Il7r kitimas lemia sarkoido uždegimą | genai ir imunitetas

Il7r kitimas lemia sarkoido uždegimą | genai ir imunitetas

Anonim

Anotacija

Sarkoidozė yra lėtinis granulomatinis sutrikimas, kuriam būdingas didelis Th1 limfocitų antplūdis. Tiek naivios, tiek atminties T ląstelės išreiškia aukštą interleukino 7 receptoriaus-α (IL7Rα), užkoduoto IL7R geno, kiekį. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti IL7R geno regiono vaidmenį jautrumui sarkoidozei. Šeši įprasti vieno nukleotido polimorfizmai (SNP), apimantys IL7R, buvo genotipizuoti ir išanalizuoti 475 sergančiais sarkoidoze ir 465 sveikomis kontrolinėmis grupėmis . Vieno reikšmingo SNP replikacija buvo atlikta 206 nepriklausomiems pacientams, sergantiems sarkoidoze, 127 kontroliniams pacientams ir 126 pacientams, sergantiems Löfgreno liga. Rs10213865 SNP buvo susijęs su sarkoidoze ( P = 0, 008), o atliekant silico analizę, buvo nustatytas visiškas ryšys ( r 2 = 1, D ′ = 1) su funkciniu nenoniminiu koduojančiu SNP 6 egzone (rs6897932, T244I). Kombinuota 663 asmenų, sergančių sarkoidoze, ir 586 kontrolinių grupių analizė (homozigotiniai rizikos alelio nešiotojai, P = 5 × 10 −4, šansų santykis = 1, 49 (1, 19–1, 86)) pateikė stiprią statistinę informaciją apie tikrą IL7R ryšį su sarkoidozės rizika. . Be to, mes pranešame apie tą pačią tendenciją tarp IL7R geno ir pacientų, sergančių Löfgreno liga, variacijų, ir tai rodo, kad IL7R kitimas gali sukelti bendrą riziką susirgti granulomatine plaučių liga.

Įvadas

Sarkoidozė yra lėtinė, dažnai negalią sukelianti liga, kuria serga 20–50 iš 100 000 žmonių daugumoje Vakarų šalių. Dėl sarkoidozei būdingų uždegiminių pažeidimų pastebimas didelis Th1 limfocitų antplūdis. Manoma, kad jautrumas ligoms ir jo progresavimas iš dalies priklauso nuo genetinių veiksnių. 1, 2, 3, 4 iš šių genetinių veiksnių pakartotinai patvirtinta, kad tik žmogaus leukocitų antigeno genų kompleksas yra susijęs su sarkoidoze daugelyje skirtingų etninių grupių populiacijų. Pranešama, kad daugelio ne žmogaus leukocitų antigenų genų polimorfizmai yra susiję su sarkoidoze, tačiau iki šiol patvirtinti juos buvo sunku (neseniai apžvelgė „Grunewald 5“ ).

Interleukino 7 receptorių α (IL7Rα) (dar žinomas kaip CD127), koduojamas IL7R geno, yra I tipo citokinų receptorių šeimos narys ir sudaro receptorių kompleksą su bendra citokinų receptoriaus γ grandine (γ c arba CD132). kuriam IL7 yra ligandas, kurį gamina stromos ląstelės limfoidiniuose audiniuose. Svarbu tai, kad IL7Rα yra pagrindinis ankstyvojo heterogeniškumo, pastebėto efektorinėse T ląstelėse, funkcinis žymeklis. 6, 7, 8 Tiek naivios, tiek atminties T ląstelės išreiškia aukštą IL7Rα lygį, o jų homeostazei nustatyti reikalingas IL7. 9 Dėl T ląstelių suaktyvinimo IL7Rα gali būti sureguliuotas per 48 valandas po antigeninės stimuliacijos, tačiau imuninės reakcijos metu ramybės atmintyje jie vėl pasireiškia. Kaech ir kt. 7 parodyta, kad IL7Rα išraiška nedideliame skaičiuje CD8 + efektorinių ląstelių identifikuoja pogrupį, kurį ketinama diferencijuoti į tikras atminties ląsteles. Kiti pranešimai parodė svarbią IL7 funkciją kuriant ir CD4 + atminties ląsteles. Bazinis IL7 lygis yra pakankamas CD8 + atminties fondo išgyvenimui palaikyti ir gali prisidėti prie CD4 + atminties fondo išgyvenimo. 11 Įdomu tai, kad IL7R signalizacija turi imunomoduliacinį vaidmenį dendritinėse ląstelėse, ypač esant timos stromos limfopoetinui (TSLP), kuris taip pat signalizuoja per IL7Rα heterodimeriniame komplekse, dimerizuodamas citokinų receptorių tipo 2 faktoriaus geno produktu ( CRLF2 ), kad sudarytų TSLP receptorius. TSLP yra homologiškas IL7 ir yra gaminamas epitelio kilmės ląstelių užkrūčio, plaučių, žarnyne ir odoje. 12 Be netiesioginio TSLP aktyvuotų dendritinių ląstelių poveikio CD4 + T-ląstelių homeostazei 13 ir T-reguliuojančių ląstelių vystymuisi užkrūčio liaukoje, 14 Rochmanas ir kt. Neseniai 15 įrodė tiesioginį TSLP poveikį aktyvuotoms CD4 + ląstelėms.

