Vaizdinio judesio aptikimo grandinė, kurią siūlo drosophila connectomics | gamta

Vaizdinio judesio aptikimo grandinė, kurią siūlo drosophila connectomics | gamta

Anonim

Dalykai

  • Judesio aptikimas
  • Neuromokslas

Anotacija

Gyvūnų elgesys atsiranda dėl skaičiavimų neuronų grandinėse, tačiau mūsų supratimą apie šiuos skaičiavimus sužlugdė detalių sinapsinių jungčių žemėlapių ar jungčių trūkumas. Pavyzdžiui, nepaisant intensyvių tyrimų daugiau nei pusę amžiaus, neuronų vietinis judesio aptikimas vabzdžių regos sistemoje išlieka sunkus. Čia mes sukuriame pusiau automatinį vamzdyną, naudodami elektroninę mikroskopiją, kad rekonstruotume jungtį, kurioje yra 379 neuronai ir 8637 cheminiai sinapsiniai kontaktai, Drosophila optinėje meduloje. Suderinę rekonstruotus neuronus su šviesos mikroskopijos pavyzdžiais, mes priskyrėme neuronus ląstelių tipams ir surinkome kartotinės medulos modulio jungtį. Šiame modulyje mes nustatėme ląstelių tipus, sudarančius judesio aptikimo grandinę, ir parodėme, kad jungtys prie atskirų judesiui jautrių neuronų šioje grandinėje atitinka jų krypčių selektyvumą. Mūsų rezultatai nustato mobiliųjų telefonų tikslus būsimiems funkciniams tyrimams ir parodo, kad jungtys gali suteikti pagrindinę informaciją apie neuronų skaičiavimus.

Pagrindinis

Vabzdžių regėjimas buvo intensyviai tiriamas elgesio 1, fiziologinių 2 ir anatominių tyrimų metu, tačiau dar nepakankamai suprantame jo pagrindinius nervų skaičiavimus. Vienas iš tokių etologiniu požiūriu labai svarbių skaičiavimų yra judesio aptikimas, kuris, kaip manoma, priklauso nuo erdvėje esančių signalų ir laiko palyginimo su 4, 5, 6 (1a, b pav.). Nepaisant to, kad daugiau nei pusę amžiaus buvo nagrinėjami teoriniai ir eksperimentiniai tyrimai 7, tikslus šio skaičiavimo pagrindas yra paslaptis. Pagrindinė kliūtis išsiaiškinti šį mechanizmą buvo mūsų neišsamios žinios apie susijusius neuronus ir sinapses.

Image

a, „Hassenstein – Reichardt EMD 4“ modelio dešiniojo judesio komponentas. Šviesos įėjimas (žaibolaidis) į kairįjį kanalą (rausvai raudoną) perduodamas su papildomu vėlavimu τ , palyginti su tuo, kuris nukreiptas į dešinįjį kanalą (cianą). Objekto, nukreipto į dešinę, signalai iš abiejų kanalų ateis į dauginimo bloką arčiau vienas kito, todėl tampa netiesiškai sustiprinti (ir atvirkščiai judantiems į kairę). Dėl to modelis pirmiausia reaguoja į judesį į dešinę. b, alternatyvus „Barlow – Levick“ tipo EMD 6 modelis, taip pat teikiantis pirmenybę judesiui į dešinę. Atminkite, kad įėjimai yra derinami su priešingais ženklais ir vėlavimas yra dešiniajame (cianiniame) kanale. c, Bodijos sidabru dažytas horizontalus Drosophila melanogasterio regos sistemos 45 skyrius, atskleidžiantis keturis optinės skilties neurolius. Diagrama pavaizduota dominančioji medulos sritis (kietas stačiakampis, išskleistas d ) ir platesnis atvaizdo tūris (brūkšninis stačiakampis), naudojamas atsekti į lobulo plokštelę. d, dominančioji 37 μm × 37 μm medulos sritis yra sutelkta į atskaitos stulpelį (raudona) ir šešias aplinkines kaimyno stulpelius (mėlyna). Meduloje yra dešimt sluoksnių (M1 – M10), apibrėžtus jo ląstelių rūšių arborizacijomis. Mastelio juostos, 50 μm ( c ) ir 10 μm ( d, visomis trimis kryptimis).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Skrendant, regos apdorojimas prasideda optinėje skiltyje, sudarytoje iš keturių retinotopiškai organizuotų neuropilių. Kiekvienas iš jų yra kartojamų modulių rinkinys, atitinkantis šešiakampę ommatidijos gardelę jungtinėje akyje (1c pav.). Kiekviename pirmojo neuropilio modulyje, sluoksninėje, yra pasikartojanti grandinė 8, 9, priimanti įėjimus iš šešių fotoreceptorių, aptinkančių šviesą iš tos pačios vietos regos lauke. Kiekvieno lamina modulio išvestinės ląstelės išsikiša į atitinkamą antrojo neuropilio, medulos, modulį (1c pav.). Manoma, kad kiekvienas medulos modulis, vadinamas stulpeliu (1d pav.), Turi stereotipines grandines 10 . Šios kolonos, savo ruožtu, inervuoja du pasroviui esančius neurolius - juosmeninę ir juosmens plokštelę (1c pav.).

Atsakymai į vietinį judesį turi būti apskaičiuojami bent iš dalies per medulinių kolonų stereotipinius kontūrus. Iš tiesų, medulla yra pirmasis neuropilas, kuriam būdingas specifinis judesio aktyvumas 11, ir tiesiai pasroviui nuo medulos, lobulinės plokštelės tangentinės ląstelės (LPTC) integruoja vietinius judesio signalus ir sukuria plataus lauko judesio atsaką 12, 13 . Tačiau iki šiol medulinės jungties nebuvimas lėmė vietinio judesio aptikimo tyrimus.

