Baltymai, kurių sudėtyje yra valosino, reguliuoja proteasomų sukeliamą dna-pkcs skaidymą gliomos ląstelėse | ląstelių mirtis ir liga

Baltymai, kurių sudėtyje yra valosino, reguliuoja proteasomų sukeliamą dna-pkcs skaidymą gliomos ląstelėse | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Vėžio terapinis atsparumas
  • CNS vėžys
  • Radioterapija
  • Universalumas

Anotacija

Nuo DNR priklausoma baltymų kinazė (DNR-PK) vaidina svarbų vaidmenį atkuriant DNR pažeidimus ir reguliuoja glioblastomos ląstelių jautrumą radiacijai. VCP (baltymas, kuriame yra valosino), chaperono baltymas, kuris reguliuoja nuo ubikvitino priklausomą baltymo skilimą, yra fosforilinamas DNR-PK ir yra įdarbinamas į DNR dvigubų grandžių lūžio vietas, kad būtų sureguliuotas DNR pažeidimų atstatymas. Tačiau neaišku, ar VCP dalyvauja DNR-PKcs (DNR-PK katalizinis subvienetas) skaidymesi, ar jis reguliuoja glioblastomos radiacijos jautrumą. Mūsų duomenys parodė, kad DNR-PKcs buvo ubikvitintas ir sujungtas su VCP. VCP numušimas lėmė DNR-PKcs baltymo kaupimąsi glioblastomos ląstelėse, o proteasomų inhibitorius MG132 šį padidėjimą padidino. Kaip ir tikėtasi, šis padidėjimas padidino DNR atkūrimo efektyvumą keliose glioblastomos ląstelių linijose; šis padidėjęs aktyvumas sumažino jautrumą radiacijai ir pailgino glioblastomos ląstelių išgyvenimo dalį in vitro . Be to, VCP numušimas glioblastomos ląstelėse sutrumpino ksenografuotų pelių išgyvenamumą, gydymas radiacija, palyginti su kontrolinėmis ksenografuotomis glioblastomos pelėmis. Be to, VCP baltymas taip pat buvo sureguliuotas ∼ 25% pacientų GBM audinių (PSO, IV laipsnio astrocitoma), o VCP baltymo lygis buvo koreliuojamas su paciento išgyvenimu ( R2 = 0, 5222, P <0, 05). Šie radiniai parodė, kad VCP reguliuoja DNR-PKcs skaidymąsi ir padidina GBM ląstelių jautrumą radiacijai.

Pagrindinis

Valosino turintis baltymas (VCP) yra ATPazės AAA klasės narys ir susijęs su įvairia ląstelių veikla. 1, 2 VCP yra gausus baltymas citozolyje ir branduolyje, 3, 4 ir fiziologiškai egzistuoja kaip homoheksameras. Dauguma, jei ne visi, heksamerai sukuria tolesnius kompleksus su kitais adapterio baltymais, tokiais kaip p47 arba Ufd1 – Npl4, 5, 6, ir kartu su ubikvitino – baltymo konjugatais baltymų ir baltymų sąveikos metu, kad būtų išvengta per didelės multiubiquitin grandinės susidarymo. dydžiai. 2 Be to, naujausi duomenys rodo, kad VCP taip pat reguliuoja baltymų apimtį, aktyvuodamas deubiquitinating fermentą Ataxin-3. Manoma, kad VCP yra nukreiptas į atitinkamus ląstelių procesus diferenciniu būdu jungiantis prie specifinių adapterio baltymų. 8 Kiekvieną VCP protomerą sudaro keturios sritys: N-galo, dvi ATPazės (D1 ir D2) ir C-galinės sritys. 1, 9 N-galinis regionas pasižymi rišamuoju aktyvumu su baltymais adapteriu, taip pat su visur esančiais baltymais. 1 VCP buvo pasiūlytas atlikti daugelį fiziologinių ląstelių funkcijų, pavyzdžiui, baltymų skaidymąsi, kurį skatina ubiquitin-proteasome sistema. 5, 10, 11, 12, 13, 14

Įdomu tai, kad pranešta, kad VCP taip pat yra verbuotas į DNR dvigubų grandžių pertraukimo (DSB) vietas, sąveikaujant su BRCA1, p53 ir RAD51, ir tai gali reguliuoti DNR pažeidimų atstatymą. 4, 15, 16 Neseniai atliktas tyrimas atskleidė, kad VCP yra naujas DNR priklausomos baltymų kinazės (DNR-PK) ir kitų PIKK šeimos narių substratas. 17 Reaguodamas į DNR pažeidimą, VCP fosforilinamas Ser 784 jo COOH gale - srityje, kuri nukreipta į VCP nukreipimą į specifinius tarpląstelinius skyrius; Tada VCP kaupiasi DSB vietose su ubiquitino ligazės RNF8, ubiquitino adapterio UFD1 – NPL4 ir su Lys-48 susietomis ubiquitin (K48-Ub) grandinėmis. 16 DNR pažeidimo sukeltas VCP fosforilinimas ir jo pritraukimas į DSB vietas rodo VCP vaidmenį atliekant DNR remontą.

