Stabilių izotopų zondavimo naudojimas norint nustatyti pagrindinius geležį mažinančius mikroorganizmus, susijusius su anaerobiniu benzino skaidymu | nežinomas žurnalas

Stabilių izotopų zondavimo naudojimas norint nustatyti pagrindinius geležį mažinančius mikroorganizmus, susijusius su anaerobiniu benzino skaidymu | nežinomas žurnalas

Anonim

Anotacija

Čia pateikiame išsamų geležies kiekį mažinančios sodrinimo kultūros, palaikomos laboratorijoje, kurioje benzenas yra vienintelis anglies ir energijos šaltinis, funkcinį ir filogenetinį apibūdinimą. Mes panaudojome DNR stabilų izotopų zondavimą, kad nustatytume mikrobus, esančius sodrinime, aktyviausius įsisavinant 13 C etiketę. Kai kaip palyginamieji substratai buvo įpilami 12 C6 - ir 13 C6- benzenai, ryškūs kiekybinio plūdriųjų tankio pasiskirstymo skirtumai išryškėjo, ypač nekultūringiems mikrobams gramneigiamuose Peptococcaceae plotuose , glaudžiai susijusiuose su aplinkos klonais, paimtais iš užterštų vandeningųjų sluoksnių visame pasaulyje ir tik tolimai susiję su kultūringais „ Thermincola“ genties atstovais . Tarp kitų sodrinimo sudedamųjų dalių išryškėjo nekultūringos deltaproteobakterijos , taip pat aktinobakterijų nariai. Nors jų buvimas sodrinimo procese atrodo stabilus, per mūsų eksperimento laiką 13 C-etiketė nebuvo įsisavinta taip reikšmingai, kaip Clostridia . Mes hipotezuojame, kad benzino skaidymasis mūsų sodrinime apima neįprastą sintezę, kai Clostridia nariai pirmiausia oksiduoja benzeną. Pirmieji oksidatoriai elektronus iš teršalų tiesiogiai perkelia į geležies geležį, tačiau kartu su jais sinchroniškai keičiasi ir Desulfobulbaceae. Arba elektronai taip pat gali būti kiekybiškai perduoti partneriams, kurie tada sumažina geležies geležį. Taigi mūsų rezultatai įrodo naujo gramneigiamų geležies reduktorių klodo svarbą anaerobiniam benzeno skaidymui ir sinchroninių sąveikų vaidmenį šiame procese. Šie duomenys atskleidė visiškai naują veiksnį, kontroliuojantį benzeno skaidymą anaerobiniu būdu užterštoje aplinkoje.

Įvadas

Aromatinių angliavandenilių skaidymasis vandeningųjų sluoksnių mikrobinėse bendruomenėse sukėlė didelį mokslinį susidomėjimą dėl didelio šių junginių tirpumo ir judrumo, dėl kurio vandeningasis sluoksnis buvo užterštas ir pablogėjo vertingi požeminio vandens ištekliai. Grynojoje kultūroje yra nemaža įvairovė mikroorganizmų, kurie anaerobinėmis sąlygomis gali skaidyti daugumą aromatinių angliavandenilių (Heider ir kt., 1998; Chakraborty and Coates, 2004; Meckenstock ir kt., 2004). Benzenas sukėlė didžiausią susirūpinimą, nes yra žinomas kaip galimas kancerogenas žmonėms (Dean, 1985), o veiksniai, kontroliuojantys jo skaidymąsi, ypač anaerobinėje aplinkoje, vis dar menkai suprantami. Aerobinis benzino skaidymasis yra gerai ištirtas, taip pat yra keletas pranešimų apie anaerobinį benzolo skaidymą denitrifikuojant (Burland ir Edwards, 1999), redukuojant sulfatus (Lovley et al., 1995; Phelps and Young, 1999), redukuojant geležį (Kazumi). et al., 1997; Anderson ir kt., 1998; Jahn ir kt., 2005) ir metanogenines sąlygas (Weiner ir Lovley, 1998).

