Steroidų profiliavimas naudojant uplc-ms / ms kaip antrosios pakopos testas naujagimiams atliekant įgimtą antinksčių hiperplaziją: kelionių patirtis | vaikų tyrimai

Steroidų profiliavimas naudojant uplc-ms / ms kaip antrosios pakopos testas naujagimiams atliekant įgimtą antinksčių hiperplaziją: kelionių patirtis | vaikų tyrimai

Anonim

Anotacija

Naujagimio patikra leidžia diagnozuoti įgimtą antinksčių hiperplaziją (CAH) prieš pasireiškiant simptomams, užkertant kelią sunkiai ir potencialiai gyvybei pavojingai krizei, susijusiai su šia liga dar kūdikystėje. Tradicinis atranka fermento imunologiniu tyrimu lemia daugybę klaidingų teigiamų rezultatų. Norėdami sumažinti nereikalingų testų skaičių, nerimą šeimoms ir gydytojams ir naštą naujagimio patikrinimo stebėjimo programai, mes įdiegėme antros pakopos CAH testą, naudodamiesi steroidų profiliavimu, atlikdami ypač efektyvią skysčių chromatografijos ir tandemo masių spektrometriją. Mes išmatuojome tris steroidus: 17-hidroksiprogesteroną, androstenedioną ir kortizolį ir koreliavome juos su kūdikio amžiumi mėginių paėmimo metu ir gimimo svoriu. Ir amžius nuo gimimo, ir nuo gimimo svorio turėjo įtakos antinksčių steroidų kiekiui, tačiau naudojant tinkamus atkirties taškus ir analitės santykį buvo galima nustatyti kūdikius su CAH. Šis metodas buvo veiksmingas identifikuojant kūdikius su CAH, vartojant tiek druską eikvojantį, tiek paprastą virilizuojantį pavidalą, tuo pačiu sumažinant klaidingai teigiamų atvejų skaičių nuo 2, 6 iki 0, 09%.

Pagrindinis

Įgimta antinksčių hiperplazija (CAH) yra autosominių recesinių sutrikimų grupė, kurią sukelia antinksčių steroidų biosintezės defektai. Dažniausiai pasitaikančią formą, kuri sudaro 90% CAH atvejų, sukelia CYP21 geno pokyčiai, dėl kurių 21-hidroksilazės (1), fermento, paverčiančio 17-hidroksiprogesteroną (17-OHP) į 11, nėra arba jis sumažėja. -deoksikortizolio ir progesterono iki deoksikortikosterono. Dėl sumažėjusio šio fermento aktyvumo padidėja 17-OHP, trūksta kortizolio ir mineralkortikoidų sintezės, padidėja androstenediono sintezė ir sumažėja centrinis grįžtamasis ryšys (padidėja adrenokortikotropinio hormono gamyba), dėl kurio atsiranda antinksčių hiperplazija, virilizacija ir druskos eikvojimo krizė, kuri gali būti mirtina (2).

Šiuo metu visos JAV valstijos tikrina CAH naujagimius; dažniausiai matuojama 17-OHP kraujo dėmėse naudojant komercinius fermentų imunologinio tyrimo (PAV) rinkinius (3–5). Tačiau ši metodika sukelia daugybę klaidingai teigiamų rezultatų, nes trūksta antikūnų ir yra didelis kryžminis reaktyvumas su kitais endogeniniais junginiais (6, 7). Be to, padidėjusi 17-OHP koncentracija serume yra susijusi su mažu gimimo svoriu ir ligomis, o tai sukelia dar didesnį klaidingų teigiamų atvejų skaičių neišnešiotų ir sergančių kūdikių populiacijoje. Koreguojant 17-OHP ribą atsižvelgiant į nėštumo amžių ir gimimo svorį, padidėja bandymo specifiškumas (8, 9). Nepaisant to, kad sumažėja klaidingai teigiamų rezultatų skaičius, ypač mažo svorio kūdikiams, CAH patikra vis dar turi mažiausią numatomą vertę naujagimių patikros tyrimuose, kai naudojama tik 17-OHP koncentracija (10–12).

