Virusai kaupiasi senstančiuose grybelinio miško patogeno infekcijos centruose nežinomas žurnalas

Virusai kaupiasi senstančiuose grybelinio miško patogeno infekcijos centruose nežinomas žurnalas

Anonim

Dalykai

  • Mikrobų ekologija
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2015 m. Sausio 20 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Manoma, kad grybeliniuose virusuose (mikovirusuose) su RNR genomais trūksta tarpląstelinių infekcinių dalelių. Šie virusai yra perduodami iš grybelių padermių per mycelial anastomozes arba vertikaliai per jų užkrėstas sporas, tačiau mažai žinoma apie jų paplitimą ir pasklidimą natūraliomis sąlygomis. Čia mes išsamiai ištyrėme mikovirusų bendruomenės ir jos šeimininko grybelio Heterobasidion parviporum , labiausiai niokojančio spygliuočių grybelio patogeną Borealio miško regione, erdvinius ir laiko pokyčius. 7 metų mėginių ėmimo laikotarpiu virusai, susikaupę klonuose-šeimininkuose, dėl vietinių virusų plitimo klonuose ir tarp jų, taip pat dėl ​​naujų štamų, gaunamų iš ore esančių sporų. Dėl virusų bendruomenės pokyčių susidarė heterogeniškumo kišenės dideliuose H. parviporum klonuose . Naujų virusinių infekcijų atsiradimas senstančiuose klonuose parodė, kad tarp Heterobasidiono kamienų trumpalaikiai kontaktai tarp ląstelių gali įvykti dažniau, nei buvo nustatyta iš genotipinių analizių. Skirtumas tarp trijų partitivirusinių rūšių tyrimo vietoje buvo mažas, o nepaskirtos virusų rūšys HetRV6 buvo labai polimorfinės. Taškinių mutacijų kaupimasis nuolatinių infekcijų metu sukėlė virusų diversifikaciją, tai yra, beveik vienodų virusų sekų variantų buvimą pavieniuose klonuose. Mūsų rezultatai taip pat rodo, kad tolimai susijusių virusinių rūšių koinfekcija yra stabilesnė nei tarp skirtingų rūšių padermių, o abipusė atskirtis gali vaidinti įtaką nustatant mikovirusų bendruomenes.

Įvadas

Grybeliniai virusai (mikovirusai) dažniausiai pasitaiko visuose pagrindiniuose grybelių taksonuose (Pearson ir kt., 2009; Ghabrial, 2013). Didelę filogenetinę mikovirusų įvairovę atspindi dabartinis jų suskirstymas į septynias dsRNR ir penkias ssRNR šeimas (www.ictvonline.org), todėl laukiama daugelio naujų taksonų aprašymo (pvz., Preisig ir kt., 2000; Ahn ir Lee, 2001). ; Márquez ir kt., 2007; Hammond ir kt., 2008; Liu ir kt., 2009; Yu ir kt., 2010). Mikovirusai, turintys RNR genomus, plinta jų šeimininkų citoplazmoje ar mitochondrijose ir per anastomozę yra perduodami šoniniu būdu tarp grybelinių kamienų. Šie virusai paprastai sudaro kriptines (latentines) nuolatines infekcijas, nors yra žinomas ir žalingas, ir abipusis poveikis (Anagnostakis ir Day, 1979; Huang ir Ghabrial, 1996; Lakshman ir kt., 1998; Preisig ir kt., 2000; Ahn ir Lee, 2001; Márquez ir kt., 2007; Yu ir kt., 2010). Hypoviridae rūšys užkrečia kaštonų pūtimo grybelį ( Cryphonectria parasitica ) ir sumažina jo patogeniškumą. Taigi hipovirusai Europoje naudojami kaip biokontrolės agentai (MacDonald ir Fulbright, 1991).

Heterobasidion parviporum Niemelä ir Korhonen sukelia baltojo puvinio medienos puvimą Norvegijos eglėse ( Picea abies ) ir susijusiose rūšyse (Niemelä ir Korhonen, 1998; Dai ir kt., 2003). Šis patogenas efektyviai plinta per bazidiosporas, kurios užkrečia šviežių gyvų medžių kelmų paviršius ar užpakalines žaizdas ir palankiomis sąlygomis gali nukeliauti šimtus kilometrų (Stenlid ir Redfern, 1998). Vienas dygstantis bazidiosporas sukuria homokariotinį, veiksmingai haploidinį pirminį grybą; ir suderinama dviejų tokių grybų pora sukuria antrinį heterokariotinį grybą su dviem skirtingais branduoliniais haplotipais (Korhonen, 1978; Hansen ir kt., 1993). Grybiena vegetatyviškai plinta per šaknų kontaktus, o pavieniai genotipai (klonai) gali užkrėsti dešimtis Norvegijos eglių ir išgyventi dešimtmečius. Neseniai sporomis užkrėstų infekcijų atveju vienas spygliuočių kelmas gali apimti kelis skirtingus Heterobasidion genotipus (Johannesson ir Stenlid, 2004). Vidutiniškai kas septintą eglę užkrečia H. parviporum pietinėje Suomijoje (Kaarna-Vuorinen, 2000). Šiuo metu liga kontroliuojama medžių rūšių atranka, cheminiu ar biologiniu kelmų apdorojimu ir kelmų pašalinimu.