DNR-PK yra DNR suaktyvinta serino / treonino baltymo kinazė, išsaugota stuburiniuose. 18 DNR-PK sudaro katalizinis subvienetas (DNR-PKcs) ir vienas Ku heterodimeras, 19, ir jis visur yra ekspresuojamas beveik visose žinduolių ląstelėse. Daugybė tyrimų parodė, kad DNR-PK vaidina svarbų vaidmenį atkuriant DSB, ypač nehomologiniame sujungime (NHEJ). Be to, DNR-PK ne tik turi lemiamą vaidmenį atkuriant DNR žalą, bet ir dalyvauja kituose svarbiuose fiziologiniuose ar patologiniuose procesuose 20, tokiuose kaip jautrumas radiacijai, uždegiminės reakcijos ir metabolinė genų ekspresija. 21, 22, 23 Tačiau vis dar nežinoma, kaip reguliuojamas DNR-PK baltymų skaidymasis ir ar VCP daro įtaką jautrumui radiacijai.

Šiame tyrime mes ištyrėme VCP ryšį su DNR-PKcs ir VCP reguliavimo įtaką glioblastomos ląstelių radiacijos jautrumui. Mūsų duomenys parodė, kad DNR-PKcs buvo visur ubituotas ir surištas su VCP; VCP numušimas lėmė DNR-PKcs baltymo kaupimąsi glioblastomos ląstelėse ir padidėjusį DNR-PK aktyvumą, kuris ilgainiui padidino GBM ląstelių išgyvenamumo dalį po IR ir sutrumpino ortotopinių ksenografuotų pelių išgyvenimo laiką.

Rezultatai

VCP yra susijęs su DNR-PK ir VCP D1 domenas yra būtinas šiam prisijungimui

Remiantis bioinformatine analize, DNR-PKcs baltyme yra VCP sąveikaujantis motyvas (VIM), kuris yra išsaugotas žinduoliuose, tokiuose kaip žmonės, beždžionės, karvės ir vilkai (1a paveikslas). Norint nustatyti, ar VCP yra susijęs su DNR-PK, imunodepresitacija (bendra IP) buvo atlikta naudojant DNR-PKcs antikūną keliose glioblastomos ląstelių linijose; M059J ląstelėje trūksta DNR-PKcs ir ji buvo naudojama kaip neigiama kontrolė. Western blot po atlikto bendro IP parodė, kad VCP yra nugriautas su DNR-PKcs (1b pav.); be to, sutinkant su ankstesniu mūsų tyrimu, 24 kuo jautresnė ląstelė, tuo daugiau VCP asocijuojasi su DNR-PK, tai rodo, kad VCP gali būti susijęs su atsparumu radiacijai. Tačiau pati radiacija nedaro didelės įtakos VCP jungimui su DNR-PKcs (duomenys neparodyti).

Image

VCP buvo susijęs su DNR-PK. a ) VIM ir baltymų sekų suderinimas tarp žmonių, beždžionių, karvių ir vilkų. ( b ) VCP buvo nugriautas DNR-PKcs IP skirtingose ​​GBM ląstelių linijose (WL: visos ląstelės lizatai). DNR-PKcs deficito M059J ląstelės buvo laikomos neigiamomis kontrolėmis. c ) atskirto VCP baltymo schema. Visi kamienai buvo pažymėti vėliavos epitopu (FL: viso ilgio). ( d ) Plazmidės, ekspresuojančios skirtingus VCP domenus, buvo atskirai perkeltos į 293T ląsteles (con: tuščias vektorius), ir buvo atliktas vėliavos imuninis nusodinimas. Tiek DNR-PKcs, tiek vėliava buvo aptikti ląstelių lizatuose (apatinės plokštės, rodomos kaip WL) arba vėliavos IP (viršutinės plokštės)

Visas dydis

Norėdami toliau nustatyti, kuris VCP domenas yra būtinas šiam prisijungimui, plazmidės, turinčios skirtingus VCP domenus, buvo atskirai perkeltos į 293T ląsteles. Įskaitant tuščią vektorių, Dr. Ueffing dosniai pateikė septynias plazmides, kaip išdėstyta 1c paveiksle pateiktame scheminiame brėžinyje. 25 Praėjus dviem dienoms po transfekcijos, sveiki 293T ląstelių lizatai buvo analizuojami Western blot analizėje, o IP prieš vėliavos antikūną buvo sunaudota 1 mg viso baltymo. „Western blot“ po IP parodė, kad viso ilgio, išskirtas N domenas ir izoliuotas D1 domenas, bet ne D2 domenas, gali tiesiogiai jungtis prie DNR-PK, ir tik sulietų baltymų ND1 domenas gali jungtis su DNR-PK . ND2 sulieti baltymai neturi aptinkamo jungimosi su DNR-PK, o D1D2 sulieti baltymai taip pat susilpnina D1 domeno surišimo afinitetą su DNR-PK. Šie stebėjimai rodo, kad D2 domenas daro neigiamą įtaką DNR-PK surišimui su VCP, kuris gali būti tarpininkaujamas keliais mechanizmais, įskaitant viena kitą paneigiančius surišimo ar konformacijos pokyčius.