Kaip alternatyva imuniniam tyrimui, dujų chromatografija-masės spektrometrija ir skysčių chromatografija-tandeminė masės spektrometrija (LC-MS / MS) gali aptikti pavienius steroidus ir todėl palengvinti kryžminio reaktyvumo ir specifiškumo klausimus, tačiau šiems metodams reikia pavyzdžių derivatizavimo, ir jiems reikia daugiau laiko (13–20). Antrosios pakopos tyrimai ( ty testai, atlikti su tuo pačiu bandiniu, kuris naudojamas pirminiam ekranui), naudojant steroidų profiliavimą, naudojant LC-MS / MS, gali žymiai padidinti CAH naujagimių patikros specifiškumą ir jautrumą (21–24). Taikant šį metodą, 17-OHP koncentracija matuojama LC-MS / MS, ir po ekstrahavimo organiniais tirpikliais ji lyginama su kitų steroidų koncentracijomis paveiktuose keliuose, kad būtų dar labiau sumažintas klaidingai teigiamų ekranų skaičius. (21–24). CAH sergantiems pacientams yra padidėjęs 17-OHP ir androstenediono kiekis santykinai mažu kortizolio kiekiu, todėl žymiai padidėjo (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykis. Šis santykis padeda pašalinti daugumą kūdikių, kurių padidėjęs 17-OHP dėl streso, ligos ar neišnešiotų kūdikių (21–24).

Papildomus steroidus, tokius kaip 11-deoksikortizolis ir 21-deoksikortizolis, galima stebėti naudojant LC-MS / MS, kad būtų galima aptikti papildomus 5% pacientų, sergančių CAH, dėl 11-hidroksilazės trūkumo, kuris 11-deoksikortizolį paverčia kortizoliu ir deoksikortikososteronu į kortikosteroonas (23, 24). Nustatyta, kad papildomi šių steroidų vartojimo santykiai yra naudingi nustatant šiuos kūdikius (23, 24).

Šiame tyrime mes supaprastiname ekstrakciją ir optimizuojame 17-OHP, androstenediono ir kortizolio kiekį, kad patobulintume esamą metodą (21, 22). Santykis tarp steroidų, kaupiančių CAH (17-OHP ir androstenediono) ir kortizolio, buvo apskaičiuotas naudojant analitų koncentracijas, o ne smailių plotus, o tai žymiai pagerina specifiškumą. Tikrosios šių steroidų koncentracijos (o ne didžiausių sričių) prieinamumas leido mums nustatyti jų pokyčius atsižvelgiant į amžių ir kūdikių gimimo svorį, kuriems reikėjo atlikti antrosios pakopos tyrimus. Pagrindinis mūsų metodo patobulinimas buvo ypač efektyvios LC-MS / MS (UPLC-MS / MS) sistemos naudojimas. Naudojant UPLC padidėjo skiriamoji geba, jautrumas ir analizės greitis, todėl 17-OHP, androstenedionas ir kortizolis buvo visiškai atskirti per mažiau nei 3 minutes - tai reikšmingas žingsnis, kuris leistų naudoti šią metodiką kaip pirminį CAH ekraną. .

METODAS

Šis protokolas buvo peržiūrėtas Jutos universitete ir Jutos Sveikatos tyrimų apžvalgos tarybų skyriuje ir buvo priskiriamas prie išimčių. Iš dalyvių nebuvo reikalaujama informuoto asmens sutikimo. Visos Jutos gimusių kūdikių kraujo dėmės yra tiriamos CAH, naudojant PAV (Neo-Genesis Accuwell, Clackamas, OR) metodą kaip pagrindinį ekraną, matuojantį 17-OHP koncentraciją. Kraujo dėmės, kurių padidėjęs 17-OHP per šį pirminį ekraną, pateikiamos steroidų profiliavimui atlikti UPLC-MS / MS. Įvertinome rezultatus, gautus per 13 mėnesių atrankos naudojant šį metodą.

Pavyzdžiai.