Pusiau automatinė jungčių rekonstrukcija

Norėdami sukurti patikimą kompiuterinio modeliavimo pagrindą ir nustatyti elektrofiziologinių įrašų tikslus, mes bandėme visiškai, tankiai rekonstruoti cheminę sinapsinę jungtį meduloje, naudodami elektronų mikroskopiją, auksinį neuroanatomijos standartą 14 . Atsižvelgiant į tai, kad tokios rekonstrukcijos reikalauja daug laiko, norėjome nustatyti mažiausią medulos tūrį, kurio rekonstravimas leistų nustatyti grandinę, kuria grindžiamas vietinio judėjimo skaičiavimas. Tiek kryptinius posūkio atsakus 15, tiek elektrofiziologinius atsakus LPTC 16 gali sukelti musės nuosekliai stimuliuodamos du fotoreceptorius, atitinkančius gretimus taškus bet kurioje regos lauko 17 vietoje . Tai rodo, kad bet kuris pasikartojantis judesio aptikimo grandinės komponentas turi būti bet kuriose dviejose gretimose medulos kolonose. Todėl mes nusprendėme rekonstruoti visas sinapsines jungtis tarp neuronų viename atskaitos stulpelyje, taip pat visus ryšius tarp etaloninių stulpelių ir neuronų per šešis artimiausius kaimyninius stulpelius (1d pav.).

Kadangi rankinis net septynių stulpelių tūrio rekonstravimas būtų pernelyg daug laiko reikalaujantis 18, mes sukūrėme pusiau automatinį rekonstravimo vamzdyną 19 ir pritaikėme jį medulos tūriui (2 pav., Metodai ir papildomi duomenys 1), rekonstruodami 379 ląsteles ( Papildomas 1 pav. Ir papildomas vaizdo įrašas 1).

Image

a . Tipinis mikrografas, vienas iš 2769 iš elektronų mikroskopijos serijos. b . Tikrinti mikrografo segmentai į neurito profilius (vienos spalvos). c ) Sinapsės apima presinapsinį procesą, kuriame yra T juostos juostelė (raudona rodyklė) ir su ja susieti neuritai, turintys postsinapsinį tankį (PSD) (mėlynos rodyklės galvutės), esančius šalia T juostos. Ne sinapsiniam procesui (žaliam apskritimui) trūksta PSD (tiek šioje, tiek kitose sekcijų plokštumose, kuriose yra ši T-juosta). d . Neuritai rekonstruojami susiejant profilius iš eilės (kairėje), kad būtų sukurtas 3D objektas (dešinėje). e. Neurono, rekonstruoto iš elektroninės mikroskopijos, pavyzdys (kairėje), identifikuotas palyginus su Golgi impregnuota ląstele (centru) 20 kaip Mi1 tipą ir kryžminiu būdu patvirtintas atitinkamu genetiniu vienaląsčiu (GSC) pažymėtu neuronu (dešinėje). (Papildomi metodai). f, toks pat kaip e, kai naudojama Tm3 tipo ląstelė. Mastelio juostos, 500 nm ( a, b ), 250 nm ( c ) ir 10 μm ( e, f ).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami palyginti mūsų rekonstrukciją pagal turimas žinias, šias ląsteles priskyrėme prie anksčiau pasiūlytų 20 ląstelių tipų, palygindami rekonstruotų pavėsinių formas (papildomas 1 pav.) Su tomis, kurios buvo gautos atlikus šviesos mikroskopiją naudojant Golgi impregnavimą arba genetinį vienos ląstelės žymėjimą ( 2e, f pav. Ir papildomi metodai). Kadangi buvo keletas rekonstruotų pavyzdžių beveik visiems neuronų tipams (papildomas 1 pav. Ir 2 papildoma lentelė), buvo galima apibūdinti bendrus kiekvieno tipo struktūrinius bruožus. Daugeliu atvejų tai leido mums vienareikšmiškai suderinti rekonstruotą ląstelę su impregnuotu „Golgi 20“, kuriam ji tada buvo pavadinta (papildomi metodai). Tačiau taip pat buvo porūšis ląstelių, kurioms nepavyko rasti Golgi atitikmens, tačiau kurias mes patvirtinome naudodami izomorfus iš genetinio vienos ląstelės ženklinimo. Mes pavadinome šiuos ląstelių tipus: Mi13, Mi14, Mi15, TmY14, Dm9 ir Dm10 (papildomas 2 pav.). Iš viso iš 379 rekonstruotų ląstelių rinkinio (papildomas 1 pav.) Sugebėjome 290 iš jų suskirstyti į 56 ląstelių tipus (2 papildoma lentelė).

Norėdami atskleisti ryšius tarp 379 rekonstruotų neuronų, mes nustatėme pre- ir sinapsines vietas ir priskyrėme jas savo atitinkamoms pirminėms ląstelėms. Etaloniniame stulpelyje ir jo artimiausioje aplinkoje mes pažymėjome 10 093 presinapsines vietas ir 38 465 susijusias postsinapsines vietas (3, 8 ± 1, 2 (vidurkis ± sd) kiekvienoje presinapsinėje vietoje) (2c pav. Ir 1 papildoma lentelė). Nors presinapsiniai T-strypai paprastai pateko į koreguotus neuronų profilius, postsinapsinės vietos dažniausiai nukrito ant izoliuotų profilių, nepriskirtų jokiam neuronui. Taigi reikėjo atsekti dendritą, kuriame yra kiekviena postsinapsinė svetainė, iki pradinės ląstelės. Šis postsinapsinis pėdsakas buvo be galo sudėtingas, nes Drosophila neuronas dendritus šakodavosi tiksliai ir, tiesą sakant, gali būti plonesnis nei pjūvio storis.