Be to, viso ilgio VCP-imunoprecipiduotas DNR-PKcs baltymas buvo mažesnis už tą, kurį imunoprecipitavo izoliuotas N domenas arba D1 domenas; be to, sumažėjo ir bendras DNR-PKcs baltymas viso ilgio VCP perkeltose 293T ląstelėse. Šie stebėjimai rodo, kad sumažėjęs signalas greičiausiai atsirado dėl sumažėjusio bendro DNR-PKcs baltymo ir kad per didelis VCP ekspresija galėjo sukelti DNR-PKcs skaidymą. Nesuskaidytų ląstelių lizatų Western blot analizė parodė, kad visi kamienai, kuriuose yra VCP domenai, buvo vienodai ekspresuoti (1d paveikslo apatinė plokštė).

DNR-PKcs skilimas priklauso nuo ubiquitin-proteasomų ir yra kontroliuojamas VCP

Norint nustatyti, ar DNR-PK baltymų skilimas priklauso nuo proteasomų ir ar VCP reguliuoja DNR-PK skilimą, VCP buvo numušta lentiviruso tarpininkaujama SHRNR (šią shRNR patikrino kita grupė 26 ) U251 ląstelėse arba U87 ląstelėse. Western blot analizė parodė, kad DNR-PKcs yra sureguliuotas VCP numušimo ląstelėse, o per didelis VCP ekspresija sumažino DNR-PKcs kiekį (2a paveikslas), o tai rodo, kad VCP reguliuoja DNR-PKcs baltymų lygį. Kalbant apie VCP funkciją, VCP gali paveikti DNR-PKcs skilimą. Norint atmesti galimybę, kad VCP reguliuoja DNR-PKcs transkripciją, siekiant įvertinti DNR-PKcs mRNR lygį, buvo atlikta kiekybinė PGR (q-PGR). DNR-Pkcs mRNR lygis buvo aptiktas VCP numetimo ląstelėse, kontrolinėse ląstelėse ir tėvų ląstelėse (2b paveikslas). Kaip ir tikėtasi, reikšmingo DNR-PKcs mRNR lygio skirtumo tarp VCP numuštų U87, kontrolinių U87 ar tėvų U87 ląstelių nebuvo, o tai rodo, kad VCP gali reguliuoti DNR-PKcs skilimą, užuot moduliavęs jo transkripciją.

Image

VCP reguliavo DNR-PKcs skilimą ir šis skilimas priklausė nuo ubikvitino proteasomų. ( a ) U251 arba U87 ląstelės buvo užkrėstos VCP shRNR lentivirusais arba VCP ekspresijos lentivirusais. Imunoblotai buvo atlikti prieš ląstelių lizatus (Par: pirminės U251 ląstelės; Consi: nespecifinė RNR; VCPsi: VCP specifinė siRNR). ( b ) realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant DNR-PKcs specifinį pradmenį U251 ląstelėse, užkrėstose skirtingais lentivirusais (Par: pirminės U251 ląstelės); DNR-PKcs mRNR lygis yra palyginti su GAPDH. c ) Viršutinė plokštė: DNR-PKcs buvo imuniteto nusėdimas, ir DNR-PKcs, ir ubiquitinas buvo aptikti toje pačioje membranoje (WL: visos ląstelės lizatai). Apatinė plokštė: DNR-PKcs buvo aptikti pradinėse U251 ląstelėse, apdorotose MG132 (125 nM) už nurodytą dozę. ( d ) Tėvų U251 ląstelės arba U251 ląstelės, užkrėstos skirtingais lentivirusais, buvo gydomos proteasomų inhibitoriumi MG132 (50 μM ), o nurodytais laiko momentais buvo aptiktas DNR-PKcs baltymas. e ) Patronuojančios U251 ląstelės arba ląstelės, užkrėstos skirtingais lentivirusais, buvo gydomos lizosomų inhibitoriaus chloroformu nurodytomis koncentracijomis, o DNR-PKcs baltymas buvo aptiktas praėjus 12 val.