Visi šiame tyrime naudojami mėginiai buvo gauti iš Jutos naujagimių atrankos programos ir buvo surinkti pirmąją gyvenimo savaitę. Kūdikiai buvo suskirstyti į tris grupes pagal gimimo svorį: 1 grupė - mažiau nei 1500 g; 2 grupė - nuo 1500 g iki 2500 g; 3 grupė, didesnė kaip 2500 g. Kraujo dėmės, gautos iš Ligų kontrolės ir prevencijos centrų, buvo naudojamos kaip metodo patvirtinimo kokybės kontrolė.

Mėginių analizė.

Trijų steroidų kalibratoriai buvo paruošti skirtingo tūrio kraujyje ir pastebėti ant filtrinio popieriaus. Maždaug 4, 8 mm (3/16 ") štampai iš kalibratorių, kontrolinių tirpalų ir mėginių kraujo dėmių buvo ištraukti 200 μL ekstrahavimo tirpalu (80:20 acetonitrilo: vandens), kuriame yra deutetuoti kiekvienos analitės vidiniai etalonai plokščiame dugne. Plokštelė buvo uždengta ir intensyviai maišoma 30 min., naudojant mikro plokštelių purtyklę, po to centrifuguojama 10 min., esant 1500 x g. Po to ekstraktas buvo perkeltas į 1 ml V dugno 96 šulinėlių plokštelę (Waters, Chicago, IL) ir džiovinamas švelniu azoto srautu naudojant „SPE-Dry 96“ azoto garintuvą (viršutinis kolektorius 50 ° C temperatūroje ir apatinis kolektorius 70 ° C temperatūroje). Sausos liekanos buvo ištirpintos 50 μL 10% acetono vandenyje. po to uždaromas permatomu plėvelės plėvele, 30 minučių maišomas mikrobangų plokštelėje ir 10 minučių centrifuguojamas esant 1500 x g greičiui. UPLC įpurškiama keturiolika mikrolitrų mišinio chromatografiniam atskyrimui, po kurio seka MS / MS. -OHP, d8 -17-OHP, androstenedionas, d7 -androstenedionas, žievė izolis ir d4-kortizolis buvo naudojami atitinkamai kaip standartai ir vidiniai standartai, norint sudaryti kalibravimo kreivę kiekvieną kartą, kai buvo atliekamas tyrimas.

Šiame tyrime chromatografiniam atskyrimui buvo naudojama „Waters Acquity UPLC“ sistema (Milford, MA). Kortizolis, androstenedionas ir 17-OHP buvo chromatografiškai išskaidomi naudojant atvirkštinės fazės kolonėlę (Acquity UPLC BEH C 18, 1, 7 μm, 2, 1 x 50 mm ir 0, 2 μm priešrutulinio kolonėlės filtras). LC atskyrimas buvo atliktas naudojant tiesinį gradientą nuo 60% judančiosios fazės A (vanduo + 0, 05% skruzdžių rūgšties) ir 40% judančiosios fazės B (100% metanolio) iki 70% judančiosios fazės A ir 30% judančiosios fazės B per 3. min., kai srautas yra 0, 6 ml / min. Kolonėlės temperatūra viso atskyrimo metu buvo palaikoma 40 ° C. Aptikimas ir kiekybinis nustatymas buvo atlikti MS / MS naudojant Waters Quattro Premier XE tandeminį spektrometrą.

Masės spektrometre buvo įrengtas elektros purškimo šaltinis, veikiantis teigiamos jonizacijos režimu. Mėginiai buvo analizuojami selektyviu reakcijos stebėjimo režimu, naudojant tris skirtingus kanalus, stebimi perėjimai buvo kortizolio (kiekybinis, apibūdinamasis) santykis: 363, 3> 121, 2, 363, 3> 97, 2; d4-kortizolis (kiekybinis rodiklis): 367, 3> 121, 2; androstenedionas (kiekybinis, kvalifikacinis): 287, 4> 97, 2, 287, 4> 109, 2; d7-androstenedionas (kiekybinis rodiklis): 294, 3> 100, 1; 17α-OHP (kiekybinis, kvalifikacinis): 331, 4> 97, 2, 331, 4> 109, 2; d8-17α-OHP (kiekybinis rodiklis): 339, 3> 100, 1. Duomenys buvo surinkti naudojant „MassLynx 4.1“ ir išanalizuoti naudojant „QuanLynx V4.0 SP4“ programinę įrangą.