Maždaug 15–17% Heterobasidion kamienų yra užkrėsti dsRNR virusais (Ihrmark, 2001; Vainio et al., 2011b). Nepriskirtas rūšis Heterobasidion RNR virusas 6 (HetRV6) sukelia maždaug 70% dsRNR infekcijų europietiškuose Heterobasidion štamuose (Vainio et al., 2012) ir pasižymi santykinai dideliu polimerazės panašumu su Curvularia šiluminės tolerancijos virusu (Márquez et al.)., 2007). Visi kiti iki šiol aprašyti Heterobasidion virusai yra Partitiviridae nariai (Ihrmark, 2001; Vainio ir kt., 2010, 2011a, 2011b, 2013b). Daugybė Heterobasidion virusų yra lengvai perduodami tarp nesuderinamų šeimininko padermių ir net su tolimomis giminėmis Heterobasidion rūšių laboratorijoje ir gamtoje (Ihrmark, 2001; Vainio et al., 2010, 2011a, 2011b). Šie virusai taip pat plinta vertikaliai per bazidiosporą ir konidiją (Ihrmark et al., 2002, 2004). Dauguma Heterobasidion virusų nesukelia drastiškų fenotipinių pokyčių jų šeimininkei, tačiau kai kurie gali sumažinti bazidiosporų daigumą (Ihrmark et al., 2004) arba paveikti šeimininko grybelio augimą (Vainio et al., 2010, 2012). Pažymėtina, kad vienas viruso štamas gali turėti teigiamą, nepaprastą ar žalingą poveikį atskiram šeimininkui, priklausomai nuo aplinkos ir ekologinių sąlygų (Hyder ir kt., 2013). Tokių sudėtingų šeimininko ir viruso ryšių ekologinį poveikį galima suprasti tik atliekant ilgalaikius lauko tyrimus.

Šiame tyrime mes iššifravome mikovirusų bendruomenės ir jos grybelio šeimininko pokyčius per 7 metus Norvegijos eglių miško medyne, kenčiantį nuo rimtos Heterobasidioninės infekcijos. Mes išbandėme šias hipotezes: (i) virusai ir grybeliai-šeimininkai yra pasiskirstę kartu, (ii) virusai perduodami šonuose tarp gretimų Heterobasidiono klonų, (iii) virusai kaupiasi ilgaamžiuose klonuose, (iv) jau egzistuojantys virusai daro įtaką kitų virusų užkrėtimo tam tikru šeimininku tikimybei, ir (v) sukauptos taškinės mutacijos lemia virusų in situ diversifikaciją konkrečiame šeimininke.

Rezultatai

Heterobasidijų klonų erdvinis pasiskirstymas

Remiantis vegetatyvinėmis nesuderinamumo reakcijomis ir mikrosatellito žymenimis, 2005 m. Surinkti 67 H. parviporum izoliatai reprezentavo 26 atskirus klonus, iš kurių 12 buvo identifikuoti kaip homokarionai (1a paveikslas; papildoma S3 lentelė). 2012 m. Iš 39 ir 117 kelmų buvo atrasti nauji heterokariotiniai genotipai, o medyje 64 buvo naujas homokaryonas, matyt, dėl vegetatyvinio plitimo iš kaimyninio klono (papildoma S3 lentelė). Keletas anksčiau užkrėstų izoliacijos šaltinių 2012 m. Nedavė gyvybingų Heterobasidion kultūrų (papildoma S2 lentelė) dėl to, kad kai kurie kelmai labai nunyko arba kai kuriuose stovinčiuose medžiuose trūko sugedusios medienos. Didžioji dalis šių stovinčių medžių ( N = 10; 83, 3%) buvo užkrėsti homokarionais 2005 m. 2012 m. Buvo gauti 49 heterobasidijų izoliatai, reprezentuojantys 14 klonų, ir tik trys izoliatai buvo homokariotiniai (14–12, 64–12 ir 187–12). Atminkite, kad dauguma medžių, kurie buvo užkrėsti homokarionais, buvo gyvi, tačiau iki 2013 m. Spalio mėn. Du mirė (6 ir 187 medžiai). Kadangi vietoje nebuvo atliekama retinimo; Manoma, kad dauguma Heterobasidion klonų yra ilgaamžiai ir kilę iš ankstesnės medžių kartos ir (arba) kelmų, sugeneruotų paskutinio kirtimo metu, vykusio prieš 43 metus.