IL7R genas yra 5p13 chromosomoje, regione, susijusiame su išsėtine skleroze, 16 astma 17 ir I tipo diabetu. 18 Iki šiol nebuvo paskelbta tyrimų, tiriančių IL7R α genotipinius skirtumus tarp sarkoidoze sergančių pacientų ir kontrolinės grupės. Mes nustatėme šešis įprastus vieno nukleotido polimorfizmus (SNP), apimančius IL7R , įskaitant 5 'promotorių, SNP 5 introną , nenonimišką SNP 8 egzone ir tris haplotipus žymintys SNP. Taip pat išanalizuota koreliacija su ligos aktyvumo parametrais, plaučių funkcijos parametrais ir bronchoalveolinio plovimo ląstelių skaičiumi.

Rezultatai

IL7R geno variacijos pasiskirstymas sergantiems sarkoidoze ir sveikiems kontroliniams pacientams

1 lentelėje apibendrinti ištirtų IL7R SNP alelių dažniai sergant sarkoidoze ir kontrolinėje grupėje. SNP nenukrypo nuo Hardy – Weinberg pusiausvyros kontrolėje. Tarp jungčių rs1353252 ir rs1389832 ( r 2 = 0, 99, D ′ = 1) ir beveik visiškas LD tarp rs1494554 ir rs3194051 ( r 2 = 0, 97, D ′ = 0, 99) buvo pastebėtas jungties disbalansas (LD) (1 paveikslas). Palyginus sergančius sarkoidoze pacientus su kontroliniais pacientais, alelio A dažnis rs10213865 buvo didesnis sergantiems sarkoidoze (0, 75 vs 0, 69, χ 2 = 7, 1, P = 0, 008, P pataisyta ( P c ) = 0, 03, šansų santykis (OR) = 1, 32 ( 1, 08–1, 62), df = 1). Panašiai rs1353252 buvo reikšmingai susijęs su sarkoidoze, tačiau jis neatlaikė Bonferroni pataisos efektyviam nepriklausomų SNP skaičiui ( χ 2 = 5, 0, P = 0, 03, P c = 0, 10, df = 1). Rs10213865 pozicijoje recesyvinis modelis (AA vs AC + CC) geriausiai tiko ir padidino ligos riziką homozigotiniams „A“ alelio nešiotojams (0, 57 vs 0, 48, χ 2 = 8, 5, P = 0, 004, OR = 1, 47 ( 1.14–1.91)).

Pilno dydžio lentelė

Image

IL7R vieno nukleotido polimorfizmų (SNP) pusiausvyros jungties pusiausvyros vertės Nyderlandų populiacijoje. Poros r 2 (× 100) vertės parodytos blokais.

Visas dydis

Atlikus permutacijos analizę (10 000 permutacijų), aukščiau pateiktas vieno žymens palyginimas išliko reikšmingas (rs10213865 A alelis; P permutacija = 0, 035). Sukurti haplotipai buvo visiškai apibrėžti unikalių SNP, todėl IL7R haplotipų analizė nepateikė jokios papildomos informacijos, išskyrus atskiras SNP analizes.

Likę IL7R polimorfizmo dažniai reikšmingai nesiskyrė tarp sergančių sarkoidoze ir kontrolinių grupių (1 lentelė).