Statistinė analizė.

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant „GraphPad Prism“, versija 5.01 (La Jolla, CA). Rezultatų reikšmingumui ( p <0, 01) nustatyti buvo taikoma vienpusė ANOVA neparametrinė analizė (Kruskal-Wallis testas). Tiesinė regresijos analizė buvo atlikta naudojant tą pačią programą, siekiant nustatyti koreliaciją tarp steroidų koncentracijos ir kūdikių amžiaus ar gimimo svorio.

REZULTATAI

Trijų steroidų atskyrimas naudojant UPLC buvo pasiektas per 3 minutes (1 pav.). Kortizolis, androstenedionas ir 17-OHP buvo lengvai atskirti, o trijų vidinių etalonų naudojimas leido tiksliai nustatyti kiekvienos analitės kiekį. Tyrimas buvo tiesinis iki 4440 ng / ml serumo visoms trims analitėms (kortizolio, androstenediono ir 17-OHP), aptikimo riba buvo 1, 7 ng / ml serumo ir kiekybinė riba - 3, 5 ng / ml serumo. Visų trijų analitų išgavimas buvo didesnis nei 90%. Vieno ir tarp bandymų netikslumai buvo mažesni nei 10%.

Image

Antrosios pakopos CHA testas UPLC-MS / MS. Normalaus kūdikio ( A ) ir CAH kūdikio ( B ) steroidų profiliai buvo gauti naudojant masės spektrometrą, kuriame įrengtas elektros purškimo šaltinis, veikiantis teigiamos jonizacijos režimu. Mėginiai buvo analizuojami pasirinktinio reakcijos stebėjimo režimu, naudojant skirtingus deuteruotų etalonų (neparodyta) ir natūralių junginių (žr. Metodų skyrių) perėjimus. Kiekybiniam įvertinimui buvo naudojami vidiniai standartai, o abi plokštės parodytos ta pačia skalė.

Visas dydis

Per 13 mėnesių, kai buvo naudojamas šis metodas, PAV buvo patikrinta 64 615 kūdikių CAH. Maždaug 1% patikrintų kūdikių svėrė <1500 g (1 grupė, n = 670), 6, 2% - 1500–2500 g (2 grupė, n = 4011), o 92, 8% -> 2500 g (3 grupė, n = 59 934). ). Iš viso 2, 6% patikrintų kūdikių ( n = 1709) buvo nenormalus pirminis CAH ekranas (17-OHP PAV virš išpjovos, pritaikytas pagal gimimo svorį), kuriam reikėjo atlikti antrosios pakopos testą steroidų profiliavimu, naudojant UPLC-MS / MS. Šioje kūdikių grupėje 146 kūdikiai (8, 5%) priklausė 1 grupei, 610 kūdikių (35, 7%) priklausė 2 grupei, o 953 kūdikiai (55, 8%) - 3 grupei. Tarp kūdikių, kurių pirminis ekranas nenormalus, vidutinis amžius kurio atrankos mėginys buvo paimtas 2 d., 92, 6% mėginių buvo paimta iki 3 d. amžiaus. Mūsų teigiamo antrosios pakopos tyrimo, reikalaujančio papildomų patvirtinančių tyrimų ir nukreipimo į vaikų endokrinologą, kriterijai buvo 17-OHP lygis didesnis nei 12, 5 ng / ml serumo ir (androstenediono + 17-OHP) / kortizolio koncentracijos santykis. didesnis kaip 1, 0. Po antrosios pakopos testo teigiamų kūdikių 8, 9% 1 grupėje ( n = 13), 6, 2% 2 grupėje ( n = 38) ir 1, 4% 3 grupėje ( n = 13) turėjo nenormalų rezultatą ir juos reikėjo papildomi patvirtinamieji tyrimai ir siuntimas pas vaikų endokrinologą. Iš šių 64 šeši kūdikiai buvo patvirtinti CAH (1: 10 769), penki - druskos eikvojimu ir vienas - paprastais virilizacijos variantais (2 pav.). Iš šešių atvejų keturi buvo vyrai ir du - moterys. Abi moterys buvo kliniškai identifikuotos pagal dviprasmiškas lytines ląsteles gimstant. Vienam iš šešių kūdikių buvo nustatytas nenormalus pirmasis ekranas (galbūt susijęs su priešlaikiniu gimdymu), tačiau normalus 17-OHP (<12, 5 ng / ml) lygis atliekant antrosios pakopos tyrimus. Tačiau 17-OHP + androstenediono / kortizolio koncentracijų santykis padidėjo iki 6, 7. Šis kūdikis prieš imdamas mėginį buvo gavęs kortikosteroidus kvėpavimo problemoms gydyti. Dėl šios priežasties į teigiamus atvejus buvo įtraukti antros pakopos testai, kurių koncentracijos santykis didesnis kaip 4, neatsižvelgiant į 17-OHP lygį. Ši papildoma grupė padidina galimybę nustatyti kūdikius, kurie vartojo kortikosteroidus prieš imdami naujagimio ekrano mėginį. Per 13 šio tyrimo mėnesių 10 kūdikių, įskaitant kūdikius, sergančius CAH, pateko į šią kategoriją. Net įtraukiant papildomus kūdikius, kuriems nustatytas padidėjęs santykis, klaidingai teigiamų naujagimio patikrinimo atvejų skaičius sumažėjo nuo 2, 64 iki 0, 09%. Mūsų žiniomis (Juta turi vieną centrinį kreipimosi centrą), ši technika nepraleido nė vieno atvejo.