Virusinis paplitimas

Išanalizavus 176 H. parviporum izoliatus, nustatyta 87 virusinės infekcijos (82 atvejai iš 116 izoliatų, išaugintų iš medienos mėginių, ir 5 atvejai tarp 60 izoliatų, gautų sporų spąstais; papildomos lentelės S2 ir S4). Iš viso 47, 8% ir 67, 3% Heterobasidion izoliatų iš medienos mėginių buvo užkrėsti atitinkamai 2005 m. Ir 2012 m. Izoliato lygiu mėginių ėmimo laikotarpiu buvo gauta daugiau virusų ( N = 14) nei prarasta ( N = 4). Daugelis Heterobasidion izoliatų, paimtų iš kelmų, buvo užkrėsti (2005 m.: 72, 2%, 2012 m.: 83, 3%), tuo tarpu tarp izoliuotų stovinčių medžių dažnis buvo mažesnis (2005: 38, 8%, 2012: 62, 2%). Jei atsižvelgsime tik į tuos izoliacijos šaltinius, kurie buvo užkrėsti Heterobasidion tiek 2005, tiek 2012 m., 2005 m. Buvo 30 virusų, o 2012 m. - 40. Nepaisant pakartotinio viruso užkrėstų izoliatų tyrimo, mes nepastebėjome virusų praradimo laikant ir subkultūrus. .

Virusų įvairovė

Mėginiame sklype aptiktos keturios skirtingos virusinės rūšys: trys tariamieji „ Partitiviridae“ nariai ir dar priskirtinas „HetRV6“ (Vainio et al., 2012). Tyrimų plane nerasta jokių papildomų viruso padermių požymių, nes CF11 chromatografijos parodyti dsRNR modeliai sutapo su RT-PCR rezultatais, o visi dsRNR teigiami izoliatai gali būti siejami su viena (ar daugiau) iš šių keturių viruso rūšių. pagal RT-PCR. Virusų padermės, pažymėtos HetPV2-pa1 ( Heterobasidion partitivirus 2, padermė 1 iš H. parviporum ) ir HetPV7-pa1, turėjo atitinkamai 66% ir 60% identiškumą savo RdRp ir kapsiidų baltymų sekose ir galėjo būti laikomos giminingomis genties narėmis. „Betapartitivirus“ (Nibert et al., 2014). HetPV2-pa1 (anksčiau HetRV2-pa1) genomą apibūdino Vainio et al. (2011a), ir čia yra pateikta visa HetPV7-pa1 ( Heterobasidion partitivirus 7, padermė 1 iš H. parviporum ) genomo seka. HetPV7-pa1 genomą sudaro 2297 bp turintis RdRp koduojantis segmentas, kuriame yra 724 aa AUG inicijuotas atviras skaitymo rėmas (M r 85 348; GC kiekis 45, 6%) ir kapididą koduojantis segmentas 2231 bp. BP, kuris apima 654 aa atvirą skaitymo rėmą (M r 73 158; GC kiekis 50, 4%).

HetPV2-pa1 buvo beveik identiškas tarp 32 izoliatorių iš šeimininko (1 lentelė), turinčių tik 0–2 taškų mutacijas per 2151 bp (99, 9% sekos tapatumas; 9, 3 x 10 –4 mutacijų per nt). Pažymėtina, kad viena specifinė mutacija (T iki A 691 vietoje) buvo būdinga visoms HetPV2 infekcijoms klone, esančiame 5 izoliacijos šaltinyje, tuo tarpu kitas viruso sekos variantas (su A ir G pakaitais nt 59 vietoje) buvo izoliate. 89-05 ir du naujai užkrėsti to paties klono izoliatai 2012 m. (93–12 ir 130–12). Buvo du prieštaringi cDNR, skirti izoliatui 89–12 (A arba G 59-oje vietoje), ir tai rodo du HetPV2 sekos variantus. Remiantis 36, 53 ir 132 izoliatų HetPV2 infekcijomis, 2012 m. Atsirado naujų taškų mutacijų. Visos stebėtos mutacijos lėmė pakaitų atvejus. „HetPV2“ sekų variantų vidutinis prisijungimo tinklas pateiktas 2 paveiksle.

Image

Vidutiniai „HetRV6“, „HetPV2“ ir „HetPV7“ tinklai. Mazgo plotai yra proporcingi kiekvieno aptikto viruso sekos varianto dažniui. Šakų etiketės rodo bazinių pakaitų skaičių tarp sekų variantų (rodomos tik vertės, kitokios nei 1). RdRp sekų ilgis buvo 2151 bp (HetPV2), 2157 (HetPV7) ir 1821 (HetRV6).