Rs10213865 neatskleidė jokio funkcinio motyvo, todėl buvo atlikta europinės kilmės populiacijų, deponuotų NCBI SNP populiacijos duomenų banke, sąsajų analizė mūsų SNP rinkiniui ir bet kokiems SNP, rodantiems funkcinius dbSNP pokyčius. Tarp rs10213865 ir rs6897932, funkcinio nenoniminio kodavimo SNP 6 egzone (T244I), buvo pastebėtas visas LD ( r 2 = 1, D ′ = 1). Treonino liekana (T244) buvo labai saugoma tarp žinduolių rūšių. Graužikams treoniną keičia aminorūgštys serinas, abu priklauso aminorūgščių grupei su neapkrautomis polinėmis šoninėmis grandinėmis (2 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Rs10213865 efekto atkartojimas

Norėdami pakartoti SNP ryšį, mes atlikome genotipą nepriklausomam pacientų atvejo ir kontrolės duomenų rinkiniui, kuris 2008 m. Dalyvavo keliose Nyderlandų ligoninėse (206 atvejai ir 127 kontrolinės). Alelio A dažnis rs10213865 buvo panašus į alelio A dažnį pradinėje kohortoje ir didesnis sarkoidoze sergantiems pacientams (0, 76 vs 0, 67, P = 0, 01). Kombinuota 663 nepriklausomų asmenų, sergančių sarkoidoze, analizė ir 586 kontrolinės grupės ( P = 0, 0005, OR = 1, 49 (1, 19–1, 86) recesyviniam genotipo kodavimui) analizė suteikė stiprią statistinę informaciją apie tikrą IL7R ryšį su sarkoidozės rizika (3 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Be to, norėdami patikrinti, ar ryšys su IL7R yra specifinis sarkoidozė, mes nustatėme 139 pacientų, sergančių Löfgreno sindromu, laikomų kliniškai ir genetiškai skirtinga granulomatine plaučių liga. Löfgreno sindromu sergantiems pacientams alelio A dažnis rs10213865 rodė tokį patį pasiskirstymą kaip ir sarkoidoze sergantiems pacientams. Tačiau dėl mažo pacientų skaičiaus reikšmingumas nebuvo lyginamas su kontroliniais (0, 74 vs 0, 69, P = 0, 09) (4 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

IL7Rα ekspresija periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse ir BALF limfocituose

Norėdami ištirti IL7R rs10213865 genotipo variacijos biologinę reikšmę, mes išmatuojome ekspresijos modelius lygiagrečiuose sveikų asmenų periferinio kraujo (PB) mononuklearinių ląstelių ir bronchoalveolinio plovimo skysčio (BALF) mėginiuose. Atliekant membranų surištos IL7Rα ekspresijos analizę atsižvelgiant į sarkoidozių riziką modifikuojančio SNP rs10213865 genotipą, reikšmingo skirtumo tarp IL7R genotipų ir IL7Rα vidutinio fluorescencijos intensyvumo ant PB ar BALF limfocitų nesiskyrė (duomenys nepateikti). Taip pat nepastebėta reikšmingų skirtumų tarp rs10213865 AA ir AC + CC genotipų, lyginant PB ir BALF limfocitų, CD4 + limfocitų ir CD4 + / CD8 + santykio procentus arba absoliutų skaičių (duomenys nepateikti).

Koreliacija tarp IL7R geno variacijos ir klinikinių parametrų sergantiems sarkoidoze

Mes ištyrėme susijusio IL7R lokuso įtaką pacientų, sergančių sarkoidoze, plaučių funkcijos parametrams, matuojant jų pateikimo metu. Kai pacientų ( n = 75) difuzinės plaučių talpos (Dlco) anglies monoksido vertės buvo sugrupuotos pagal AA vs AC + CC genotipus, rezultatai buvo (vidurkis ± sem) taip: AA (80, 2 ± 2, 8) vs AC + CC ( 86, 7 ± 3, 0), P = 0, 12. Panašiai tiek gyvybiškai svarbus (įkvepiantis) iVC, tiek priverstinis iškvėpimo tūris per 1 s (FEV 1 ) buvo mažesni homozigotinių AA asmenų, nepasiekus reikšmingumo (duomenys nepateikti).