Benzeno skilimo tyrimai su vandeningųjų sluoksnių nuosėdomis geležį mažinančiomis sąlygomis parodė, kad Geobacteraceae šeimos nariai buvo žymiai praturtėję (Rooney-Varga ir kt., 1999). Palyginus, molekulinis benzeną ardančios , sulfatus redukuojančios sodrinimo kultūros apibūdinimas parodė, kad yra Desulfobacteraceae , žinomos aromatinių angliavandenilių skilėjų šeimos, nariai (Phelps et al., 1998). Be to, anaerobinį benzeną ardančio, metanogeniško ir denitrifikuojančio sodrinimo medžiagų fiziologinis ir molekulinis apibūdinimas parodė, kad yra įvairių mikrobų, tačiau, kaip ir aukščiau pateiktuose pranešimuose, nepavyko nustatyti aktyviųjų mikrobų, kurie faktiškai atsakingi už benzino skaidymą (Ulrich ir Edwards, 2003). Nepaisant to, iki šiol buvo išskirtos kelios faktiškai pasireiškiančios Dechloromonas ir Azoarcus genčių padermės, kurios denitruojančiomis sąlygomis ardo benzeną (Coates et al., 2001b; Kasai et al., 2006). Nepaisant šių procesų svarbos užterštoje požeminio vandens aplinkoje, nebuvo aiškiai nustatyta, kad būtų griežtai anaerobiniai mikrobai ar mikrobų kilmė.

Savo laboratorijoje sėkmingai gavome stabilią benzeną ardančią, geležį mažinančią sodrinimo kultūrą ir palaikėme ją daugelį metų. Tačiau nepavyko atkurti pavienių mikrobų izoliatų iš šios kultūros išlaikant benzeno skilimo aktyvumą. Viena iš galimų šio nesėkmės priežasčių gali būti netinkamas augimo in situ poreikio imitavimas izoliavimo metu, kuris mus paskatino taikyti nuo kultūros nepriklausomą metodą - nukleorūgštimis pagrįstą stabilų izotopų zondą (SIP), kad būtų galima nustatyti pagrindinius dalyvaujančius mikrobus. degraduojant. SIP apima 13 C-etiketės įdėjimą į ląstelių biomarkerius, tokius kaip nukleorūgštys, po to pažymėtų nukleorūgščių tankio gradiento atskyrimas ir dalyvaujančių mikrobų molekulinis identifikavimas (Radajewski et al., 2000). Šiandien SIP metodas labai padidino mūsų supratimą apie konkrečių mikrobų bendruomenės narių vaidmenį įvairiose aplinkos sąlygose (Madsen, 2006) ir nustatė pagrindinius mikrobus, naudojančius įvairius aromatinius ir chlorintus angliavandenilius (Manefield et al., 2002; Jeon et al., 2003; Padmanabhan ir kt., 2003; Mahmood ir kt., 2005; Yu ir Chu, 2005; Kasai ir kt., 2006). Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti mūsų sodrinime esančius mikroorganizmus, specialiai atsakingus už anaerobinį benzeno skaidymą. Mūsų rezultatai įrodo nekultūringos gramneigiamos linijos svarbą benzeno skaidymui mažinant geležies kiekį ir tuo pačiu metu dalyvaujant kitoms filogenetinėms grupėms akivaizdžiose sinchroninėse sąveikose skilimo metu.

Rezultatai

Praturtinimo kultūra ir inkubavimas su 13C6-benzenu

Šiame tyrime naudojama benzeną ardanti, geležį redukuojanti sodrinimo kultūra buvo gauta iš buvusios anglių dujinimo vietos, esančios Glivicuose, Lenkijoje, grunto. Jis visiškai mineralizuoja benzeną iki CO 2 kartu su geležies redukcija (U Kunapuli, C Griebler, HR Beller ir RU Meckenstock, nepaskelbti rezultatai). Kultūra dažnai buvo perkelta į gėlo vandens mineralinę terpę, kol buvo gautas stabilus sodrumas be nuosėdų.