Dėl nelengvo postsinapsinio atsekimo atsirado (1) kai kurie klaidingai nustatyti sinapsiniai kontaktai ir (2) didelė dalis ((50%) kontaktų, kurių nepavyko atsekti pagal jų pirminį neuroną, todėl buvo nenustatyti. Norėdami padidinti pasitikėjimą nustatytais kontaktais (1), mes turėjome du korektorius, kurie sekė kiekvieną postsinapsinę vietą (metodus), ir į prisijungimo vietą priėmė tik tuos kontaktus, kuriuos abu korektoriai nustatė nepriklausomai. Atvirkščiai, nebuvo įmanoma eksperimento būdu sumažinti nežinomų kontaktų skaičių (2). Vis dėlto mes vis tiek sugebėjome sukurti jungiamąją vertę, leidžiančią daryti nuoseklią funkciją, nes mes nustatėme, kad medulėje didelio svorio jungtys (tai yra didelis sinapsinių kontaktų skaičius kiekviename jungtyje) ir užima didelę dalį bendro ryšio svorio, ir gali būti tapatinamas su didele ištikimybe. Tiesą sakant, jungties svorio pasiskirstymas mūsų connectome yra sunkios formos (3b pav., Įterptas ir papildomas 3 pav.), Kaip buvo nustatyta kituose organizmuose 21, 22 . Be to, darant prielaidą, kad sinapses yra vienodai sunku koreguoti, mes nustatėme, kad bet koks stiprus ryšys (su> 5 sinapsiniais kontaktais) bus identifikuojamas> 95% tikimybe. Todėl gautame jungime tiksliai identifikuojami 8 637 sinapsiniai kontaktai ir pavaizduoti visi stiprūs ryšiai.

Image

a, Synaptic jungiamumo matrica moduliniams ląstelių tipams, surinktiems iš 2495 sinapsių (1 papildoma lentelė). Trys keliai, nustatyti naudojant „Louvain“ klasterizacijos analizę 46, yra pažymėti spalvotomis dėžutėmis. Jie yra įvardijami pagal pirminį (-ius) įvesties neuroną (-us): L1 (magenta), L2 (žalia) ir L3 / R7 / R8 (cianinis) keliai. Keliai yra suskirstyti pagal bendrą jungčių skaičių mažėjimo tvarka, o ląstelių tipai kiekviename maršrute yra suskirstyti pagal jų prieš ir po sinapsinių jungčių sumą tarp ir kitų ląstelių tipų jų kelyje, taip pat mažėjančia tvarka. b, „Medulla connectome“ modulis kaip 3D grafikas. Ląstelių tipai, turintys stipresnius ryšius, išdėstomi arčiau vienas kito, panaudojant panašumų išdėstymo algoritmą 47 . Stebimos trys erdvėje atskirtos grupės, kurios glaudžiai sutampa su keliais, identifikuojamais susiskirstant į grupes (sferų dažymas). Dominuojanti signalo srauto kryptis nukreipta į 22 puslapį. Įbrėžimas b rodo sinapsinių jungčių dalį per visą jungtį, kurios jungties svoris yra didesnis nei nurodyta.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

„Connectome“ modulis ir jo keliai

Norint nustatyti maršrutus, atliekančius vietinius skaičiavimus, tokius kaip judesio aptikimas, reikėjo sugeneruoti patogesnę visos jungties abstrakciją. Kadangi mes tikimės, kad dominančios grandinės pasikartos kiekvienoje stulpelyje, mes iš medulla connectome ištraukėme periodinį jungčių modulį tarp nustatytų ląstelių tipų, esančių kiekvienoje stulpelyje. Tai apima ir vadinamuosius sinperiodinius ląstelių tipus su atskirais neuronais kiekvienoje medulos 23 stulpelyje, ir ląstelių tipus su keliais nariais kiekvienoje stulpelyje, kuriuos mes apibūdiname kaip ultraperiodinius. Neapimame infraperiodinių tangentinių ar vietinių į amakriną panašių ląstelių, net jei kiekvienoje skiltyje yra arborizacijų, nes to negalima vienareikšmiškai nustatyti atlikus elektronų mikroskopiją (2 papildoma lentelė). Atlikdami elektronų mikroskopijos rekonstravimą (papildomas 1 pav.), Mes panaudojome kelis atstovus iš gretimų kolonų (papildomas 1 pav.), Kad 25 ląstelių tipus identifikuotume kaip sinperiodinius, taip pat du ląstelių tipus - Tm3 ir T4 - kaip ultraperiodinius (po 1, 5 ir 4 langelius kiekvienoje kolonoje)., atitinkamai) (2 papildoma lentelė). Šiuos 27 ląstelių tipus pavadinome moduliniais.

Darant prielaidą, kad jungtys tarp modulinių elementų yra stereotipinės tarp stulpelių, mes sukūrėme kartojamąjį grandinės modulį, surasdami visus ryšius tarp šių elementų tipų (metodai). Skirtingai nuo nedidelių rekonstrukcijų, gautas jungiamosios modulis (3a pav.) Tiksliai užfiksuoja ne tik tvirtų jungčių, bet ir tarp bet kurių dviejų elementų tipų, buvimą.