Visas dydis

Kadangi VCP sąlygojamas baltymų skaidymas priklauso nuo ubiquitin-proteasomų, siekiant nustatyti, ar DNR-PKcs yra visur, DNR-PKcs buvo išgrynintas per IP, o po to aptiktas ubiquitinas. Western blot parodė, kad ubiquitino signalas atsirado tik DNR-PKcs turinčiose U251 ląstelėse, kurių dydis yra DNR-PKcs, bet ne DNR-PKcs-deficito M059J ląstelėse ar nespecifinėje IgG juostoje, o tai rodo, kad DNR-PKcs buvo visuotinai išvalytas (2c paveikslas). Norėdami dar labiau išsiaiškinti, ar DNR-PKcs skilimas priklauso nuo proteasomų sistemos, U251 ląstelės buvo apdorotos proteasomų inhibitoriumi MG132 (125 nM) ir surinktos nurodytais laiko momentais (0, 12, 24, 48, 72 h), remiantis DNR-PKcs baltymo pusinės eliminacijos laikas.

Western blot duomenys parodė, kad DNR-PKcs baltymų lygis žymiai padidėjo praėjus 24 val. Po gydymo MG132; kuo ilgiau truko gydymas, tuo daugiau susikaupė DNR-PKcs (2c paveikslas), o tai rodo, kad DNR-PKcs skilimas priklausė nuo ubikvitino-proteasomos sistemos, nors tipiškų išteptų juostų nebuvo matyti, galbūt dėl ​​didelio DNR-PKcs (460 KD) molekulinė masė. Norint nustatyti, ar VCP numušimas daro sinergetinį poveikį DNR-PKcs kaupimuisi, kai yra proteasomų slopinimas, kontrolinės ir VCP numuštos U251 ląstelės nurodytą laiką (0, 3, 6, 12 h) buvo gydomos MG132. Imunoblotai parodė, kad 3 valandas po gydymo MG132 DNR-PKcs padidėjo VCP numuštų U251 ląstelėse (2d paveikslas). Be to, siekiant atmesti galimybę, kad šis padidėjimas priklausė nuo lizosomų, VCP numuštos U251 ląstelės buvo apdorotos lizosomų inhibitoriaus chlorokvinu nurodytoje koncentracijoje. Western blot parodė, kad chlorokvinas neturėjo jokios įtakos DNR-PKcs kaupimuisi net 6 valandas po gydymo; priešingai, chlorokinas sumažino DNR-PKcs ir VCP baltymų kiekį (2e pav.). Trumpai tariant, mūsų duomenys parodė, kad DNR-PKcs buvo ubikvitintas ir kad VCP reguliavo DNR-PKcs skaidymąsi per ubiquitin-proteasomų sistemą.

VCP numušimas padidina DNR-PK aktyvumą ir padidina DNR pažeidimų atstatymo efektyvumą

Norint nustatyti, ar VCP reguliuoja DNR-PK aktyvumą, taip pat DNR-PKcs baltymų lygius, endogeninis DNR-PK aktyvumas buvo tiesiogiai įvertintas atliekant in vitro kinazės testą ir netiesiogiai išmatuotas atliekant endogeninio RPA32 fosforilinimą (32 kDa replikacijos subvienetas). baltymas A). Nors RPA32 yra diferencijuotai fosforilinamas trijų PI3K (ataksinės telangiektazijos mutavusių baltymų, ATM, su ATM-Rad3 susijusiu baltymu ir DNR-PK), reaguojant į skirtingus DNR pažeidžiančius agentus, DNR-PK yra pirminė kinazė, atsakinga už kamptotecino (CPT) sukeltą medžiagą. RPA32 fosforilinimas; 27, 28, 29, 24, taigi, CPT sukeltas RPA32 fosforilinimas yra dar vienas DNR-PK aktyvumo rodiklis.

In vitro kinazės tyrime mūsų duomenys parodė, kad DNR-PK buvo suaktyvinamas jonizuojančiąja spinduliuote ir kad VCP numušimas sustiprino šį aktyvavimą, kuris buvo pusantro karto didesnis nei kontrolinėse ląstelėse, kaip parodyta pirmame 3a paveikslo grafike. . Atsakant į CPT gydymą, buvo pastebėtas RPA32 Ser 4/8 fosforilinimas kaip riboto judrumo juostos atsiradimas, palyginti su pradine RPA32 juosta, ir šią pasislinkusią juostą patvirtino fosforilinimo specifinis antikūnas. Šis CPT sukeltas RPA32 fosforilinimas tėvų U251 ląstelėse, U251 ląstelėse su VCP numušimu arba kontrolinėje siRNR (3a pav.) Buvo analizuotas densitometrijos būdu, naudojant ImageJ programinę įrangą (NIH, JAV). Kiekvienoje juostoje buvo apskaičiuotas fosforilinto RPA32 (viršutinė plokštė) ir bendro RPA32 (dvi juostos antroje plokštėje) santykis, kuris parodo DNR-PK aktyvumą. P-RPA32 santykis VCP numušto U251 ląstelėse buvo du kartus didesnis nei santykis kontroliniame U251, kaip parodyta paskutiniame 3a paveikslo grafike. Bendras RPA32 kiekis padidėjo VCP numušimo ląstelėse, tačiau to priežastis nežinoma.