Image

Antrosios pakopos CHA testavimas. Mėginiai, gauti iš PAV padidėjusių 17-OHP, buvo ištirti naudojant UPLC-MS / MS ir nubraižyti pagal 17-OHP koncentracijos ir santykio (17-OHP + androstenedionas) / kortizolio žurnalo grafiką. Išperintas plotas parodo pavyzdžius, kurių nenormali 17-OHP koncentracija (> 12, 5 ng / ml serume) ir nenormalus santykis (17-OHP + androstenedionas) / kortizolio> 1, reikalaujantys papildomų tyrimų ir nukreipimo į vaikų endokrinologiją. Taškinis taškas rodo pavyzdžius, kurių normali koncentracija yra 17-OHP, bet santykis yra> 4. Šių mėginių stebėjimas priklausė nuo to, ar kūdikiui nebuvo imami kortikosteroidai prieš imant mėginius. Atviri kvadratai (□) = kūdikiai, sergantys CAH (į grafiką įtrauktos kūdikių vertės, nurodytos per 13 šio tyrimo mėnesių ir vėliau); taškai (•) = nepaveikti kūdikiai.

Visas dydis

UPLC-MS / MS atlikta steroidų profiliavimo strategija po pirmojo neįprasto EIA patikrinimo reikšmingai sumažino klaidingai teigiamą naujagimio CAH patikrinimo procentą ir atitinkamai sumažino papildomų ir nereikalingų testų skaičių. Tai taip pat sumažino nerimą šeimoms ir gydytojams, kurie turi reaguoti į klaidingai teigiamus ekranus, ir žymiai sumažino naujagimio patikrinimo stebėjimo programos, reaguojančios į nenormalų ekraną, naštą.

17-OHP lygis, matuojamas PAV, mažėja didėjant gimimo svoriui ir didėjant amžiui kolekcijos metu (11). Mes įvertinome 17-OHP, androstenediono ir kortizolio koncentracijas kūdikiams be CAH mūsų populiacijoje kaip gimimo svorio ir amžiaus funkciją. Androstenedionas reikšmingai nepakito atsižvelgiant į gimimo svorį (duomenys neparodyti). Priešingai, didėjant gimimo svoriui, įvyko reikšmingų 17-OHP ir kortizolio pokyčių (3 pav.). Kai kūdikiai buvo suskirstyti į tris grupes pagal gimimo svorį, kortizolio kiekis sumažėjo 2500 g sveriantiems kūdikiams (3 pav., Vidurinės plokštės). 17-OHP reikšmingai sumažėjo kūdikiams, sveriantiems 2500 g (3 pav., Viršutinės plokštės).