Visas dydis

HetPV7-pa1 buvo labai konservuotas (1 lentelė), o tarp 177 HetPV7-pa1 sekų 2157 bp sekų iš 187–12 ir 226–05 izoliatų buvo aptiktos tik dvi taškų mutacijos (4, 6 × 10 –4 mutacijos per nt; 2 paveikslas). . Abu pakeitimai tylėjo. Šiuo metu „HetPV7“ radome tik vienoje vietoje, maždaug 40 km nuo dabartinės tyrimo vietos, ir šis kamienas (HetPV7-an1) nuo HetPV7-pa1 skyrėsi 62 taškų mutacijomis (Hyder et al. , Nepaskelbta), o tai rodo, kad pavienių nukleotidų mikrovariacijos, rastos tarp HetPV7-pa1 variantų, buvo in situ mutacijos.

Trečioji partitiviruso rūšis buvo paskirta kaip HetPV9 ( Heterobasidion RNR virusas 9; 3 pav.; Nibert et al., 2014). Buvo nustatyta, kad „HetPV9“ yra identiški to paties klono izoliatuose 227–05 ir 242–05 (1a paveikslas; 1 lentelė), tačiau 2012 m. Iš šių izoliacijos šaltinių nebuvo gauta Heterobasidion kultūrų. „HetPV9“ klasteriai Alphapartitivirus gentyje ir turi 68–5 dalis. 76% RdRp baltymo sekos tapatumas su HetPV1 padermėmis (anksčiau HetRV1; Vainio et al., 2011b; Nibert et al., 2014). HetPV9-pa1 (pa1 = 1 kamienas iš H. parviporum ) RdRp segmentas buvo 2030 bp ilgio ir turėjo AUG inicijuotą atvirą skaitymo rėmą, kurio matmenys 620 aa (M r 72 362; GC kiekis 47, 6%).

Image

Bajeso dendrograma, apimanti HetPV2, HetPV7 ir HetPV9 bei susijusias Partitiviridae rūšis. Skalės juostoje rodomi 0, 3 aa pakeitimai vienoje vietoje, o užpakalinės tikimybės procentai, viršijantys 90%, pateikiami šakos mazguose. Aa sekų derinimas buvo pagrįstas pilnomis RdRp sekomis, sukurtomis naudojant MAFFT 7.017 versiją ir redaguotos rankiniu būdu pagal konservuotus motyvus. Filogenetinis grupavimas buvo atliktas naudojant MrBayes, pasižyminčią gama tarp dažnio dažnio ir 1, 1x106 ciklų, naudojant MCMC algoritmą, imant vieną medį iš 200 ciklų ir išmetant 10 5 mėginius kaip nudegimą. Blosum matrica buvo naudojama kaip baltymų evoliucijos modelis, o runkelių kripto virusas 3 buvo naudojamas kaip išeitis.

Visas dydis

„HetRV6“ buvo žymiai polimorfiškesnis, palyginti su trimis partitivirusais, ir atvirojo skaitymo rėmo srityje buvo 182 bp (24–25 kintamų vietų). Norėdami atskirti specifines HetRV6 padermes nuo nedidelių sekų variantų, atlikome filogenetinę analizę, į kurią įtrauktos paskelbtos HetRV6 sekos iš tolimiausių vietų jos globaliame pasiskirstyme (Vainio et al., 2012). Remiantis kaimynų sujungimo (NJ) analize (papildomas paveikslas S1), iš tyrimo vietos buvo išgautos aštuonios skirtingos HetRV6 sekų grupės (atitinkančios viruso padermes). Pažymėtina, kad HetRV6-pa19 atrodė labiau susijęs su H. annosum HetRV6 padermėmis nei H. parviporum padermėmis, ir tai rodo šoninį perkėlimą (ty šeimininko poslinkį). Tarp HetRV6 sekų nebuvo aptikta jokių rekombinacijos įvykių.

Daugumoje iš aštuonių „HetRV6“ padermių buvo pastebėti nedideli sekos polimorfizmai (1–4 taškų mutacijos, palyginti su dominuojančiu variantu; 5, 5 × 10 –4 –2, 2 × 10 –3 mutacijos per nt), ir gauta 19 „HetRV6“ sekos variantų (2 paveikslas; 1 lentelė). ). Tarp atskirų Heterobasidiono klonų HetRV6 infekcijų buvo stebimos erdvinės ir laiko mikrovariacijos. Tarp 36 ištirtų HetRV6 sekų buvo rastos keturios dviprasmiškos nukleotidų vietos, tai atitinka mutacijos dažnį 6, 1 × 10 –5 . Konkrečiai, sekos iš 242–05, 195–12 ir 272–12 izoliatų turėjo unikalią NT vietą, kurioje rodomi nuolatiniai dvigubos bazės skambučiai (3–4 × sekos aprėptis), ir buvo dvi prieštaringos cDNR iš izoliato 12–12 ( nt svetainė 1873). Nors atrodo, kad tai rodo dviejų molekulinių variantų buvimą viename izoliuotame šeimininke, mes nustatėme charakteristikos būseną vidutinio sujungimo ir kaimyno jungimosi analizėms pagal dažniausiai pasitaikantį izoliacijos šaltinio ar klono nukleotidą.