Be to, nebuvo pastebėta jokių reikšmingų skirtumų tarp rs10213865 AA ir AC + CC genotipų, lyginant PB ir BALF limfocitų, CD4 + limfocitų, CD4 + / CD8 + santykio ir serumo IL-2R procentus arba absoliutų skaičių ir serumo IL-2R bei serume angiotenziną konvertuojančio fermento (AKF)., pataisytos atsižvelgiant į AKF įterpimo / trynimo genotipus) vertės, išmatuotos pateikiant (2 paveikslas).

Image

Vidutinės absoliučių BALF ląstelių procentinės dalys, bronchoalveolinio plovimo skysčio (BALF) limfocitų procentas, BALF CD4 + ląstelių procentas, BALF CD4 + / CD8 + santykis, serumo IL-2R vertės ir angiotenziną konvertuojančio fermento (ACE) Z balai (remiantis ACE) įterpimo / pašalinimo pataisyti atskaitos intervalai) asmenims, turintiems IL7R rs10213865 AA vs AC + CC genotipus. Nė vienas iš parametrų reikšmingai nesiskyrė tarp genotipų.

Visas dydis

Nebuvo pastebėta koreliacijos su rentgenografine stadija pristatymo metu (duomenys neparodyti). Plaučių ligos baigties, apibrėžtos rentgenograma po minimalaus 4 metų stebėjimo, analizė nenustatė jokio ryšio su IL7R rs10213865 genotipais (5 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Šie duomenys rodo, kad IL7R kitimas neturi įtakos ligos sunkumui ar aktyvumui klinikinės atviros ligos metu.

Diskusija

Šiame darbe mes aprašėme ryšį tarp introno SNP IL7R gene ir sarkoidozės. Nauji atradimai buvo pakartoti patvirtinimo grupėje, atskleidžiančioje tuos pačius skirtumus, susijusius su apelių dažniu tarp sarkoidoze sergančių pacientų ir kontrolinių grupių. Introno SNP, esantis rs10213865, buvo visiškai LD su funkciniu nesinoniminiu koduojančiu SNP 6 egzone (rs6897932, T244I), dėl kurio pakito pakitęs membrana ir tirpus IL7Rα. 19 Gregory ir kt. 19 parodė, kad nuorašai, kuriuose yra C alelio rs6897932 padėtyje, dvigubai padidino 6 egzono praleidimą, sutrukdydami egzoninį splaising duslintuvą, palyginti su nuorašais su T alele, ir tuo pat metu gamino mažiau membranų surištą IL7Rα baltymą, o tai dar labiau padidina tirpios formos IL7Rα. Tai greičiausiai turės įtakos IL7 arba TSLP signalų tinklo dinamikai kelių tipų ląstelėse 8, 20 ir gali turėti tiesioginį poveikį sarkoidozės patogenezei.

Rs10213865 dažnis buvo vienodai pasiskirstęs pacientams, sergantiems Löfgreno liga, nors ribotas skaičius neleido jo reikšmingumo. Tai gali reikšti, kad su sarkoidoze susijęs alelis sukelia bendrą granulominės plaučių uždegiminės ligos riziką. Kaip buvo pranešta anksčiau, dėl genetinių kitų genų pokyčių gali atsirasti įvairių klinikinių sarkoidozės fenotipų jautrumas. 21, 22, 23, 24, 25, 26 Mūsų rezultatai rodo, kad su IL7Rα susijęs imuninio atsako kelias yra sarkoidozės etiologijoje.

IL7R kitimas gali sukelti jautrumą sarkoidozei ankstyvosiose reakcijos į „sarkoidozės antigenus“ stadijose, kai pažeistas IL7 signalas gali sumažinti pradinį imuninės sistemos aktyvavimą. Antigeno išlikimas gali sukelti klinikinę atvirą ligą, o IL7R polimorfizmo įtaka gali būti sumažinta. Tai galėtų paaiškinti, kad nėra koreliacijos tarp IL7R rs10213865 genotipų ir klinikinių parametrų, išmatuotų pateikiant ar atliekant rentgenografiją po minimalių 4 metų stebėjimo.