Norėdami stebėti sodrinimo kultūros bendruomenės sudėtį, T-RFLP pirštų atspaudai buvo imami įvairiais laiko tarpais sodrinimo metu, kad vizualizuotų įvairovės pokyčius (1 paveikslas). Bendruomenės kompozicija praturtėjimo ir vėlesnių perdavimų metu parodė laiko kitimą. T-RF įvairovė geležį mažinančioje sodrinimo kultūroje laikui bėgant mažėjo ir ilgainiui ją reprezentavo du pagrindiniai T-RF, kurie įgijo dominavimą prieš kitus, iš pradžių buvusius. Dominuojantys T-RF buvo identifikuoti atitinkamai kaip 289 ir 162 bp, nors ankstyvosiose sodrinimo stadijose buvo pastebėta keletas kitų T-RF. Norėdami apibūdinti abiejų T-RF reprezentacinius mikrobus (289 ir 162 bp) ir gauti papildomos informacijos apie jų specifines benzeno skaidymo funkcijas, mes atlikome SIP geležies kiekį mažinančioje sodrinimo kultūroje.

Image

Laiko bakterijų bendruomenės dinamika mūsų geležies kiekį mažinančio, benzeną ardančio sodrinimo kultūroje per eilinius pernešimus ir sodrinimo stadijas, stebima atliekant galinių restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo pirštų atspaudų analizę bakterijų 16S rRNR genuose. 'BF' - benzolo ferrihidrito sodrinimas.

Visas dydis

Kai kultūra buvo inkubuota su 13 C6- benzenu kaip augimo substratu, pastebėtas aiškus augimo metu susidariusio 13C02 (mM) padidėjimas, rodantis, kad kultūra panaudojo pateiktą substratą (2a paveikslas). Benzeno, kaip augimo substrato, panaudojimas taip pat buvo stebimas išmatuojant juodosios geležies, susidarančios kartu su redukuotos geležies geležimi, kaip galinio elektronų akceptoriaus, kiekį (2b paveikslas). Iš butelių pridėjus ∼ 0, 9 mM 13 C-benzeno, po 120 dienų susidarė ∼ 4, 78 m M 13 CO 2 (1 ir 2 lygtys) ir 20, 5 mM Fe (II) (20 pav.) (Pav. 2a ir b). Remiantis stechiometriniu benzino oksidacija į CO 2 (4 lygtis), tai atitinka 0, 80 mM 13C-benzeno, kurie buvo oksiduoti, ir ∼ 85% elektronų, surinktų juodoje geležyje, aiškiai parodo, kad nuo benzino priklauso nuo geležies. oksidacija. Iš benzeno mineralizacijos išsiskyrusi 13 CO 2 koncentracija buvo normalizuota iki pradinio 13 CO 2, esančio serumo buteliuke (0, 42 mM), gaunamo iš bikarbonato buferio.

Image

Nepakeistame nepakeisto substrato ir nepakeistoje kontrolinėje medžiagoje 13 CO 2 koncentracijos padidėjimo ir juodosios geležies koncentracijos padidėjimo nepastebėta.

Image

Laikas ( a ) 13 CO 2 evoliucija, suskaidžius 13 C-benzeną eksperimentinėse kontrolėse, ir kultūra nepakeista, o substratas - nepataisytas. b ) Fe (II) susidarymas auginant sodrinimą su 13 C-benzenu, taip pat kultūroje nepakeista ir substrate nepataisyta kontrolė. Rodyklės rodo mėginių ėmimo dienas stabiliai izotopų zondavimo analizei atlikti. Vertikalios juostos rodo standartines dvigubų ar trigubų matavimų klaidas.

Visas dydis

Palyginamųjų SIP nuolydžių kiekybinė ir kokybinė analizė

Gradiento centrifugavimui po DNR ekstrahavimo paimti pagrobti buteliai, gauti iš įvairių laiko momentų 13C6 - ir 12C6-benzeno inkubacijų. Tolesniam tyrimui buvo pasirinktas 60 dienų laiko taškas iš 13 C ir 12 C pažymėtų inkubacijų, kurios buvo ankstyvas laiko momentas susiformavusio 13 CO 2 atžvilgiu, todėl atsirado galimybė iš tikrųjų išaiškinti skirtumus žymint etiketes skirtingi konsorciumo nariai. Po centrifugavimo gradientai buvo suskaidyti į 12 vienodų alikvotų ir kiekybinis PGR (qPCR) buvo naudojamas kiekybiškai įvertinti bakterijų 16S rRNR geno kopijų, esančių kiekvienoje atskiroje frakcijoje, gausumą ir įvertinti lyginamąjį šablono pasiskirstymą 12 C ir 13 C nuolydžiai (3a paveikslas). Kiekybinis etiketės įtraukimas buvo labai akivaizdus 13 C pažymėtame gradiente, kur tūrinės DNR smailė pasislinko į plūdrumo tankį (BD) - 1, 715 g ml −1, palyginti su 12 C gradientu (1, 698 g ml −1 ). . Šis BD pokytis ∼ 0, 02 g ml −1 atitinka ∼ 50% density 0, 04 g ml − 1 tankio poslinkio, kurio tikimasi įdedant 100% etiketę (Lueders et al., 2004). Be to, 13 C gradiente buvo aptiktas DNR suskaidymas į dar sunkesnes frakcijas, rodančias didesnį genomo dalies įsitvirtinimą.