Erdvinis virusų pasiskirstymas

7 metų mėginių ėmimo laikotarpiu nebuvo naujų HetPV7 infekcijų ir šešiais atvejais, kai klonas pasklido dėl HetPV2 (2, 36, 86, 87, 93 ir 130 izoliacijos šaltiniai; 1a ir b paveikslai; papildomas S2 paveikslas). Vienuolikoje izoliacijos šaltinių buvo H. parviporum padermės, užkrėstos HetPV2 tiek 2005, tiek 2012 m., Ir dviejose padermėse (5 ir 133 šaltiniai) virusas buvo prarastas. 2012 m. Nebuvo gautos kultūros iš dviejų izoliacijos šaltinių, kuriuose anksčiau buvo šeimininko padermių, užkrėstų HetPV2. HetPV7 atveju padermės iš septynių izoliacijos šaltinių buvo užkrėstos virusu 2005 ir 2012 m., Tačiau 2012 m. Iš trijų izoliacijos šaltinių nebuvo gautos kultūros.

Remiantis mikrosatellito analize, dauguma iš penkių HetPV2 apgyvendintų klonų nebuvo vieno vaisiaus kūno seserys (ty, bent viename iš keturių mikrosatellito lokusų nebuvo bendrų alelių). Tačiau 117-05 izoliatas atrodė kaip gretimo heterokariono 97-05 homokariotinė sudedamoji dalis. Atrodė, kad penki „HetPV7“ užkrėsti klonai yra labiau susiję; ir izoliatas 187-05 atrodė kaip gretimo heterokariono 228-05 homokariotinė sudedamoji dalis, o tai, savo ruožtu, buvo spėjamas kaimyninio izoliatoriaus 227-05 brolis / sūnus (vienas bendras alelis kiekviename lokuse). Klonai, įskaitant izoliatus 195-05 ir 270-05, buvo skirtingi.

Atrodė, kad „HetRV6“ padermių pasiskirstymas yra labiau suskaidytas ir laikui bėgant kintamas, palyginti su partitivirusais (1b paveikslas; papildomas S2 paveikslas). 2005 m. Trys iš penkių rastų skirtingų HetRV6 padermių (HetRV6-pa15, HetRV6-pa18 ir HetRV6-pa28) atsirado tik pavieniuose Heterobasidiono klonuose, o HetRV6-pa13 ir HetRV6-pa19 - dviejuose kaimyniniuose klonuose. 2012 m. Tyrimo metu pasirodė du nauji „HetRV6“ padermės dviejuose klonuose, kuriuose anksčiau nebuvo „HetRV6“. Vienas iš naujų kamienų atsirado dviejuose gretimuose klonuose (12 ir 52 izoliacijos šaltiniai). Taip pat buvo rastas naujas HetRV6 štamas iš dviejų to paties klono kaimyninių izoliatų, 95–12 ir 117–12. Buvo tik vienas atvejis, kai „HetRV6“ virusas pasklido klonuose: 82–05 izoliato virusas buvo naujai aptiktas kaimyniniame 83 izoliate. Be to, dvi naujos infekcijos atsirado dėl to, kad klonas pernešamas iš 5 izoliacijos šaltinio į izoliatus. 36–12 ir 116–12 kaimyninio klono. Aštuoniuose izoliacijos šaltiniuose buvo H. parviporum padermės, užkrėstos HetRV6 tiek 2005, tiek 2012 m., O padermės iš dviejų (226, 270) izoliacijos šaltinių virusą prarado 2012 m. - užkrėsti šeimininko padermės. Nė vienas iš klonų, turinčių tam tikrus „HetRV6“ sekos variantus (2005 m. - 120 ir 124; 2012 m. - 12 ir 52) nebuvo broliai ir seserys pagal mikrosatellito kitimą.