Sveikų kontrolinių tyrimų metu nebuvo nustatyta koreliacijos tarp sarkoidozės rizikos genotipo ir IL7Rα ekspresijos ant PB arba BALF T limfocitų, nors mes negalime atmesti galimybės, kad tirpus IL7R prilipo prie ląstelės membranos ir dėl to padidėjo fluorescencijos intensyvumo vertės. Sumažėjusi išraiška BALF skyriuje būtų leidusi supaprastinti neseniai suaktyvintų limfocitų, kurie migravo į plaučius ir vėliau sumažino IL7Rα, aiškinimą.

Reikia toliau ištirti IL7-IL7Rα ligando ir receptoriaus poros svarbos mechanizmą sarkoidozėje. Sumažėjęs IL7 signalizavimas dėl padidėjusios tirpios IL7Rα produkcijos sarkoidoze sergantiems pacientams gali turėti reikšmingų padarinių imuniniam aktyvumui, skatinant mažiau T ląstelių daugintis ir išgyventi. Imuninis atsakas į bakterijas 27 gali susilpnėti dėl sumažėjusios B ir T ląstelių diferenciacijos. Alternatyviai, sutrikusi reguliuojamoji T-ląstelių funkcija gali sukelti lėtinę imuninės sistemos aktyvaciją ir susijusius audinių pažeidimus, ir tai gali turėti įtakos granulomos evoliucijai. 28 Maža IL7Rα ekspresija CD4 + CD25 + T ląstelėmis koreliuoja su aukšta branduolio transkripcijos faktoriaus FoxP3 ekspresija ir neseniai buvo nustatyta kaip svarbi periferinių reguliavimo T ląstelių savybė. Norint normaliai vystytis T ląstelių linijai, reikia tiek IL7, tiek TSLP signalų. 30 Anksčiau buvo pranešta, kad FoxP3 teigiamoms ląstelėms, be IL2 receptorių, reikėjo ir γ stimulo. 31 Nesenus Mazzucchelli ir kt. Tyrimas . 32 reiškia, kad IL7Rα teikia ir y c stimulą, ir, suporuotas su TSLP receptoriumi, γ c- nepriklausomą stimulą.

Nustatyta, kad aktyviose sarkoidozėse esančiose FoxP3 + reguliuojančiose T ląstelėse padaugėjo funkcijų, tačiau jos negali slopinti granulomos susidarymo in vitro . Konkurencija dėl riboto IL7 tarp ląstelių tipų gali sumažinti sarkoidozių apsauginių ląstelių, tokių kaip reguliuojančios T ląstelės, išgyvenamumą. Visų pirma, tolesnius tyrimus reikia atlikti dėl TSLP vaidmens sergant epitelio ląstelių sukelta sarkoidoze. TSLP suaktyvina CD11c + dendritines ląsteles ir sukelia jų Th2 citokinų gamybą. 33 Sumažėjęs TSLP receptorių lygis gali sukelti Th1 spragą sarkoidozėje.

Čia mes pateikėme įtikinamų įrodymų, kad IL7R polimorfizmai padidina ne žmogaus leukocitų antigeno genetinę riziką sergant sarkoidoze, parodydami šio baltymo vaidmenį ligos patofiziologijoje. Kadangi rizikos genotipas yra gana paplitęs bendroje populiacijoje (europiečių kilmės asmenų dažnis yra 0, 48), tikėtina, kad sarkoidozės išsivystymui ir progresavimui reikalingi papildomi trigeriai, kurie atitinka sudėtingą ligos modelį, kuriame prie fenotipo prisideda daugybė genų ir aplinkos veiksnių.

medžiagos ir metodai

Dalyviai

Originali kohorta

Iš viso į šį tyrimą buvo įtraukti 475 nesusiję Olandijos kaukazo sarkoidozės pacientai (vyras / moteris; 212/263). Diagnozuojama sarkoidozė buvo nustatyta, kai klinikiniai duomenys buvo pagrįsti histologiniais įrodymais ir pašalinus kitas žinomas granulomatozės priežastis, remiantis ATS / ERS / WASOG teiginiu dėl sarkoidozės. 34 Kontrolinius asmenis sudarė 465 sveiki, Olandijos Kaukazo St Antonijaus ligoninės darbuotojai ir kraujo mėginiai iš Sanquin kraujo banko Nyderlanduose. Trisdešimt devyniems į kontrolinę grupę įtrauktiems asmenims buvo atliktas bronchoalveolinis plovimas. Iš visų dalyvių buvo gautas žodinis ir rašytinis sutikimas, o leidimą suteikė Nieuwegein miesto St Antonius ligoninės etikos komitetas.