Image

Kiekybiniai genų pasiskirstymo profiliai lyginant CsCl tankio gradiento centrifugavimą iš DNR, išgauto iš benzeną ardančio, geležį redukuojančio sodrinimo, užkrato 13C6-benzenu arba 12C6-benzenu. a ) Bakterinių 16S rRNR genų pasiskirstymas tankio gradiento frakcijose, kiekybiškai įvertintas realaus laiko PGR. b ) Kiekybinis T-RF gausos pasiskirstymas, apskaičiuotas padauginus bendrą genų gausą (3a paveikslas) iš visų frakcijų pirštų atspaudų santykinio T-RF smailės aukščio. Rodyklės rodo gradiento dalis, parinktas klonavimo ir sekos analizėms.

Visas dydis

Iš visų gradiento frakcijų buvo sugeneruoti T-RFLP tankio išskaidytų bendruomenių pirštų atspaudai, kad būtų galima nustatyti konkrečius bendruomenės narius, kurie yra veiksmingiausi įdedant etiketę. „Ankstyvojo“ laiko taško parinkimas yra ypač svarbus sodrinimo kultūroje, kurios įvairovė, palyginti su aplinkos mėginiais, yra labai sumažinta ir mikrobų, kurie anksčiau ar vėliau įterps anglies iš pridėto benzeno tiesiogiai arba per trofinius kryžminimus, rinkinyje. Vėlgi, visose frakcijose dominavo 162 ir 289 bp T-RF, tačiau keli kiti T-RF, tokie kaip 80, 145, 165 ir 225 bp T-RF, aptinkami kai kuriose frakcijose (4 paveikslas). Tačiau jų indėlis į bendrą T-RF gausą buvo mažas, ypač normalizavus pagal bendrą piko gausą. Norėdami dar labiau atskirti etikečių paskirstymą pagrindiniams T-RF, santykinį bendrą genų gausą (kaip pavaizduota 3a paveiksle) padauginome iš santykinio T-RF smailės aukščio gausumo pirštų atspauduose visoms frakcijoms, taip palengvindami lyginamąjį kiekybinio T-RF vertinimą. gausos pasiskirstymas tarp 12 C ir 13 C gradientų (3b paveikslas). Tai aiškiai parodė, kad mikrobai, atstovaujami 289 bp T-RF, gavo didžiąją dalį 13 C etiketės. Tuo pačiu metu 162 bp T-RF tankio pasiskirstymas išliko beveik pastovus, didžiausias dažnis visada buvo ∼ 1, 705 g ml −1 . Nepaisant to, pirštų atspaudai parodė aiškų T-RF paskirstymo skirtumą tarp 12 C ir 13 C gradientų, tačiau tai buvo akivaizdžiau lengvosiose, o ne sunkiojoje frakcijose (4 paveikslas).

Image

Tankio atžvilgiu išskaidytų frakcijų, gautų iš stabilių izotopų 12 C6- benzeno ( a, b, c ) ir 13C6-benzeno ( d, e, f ) gradientų, pirštų atspaudų galinių restrikcijos fragmentų ilgio, polimorfizmo, pirštų atspaudai. Skaičiai skliausteliuose rodo plūdriųjų tankį (g ml −1 ). Pirštų atspaudai b ir e buvo parinkti 16S rRNR geno sekai nustatyti.