Norėdami nustatyti, kurie neuronai gali būti įtraukti į skirtingus vietinius skaičiavimus, jungties modulį suskirstėme į tris atskirus signalo apdorojimo būdus, naudodamiesi klasterizacijos ir išdėstymo algoritmais (3 pav.). Mes juos atpažinome kaip anksčiau nustatytus kelius, tokius kaip L1, L2 ir L3 / R7 / R8. Pasrovių R7 ir R8 tikslai anksčiau buvo įtraukti į spalvų matymą. Kadangi spalvų keliai yra padalinti į skirtingas stulpelius, gaunančius iš šviesios arba geltonos ommatidijos 24 įvestis, mes tikimės, kad jos turėtų remtis infraperiodinėmis ląstelių rūšimis, kurios nebuvo įtrauktos į mūsų jungiamąjį modulį. Todėl tiksli L3 / R7 / R8 kelio struktūra bus peržiūrėta kitur.

Likę L1 ir L2 keliai signalizuoja vaizdinį kontrastą ir yra naudojami judesio aptikime 7, 25, 26, 27, 28, 29 . Elgesio eksperimentai ir elektrofiziologiniai įrašai patvirtina šį L1 ir L2 vaidmenį: kiekvienas jų būtinas ne tik judesio aptikimo aspektams 29, 30, 31, bet ir tarp ląstelių, kurios yra sinapsinės fotoreceptoriams R1 – R6, abiejų taip pat dažniausiai pakanka 30, 31 skaičiavimui. Tačiau patiems L1 ir L2 trūksta kryptingai parinktų atsakymų 7, 25 . Todėl, norėdami ieškoti judesio aptikimo grandinės (-ių) jungiamojo modulio viduje, išsamiau ištyrėme neuronus, esančius pasroviui nuo L1 ir L2.

Kandidato judesio aptikimo grandinė

Keletas įrodymų linijų rodo, kad judesio informacija, apskaičiuota pasroviui nuo L1 ir L2, perduodama į lobulo plokštelę per T4 ir T5 tipo ląsteles (nuoroda 25). Pirmiausia, LPTC įrašai apie vaismedžius su genetiškai nutildytais T4 ir T5 rodo, kad bent vienas iš šių stulpelinių ląstelių tipų yra būtinas selektyvumui krypčiai nustatyti 32 . Antra, T4 ir T5 ląstelės Drosofiloje turi keturis potipius, išskiriamus iš lobulinės plokštelės sluoksnio, kuriame jų aksonai sudaro 20 . Trečia, kiekvienas iš šių keturių sluoksnių, esančių raiščio plokštelėje, pasižymi aktyvumu, reaguodamas į plataus lauko dirgiklius, judančius tam tikra kryptimi: žemyn, aukštyn, atgal ir į priekį (4b pav., E), kurį parodo jų įsisavinta dezoksigliukozė 11, 27. . Galiausiai skirtingo judesio pasirinkimo LPTC dendritai kartu užima blauzdos plokštelės sluoksnius, atitinkančius jų kryptinę pirmenybę 20, ir, be to, gauna tiesioginius sinapsinius ryšius iš T4 gnybtų 28 . Visi šie duomenys leidžia manyti, kad kiekvienas T4 / T5 potipis sudaro judesio aptikimo grandinių, signalizuojančių apie tam tikrą judėjimo kryptį, išvestį.

Image

a, Mi1 (cianinis) ir Tm3 (magenta) neuronų, kurie presinapsiniai T4-12, dendritų vaizdas apačioje, uždengtas L1 aksoninių galinių elementų rinkiniu (geltona). Kiekvienos dendritinės pavėsinės spalvų sodrumas atspindi sinapsinių kontaktų, padarytų ant T4-12, skaičių (žr. B ir d ). Rodyklė rodo poslinkį nuo Tm3 masės centro iki Mi1 masės centro, apskaičiuoto, kaip parodyta e . b, T4-12 ir jo presinapsinių Mi1 ir Tm3 ląstelių vaizdas iš šono. T4 langelio (spalvotas, kad atitiktų e krypties pasirinkimą) krypties pasirinkimą lemia aksonų gnybtų plokštelės arborizacijos sluoksnis (juodos spalvos T formos juostos). c, padidinimas (brūkšninis stačiakampis a ), parodantis rekonstruotus Mi1, Tm3 ir L1 ląstelių neuritus (be a ) svertinių spalvų ir jų sinapsinius kontaktus (L1 → Mi1: mėlyna; L1 → Tm3: raudona). d, rekonstruota T4-12 dendritinė pavėsinė su Mi1 (mėlyna) ir Tm3 (raudona) sinapsėmis. e . Įvesties į vieną T4 langelį per Mi1 ir Tm3 langelius animacija. Neįveikti sinapsių svoriai parodo, kaip buvo apskaičiuoti imamieji laukai. Mi1 (arba Tm3) komponento, mėlynojo (arba raudonojo) apskritimo, masės centras apskaičiuojamas masę, atitinkančią junginio sinapsinę masę nuo L1 iki Mi1 (arba Tm3) iki T4, atitinkamos kolonėlės centre. Masto juostos, 8 μm ( a ), 8 μm ( b ), 1 μm ( c ) ir 4 μm ( d ).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Toliau mes tvirtiname, kad pasirinktos krypties T5 ir ypač T4 išvestys yra apskaičiuojamos beveik nepriklausomai viena nuo kitos. Atlikdami stratos sutapimo analizę Drosophila 26 ir didelėse musėse 25, mūsų connectome (3a pav., B) rodo, kad T4 priklauso L1 keliui. Ir atvirkščiai, nors mes neradome pėdsakų į lobulą, T5 ląstelių dendritai kartu užima juosmenis su neuronų, tokių kaip Tm1 (ref. 20, 25), Tm2 (ref. 20) ir Tm4 (ref.), Aksonų terminalais. 20), kurie priklauso L2 keliui (3b pav.). Elektrofiziologiniai 30 ir elgesio 29 įrodymai rodo, kad L1 ir L2 keliai jungties modulyje (3a, b pav.) Yra skaičiavimo požiūriu nepriklausomi ir atitinka ON ir OFF kelius vaizdinėse sistemose stuburiniams. Be to, didžioji dalis jungčių iš L2 į L1 kelią patenka per L5 (3a pav.), Ląstelių tipo, nedalyvaujančio judesio aptikime 33 . Taigi, mes nusprendėme ieškoti judesio aptikimo grandinės pasroviui nuo L1, susiliejančios su T4 ląstelėmis. Šis sprendimas buvo priimtas nepaisant elektrofiziologinių įrodymų, rodančių, kad T4 ląstelėse nėra selektyvios krypties 34, tačiau nuo to laiko, kai baigėme savo darbą, ją palaikė T4 ląstelių tyrimas 35 .