Image

Koreliacija tarp ( A ) 17-OHP, ( B ) kortizolio ir nepaveiktų kūdikių gimimo svorio trijose gimimo svorio grupėse: <1500 g ( p <0, 001 17-OHP, p = 0, 023 kortizolio); 1500–2500 g ( p <0, 001 17-OHP, p = 0, 235 kortizoliui); > 2500 g ( p = 0, 537 17-OHP, p <0, 001 kortizoliui). C , kortizolio koncentracijos ir amžiaus santykis imant mėginį nepažeistiems kūdikiams trijose gimimo svorio grupėse: <1500 g ( p = 0, 104); 1500–2500 g ( p 2500 g ( p <0, 0001).

Visas dydis

Tiriant kolekciją, reikšmingo ryšio tarp androstenediono ar 17-OHP ir kūdikio amžiaus nenustatyta (duomenys nepateikti). Kortizolis, priešingai, smarkiai sumažėjo didėjant kūdikio amžiui (3 pav., Apatinės plokštės). Tiriant tris kūdikių grupes, reikšminga neigiama koreliacija buvo nustatyta 2 (gimimo svoris 1500–2500 g) ir 3 grupėse (gimimo svoris> 2500 g), bet ne 1 grupėje (gimimo svoris <1500 g).

17-OHP / kortizolio santykis gali nustatyti CAH sergančius pacientus. Jis daugiausia buvo naudojamas plazmos tyrimams; duomenų apie šio santykio naudojimą naujagimių kraujo dėmėse yra labai nedaug (23). Mūsų populiacijoje buvo reikšmingas ( p <0, 05) ryšys tarp 17-OHP / kortizolio santykio ir abiejų kūdikių amžiaus imant mėginius (didėjant su amžiumi) ir gimimo svorio (mažėja didėjant gimimo svoriui), todėl šis santykis buvo mažesnis naudinga kaip diskriminacinė priemonė (4 pav.). Priešingai, (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykis reikšmingai nepasikeitė nei atsižvelgiant į amžių kolekcionavimo metu, nei pagal gimimo svorį (4 pav.). Taip pat įvertinome androstenediono ir kortizolio santykį. Nors šis santykis reikšmingai nepasikeitė nei atsižvelgiant į amžių kolekcionavimo metu, nei pagal gimimo svorį (4 pav.), Androstenediono lygis labai skyrėsi, dažnai nukritęs iki kiekybinės ribos, tuo tarpu kortizolis dažnai, ypač mažiausiems kūdikiams, buvo labai didelis., todėl labai maža santykio vertė.

Image

Koreliacija tarp ( A ) surinkimo amžiaus ir (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykio ( p = 0, 058); 17-OHP / kortizolis ( p = 0, 034); androstenediono / kortizolio ( p = 0, 254) ir ( B ) gimimo svorio ir santykio (17-OHP + androstenediono) / kortizolio ( p = 0, 412); 17-OHP / kortizolis ( p = 0, 033); androstenediono / kortizolio ( p = 0, 589) visiems kūdikiams, kuriems nepaveikta.

Visas dydis

Vidutinė androstenediono koncentracija trijose gimimo svorio grupėse reikšmingai nesiskyrė, tuo tarpu kūdikių, sergančių CAH, koncentracija reikšmingai padidėjo, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (5 pav., P <0, 01) visose grupėse (5 pav. A ). Vidutinė ir vidutinė 17-OHP koncentracija sumažėjo didėjant gimimo svoriui ir buvo reikšmingai didesnė (ANOVA, p <0, 01) CAH kūdikiams nei nepaliesta kūdikiams, nepriklausomai nuo gimimo svorio (5 pav. B ). Kortizolio koncentracija reikšmingai nepakito atsižvelgiant į gimimo svorį, tačiau buvo žymiai mažesnė CAH sergantiems kūdikiams nei nepaveikti kūdikiai (5 pav. C ) visose grupėse.

Image

Androstenediono ( A ), 17-OHP ( B ), kortizolio ( C ) koncentracijos logaritminėje skalėje ir (17-OHP + androstenedionas) / kortizolio ( D ), 17-OHP / kortizolio ( E ) ir androstenediono santykiai / kortizolio ( F ) kūdikiams, kuriems nepaveikta (suskirstyta į grupes pagal jų gimimo svorį) ir kūdikiams, sergantiems CAH. * reikšmingas ( p <0, 05) skirtumas tarp kūdikių, sergančių CAH, ir nepaveiktų kūdikių.