Visas dydis

Ženklintų ir nepaženklintų bendruomenės komponentų filogenetinis identifikavimas

Konkretūs mikrobų bendruomenės nariai, kuriuos reprezentuoja aptikti T-RF, esantys „lengvojoje“ ir „sunkiojoje“ DNR, vėliau buvo identifikuoti klonavimo ir sekos nustatymo būdu. Iš vienos gradiento frakcijos buvo sudarytos dvi nepriklausomos klonų bibliotekos, kiekviena atitinkamai iš 12 C ir 13 C centrifugavimo gradientų. Dvi frakcijos, pasirinktos klonuoti, buvo šios: Gradiento frakcijos HS07 (BD 1, 715 g ml –1 ), tai yra frakcija, turinti didžiąją dalį pažymėtos DNR apdorojant 13 C, ir panašaus BD frakcija apdorojant 12 C, HT06 (BD 1, 716 g ml –1 ), kuriame yra papildomų žemo dažnio T-RF, esant 80 ir 165 bp (taip pat žr. 3 ir 4 paveikslus). 16S rRNR geno klonai iš 13 C6- benzeno inkubacijos ( n = 18, žr. 1 lentelę) sudarė du pagrindinius klasterius Clostridia ( Peptococcaceae ) ir Deltaproteobakterijose ( Desulfobulbaceae ). Sekos duomenys prognozavo, kad klostridinio klono klasteris, kurį mes laikinai pavadinome „BF1 klasteriu“, buvo reprezentatyvus 289 bp T-RF, o 162 bp fragmentas koreliavo su nekultūringais Desulfobulbaceae . Šių dviejų grupių artimiausi giminaičiai yra visi aplinkos klonai, gauti visame pasaulyje tiesiogiai iš užterštų vandeningųjų sluoksnių ar kitų teršalus ardančių sistemų (5 paveikslas). Šioje bibliotekoje mes taip pat aptikome du klonus, susijusius su Clostridial Moorella spp.

Pilno dydžio lentelė

Image

Filogenetinis medis, rodantis reprezentatyviųjų bakterijų 16S rRNR geno klonų priklausymą deltaproteobakterijoms , Clostridia ir aktinobakterijoms , aptiktas mūsų geležį mažinančio praturtėjimo tankio gradiento, išskaidyto DNR frakcijų, skaidančių 13 C-benzeną (HS07-klonai), klonų bibliotekose. arba 12 C-benzeno (HT06-klonai). Gauti klonai yra paryškinti. Skalės juosta rodo 10% sekos nukrypimą. Nurodomi „GenBank“ nuorodų sekų prisijungimo numeriai.

Visas dydis

Šis bibliotekos rinkinys smarkiai prieštaravo bibliotekos sudėčiai iš atitinkamos 12 C6- benzeno gradiento frakcijos (1 lentelė). Čia nekultūringi Desulfobulbaceae ir BF1 klasterių klonai taip pat buvo dažni komponentai (atitinkamai penki ir keturi klonai), tačiau ryškiausia, kad Actinobacteria bakterijose buvo pastebėtas didelis (beveik 50%) klonų kiekis. Visi suaktyvinti aktinobakterijų klonai priklausė trims didelėms šeimoms, tai yra Cellulomonadaceae, Promicromonosporaceae ir Intrasporangiaceae , daugiausia susijusiems su Actinotalea , Cellulomonas ir Terrabacter spp. (žr. 1 lentelę). Jie atitiko 165, 80 ir 145 bp T-RF, aptiktus atitinkamai HT06 frakcijoje. Be to, abiejose bibliotekose buvo aptikti pavieniai kitų proteobakterijų ir Chloroflexi klonai, tačiau neatrodė, kad jie būtų funkciškai svarbi mūsų sodrinimo bendruomenės dalis.

Diskusija

Čia pateikiame anaerobinę, geležį redukuojančią sodrinimo kultūrą, galinčią panaudoti benzeną kaip vienintelį anglies ir elektronų šaltinį. Nors kultūra išauga per pagrįstą 3–4 mėnesių laikotarpį nuo 1/10 (v v −1 ) pasėjimo, visi mūsų bandymai išgauti gryną kultūrą praskiedžiant išnykimą iki šiol nebuvo sėkmingi. Todėl, kad apibūdintume specifinius konsorciumo mikrobus ir jų galimą vaidmenį panaudojant benzeną, mes taikėme nuo kultūros nepriklausomus metodus (pavyzdžiui, SIP). Pradinis T-RFLP atliktas bendruomenės patikrinimas atskleidė daugialypį mikrobų konsorciumą mūsų benzeną ardančio sodrinimo metu, o SIP leido mums nustatyti mikrobus, kurie pirmiausia susiję su anglies įsisavinimu. Tai buvo įmanoma tik dėl to, kad kartu buvo imtasi pirštų atspaudų ir qPCR analizės, naudojant tankio atžvilgiu išskaidytas gradiento frakcijas, kurios leido mums priskirti etiketę specialioms T-RF, taigi ir mikrobams.