Norėdami nustatyti judesio aptikimo grandinės, jungiančios tarp L1 ir T4, elementus, pasinaudojome tuo, kad judesio aptikimas yra greitas ir tvirtas, kad kelia triukšmą 16, 17, todėl jį turėtų įgyvendinti tiek pirmyn, tiek stipriai jungdami. Mūsų tankios elektroninės mikroskopijos rekonstrukcija nustatė penkis ląstelių tipus, turinčius reikšmingą L1 įvestį: Mi1, Tm3, L5, C2 ir C3 (3a pav.). Ląstelių tipai Mi1 ir Tm3 yra du didžiausi L1 įėjimo gavėjai, kartu sudarantys daugiau nei pusę L1 sinapsinių kontaktų. Savo ruožtu, Mi1 ir Tm3 kartu sudaro> 80% presinapsinių įėjimų į T4 (įskaitant visas įvestis tiek iš modulinių, tiek į ne moduliarių elementų tipus), tokiu būdu sudarydami du stipriausius kelius nuo L1 iki T4. Priešingai, C3 tipo ląstelės kontaktuoja su T4 mažesnės sinapsės laipsniais nei Mi1 ir Tm3, nurodydamos, kad jos indėlis yra daug silpnesnis. Galiausiai L5 ir C2 ląstelių tipai neturi sinapsių tiesiogiai su T4. Šios savybės leidžia manyti, kad Mi1 ir Tm3 yra pagrindiniai tvirto ir greito judesio aptikimo substratai L1 kelyje.

Anatominiai T4 ląstelių laukai

Norėdami toliau ištirti, ar T1 ląstelėse suartėjusios Mi1 ir Tm3 ląstelės galėtų sudaryti abi koreliacija paremto judesio detektoriaus atramas (1a, b pav.), Ištyrėme, ar judesio ašis, apibrėžta šiais įėjimais į tam tikrą T4, atitinka jo pageidaujama kryptis, matuojama pagal jos išėjimus. Ši išėjimo pasirinkta kryptis buvo nustatyta 16 T4 neuronų, atsekiant jų aksonus į lobulo plokštelę ir identifikuojant jų arborizacijos sluoksnį 11, 27 (4b pav., E).

Norėdami palyginti T4 išėjimo pasirinkimą su judesio ašimi, kylančia iš jo įvesties, mes sukonstravome įėjimo judesio ašį, išanalizavę atskirų Mi1 ir Tm3 ląstelių kontaktų skaičių ant nagrinėjamo T4 neurono. Mes nustatėme, kad kiekvienas T4 gauna įėjimus iš kelių Mi1 ir Tm3 neuronų. Tai rodo, kad, skirtingai nuo 1a ir b paveikslų schemų, keli regėjimo lauko taškai teikia įvestis į kiekvieną judesio detektoriaus svirtį (4a, b, e pav.) . Šį pastebėjimą patvirtina mėginių ėmimo vienetų struktūra, nustatyta remiantis įrašais „Hfly“ sraigte (nuoroda 36), kuris priima duomenis iš LPTC 37 . Todėl mums reikėjo apibūdinti kiekvieno T4 įvestį kaip Mi1 ir Tm3 tarpininkaujantį reaktoriaus lauko komponentą, susietą su regos lauku. Norėdami tai padaryti, mes atsekėme sinapsines jungtis iš L1 gnybtų 19 stulpelių (atskaitos stulpelis ir aplink juos esanti 18 stulpelių) iki pasroviui esančių Mi1 ir Tm3 ląstelių, o paskui iš Mi1 ir Tm3 neuronų į T4 ląsteles, kurios gauna įvestį iš etaloninės kolonėlės (kuri taip pat nutinka su numeriu 19). Gauti priėmimo laukai (4a pav. Ir papildomas 4 pav.) Rodo T4 įvestis, išdėstytas tarsi L1 masyve, taigi ir į regėjimo lauką.

Visoms T4 ląstelėms T4 receptorių lauko Mi1 ir Tm3 tarpininkaujantys komponentai iš esmės sutampa (papildomas 4 pav.). Iš tikrųjų, dviejų komponentų masės centrai yra pasislinkę mažiau nei per vieną tarpmatidinį atstumą (5a pav.). Tačiau 15 iš T4 ląstelių šis poslinkis vis tiek yra žymiai didesnis ( P <0, 05), nei tai būtų buvę įmanoma atsitiktinai padarius atsekimo klaidas. Toks mažas poslinkio dydis, atsižvelgiant į priimamųjų laukų plotį, sutinka su ankstesniais įrodymais, padarytais iš H1 pūtimo įrašų, ir buvo pagrįstas teoriškai 36 .