Visas dydis

Ir 17-OHP / kortizolio, ir (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykis buvo žymiai didesnis kūdikiams, sergantiems CAH, palyginti su nepaliestais bet kokio gimimo svorio kūdikiais (5 pav. D ir E ). Be to, androstenediono / kortizolio santykis buvo žymiai didesnis kūdikiams, sergantiems CAH, nei nepaveiktiems kūdikiams (5 pav. F ).

DISKUSIJA

Naujagimių atranka gali nustatyti kūdikius, kuriems gresia CAH, tačiau gaunami daug klaidingų teigiamų rezultatų, kai kaip žymeklis naudojamas tik 17-OHP (matuojamas PAV metodais). Dėl nėštumo amžiaus ir gimimo svorio pataisų sumažėja klaidingų teigiamų atvejų skaičius (10, 11), tačiau vis tiek daug mėginių turi padidėjusią 17-OHP koncentraciją, todėl diagnozei patvirtinti reikia intensyvių tolesnių veiksmų. LC-MS / MS naudojimas steroidų profiliavimui kaip antros pakopos testas pagerina naujagimių CAH patikrinimo specifiką (21–24). Šiame tyrime mes toliau tobuliname steroidų profiliavimo specifiškumą naudojant UPLC. Ši technologija pagerino atskyrimą ir sumažino analizės laiką (1 pav.). Be to, apskaičiuodami (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykį, mes naudojome analitės koncentracijas (o ne smailių plotus). Tai buvo įmanoma įtraukus kiekvieno išmatuoto steroido vidinius standartus, todėl buvo geresnis santykio atkuriamumas ir nuoseklumas. Taikant šį metodą, teigiama prognozuojama CAH patikros vertė reikšmingai padidėjo nuo 0, 4% su PAV iki 9, 4%, atliekant antrosios pakopos testą UPLC-MS / MS. Tai rodo pagerėjimą, net palyginti su paskelbta teigiama 4, 7% pirminio metodo numatoma verte (22).

Mūsų populiacijoje didžiausias nenormalių, pirmojo CAH patikrinimo rezultatų procentas (146 iš 670 arba 21, 8%) buvo kūdikių, kurių gimimo svoris mažiausias (2500 g, 953 iš 59 934 arba 1, 6%), grupėje. Tai tęsėsi net atlikus antrosios pakopos tyrimus: 13 iš 670 kūdikių (1, 9%) buvo mažiausio gimimo svorio (2500 g.) Tai nenuostabu, atsižvelgiant į tai, kad mažesni kūdikiai dažniausiai turi nesubrendusią antinksčių funkciją ir serga ar patiria stresą., sąlygos, kurios padidins 17-OHP lygį. Tai patvirtino mūsų atliktas 17-OHP matavimas ir stebimas sumažėjimas didėjant gimimo svoriui (3 pav.). Visais atvejais kūdikiai be CAH buvo gerai atskirti nuo kūdikių. su CAH, kai diskriminacijai buvo naudojamas (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykis (2 ir 5 pav.). Palyginti nedaugelis kūdikių, kurių santykis nuolat padidėjęs, tikriausiai atidėtas fermentų, tokių kaip 11-hidroksilazė, ekspresijoje, Steroidų sintezė. Įvairių santykių vertinimas patvirtino, kad (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykis yra geriausias CAH diskriminacinis faktorius (22). Jei atrankos metu išmatuojami papildomi steroidai, tokie kaip 11 ir 21 deoksikortizolis, kiti santykiai cou ld (23, 24).