Filogenetinė kultūros narių priklausomybė

Naujų klostridinių BF1 klasterių klonai sudarė beveik 37% mūsų sekos klonų iš sujungtų etikečių ir nepaženklintų tankio gradiento frakcijų. Artimiausi giminaičiai yra klonai, nustatyti iš dichlorpropano dechlorinimo mišrios kultūros, gautos iš upių nuosėdų (Schlötelburg et al., 2000). Artimiausi aprašyti atstovai yra termofilinė „ Thermincola“ karboksidifila (92% sekos tapatumas) (Sokolova ir kt., 2005) ir „ Thermincola ferriacetica“ - fakultatyvusis anaerobas, galintis sumažinti geležies kiekį geležyje (Zavarzina ir kt., 2007). Kiti BF1 klasterio giminaičiai yra klonai, gauti iš reaktoriaus in situ, valančio požeminius vandenis, užterštus monochlorobenzenu (Alfreider ir kt., 2002). Kiti mūsų prisodrintos klostridiniai klonai buvo priskirti termofilinės Moorella genties nariams , tačiau jie buvo suskirstyti į grupes atskirai ir filogenetiškai buvo labiau susiję su požeminiais vandeningųjų sluoksnių klonais (Collins ir kt., 1994; Slobodkin ir kt., 1997).

Antrasis pagrindinis klonų klasteris, identifikuotas iš 16S rRNR genų sekų, sugrupuotų su deltaproteobakterijų šeima Desulfobulbaceae, kuri sudarė beveik 20% visų sekvenuotų klonų. Klonai parodė ryšį su įvairiais klonais, gautais iš įvairių užterštų vandeningųjų sluoksnių, tokių kaip TCE užteršti, urano užteršti, taip pat reaktorių klonai, stebintys monochlorbenzeno skaidymą (Alfreider ir kt., 2002).

Daugiausia žinoma, kad kultivuojami Desulfobulbaceae nariai naudoja kelis sieros junginius kaip elektronų priimtuvus su Desulfocapsa genties atstovais, žinomais dėl sieros disproporcijos (Kuever ir kt., 2005). Taip pat buvo pranešta, kad kai kurios rūšys mažina geležies kiekį geležyje (Knoblauch et al., 1999). Be to, pranešta, kad viena sulfatus redukuojanti bakterija, susijusi su Desulfocapsa , anaerobiškai naudoja tolueną su sulfatu kaip elektronų akceptorių (Meckenstock, 1999; Winderl ir kt., 2007). Dabartiniai rezultatai negali išsiaiškinti , ar mūsų sodrinime pastebėti Desulfobulbaceae tiesiogiai redukuoja geležies geležį, ar elektronai suveikia, pavyzdžiui, per sulfido / sieros šaudyklą (Straub ir Schink, 2004). Nors mūsų sodrinime sulfatų nebuvo, kita galimybė (nors ir mažai tikėtina) gali būti tai, kad mūsų sodrinime esantys sulfato reduktoriai naudojo oksiduotas sieros rūšis, susidarančias deguoniui prasiskverbus per kamštį. Tačiau palyginti didelis Desulfobulbaceae gausumas ir beveik uždarytas elektronų balansas (85%) iš juodosios geležies atstato reikšmingą deguonies įsiskverbimą.