Image

a. Kiekvieno T4 neurono poslinkio vektoriai ( n = 19). Neuronų, turinčių reikšmingą poslinkį (pavadinimai paryškinti), 95% pasikliovimo intervalai (elipsės) neįtraukia kilmės (metodai). Vektoriai yra ommatidiniame atskaitos taške (ne daugiau kaip 30 ° nuo regėjimo ašių). b, viršuje, vidutinis poslinkis, apskaičiuotas iš a, apskaičiuotas pagal ląsteles su ta pačia pageidaujama išėjimo kryptimi. Apačioje kampinis skirtumas tarp atskirų T4 neuronų erdvinio poslinkio ir pageidautinos jo išvesties krypties (1–3 lobula plokštelių sluoksniams (LP1–3)) koreliuoja su trūkstamų L1 įėjimų dalimi (metodai). Vidutiniai poslinkiai (viršutinė dalis) nebuvo įtraukti į T4 ląsteles, kurių L1 įvestis buvo> 15%. Mastelio juostos, 0, 5 ( a ) ir 0, 2 ( b ) atstumo nuo centro iki gretimų briaunų.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Ar poslinkio tarp T4 ir Mi1 receptorių lauko komponentų, esančių T4 neurone, poslinkio kryptis atitinka neurono krypties pasirinkimą, apibrėžtą jo galinio aksono arborizacijos gylyje lobulo plokštelėje? Darant prielaidą, kad poslinkio kryptis yra nustatoma nuo Tm3 iki Mi1 komponento masės centrų, 5b pav. (Viršuje) parodyta, kad poslinkio kryptis atitinka krypties pasirinkimą trims iš keturių lobulinės plokštelės sluoksnių. Ketvirtajame sluoksnyje pasibaigusių T4 ląstelių (lobulinės plokštelės vėliau 4, LP4) poslinkio krypties ir judėjimo pirmyn ir atgal pasirinkimą gali sukelti apleistos grandinės, kurios konkrečiai prisideda prie šių T4 neuronų reakcijų. Pvz., Elgesio įrodymai rodo C3 neuronų aptikimą judant priekyje ir atgal 33, ir iš tikrųjų preliminarūs susekimo rezultatai rodo, kad nepaisant C3 ląstelių, teikiančių eiliškumą T4 ląstelėms, mažiau nei Mi1 ar Tm3 ląstelių, C3 neuronai yra taikiniai LP4 T4 ląstelės.

Dalį neatitikimo tarp atskirų T4 ląstelių receptorių lauko poslinkio ir kryptinės pirmenybės (5a pav.), Vidinio vidinio raiščio plokštelės 1–3 sluoksnių, tikriausiai lemia sisteminė mūsų rekonstrukcijos klaida, atsirandanti dėl baigtinio rekonstruoto regiono dydžio. Iš tikrųjų neatitikimas tarp išmatuoto įvesties poslinkio tam tikrame T4 ir numatomos krypties pasirinkimo yra susijęs su trūkstamų L1 įėjimų į Tm3 langelius prieš tą T4 (5b pav., Apačia) svertine dalimi, patvirtinantis, kad periferinių laukų laukai T4 ląstelės gali būti nevisiškai rekonstruotos. Be to, kai kurie likę poslinkio orientacijos pokyčiai taip pat gali būti realūs, atsižvelgiant į stebėjimo nustatymo kreivių, gautų atliekant kalcio vaizdus atskirais T4 potipiais, 35–90 ° perpusį plotį 35–50 °.

Mūsų pasirinkimas matuoti poslinkį nuo Tm3 iki Mi1 (ir ne atvirkštine tvarka) atrodo savavališkas, neįtraukiant informacijos apie vėlavimus ir sinapsinį poliškumą (1a, b pav.). Norėdami įvertinti galimą laidumo atidėjimą, išmatuojome pagrindinio aksonų kamieno, vedančių signalus išilgai Mi1 ir Tm3 ląstelių nuo L1 sinapsių iki T4 sinapsių, ilgį ir kalibrą, ir nustatėme, kad jie yra panašūs 10% atstumu vienas nuo kito. Be to, naudojant elektroninių parametrų diapazoną, išmatuotą kituose skriejančiuose neuronuose 38, atitinkami laidų vėlavimai vis tiek buvo tik vienos milisekundės tvarka, mažesnio laipsnio nei reikalaujama judesio aptikimui 29 . Be to, nors kai kurie neurotransmiteriai buvo nustatyti dalyvaujančių ląstelių tipams, mes nežinome, kokie yra jų receptoriai ir dėl to atsirandantis sinapsinis poliškumas.

Nesant įrodymų apie santykinį uždelsimą ir sinapsių poliškumą, mes galime laisvai pasirinkti matavimo kryptį nuo Tm3 iki Mi1, o tai lemia erdvinius poslinkius, atitinkančius krypties nuostatą, numatomą pagal T4 gnybto gylį lobulo plokštelėje. Darant prielaidą, kad Mi1 ir Tm3 įėjimai į T4 yra sujungti tuo pačiu ženklu, kaip ir Hassensteino – Reichardto elementinio judesio detektoriaus (EMD) 4 modelyje (1a pav.), Mes prognozuojame, kad judesio detektoriaus Tm3 rankena turėtų įvesti ilgesnį ilgį. vėlavimas nei „Mi1“ rankos. Tačiau jei įvestys būtų sujungtos su priešingais ženklais, kaip Barlowo – Levickio panašiame EMD modelyje 6 (1b pav.), Mūsų prognozė būtų priešinga. Kalbant apie vėlavimo mechanizmą, tai, kad abiejų grandinių rankos, įgyvendintos skirtingais ląstelių tipais, suteikia galimybę, kad delsimas gali būti įgyvendinamas biologiškai, naudojant metabotropinius receptorius, kaip rašoma stuburinių tinklainėje 39 .