HetRV6 buvo vienintelė viruso rūšis, aptinkama izoliatuose, gautuose sporų spąstais (8, 3% iš 60 nustatytų kultūrų; papildoma S3 lentelė). Keturi iš šių izoliatų (D4I / 5, D5I / 4, D6I / 4 ir D9I / 3) buvo įstrigę per pirmąjį ekspozicijos laikotarpį (2012 m. Rugpjūčio 31–31 d.), Ir visi buvo užkrėsti „HetRV6-pa30“, kuris taip pat buvo naujai aptiktas medienos izoliate 133–12 (ty, HetRV6 nebuvo aptiktas 133–05). Tačiau visuose homokariotų izoliatuose, gautuose iš sporų, buvo mikrosatellito alelių, kurie skyrėsi nuo 133 iki 12 ir atrodė kilę iš šaltinio, esančio už tyrimo vietos ribų. Antrasis ekspozicijos laikotarpis (2012 m. Rugsėjo 6–6 d.) Buvo įstrigęs izoliatas D8III / 1, užkrėstas HetRV6-pa13. Spąstai įstrigę greičiausiai kilo iš Heterobasidiono klono, esančio 82 izoliacijos šaltinyje, esančiame už 3 m nuo surinkimo disko. Iš sporų gautas D8III / 1 ir vietiniai izoliatai turėjo bendrą mikrosatellitinį žymeklį visuose keturiuose lokusuose ir buvo užkrėsti HetRV6-pa13 sekos variantais, kurie skyrėsi tik vieno taško mutacija. H. parviporum vaisinis kūnas buvo 82 kelme 2012 m.

Netaisyklingas virusų pasiskirstymas Heterobasidion klonuose

Dideli klonai, kuriuose gyvena keli (5–18) izoliacijos šaltiniai, buvo užkrėsti bent viena viruso rūšimi, tuo tarpu klonai, esantys tik viename išskyrimo šaltinyje, dažniausiai nebuvo virusai (70, 6% 2005 m., 71, 4% 2012 m.) Ir dažniausiai homokariotiniai. Vieninteliai virusais užkrėsti homokaryonai buvo 117–05, 187–05 ir 187–12, kiekvienas iš jų buvo išdėstytas šalia heterokariotinio klono, turinčio bendrą mikrosatellito haplotipą ir bendrą viruso kamieną (atitinkamai HetPV2 arba HetPV7).

Dideli heterobasidijų klonai, pasklidę per kelis izoliacijos šaltinius, taip pat buvo nevienalytiški. Dviejų didelių klonų, gautų iš 8 ir 18 išskyrimo šaltinių, izoliatas 2005 m. Užkrėtimo rodiklis atitinkamai buvo 37, 5% ir 44, 4%. Panašiai klonų, turinčių nuo 5 iki 8 izoliacijos šaltinių, turinčių HetRV6 padermes, infekcijos procentas buvo 12, 5–80. % 2005 m. Pažymėtina, kad dėl naujų „HetRV6“ infekcijų 2012 m. kiekviename iš dviejų didelių klonų buvo du – trys atskiri „HetRV6“ kamienai, tačiau kiekvienas viruso štamas atsirado tik nuo vieno iki dviejų izoliatų, o tai rodo, kad naujosios „HetRV6“ infekcijos buvo sporadinės ( 1b pav. Neapsaugotos nepažeistos virusinės RNR iš šeimininko genomo DNR atsiradimo galimybė neatrodo tikėtina, nes mes nenustatėme viruso amplifikacijos produktų, naudodami šeimininko genomo DNR kaip PGR šabloną.

Bendros infekcijos, susijusios su tolimai susijusiais ir įgimtais virusais

2005 m. Mes nustatėme natūralias dvigubas HetPV2 / HetRV6 (izoliatas 5) ir HetPV7 / HetRV6 (izoliatai 195, 226, 241, 270 ir 274) ir trigubas HetRV6 / HetPV7 / HetPV9 (izoliatai 227 ir 242) infekcijas. 2012 m. Buvo pastebėtos penkios naujos koinfekcijos, daugeliu atvejų atsirandančios dėl naujų Heterobasidion padermių, kurios jau buvo apėmusios HetPV2, HetRV6 (12, 95, 116 ir 117 izoliatai). Dėl viruso padidėjimo ir praradimo 2005 m. Ir 2012 m. Tais pačiais dviem viruso kamienais buvo užkrėsti tik du šeimininko kamienai (95 ir 274). Visi viruso praradimai atsirado padermėse, kuriose buvo užkrėstos antros viruso rūšys, o trimis iš keturių atvejų - viena kartu užkrėstų virusų buvo tiek 2005, tiek 2012 m.

Įgimtos HetPV2 ir HetPV7 padermės natūraliai nesudarė kofinfekcijų. Norėdami patikrinti, ar tai įvyko dėl viruso įsikišimo, mes atlikome perdavimo eksperimentus, kurie sukėlė HetPV2 ir HetPV7 koinfekcijas izoliate 228-05 (visi keturi pakartojimai).