Trečiasis pagrindinių sekvenuotų klonų klasteris (29%) sugrupuotas su aktinobakterijomis, kurios buvo aptiktos ypač 12 C gradiente. Tai galima paaiškinti tuo, kad HT06 biblioteka buvo generuojama gana dideliu tankiu nepaženklintai DNR, todėl tikimasi, kad joje bus per didelis aukštų G + C genomų vaizdavimas. Aktinobakterijos sodrinimo kultūroje galėtų panaudoti antrinius substratus, atsirandančius dėl pirminių substratų metabolizmo ir (arba) negyvos biomasės. Tai taip pat galėtų paaiškinti, kodėl gavome gryną Actinobacteria bakterijos (U Kunapuli, nepublikuoti rezultatai) nario kultūrą (padermė GF, žr. 5 paveikslą) iš benzinu ardančio sodrinimo, parinkto ant gliukozės, kuris yra susijęs su neseniai aprašyta Actinotalea gentis. (Yi ir kt., 2007). Actinobakterijos nariai dažniausiai žinomi dėl savo aerobinio kvėpavimo būdo, naudojant įvairius polisacharidus, išskyrus keletą narių, kurie taip pat žinomi dėl fakultatyvaus anaerobinio augimo.

Palyginimas su žinomais benzeno skaidytojais ir benzeną skaidančiomis sodrinimo kultūromis

Yra keletas pranešimų, kurie parodė, kad tam tikra mikrobų grupė ar bendruomenė skirtingomis elektronus priimančiomis sąlygomis gali dalyvauti anaerobiniame benzeno skaidyme. Molekuliniu būdu apibūdinant sulfatus redukuojančią sodrinimo kultūrą, ardančią benzeną, buvo nustatyti klonai, susiję su citofaga , tiomikrospora , mažu G + C grampospozicijomis ir deltaproteobakterijomis (Phelps et al., 1998), iš kurių keturi pagrindiniai klonai pateko į deltaproteobakterinius Desulfobacteraceae , kurių nariai yra žinoma, kad naudoja aromatinius junginius (Bak ir Widdel, 1986; Szewzyk ir Pfennig, 1987; Rabus ir kt., 1993; Beller ir kt., 1996).

Anksčiau buvo pranešta apie geležį redukuojančių mikroorganizmų svarbą mineralizuojant benzeną anoksinėmis sąlygomis, kai buvo nustatyta, kad geobacteraceae šeimos nariai yra labiausiai dominuojantys organizmai (Rooney-Varga ir kt., 1999). Geobacteraceae šeimos nariai yra pagrindiniai geležį mažinantys mikroorganizmai požeminėje aplinkoje (Lonergan ir kt., 1996), todėl jų paplitimas benzeną ardančiose nuosėdose ir sodrinimuose nestebina, nes žinoma, kad kelios rūšys ardo aromatinius angliavandenilius, tokius kaip toluenas (Lovley ir kt.). al., 1993; Coates et al., 2001a). Iki šiol nebuvo hipotezuojama, kad būtų galima išskirti anaerobinį benzolo skaidymą geležį mažinančiomis sąlygomis. Pateikiame įrodymų, kad Clostridial Peptococcaceae nariai dominuoja sodrinimo kultūroje, išreiškiančioje šią veiklą, nors mes negalime tiesiogiai daryti išvados, kad Clostridia buvo aktyvūs geležies reduktoriai praturtėjus. Nepaisant to, mes aiškiai parodome, kad jie į teršalus įtraukė daugiausiai anglies, be to, buvo pranešta, kad artimi giminaičiai iš Desulfosporosinus ir Desulfitobacterium genčių mažina įvairias geležies formas (Robertson et al., 2001; Villemur et al., 2006). ). Mūsų duomenys pabrėžia iki šiol nepripažintą gramneigiamų Peptococcaceae svarbą anaerobiniame aromatiniame angliavandenilių skilime.

Sinchroninės sąveikos, susijusios su benzino skaidymu, redukuojant geležį

Manoma, kad metanogeninis benzeno skaidymas apima sintetinį fermentacijos mikroorganizmų ir metanogenų bendradarbiavimą. Metanogeninį konsorciumą skaidančio benzeno molekulinis apibūdinimas parodė keletą bakterijų, susijusių su sulfatus redukuojančiais mikrobais, pavyzdžiui, Desulfosporosinus ir Desulfobacterium, ir archeologinius klonus, susijusius su acetotrofiniais metanogenais, taip pat metanogenus, naudojančius H2 – CO 2 ir formatą (Ulrich ir Edwards, 2003). ). Autoriai aiškino, kad keletas sulfato reduktorių yra metanogeniniuose konsorciumuose kaip kultūros poslinkio nuo sulfato redukcijos prie metanogenezės rezultatas. Tačiau gerai žinoma, kad ne-C1 arba ne-C2 junginius paverčiant metanais, metanogenams reikia glaudžios sintetinės sąveikos su fermentatoriais ir kad sulfatų reduktoriai gali užpildyti šią funkcinę nišą (Schink, 1997).