Tyrinėdami rekonstruotas T4 ląsteles, nustatėme iki šiol neatpažintą jų medulinės dendritinės pavėsinės požymį (vis dėlto žr. T4a, d 20 pav. 14 pav. Ir NJ Strausfeld, asmeninė komunikacija): kiekvieno T4 neurono dendritinės šakos yra orientuotos pirmiausia viena kryptimi (6a pav. ir metodai). Be to, kiekvieno T4 šakos orientacija, matuojama nuo dendrito antgalių iki jų bazių, telkiasi aplink vieną iš keturių krypčių (6b pav.). Šios keturios kryptys, pažymėtos iš medulos koordinačių rėmo į regėjimo lauką (6c pav.), Atitinka kiekvieno išvaržos plokštelės sluoksnio išėjimo krypties pasirinkimą (6b pav.). Šis stebėjimas leido mums kryžmiškai patvirtinti kiekvienos iš 16 T4 ląstelių klasifikavimą pagal krypties potipius (6a, b ir papildomas 5 pav.). Tada mes pasinaudojome šiuo stebėjimu norėdami nustatyti, kokia yra likusių trijų T4 ląstelių, kurių sekimas į lobulo plokštelę nebuvo tinkamas, kryptis (6c pav.).

Image

a, keturios reprezentatyvios T4 ląstelių medulla dendritinės pavėsinės. Spalvos atspindi vietinę dendritinę šakos orientaciją. Spalvų žemėlapis buvo sudarytas paskirstant spalvas iš kiekvieno raiščio plokštelės sluoksnio (4e pav.) Į vidutinę dominuojančios šakos orientaciją per visus kiekvieno sluoksnio neuronus (rodyklės spalvų žemėlapyje) ir sklandžiai interpoliuojant. b, T4 neurono aksoninės pavėsinės gylis lobulo plokštelėje koreliuoja su vyraujančia dendrito šakos orientacija medulėje (metodai). Gylio ašyje pažymėti keturi sluoksniai, o kiekvieno sluoksnio neuronai yra spalvoti, kaip parodyta 4e pav. Dominuojančios neuronų, kurių aksonai neatsekti į lobulo plokštelę, orientacija yra pažymėta x ašyje (1: T4-5, 2: T4-4, 3: T4-14), ir jie nuspalvinami klasterio spalva iki kuriai jie greičiausiai priklauso (papildomas 5 pav.). c, dominuojančios dendritinės orientacijos (± sem) iš medulos stulpelių masyvo (M10 sluoksnyje) apibrėžtos erdvės pavertimas vaizdinės erdvės kryptimis. Svarstyklės, 5 μm.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Ši ataskaita pristatė naują didelio pralaidumo, pusiau automatizuotą dujotiekį elektronų mikroskopijai rekonstruoti ir pritaikė jį visapusiškai sujungimo modulio rekonstrukcijai medulos srityje - neuropilyje, kuris ilgą laiką priešinosi tokiems bandymams. Be to, naudodamiesi jungtimi, mes nustatėme, kad Mi1 ir Tm3 įėjimai į T4 neuronus yra abi koreliacija paremto judesio detektoriaus rankos. Nors vien tik anatomija neleidžia ištirti netiesinės operacijos ar laiko uždelsimo, todėl galime atskirti skirtingus koreliacija paremtus modelius 5, 6, 40, mes sugebėjome numatyti, kuris ląstelių tipas turėtų įvesti ilgesnį atidėjimą, atsižvelgiant į jų sinapsinius poliariumus (1a, b pav.).

Analogiškai mūsų siūlomai grandinei, esančiai pasroviui nuo L1, elektroninės mikroskopijos rekonstrukcijos jungtys leidžia mums pasiūlyti ląstelių tipus kandidatus - Tm1, Tm2 ir Tm4 - kurie gali sudaryti judesio aptikimo grandinę pasroviui nuo L2. Žinoma, patvirtinus šį pasiūlymą, reikia laukti tankios ryšių su T5 neuronais lobulėje rekonstrukcijos.

Šioje ataskaitoje yra keletas įdomių paralelių su stuburinių tinklainių rezultatais. Pirmiausia, tai, kad egzistuoja keturi T4 ląstelių potipiai, reaguojantys į keturias kardinalias judėjimo kryptis, yra keturių ON – OFF kryptyje selektyvių ganglinių ląstelių (DSGC) potipiai triušio tinklainėje 41 . Antra, mūsų pastebėjimas, kad T4 ląstelių kryptinis selektyvumas yra suderintas su jų dendritine orientacija, primena JAM-B gangliono ląsteles 42 ir žvaigždžių pūtimu pasižyminčias amakrino ląsteles (SAC) 43 pelės tinklainėje. Tačiau skirtingai nuo JAM-B ir SAC ląstelių, geriausia T4 ląstelių kryptis yra nutolusi nuo dendritų galiukų ir, skirtingai nei SAC ląstelės, bet kaip ir JAM-B ląstelės, visi dendritai viename T4 taške yra ta pačia kryptimi. Trečia, labai specifiniai ryšiai tarp SAC ir DSGC, atsakingų už pastarųjų kryptinį selektyvumą, taip pat buvo pademonstruoti anksčiau, naudojant plataus masto jungtį 44 . Tačiau skirtingai nuo SAC-to-DSGC grandinės, mūsų pranešta grandinė gali apskaičiuoti kryptiniu būdu pasirinktus atsakymus iš kryptinių įėjimų.