Patvirtinimo grupė

Norėdami pakartoti rezultatus, įtraukėme nepriklausomą pacientų, sergančių sarkoidoze, atvejų duomenų rinkinį, pateiktą kelioms ligoninėms (30 km spinduliu nuo Šv. Antonijaus ligoninės) Nyderlanduose (206 atvejai ir 127 kontrolinės).

Norint ištirti, ar genetinis ryšys buvo būdingas sarkoidozei, buvo įtraukti 139 pacientai, kuriems būdingi klasikiniai Löfgreno sindromo simptomai: karščiavimas, mazginė eritema, artralgija ir dvišalė didžioji limfadenopatija. Šiems pacientams diagnozė buvo atlikta be biopsijos įrodymų.

Radiografinis pastatymas

Krūtinės ląstos rentgenografiją bendru sutarimu įvertino difuzinių plaučių ligų gydytojai, kurie nustatė ligos sunkumą, naudodamiesi standartine radiografine sarkoidozės stadija, klasifikuojama pagal Scadding kriterijus. Pateikti 35 rentgenografiniai duomenys apie 191 sarkoidoze sergantį pacientą. Buvo gauti 309 pacientų rentgenografiniai duomenys apie plaučių ligos baigtį, apibrėžtą krūtinės ląstos rentgenograma po mažiausiai 4 metų stebėjimo. Pacientai, kuriems pasireiškė plaučių fibrozė arba kuriems buvo atlikta plaučių fibrozė atliekant krūtinės ląstos rentgenografiją stebint <4 metus, ligos stadijoje buvo klasifikuojami kaip IV stadija, atsižvelgiant į fibrozinių randų negrįžtamumą.

Plaučių funkcijos tyrimai

Pristatymo metu buvo atlikti plaučių funkcijos tyrimai. Siekiant įvertinti plaučių funkcijos sutrikimą, pasireiškiant ligai, buvo naudojamas gyvybinis pajėgumas (įkvepiantis) (iVC), priverstinis iškvėpimo tūris per 1 s (FEV 1 ) ir anglies monoksido difuzinė plaučių talpa (Dlco). Visi plaučių funkcijos parametrai yra išreiškiami procentinėmis prognozuojamomis vertėmis. IVC ir FEV 1 buvo apskaičiuoti pagal tūrį litrais ir sureguliuoti pagal kūno temperatūrą, aplinkos slėgį, prisotintą vandens garais.

Bronchoalveolinis plovimas

Bronchoalveolinis plovimas buvo atliekamas atliekant lanksčią pluošto optinę bronchoskopiją diagnozės metu, remiantis anksčiau aprašyta standartizuota ir patvirtinta procedūra. 36 BALF buvo filtruojamas per nailono marlę ir centrifuguojamas (10 min. 400 g 4 ° C temperatūroje). Ląstelių nuosėdos buvo plaunamos du kartus, suskaičiuojamos ir pakartotinai suspenduojamos minimalioje būtinoje terpėje / RPMI 1640 (Gibco; Grand Island, NY, JAV), papildytas 0, 5% galvijo serumo albuminu (Organon; Teknika; Boxtel, Nyderlandai). Ląstelės buvo suskaičiuotos Bürker kameroje (Omnilabo, Breda, Nyderlandai). Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas pagal trypano mėlynojo išskyrimą. Ląstelių diferenciacijos tepinėliai buvo paruošti citocentrifugavimo būdu (Shandon; Runcorn, UK). Ląstelių diferenciacija atlikta citospinslide po dažymo gegužės – Grünwald – Giemsa (Merck; Darmstadt, Vokietija), suskaičiuota mažiausiai 2 × 500 ląstelių.

IL-2R tyrimas serume

IL-2R kiekis serume buvo kiekybiškai nustatytas naudojant su fermentais susietą imunosorbentų tyrimą (AMDS Benelux, Malden, Nyderlandai). Mes naudojome normalų diapazoną, kurį riboja gamintojo nurodytas aukščiausias etaloninis lygis - 710 U ml −1 .