Tarpusavio specifinių virusinių padermių pašalinimas

Iš kiekvieno Heterobasidiono izoliato buvo aptiktas tik vienas HetRV6 štamas, naudojant HetRV6 specifinius pradmenis, o tai rodo abipusį artimai susijusių HetRV6 padermių atskyrimą tame pačiame šeimininke. Šią hipotezę taip pat patvirtina rekombinacijos tarp HetRV6 padermių trūkumas. Norėdami atskleisti tariamas koinfekcijas, mes sukūrėme tam tikroms padermėms skirtas pradmenų poras HetRV6-pa15 ir HetRV6-pa19 (papildoma S5 lentelė). Šie viruso kamienai atsirado dviejuose gretimuose klonuose, kurie abu buvo užkrėsti HetPV7-pa1, ir tai rodo, kad tarp jų galėjo būti šoninis pernešimas. Specifiniai kamienai ir pradinės sekos analizė parodė, kad HetRV6-pa15 ir HetRV6-pa19 yra kartu užkrėsti Heterobasidiono izoliatuose 241–05 ir 226–05 (papildoma S5 lentelė). Tačiau retesnis štamas (HetRV6-pa15) atsirado tik keliuose tirtuose pakartotiniuose cDNR mėginiuose (12, 5–18, 2%). Visi kiti izoliatoriai iš dviejų greta esančių klonų paėmė pavienes HetRV6 padermes.

Diskusija

Šiame tyrime mes parodėme, kad Heterobasidion izoliatuose miško vietoje, kurioje seniai yra šaknų ir užpakalinių puvinių, virusinės infekcijos dažnis buvo 48–67%, tai buvo žymiai didesnis nei tipiškas 15–17%, stebėtas ankstesniuose tyrimuose. (Ihrmark, 2001; Vainio ir kt., 2012) ir rodo, kad virusai laikui bėgant kaupiasi Heterobasidiono klonuose. Mūsų 7 metų stebėjimo darbas taip pat atskleidė naujų virusinių infekcijų atsiradimą senėjančiuose klonuose. Stebėjimas įdomus, nes manoma, kad Heterobasidion klonų gyvenimo trukmė yra žymiai trumpesnė (<200 metų; Stenlid ir Redfern, 1998) nei kai kurių kitų medienos puvimo grybelių, kurie miške sudaro didelius klonus (pvz., Phellinus weirii ir Armillaria). spp., kurių gyvenimo trukmė yra daugiau nei 1000 metų; Dickman ir Cook, 1989; Ferguson ir kt., 2003), ir pateikia hipotezę, kad virusai efektyviai sutrumpina Heterobasidion klonų gyvenimo trukmę dėl jų dažnėjimo ir nedidelio, bet neigiamo bendro poveikio (Hyder ir kt., 2013).

Virusų pasiskirstymas tarp stambių H. parviporum klonų buvo nereguliarus ir leido manyti, kad virusai buvo įgyti ir prarasti vegetatyvinėje šeimininko augimo metu ir (arba) kad micelinis tinklas, kurį sudaro vienas klonas, gali būti iš dalies atjungtas. Šis pasiskirstymas primena netolygų virusų pasiskirstymą patogeniško šakninio puvinio grybų Helicobasidium mompa (Ikeda ir kt., 2005) ir Rosellinia necatrix (Yaegashi et al., 2013) klonuose ir ascotetiniame patogene C. parasitica (Shain ir Miller, 1992). ; Hoegger ir kt., 2003). Mes parodėme, kad partitivirusas HetPV4 (anksčiau - HetRV4) buvo perneštas per mirtiną kontaktą iš įvesto H. parviporum kamieno į vietinius kamienus, kuriuose gyvena Norvegijos eglių kelmai (Vainio et al., 2013a). Šiame tyrime atrodė, kad partitivirusai lėtai pasiskirstė per hipofilinius kontaktus tarp gretimų Heterobasidion mycelia, tuo tarpu HetRV6 padermės galėjo greitai užkrėsti naujus klonus per ore esančias sporas. Visų pirma, naujų viruso padermių atsiradimas senstančiuose klonuose rodo, kad anastomozės tarp Heterobasidiono padermių yra dažnesnės nei tai, kas buvo padaryta remiantis genotipo duomenimis.