Pagrindinis klaidinantis mūsų patirties veiksnys yra steroidų vartojimas prieš imant mėginius. Vieno CAH turinčio kūdikio, gavusio kortikosteroidus prieš paimant naujagimio ekrano mėginį, normalus 17-OHP lygis (7, 3 ng / ml serumo), tačiau pastebimai padidėjęs (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykis (6, 7). . Tai galima paaiškinti reakcija į kortikosteroidus ir mėginių paėmimo laiką. Išskyrus šį kūdikį, visi patvirtinti CAH atvejai buvo nuolatiniai (> 2500 g gimimo svorio) ir mėginių paėmimo metu nebuvo sergantys. Jų 17-OHP ir steroidų koncentracijos santykis buvo didžiausias jų gimimo svorio grupės procentinis rodiklis. Norėdami nustatyti galimus CAH ar švelnesnius CAH variantus, mes stebime visus kūdikius, kurių (17-OHP + androstenediono) / kortizolio santykis yra didesnis nei 4, kad patikrintume, ar prieš imdami mėginį jie gavo kortikosteroidų. Tačiau šiame tyrime gali būti nenustatytos kitos klaidingai neigiamų rezultatų priežastys, pavyzdžiui, motinos kūdikiams, kurie vartojo kortikosteroidus arti gimdymo laiko. Pirminės sveikatos priežiūros gydytojai turėtų tai žinoti ir turėtų įvertinti, ar vaikui nėra CAH, nepaisant normalių ekrano rezultatų tokiais atvejais.

CAH sergantiems kūdikiams buvo platus 17-OHP koncentracijos diapazonas. Mažiausia serumo vertė buvo 7, 3 ng / ml, o didžiausia - 1054 ng / ml. Aukščiausios vertės buvo susijusios su CAH druską švaistojančiomis formomis. Tarp nepaveiktų kūdikių 17-OHP koncentracijos diapazonas buvo vienodai platus, o didžiausios vertės buvo kūdikiams, kurių gimimo svoris mažiausias, kaip anksčiau buvo pastebėta (3 ir 5 pav.). Kortizolio koncentracija smarkiai sumažėjo tik kūdikiams, sveriantiems <1500 g, nors mažesnių kūdikių vidutinė kortizolio koncentracija buvo didesnė (5 pav.). Tai rodo, kad mažesni kūdikiai patiria didelį stresą ir toliau gamina daugiau kortizolio bent iki 7 d amžiaus. Vyresniems kūdikiams kortizolio gamyba mažėja, nes jie atsigauna po gimdymo streso.

Įdomu buvo tai, kad 93% kūdikių, kuriems reikia papildomų tyrimų (su nenormaliais antrosios pakopos tyrimų rezultatais), buvo paguldyti į naujagimių intensyviosios terapijos skyrių dėl priešlaikinio gimdymo ar ligos. Šis faktas taip pat gali paaiškinti teigiamą koreliaciją tarp kortizolio ir gimimo svorio 3 grupėje (> 2500 g, 3 pav.). Dauguma šių kūdikių dėl ligos buvo paguldyti į naujagimių intensyviosios terapijos skyrius. Todėl ši grupė atstovauja stresą patiriančių kūdikių populiacijai, paaiškindama didesnį kortizolio kiekį.

Tik kortizolio koncentracija smarkiai pasikeitė, kai buvo imamas mėginys (3 pav.), Tuo tarpu reikšmingos koreliacijos su 17-OHP ar androstenedionu nepastebėta (3 pav.). Nepaisant gimimo svorio ir surinkimo laiko pokyčių, skirtingi steroidų santykiai išliko gana pastovūs (4 pav.), O (17-OHP + androstenedionas) / kortizolio santykis buvo geriausias diskriminuojantis kūdikius, sergančius CAH (5 pav.).

Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad didžiausias klaidingų teigiamų rodiklių skaičius pastebimas mažiausio gimimo svorio ir sergančių kūdikių atvejais. Antrosios pakopos testavimas, nors ir visiškai nepanaikina klaidingai teigiamų rezultatų, tačiau labai sumažina klaidingai teigiamų ekranų skaičių ir papildomų bandymų, patvirtinančių ar paneigiančių diagnozę, skaičių.

Žodynas

17-OHP

17-hidroksiprogesteronas

CAH

įgimta antinksčių hiperplazija

PAV

fermento imunologinis tyrimas

LC-MS / MS

skysčių chromatografija-tandeminė masių spektrometrija

UPLC

ypač efektyvi skysčių chromatografija