Image

VCP numušimas padidino DNR-PK aktyvumą ir padidino DNR pažeidimų atstatymo efektyvumą. a ) Patronuojančios U87 ląstelės arba ląstelės, užkrėstos kontroliniais lentivirusais ar VCP shRNR lentivirusais, buvo gydomos 5 Gy spinduliu arba kamptotecinu (20 μM ). In vitro kinazės tyrimas buvo atliktas ląstelėms, apdorotoms radiacija. Ląstelės, apdorotos CPT, buvo tiriamos imunoblotu ir RPA32 ser 4/8 fosforilinimas buvo aptiktas densitometrijos analize praėjus 2 valandoms po apdorojimo (stulpeliai rodo vidurkį ± SD, atlikti trys nepriklausomi eksperimentai). Apskaičiuotas fosforo-RPA32 santykis su visu RPA32, o vertė normalizuota pagal β- aktino tankį. ( b ) U87 ląstelės, užkrėstos kontroliniais lentivirusais arba VCP shRNR lentivirusais, buvo apdorotos 5 Gy spinduliuote; ląstelės buvo surinktos nurodytais kometos tyrimo laiko momentais ir išmatuota 100 ląstelių kiekvienoje grupėje OTM vertės ir uodegos ilgio atžvilgiu. ( c ) U87 ląstelės su kontroliniais lentivirusais arba VCP shRNR lentivirusais buvo imunizuotos γ- H2AX gavus 2 Gy radiaciją; Buvo suskaičiuota 100 ląstelių ir grafikoje pateiktas vidutinis židinių skaičius ląstelėje nurodytais laiko momentais (raudona: γ- H2AX; mėlyna: DAPI). (Par: pirminės U87 ląstelės; Consi: nespecifinė RNR; VCPsi: VCP specifinė siRNR)

Visas dydis

Be to, siekiant įvertinti DNR pažeidimo atstatymo efektyvumą, buvo atliktas COMET tyrimas ir γ – H2AX aptikimas, parodantis DNR pažeidimo lygį kiekvienoje ląstelėje. COMET tyrime ląstelės buvo apšvitintos 10 Gy radiacija ant ledo. Apdorotos ląstelės buvo surinktos ir išgautos nurodytą laiką (30, 180, 360 min.), Ir ląstelėms buvo atlikta vienos ląstelės elektroforezė neutraliomis sąlygomis. Kiekvieną kartą išmatuota 200 ląstelių kiekvienai grupei, padidinant 200 kartų. Išmatuotas uodegos ilgis ir alyvuogių uodegos momento (OTM) vertės buvo apskaičiuotos naudojant CASP programinę įrangą, remiantis formule: OTM = uodegos DNR% × (uodegos vidurkis – galvos vidurkis). Po 30 minučių reikšmingo skirtumo tarp kontrolinių U251 ląstelių ir VCP numuštų ląstelių nebuvo. Tačiau po 3 ar 6 h atsigavimo U251 kontrolinėse ląstelėse uodegos ilgis arba OTM reikšmės buvo akivaizdžiai ilgesnės ar didesnės, palyginti su VCP numuštų U251 ląstelių ( P <0, 05), kaip parodyta 3b paveiksle, kuris rodo kad VCP numušimas paskatino DNR atstatymo efektyvumą.

Be to, U251 ląstelėse, apdorotose 2 Gy spinduliu, taip pat buvo suskaičiuotas kitas DNR pažeidimo žymeklis, γ- H2AX židiniai (duomenys apie kitas radiacijos dozes nerodomi). Praėjus valandai po radiacijos, U251 kontrolinėse ląstelėse ir VCP numušimo ląstelėse buvo pastebėti masiniai γ- H2AX židiniai, ir beveik kiekvienoje ląstelėje buvo daugybė židinių (raudoni taškai). Praėjus šešioms valandoms po radiacijos, daugumoje kontrolinių ląstelių nebuvo ryškių γ- H2AX dažų pokyčių, tuo tarpu pusės VCP numuštų ląstelių židiniai išnyko ( P <0, 01) (3c paveikslas). Galiausiai tiek kontrolinės, tiek VCP numuštos ląstelės po 24 val. Atsigavimo nebuvo aptinkamos. Visi šie stebėjimai rodo, kad VCP numušimas padidina DNR-PK aktyvumą ir padidina DNR pažeidimų atstatymo efektyvumą.