2005 m. Stebėjome netikėtai aukštą homokariotinių izoliatų dažnį, nors 2012 m. Jų dar kartą nebuvo aptikta. H. parviporum homokaryon atsiradimas gyvuose medžiuose Europoje laikomas retu reiškiniu, tačiau artimai susijusio H. homokarionai. yra žinoma, kad kolonizuoja du ar daugiau netoliese esančių medžių Šiaurės Amerikoje (Garbelotto ir kt., 1997). Čia mes pastebėjome keletą homokarionų, kurių dauguma neturėjo virusų, ir tai patvirtina nuostatą, kad virusai bazidiosporose yra palyginti reti. Tačiau kai kurios iš ore esančių sporų laikė HetRV6 padermes, tuo tarpu tarp sporų įstrigusių izoliatų partitivirusinės infekcijos nebuvo aptiktos. Galimybė būti perduota bazidiosporų gali stipriai paveikti virusų plitimą ir sudaryti sąlygas greitai plisti į naujas vietas. Ihrmark ir kt. (2004) parodė, kad priklausomai nuo grybelio kamieno, dsRNR virusai yra 10–84% bazidiosporų, kurias gamina virusas užkrėstas Heterobasidion vaisiaus kūnas; tačiau virusinės rūšys nebuvo nustatytos. Atsižvelgiant į didžiulį sporų kaupimąsi iš H. parviporum vaismedžių (Möykkynen ir kt., 1997), nuolatinė sporų apkrova galėtų būti pagrindinis viruso perdavimo būdas, ir tai patvirtina mūsų pastebėjimas, kad kelmų virusų dažnis didesnis nei stovinčių medžių., ko tikimasi, nes kelmai turi daugiau atvirų ir neapsaugotų paviršių, tinkamų sporų sukeliamoms infekcijoms, nei nepažeisti medžiai.

Keliuose Heterobasidiono izoliatuose stebėjome dvigubą ar trigubą virusinę infekciją. Buvo aprašytos koinfekcijos, susijusios su tolimai susijusiais ar įgimtais mikovirusais (Peever ir kt., 1997; Lakshman ir kt., 1998; Preisig ir kt., 1998; Hong ir kt., 1999; Ghabrial ir kt., 2002; Osaki ir kt.) al., 2004; Park ir kt., 2005; Tuomivirta ir Hantula, 2005; Vainio ir kt., 2012, 2013a), o bendras kartu užkrėstų virusų panašumas buvo palyginti mažas (30–53% aa lygis arba <55% nt lygyje). Sun ir kt. (2006) aprašė, kad Mycoreovirus 1 plitimą pagerina kartu užkrėstos Cryphonectria hypovirus 1 bakterijomis C. parasitica . Mūsų rezultatai rodo, kad tolimai susijusių virusinių rūšių koinfekcija buvo stabilesnė nei tarp skirtingų rūšių padermių, o „HetRV6“ padermės galėjo pereiti tik pereinamuoju laikotarpiu per vieną grybelio grybą. Jei tai yra bendras reiškinys, anksčiau buvusios virusinės infekcijos gali paveikti panašių padermių pasklidimą ir turėti įtakos kiekvieno viruso padermės paplitimui šeimininko grupėje. Partitivirusinės infekcijos yra gana retos heterobasidijos metu ir pasitaiko tik ∼ 5% izoliatų kultūros kolekcijose (Vainio et al., 2011b). Todėl vienas partitiviruso štamas gali išplisti į kelis gretimus klonus, jo neapsiribojant susidūrimais su specifiniais kamienais. Priešingai, „HetRV6“ infekcija pasitaiko ∼ 12, 5% Heterobasidion padermių (Vainio ir kt., 2012), o pasklidę virusai labiau linkę į specifinius štamus.

Trijų partitivirusinių rūšių intraspecifinės sekos kitimo lygis buvo žemas, o HetRV6 populiaciją sudarė aštuoni viruso kamienai, iš kurių trys parodė erdvinius ar laiko mikrovariacijas tarp atskirų Heterobasidiono klonų izoliatų. Remdamiesi sekų palyginimais su anksčiau aprašytais viruso kamienais, padarėme išvadą, kad nedideli 1–4 nt sekos polimorfizmai buvo in situ mutacijos įvykiai, o ne lygiagrečios labai panašių padermių infekcijos. Tarp augalų ne vienas individas gali būti užkrėstas virusų spiečiumi, turinčiais sekos polimorfizmus arba vadinamąsias kvazispecies rūšis (Domingo ir Holland, 1997), tačiau šis reiškinys blogai parodytas mikovirusuose.

Išsami mikovirusų bendruomenės analizė per 7 metų intervalą parodė, kad H. parviporum virusų pasiskirstymą erdvėje įtakoja (i) šeimininko kloninė struktūra ir (ii) virusų perdavimas šonuose tarp kaimyninių klonų. Mes taip pat parodėme, kad (iii) virusai kaupiasi senstant Heterobasidion klonams, (iv) buvusios virusinės infekcijos gali apriboti panašių padermių sklaidą, ir (v) virusinės padermės įgyja taškines mutacijas vykstant nuolatinėms infekcijoms. Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas suteikia unikalių įžvalgų apie mikovirusų pasiskirstymą, kurie yra būtini norint suprasti jų biologiją, jų poveikį miško mikologijai ir jų kaip biokontrolės agentų naudojimo plėtrą.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos lentelės ir paveikslų legendos

  2. 2.

    Papildomas S1 paveikslas

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas S2 paveikslas

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento „ISME Journal“ svetainėje (//www.nature.com/ismej)