ACE tyrimas serume

AKF aktyvumo kiekybinis įvertinimas buvo matuojamas ličio heparino plazmoje naudojant Bühlmann AKE kinetinį testą pagal anksčiau aprašytus metodus (Bühlmann Laboratories AG, Schönenbuch, Šveicarija). ACE koncentracijai serume turi įtakos ACE geno įterpimo / delecijos polimorfizmas. Šio polimorfizmo D alelis yra susijęs su padidėjusiu AKF kiekiu serume. Analizėje mes panaudojome Z rezultatą, pagrįstą ACE įterpimo / išbraukimo pataisytais atskaitos intervalais (II: 9–43, ID: 14–62, DD: 24–82). 37

IL7R genetinių SNP analizė

Iš viso kraujo mėginių buvo paimta DNR, o SNP buvo ištirti pagal pasirinktinį „Illumina“ aukso spalvos granulių SNP tyrimą, kuris buvo atliktas pagal gamintojo rekomendacijas (Illumina, San Diegas, CA, JAV). Buvo pasirinkti šeši SNP IL7R gene (1 lentelė). Trys haplotipą žymintys SNP buvo išrinkti naudojant žymėjimo programą, įvedančią į IL7R genominę sritį, naudojant „genomo build 35“, naudojant „CEU HapMap“ analizės skydą ir lengvatinį SNP pasirinkimą, kai mažiausias alelių dažnis yra 25%, ir aukštus „Illumina“ projektavimo balus pagal porą. žymėjimo parinktys su r 2 slenksčiu SNP> 0, 8. 38

Srauto citometrija

IL7Rα paviršiaus ekspresija ex vivo

Interleukino-7Rα paviršiaus išraiška buvo matuojama T limfocitais iš sveikų asmenų iš PB ir iš BALF. Penkiasdešimt μl PB arba BALF, turinčių ne mažiau kaip 100 000 ląstelių, buvo inkubuojami 15 minučių kambario temperatūroje su 10 μl šių monokloninių antikūnų: anti-CD3 PE, anti-CD4 PerCP, anti-CD8 APC ir anti-CD127 FITC. . Limfocitų populiacija buvo parinkta remiantis priekinio išsibarstymo (FSC – SSC) charakteristikomis. Imunofluoresencija buvo matuojama srauto citometrija (FACS-Calibur, Becton Dickinson, Alphen aan den Rijn, Nyderlandai). Fluorescencijos stabilumas buvo tikrinamas kas savaitę kalibruojant srauto citometrą eksperimento metu. Duomenys buvo analizuojami naudojant FlowJo programinę įrangą (Tree Star, Ashland, OR, JAV). Kiekvieno eksperimento metu buvo suskaičiuota 50 000 ląstelių.

Statistinė analizė

Vienos SNP analizė

Alelių ir genotipų dažnis buvo apskaičiuotas kiekvienam lokusui ir patikrintas Hardy – Weinberg pusiausvyrai kontrolėje. Atvejo ir kontrolės asociacijų tyrimai buvo analizuojami χ 2 bandymu, naudojant atitinkamai 2 x 3 ir 2 x 2 nenumatytų atvejų genotipo ir alelio dažnio lenteles. Šansų santykiai ir pasitikėjimo intervalai buvo apskaičiuoti naudojantis internetine priemone, kurią galima rasti adresu //ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/snps.html.

Reikšmingumo riba buvo nustatyta įvertinus kelis palyginimus, naudojant Bonferroni pataisą efektyviam nepriklausomų SNP, kuriuos pasiūlė Li ir Ji, skaičiui. 39 Dėl LD faktinis SNP skaičius buvo 4001 IL7R (šešių genotipų SNP), todėl pakoreguota reikšmingumo riba buvo 0, 05 / 4, 001 = 0, 0127 (pasiekiama adresu //gump.qimr.edu.au/general/daleN/matSpD /).

Haplotipo analizė

Haplotipo dažnis ir haplotipo asociacijos testai buvo nustatyti naudojant Haploview 4.0 versiją. Naudojant PHASEv2 programinę įrangą buvo nustatyti 40 atskirų haplotipų. 41

Dispersijos analizė buvo naudojama norint išbandyti skirtumus tarp IL7R genotipų ir IL7Rα ekspresijos. P reikšmė <0, 05 buvo laikoma reikšminga.

Interesų konfliktas

Autoriai teigia, kad interesų konflikto nėra.