VCP numušimas padidina GBM ląstelių išgyvenamumą po gydymo radiacija ir sutrumpina ortotopinių ksenografuotų pelių išgyvenimą

Norint nustatyti, ar VCP reguliuoja GBM ląstelių jautrumą radiacijai, šiame tyrime buvo naudojamas in vitro klonogeninis tyrimas ir in vivo ortotopinis pelių modelis. Atliekant klonogeninį testą, signalizuotos VCP numuštos U87 ląstelės arba U251 ląstelės buvo pasėtos 100 mm lėkštelėse (kiekvienoje po 400 ląstelių); ląstelės buvo apšvitintos nurodyta doze ir po to buvo kultivuojamos 2 savaites. Buvo suskaičiuotos kolonijos, kuriose yra 50 ar daugiau ląstelių. VCP numušimas padidino išgyvenamumo dalį tiek U251, tiek U87 ląstelėse. Po 2 Gy radiacijos, VCP numušimas paskatino U251 ląstelių išgyvenimą nuo 29, 3 iki 51, 3% ( P <0, 01), o U87 ląstelių išgyvenimą nuo 34, 9 iki 62, 3% ( P <0, 01) (4a paveikslas). U87 ląstelės buvo atsparesnės radiacijai nei U251 ląstelės, tai atitiko mūsų ankstesnį tyrimą. 24 Kontrolinio ir tėvų U251 ar U87 ląstelių išgyvenamumas reikšmingo poveikio neturėjo. Norėdami dar labiau patvirtinti, ar padidėjęs VCP atsparumas radiacijai yra priklausomas nuo DNR-PK, šiame tyrime buvo panaudotos DNR-PKcs turinčios (M059K) ir deficitinės (M059J) GBM ląstelės. Mūsų duomenys parodė, kad VCP numušimas žymiai pagerino DNR-PK turinčių M059K ląstelių išgyvenimą, bet ne DNR-PK turinčių M059J ląstelių išgyvenimą, parodydamos, kad VCP sukelto radiacijos atsparumas priklauso nuo DNR-PK.

Image

VCP smūgis padidino GBM ląstelių atsparumą radiacijai. a ) Eksponentiškai augančios pirminės U251, U87, M059K, M059J ląstelės arba ląstelės, užkrėstos kontroliniais lentivirusais ar VCP shRNR lentivirusais, buvo atskirai pasėtos 10 cm lėkštelėmis (400 ląstelių viename inde), klonogeniniai tyrimai buvo atlikti po radiacijos, nurodytomis dozėmis., o išgyvenamumo frakcija buvo normalizuota, norint kontroliuoti ląsteles. ( b ) orthotopinėms GBM pelėms, sudarytoms iš keturių grupių, buvo sudaryta Kaplano ir Meier išgyvenimo kreivė (* P <0, 05); išgyvenamumo laiko padidėjimas radiacijos metu buvo apskaičiuotas remiantis formule: išgyvenimo trukmės padidėjęs radiacija = prailgintas išgyvenimo laikas / išgyvenimo laikas be radiacijos. c ) vidutinis naviko dydis ir tipiniai MR vaizdai kiekvienoje grupėje bei reprezentatyvūs VCP imunofluorescencijos vaizdai (raudoni) ksenografuotose glioblastomos atkarpose. d ) VCP baltymų lygio koreliacijos su paciento išgyvenimu analizė ir reprezentatyvūs VCP imunohistocheminiai vaizdai glioblastoma sergančių pacientų parafino skyriuose. e ) reprezentatyvūs kiekvienos grupės paveikslėliai (Con: para-naviko audinys)

Visas dydis

Ortotopinio pelės modelio kontrolėmis buvo naudojamos tuščių virusų užkrėstos U87 ląstelės, iš viso buvo sušvirkštos 48 pelės. Devynias dienas po injekcijos pelės, turinčios navikus (39 pelės), buvo atsitiktinai suskirstytos į dvi grupes pagal MRT, įskaitant IR ir ne IR švitinimą. Kiekvienoje grupėje buvo kontroliniai ir numetami pogrupiai (po 10 pelių kiekviename pogrupyje). 6 Gy visos radiacijos buvo sušvirkšta tris kartus per 1 savaitę; grafikas yra aprašytas skyriuje Medžiagos ir metodai. Buvo užregistruotas kiekvienos pelės išgyvenimo laikas, o visi išgyvenimai kiekvienoje grupėje buvo analizuojami Kaplan – Meier metodu. Mūsų duomenys parodė, kad gydymas radiacija pailgino pelių išgyvenimo laiką visose grupėse. Gydant radiacija, VCP numušimo grupės pelės išgyveno trumpiau (38, 4 dienos, vidutinis išgyvenimo laikas) nei pelės kontrolinėse grupėse, kurių išgyvenimo laikas buvo 53, 8 dienos (4b paveikslas). Negydant radiacijos, išgyvenimo laikas VCP numušimo grupėje buvo šiek tiek trumpesnis nei kontrolinės grupės. Išgyvenimo laiko padidėjęs radiacijos koeficientas VCP numušimo grupėje buvo 2, 69%, daug mažesnis nei kontrolinės grupės (27, 1%); skirtumas buvo statistiškai reikšmingas ( P <0, 001) (4b paveikslas).