Santykinė klonuotų sekų ir T-RF iš mūsų SIP inkubacijų gausa parodė, kad nekultivuojamo klasterio Clostridia mikrobai, tai yra „BF1 klasteris“ (289 bp T-RF), ir nekultūringi Desulfobulbaceae nariai (162 bp T -RF) yra pagrindiniai dalykai mūsų benzeną ardančioje, geležį mažinančioje sodrinimo kultūroje ir todėl, matyt, abu yra būtini šiam procesui. Todėl mes siūlome sinchronišką sąveikos būdą anaerobinio benzino skaidymo metu, kuris yra gana neįprastas ir iki šiol nebuvo teigiamas geležies kiekį mažinančiose sistemose. Atrodo, kad šioje sąveikoje BF1 klasteris yra atsakingas už pradinį benzolo užpuolimą, nes jis efektyviausiai įsisavina etiketę, o Desulfobulbaceae klesti pirmiausia elektronams, kylantiems iš teršalų, tačiau įsisavina daugiausia foninę anglį. (tai yra karbonatas) iš dirbtinės požeminio vandens terpės. Jie tiesiogiai nesisavina etiketės, nes 162 bp T-RF išlieka „lengvose“ frakcijose, taip pat ir 13 C-benzeno gradiente. Todėl galime tik spėlioti, kad dviejų populiacijų sąveika galėtų būti pagrįsta H 2, kurį išskiria pirminiai skilėjai, ir antrinių mikrobų panaudojimu, tokiu būdu „ištraukiant“ pradinę reakciją į pabaigą, kaip paprastai nustatyta sinchroninėms asociacijoms. esant metanogeninėms sąlygoms (Schink, 1997). Šie duomenys taip pat reiškia, kad acetatas ar kiti fermentacijos produktai negali būti svarbus tarpinis junginys sinchroninėje partnerystėje, kitaip antrinis partneris bus paženklintas. Tai priešingai nei daugelio junginių, įskaitant riebalų rūgštis ir alkanus, žinomus dėl metanogeninių sistemų, sinchroninis oksidacija (Schink, 1997; Zengler ir kt., 1999). Tačiau turime pasakyti, kad mes nenustatėme acetato ar kitų tarpinių medžiagų, kurios galėjo susidaryti skaidymo metu.

Oksiduodami H2, Desulfobulbaceae galėjo pasisavinti CO 2 iš aplinkinės terpės, o tai paaiškintų, kodėl jie nėra efektyviai paženklinti. Kaip buvo hipotezuota aukščiau, jie galėjo perduoti dalį elektronų geležies geležiui tiesiogiai arba netiesiogiai per sulfido / sieros šaudyklą (Straub ir Schink, 2004). Svarbu atkreipti dėmesį į tai, kad kultūra nėra pajėgi augti benzenu ir sulfatu kaip elektronų donoras ir akceptorius. Todėl geležies redukcija tikriausiai yra tiesioginis galutinis elektronų priėmimo procesas benzeno oksidacijai, o ne netiesiogiai per sulfato šaudyklę.

Kiti aptikti mikrobai galėjo vykdyti acetogeninį gyvenimo būdą („ Moorella“ giminystės ryšiai ) arba fermentuoti antrinius angliavandenius arba negyvą biomasę, kurią teikia pirminiai sintezatoriai (aktinobakterijos). Tačiau T-RFLP duomenys parodė, kad jų sodrinimas yra menkesnis, todėl tikriausiai jie nėra svarbūs pirminiam benzeno skaidymui. Tikslus konsorciumo sinchroninės sąveikos būdas dar turi būti išspręstas. Nepaisant to, šis tyrimas aiškiai parodo, kaip SIP gali padėti išsiaiškinti tikrąjį mikroorganizmų, atsakingų už teršalų skilimą aplinkos aplinkoje, tapatumą ir specifines funkcijas bei atskleisti veiksnius, kurie gali kontroliuoti ar apriboti jų veiklą vietoje .

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • EU016408 – EU016450