 aps./min., 4 ° C. Kardiomiocitai buvo išskirti iš prigludusių fibroblastų po 1, 5 valandos inkubacijos. Fibroblastų praleidimui buvo naudojami 0, 25% trypsono-EDTA ir fenolio raudonojo (Gibco, Nyderlandai). Fibroblastus buvo galima surinkti 2 kartus perėjus. Visos ląstelės buvo inkubuotos aukščiau esančioje kultūroje 37 ° C, 5% CO2. Širdies fibroblastų stimuliavimui buvo naudojamas 1 μM Ang II. Ląstelių proliferacija buvo matuojama CCK-8 tyrimu.

Sesno raiška ir numušimas

Visa RNR buvo ekstrahuota iš HL-1 ląstelių, naudojant RNAiso Plus (Takara D9108A), ir cDNR buvo gauta naudojant atvirkštinę transkripciją. Gruntus sintezuoja ribotos atsakomybės bendrovė „Harbin Boshi Biotechnology“ (parodyta 1 papildymo duomenyse). Į PGR reakcijos mišinį buvo įtraukta: cDNR šablonas 2, 5 μl; Ex Taq 0, 5 μl; dNTP 5 μl; 10 × PGR buferis 5 μl; Jutimai 2 μl; antisense 2 μl; ir dd H 2 O 33 μl. Trisdešimt penki PGR amplifikacijos ciklai buvo atlikti taip: 94 ° C 10 minučių, 94 ° C 30 sekundžių, 60 ° C 30 sekundžių, 72 ° C 2 minutes ir 72 ° C 10 minučių. PGR produktai buvo išgryninti naudojant 1% agarozės gelio elektroforezę, naudojant AxyPrep DNR gryninimo rinkinį (Axygen, JAV). PcDNA3.1-Sesn1, PcDNA3.1-Sesn2 ir PcDNA3.1-Sesn3 buvo sukonstruoti klonuojant cDNR į pcDNA3.1 vektorių „EcoR I / Kapn I“ vietą (Invitrogen, JAV). Trumpos trukdančios RNR, nukreiptos į „Sesn1“, „Sesn2“, „Sesn3“ ir neigiamą kontrolę, buvo susintetintos „GenePharma co, Ltd“ (Šanchajus, Kinija) (parodyta 2 papildymo duomenyse). HL-1 ląstelės buvo transfekuotos PcDNA3.1-Sesns 72 valandas arba siRNR, nukreipiančiomis į Sesns 72 valandas, naudojant Lipofectamine 2000 (Life Technologies, JAV) 6 šulinėlių plokštelėse. Panašiai Sesn1 ir Sesn2 buvo per daug ekspresuojami širdies fibroblastuose. Viršutinė Sesno ekspresija ir nutildymas buvo nustatyti naudojant SYBR realaus laiko kiekybinę PGR su SYBR „One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II“ (TaKaRa) (pradmenų sekos buvo parodytos 3 papildymo duomenyse), taip pat atliekant Western blot metodus.

Imunofluorescencija

Sesn1, Sesn2 ir Sesn3 imunofluorescencinis dažymas buvo atliekamas užšaldytuose skyriuose. Objektyvai buvo permeabiluojami 0, 4% Triton X-100 fosfatu buferiniame druskos tirpale (PBS), nuplauti ir užblokuoti kambario temperatūroje 10% galvijų serumo albumino (BSA). Skyriai buvo inkubuojami su anti-Sesn1 (Abcam, JAV), anti-Sesn2 (Santa Cruz Biotechnology, JAV) ir anti-Sesn3 (Abcam, JAV) antikūnais per naktį 4 ° C temperatūroje. Objektyvai buvo inkubuojami su Alexa Fluor 594 antikūnais (Molecular Probes, JAV) kambario temperatūroje. Nuclei were stained with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich, USA) and images were captured by a laser-scanning confocal microscope (Olympus, Japan). Three paraffin sections were made for every patient and three fields were evaluated in every section. Cells were seeded on glass coverslips and cultured for 24 h in DMEM (10% FBS). Cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 20 min at room temperature. Cells were washed with PBS and blocked with 3% BAS for 1 h, then incubated with anti-Sesn1 (Abcam, USA), anti-Sesn2 (Santa Cruz Biotechnology, USA), and anti-Sesn3 (Abcam, USA) antibodies, overnight at 4 °C. They were incubated with secondary antibody (FITC, EarthOx, USA) for 2 h at 37 °C. Nuclear staining was incubated with DAPI (Sigma, St. Louis, MO, USA) at room temperature for 10 min. Cells were imaged with Carl Zeiss Axio VertA1 microscope (Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY, USA).

Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) Analysis

A quantitative analysis of collagen I (COLI), collagen III (COLIII) and fibronectin1 (FN1) mRNA expression in cardiac fibroblasts was determined by qRT-PCR. Total RNA was extracted from cardiac fibroblasts using Trizol reagent (Invitrogen, USA) according to manufacturer's protocols. 0.5 μg of total RNA was reverse transcribed with High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA) to obtain cDNA. The SYBR Green PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems, USA) was used in qRT-PCR to quantify the RNA levels of COL I, COL III and FN1 in cardiac fibroblasts, with GAPDH as an internal control. The qRT-PCR was performed on 7500 FAST Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) for 40 cycles. The sequences of primers used for amplification were: COLI, 5′-CGTGGAAACCTGATGTATG CT-3′ and 5′-CCTATGACTTCTGCGTCTGG-3′; COLIII, 5′-GATCCTAACCAAGGCTGC AA-3′ and 5′-ATCTGTCCACCAGTGCTTCC-3′; FN1, 5′-GACACTATGCGGGTCACT TG-3′ and 5′-CCCAGGCAGGAGATTTGTTA-3′; GAPDH, 5′-AAGAATGGTGAAGCAG GC-3′ and 5′- TCCACCACCAGTTGCTGTA-3′.

Vakarų bloto analizė

The protein concentration in the supernatant was determined by BCA assay. Aliquots of 80 μg protein were separated in SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membranes by an electric transfer (BIORAD Inc., USA). The membranes were blocked with 5% milk PBS-Tween20 (PBST) and incubated with primary antibody including: anti-Sesn1 (Abcam, USA), anti-Sesn2 (Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-Sesn3 (Abcam, USA), anti-COL I (Abcam, USA), anti-COL III (Abcam, USA), anti-FN1 (Abcam, USA), and anti-Actin (Cell Signaling, USA) antibodies. They were then incubated with Alexa Fluor 700 antibodies (Molecular Probes, USA). Images were captured on an Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, USA), and quantified using Odyssey v1.2.

Histopathological Examination

Masson's trichrome staining for interstitial collagen deposition were analysed. Tissue specimens were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin. Serial sections about 5 μm in thickness were cut and stained with Masson trichrome. Sections were photographed with an Olympus HPISA-1000 camera and the extent of fibrosis was quantified with Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, Md). Sections of the heart were analysed for bright blue staining (collagen) and red staining (cardiacmyocyte). Collagen volume fraction (CVF) was defined as the sum of all stained interstitial collagen tissue areas divided by the whole tissue area.

Assessment of Oxidative Stress Markers

The amount of superoxide anion (O 2 · ) in the atrium was measured as described previously 18 . Electron spin resonance spectroscopy was used to examine intracellular O 2 · production with the cell-permeable spin probe 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2, 2, 5, 5- tetramethylpyrrolidine hydrochloride (CMH; Alexis Corp). Briefly, freshly isolated atrial tissues was incubated with deferoxamine-chelated Krebs-HEPES solution containing CMH (0.5 mmol/L), deferoxamine (25 μmol/L), and DETC (5 μmol/L) for 90 minutes at 37 °C. Then, samples were transferred into 1-mL syringes filled with Krebs-HEPES solution and frozen in liquid nitrogen. Samples were scanned with a Bruker EMX spectrometer. Analyses of the spectra peak height were used to quantify the amount of O 2 · produced by the tissue. The amount of malondialdehyde (MDA) produced from the atrium was examined by thiobarbituric acid (TBA) assay with an MDA Detection Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). In brief, stored atrium samples were weighed and 5% tissue homogenate was obtained on ice in isotonic Na chloride. 0.1 ml tissue homogenate was processed according to the manufacturer's instructions and detected spectrophotometrically at 532 nm by an ultraviolet spectrophotometer (GeneQuant pro, Amersham Biosciences, England).

Measurement ROS, Ca 2+ and Apoptosis

HL-1 cells were treated with different group and incubated with 10 μM DCFH-DA (Sigma-Aldrich, USA) at 37 °C for 30 minutes for ROS detection. Fluorescence intensities of DCF were measured by excitation wave length of 488 nm and emission wave length of 525 nm with flow cytometry (BD FACSCantoII). HL-1 cells were also loaded with the Ca 2+ indicator Fluo 3/AM (5 μM) (Beyotime Biotechnology, China) at 37 °C for 30 minutes to measure the Ca 2+ content within HL-1 cells. Fluo 3/AM excitation wavelength was 488 nm and emission wavelength was 525 nm. Surviving cells of different treatment group were tracked with flow cytometry. Cell samples were prepared according to manufacturer's instructions of Apoptosis Detection Kit I (BD Sciences, USA). The data of flow cytometry was acquired using Cell Quest software.

Statistinė analizė

Quantitative data were expressed as mean ± SEM. Differences among quantitative data were analyzed by ANOVA. Multiple comparisons were made using SNK-q test. An unpaired student's t-test was used for comparisons between two groups. Categorical variables were analyzed by Chi-square test with continuity correction when 1 ≤ T < 5. Pearson's correlation coefficient (r) was used to measure the strength of association between quantitative parameters. A 2-tailed P < 0.05 was considered statistically significant.

Papildoma informacija

How to cite this article : Dong, Z. et al . Upregulation of sestrins protect atriums against oxidative damage and fibrosis in human and experimental atrial fibrillation. Mokslas. Rep. 7, 46307; doi: 10.1038/srep46307 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma medžiaga

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.