Remiantis navikų MRT atvaizdu 9-ą dieną po intrakranijinės injekcijos, naviko dydis kiekvienoje grupėje skyrėsi, tačiau nežymiai, kaip matyti reprezentatyviose nuotraukose 4c paveikslo viduryje. Kaip ir tikėjomės, naviko dydžiai VCP numušimo grupėje 29-tą dieną buvo akivaizdžiai didesni nei tos pačios pelės 9-tą dieną, kaip parodyta reprezentatyviuose vaizduose dešiniajame vidurinės grafikos stulpelyje (4c paveikslas). Buvo apskaičiuoti vidutiniai naviko tūriai kiekvienoje grupėje ir parodyti 4c paveiksle. Naviko dydžiai sumažėjo daugiau (28, 9%) kontrolinėje grupėje nei VCP numalšinimo grupėje (6, 3%) po radiacijos. Reprezentatyvios fluorescencinės VCP baltymų lygio ksenografuoto GBM baltymo nuotraukos yra parodyta 4c paveiksle.

Norint toliau tirti VCP raišką ir jo poveikį GBM jautrumui radiacijai, VCP baltymo ekspresija pacientų (IV laipsnio astrocitoma) GBM sekcijose buvo pusiau įvertinta naudojant audinių IA kiekybinės analizės programinę įrangą (Leica, Solms, Vokietija) ir koreliacija su išgyvenimu buvo analizuojamas laikas. Visi skaitmeniniai vaizdai buvo normalizuoti iki neigiamos kontrolės. Taškai, esantys mažiau nei 10%, buvo laikomi „-“; balai, didesni nei 10% ir mažesni nei 25%, buvo laikomi „+“; ir daugiau kaip 25% balų buvo laikomi „++“. Duomenys parodė, kad VCP buvo diferencijuotai ekspresuojamas GBM audinyje ir kad VCP ekspresijos lygis buvo teigiamai koreliuojamas su pacientų išgyvenimo laiku ( R2 = 0, 5222, P <0, 05). Pacientai, kuriems yra didelis VCP, gydantis radiacija, ilgiau išgyventų (4d pav.). Tipinės nuotraukos parodytos 4e paveiksle. Šis pastebėjimas atitiko mūsų duomenis apie gyvūnus.

Diskusija

Pirmiausia išsiaiškinome, kad DNR-PKcs yra visuminis ir sujungtas su VCP; gydymas proteasomų inhibitoriumi (MG132), bet ne lizosomų inhibitoriumi (chlorokinas), padidino DNR-PKcs baltymų kiekį; VCP numušimas turėjo sinergetinį poveikį apdorojant MG132 DNR-PKcs baltymų kaupimuisi. VCP, kaip nešiklis, jungiasi su polikvitinitinu baltymu ir tiekia jį į proteasomų sistemą skilimui; taigi, tiek proteasomų slopinimas, tiek VCP numušimas padidino DNR-PKcs baltymų lygį, o abiejų derinimas padidino DNR-PKcs baltymų lygį. Šie stebėjimai parodė, kad VCP reguliuoja DNR-Pkcs baltymų skilimą, kuris priklauso nuo ubikvitino ir proteasomų. Įdomu tai, kad gydymas MG132 taip pat padidino paties VCP baltymo lygį, o tai rodo, kad VCP skaidymą taip pat reguliuoja ubiquitin-proteasome sistema. Be to, gydymas chloroquine netikėtai sumažino DNR-PKcs ir VCP baltymų kiekį glioblastomos ląstelėse, o tai rodo, kad lizosomų slopinimas kompensaciniu būdu gali sustiprinti proteasomų skilimą arba su endoplazminiu retikulumi susijusį skilimą.

Be to, nors manoma, kad DNR-PK yra branduolio baltymas, mūsų pastebėjimas rodo, kad DNR-PK ar bent jo katalizinis subvienetas taip pat yra citoplazmoje 21 ir kad VCP yra susijęs su ja ir reguliuoja jo skilimą. Bendrai atliktame IP eksperimente nustatyta, kad tiek VCP baltymo N-galinis domenas, tiek D1 domenas gali jungtis prie DNR-PK, o tai atitinka naujausias bendro IP ir biologinio sluoksnio interferometrijos eksperimentų išvadas, naudojant VIM peptidą gp78; Ši išvada taip pat iš dalies atitiko ankstyvuosius duomenis, kurie parodė, kad rodopsino (P23H) baltymas sąveikauja tik su p97ND1 domenu, bet ne su izoliuotu p97N domenu. 25 Tačiau VCP ND2 domenas neturi aptinkamo surišimo su DNR-PKcs, o D1D2 domenas taip pat susilpnina D1 domeno surišimo afinitetą su DNR-PKcs. Šie rezultatai rodo, kad VCP asociacijai su tiksliniu baltymu turi įtakos konformacijos pokyčiai, kuriuos gali sukelti ATP surišimas / hidrolizė arba hierarchinis surišimas. Be to, buvo pranešta, kad vienas aminorūgščių pakaitalas (R155H), esantis sąsajoje tarp N-galo domeno ir gretimo VCP AAA domeno (D1), sumažina afinitetą ADP. 31 Nors ankstesni duomenys parodė, kad VCP fosforilinamas DNR-PK, reaguojant į DNR žalą, neaišku, ar šis VCP fosforilinimas turi įtakos jo jungimuisi su DNR-PK, ar reguliuoja VCP aktyvaciją.

Be to, biocheminiai ir struktūriniai tyrimai parodė, kad daugybėje VCP atpažįstamų kofaktorių (p97) yra Ubix baltymų šeimoje esantis ubiquitino X (UBX) domenas arba panašus NPL4 ubikvitino domenas. 30 Be to, kad VCP fosforilinamas ties Ser 784, DNR-PKcs taip pat turi „AAXXR“ VIM motyvą (1a pav.), Kuris yra išsaugotas žinduoliuose ir atitinka ankstesnį atradimą. 30 Mūsų duomenys taip pat parodė, kad DNR-PKcs yra uviquitinated ir jo skilimas priklauso nuo ubiquitin-proteasome; tačiau specifinė visur esanti (-ios) DNR-PKcs (-ų) vieta ir jos atitinkama E3 ligazė dar nebuvo atrasta ir bus nagrinėjama mūsų būsimuose tyrimuose.

DSB yra mirtiniausias DNR pažeidimo tipas; Jei ląstelė negali ištaisyti šios žalos, nepataisyti DSB gali sukelti ląstelės mirtį. Kaip centrinis NHEJ komponentas, DNR-PK kontroliuoja DSB atstatymo procesą ir palaiko genomo stabilumą. DNR-PK aktyvumo pokyčiai ar DNR-PKcs baltymo kiekis greičiausiai pakeis ląstelių jautrumą genotoksiniam stresui, pavyzdžiui, radiacijai. Gerai žinoma, kad DNR-PKcs - / - pelės yra padidėjusio jautrumo radiacijai ir joms atliekama ATM ir p53 priklausoma apoptozė. 32, 33, 34 Tačiau TCGA ir mūsų grupės duomenys rodo, kad DNR-PKcs baltymų lygiuose nėra reikšmingo skirtumo tarp normalaus gliaudinio audinio ir GBM naviko audinio, nors kai kuriais atvejais imunohistocheminė analizė parodė, kad naviko ląstelės išreiškia daugiau DNR -PKcs nei gretimas normalus audinys, 35 tai gali būti dėl audinio specifiškumo.

Siekiant išvengti galimo šalutinio poveikio, kurį sukelia DNR-PK inhibitoriai, nukreipimas į DNR-PK reguliuojančius baltymus, padidintus spinduliuotei atspariose glioblastomos ląstelėse, yra alternatyvi radiosensitizacinio gydymo strategija. Anksčiau nustatėme, kad baltymas fosfatazė PP6 reguliuoja GBM ląstelių jautrumą radiacijai per DNR-PK ir kad numušdamas PP6c padidina pelių išgyvenimo laiką; be to, PP6c buvo per daug išreikštas 44, 7% (17 iš 38 atvejų) GBM sergančių pacientų. 21, 22, 36, 37, 24

Šiame tyrime VCP numušimas ne tik sukėlė DNR-PKcs baltymo kaupimąsi, bet ir padidino DNR-PK aktyvumą bei padidino DNR pažeidimo atstatymo GBM ląstelėse efektyvumą. Nors VCP numušimas paveikė 53BP1 verbavimą į DNR pažeidimo vietas ir atrodė, kad padidina U2OS ląstelių ir nematodo jautrumą radiacijai, 15, 16 duomenys parodė, kad DNR-PK kaupimas padidino DNR pažeidimo atstatymo GBM ląstelėse efektyvumą, o tai gali būti nuo p53 nepriklausomų kelių ir skirtingo VCP vaidmens skirtingų tipų ląstelėse rezultatas. 38 Mūsų tyrimas in vivo patvirtino, kad VCP numušimas sumažino pelių išgyvenamumą ir sutrumpino GBM ortotopinį modelį. Klinikiniai duomenys taip pat patvirtino šią išvadą. Todėl mažos molekulės, kurios selektyviai nukreipia į VCP baltymą, gali paveikti jautrumą radiacijai, reguliuodamos DNR-PK baltymo lygį. Šie stebėjimai rodo, kad DNR-PK reguliuojantys baltymai yra potencialūs taikiniai gydant radiosensibilizaciją.

Žodynas

VCP

valosino turintis baltymas

DNR-PK

Nuo DNR priklausanti baltymų kinazė

ER

endoplazminis Tinklelis

ERAD

Su ER susijęs baltymų skilimas

DSB

DNR dvigubos grandinės pertrauka

VIM

VCP sąveikaujantis motyvas

NHEJ

nehomologinis pabaigos sujungimas

ATR

Su ATM-Rad3 susijęs baltymas

Bankomatas

ataksijos telangiektazijos mutavusių baltymų

CPT

kamptotecinas