Mums identifikuoti kandidato judesio aptikimo kelią pasroviui nuo L1 labai padėjo mūsų elektronų mikroskopijos rekonstrukcijos išsamumas. Palyginti su pavėsinės sutapimais 26, tikslus sinapsių skaičius leidžia vienareikšmiškai užmegzti ryšius (papildomas 6 pav.). Tokiu būdu mes nustatėme, kad Tm3 yra pagrindinis judesio aptikimo grandinės komponentas - tai faktas, kuris išvengė ankstesnių tyrinėtojų dėl jo minimalaus arborizacijos M10. Be to, palyginti su retomis rekonstrukcijomis kitose sistemose, pavyzdžiui, sinapsinėmis jungtimis tarp SAC ir DSGC 44, visapusiškumas leidžia mums teigti ir apie alternatyvių būdų nebuvimą, ir apie siūlomo kelio skaitmeninę svarbą.

Tankios medulinės jungties reikšmė taip pat peržengia vietinį judesio detektorių, taikoma daugeliui kitų vaizdinių skaičiavimų. Nors dar reikia daug nuveikti, ypač norint visiškai integruoti tangencialines ir infraperiodines ląsteles, mūsų connectome yra stulpelių neuronai, esantys kiekvienoje stulpelyje, todėl pašalinamas ilgalaikis vabzdžių regėjimo supratimo blokas. Apskritai, mūsų rezultatai iliustruoja, kad kartu su gausia eksperimentinių ir teorinių rezultatų kolekcija jungtys, identifikuodamos pagrindines grandines, gali suteikti pagrindinę informaciją apie neuronų skaičiavimą.

Metodų santrauka

Musės smegenys buvo paruoštos elektronų mikroskopijai, pakeičiant aukšto slėgio užšaldymu / užšaldymu, po to įdėjus ir pjaustant. Skyriai buvo pavaizduoti naudojant perdavimo elektronų mikroskopiją. Elektronų mikrografai buvo surinkti į trijų matmenų krūvą, teisingai vaizduojančią santykines atvaizdų struktūrų vietas netiesinės registracijos būdu. Išlygintas pilkos spalvos vaizdų pluoštas kompiuterio mokymosi algoritmais buvo padalintas į pikselių pogrupius, kurių kiekvienas priklausė tik vienam neuronui (žr. //Bitbucket.org/shivnaga/sstem). Šis per didelis segmentas buvo rankiniu būdu patikrintas ir aglomeruotas į atskirus neuronus („korektūra“). Presinapsiniai terminalai ir postsinapsiniai tankiai anotuojami ranka ir priskiriami neuronams (1 papildomi duomenys). Šiems rankiniams veiksmams atlikti reikėjo ∼ 14 400 asmens valandų (įskaitant ∼ 2500 ekspertų valandas). Rekonstruoto neurono tipai buvo nustatyti derinant jų formas su šviesos mikroskopijos pavyzdžiais. Visas „connectome“ buvo kondensuotas į „connectome“ modulį, kuris buvo padalintas į kelius naudojant grafiko išdėstymą ir grupavimo algoritmus. Suskaičiavę sinapsinių kontaktų skaičių tarp L1, Mi1, Tm3 ir T4 ląstelių, mes apskaičiavome santykinį įvesties komponentų poslinkį. Mes kryžminiu būdu patvirtino šį poslinkį, palyginti su T4 ląstelių, rastų krypčiai, kryptimi, atsekdami jų aksonus į lobulo plokštelę.

Internetiniai metodai

Audinių paruošimas, elektronų mikroskopija ir vaizdavimas

Dešinioji laukinio tipo Oregono R moteriškos lyties smegenų dalis buvo nuosekliai padalinta į 40 nm pjūvius. Iš viso buvo pavaizduota 1 769 pjūviai, kertantys medulinę ir pasroviinę neuropilius (1c pav.), Padidinimu × 5000. Šis procesas išsamiai aprašytas papildomuose metoduose.

Pusiau automatinis rekonstravimo vamzdynas

Norėdami gauti tankią elektroninės mikroskopijos atskaitos stulpelio rekonstrukciją, mes panaudojome automatinio suderinimo ir segmentavimo žingsnių seką, po kurios sekė rankinis korektūra ir rekonstrukcija, kurią apibūdinome kaip pusiau automatinį rekonstravimo vamzdyną 19 .

Vaizdo išlyginimas

Pirmiausia aptikome apytikslį viso vaizdo krūvos išlyginimą, nekreipdami dėmesio į tokius artefaktus kaip raukšlės, ašaros ir nešvarumų užkimšimai, naudodami griežtą „TrakEM2“ registraciją 48, norėdami suderinti vaizdų blokus, susidedančius iš 20 sekcijų iš 9 × 9 mozaikų, ir tada suderinti blokus automatizuotu būdu. ieškokite vaizdų kiekvienos mozaikos centre. Šis grubus išlyginimas leido nustatyti, kurie vaizdai sutapo, ir tai leido tiksliau išanalizuoti audinius, turinčius artefaktus, o ypač didelius raukšles. Buvo manoma, kad daug tamsesni nei vidutiniai taškai atitinka raukšles ir buvo naudojami padalinti kiekvieną vaizdą į du ar daugiau sujungtų komponentų, vadinamų pleistrais. Kiekvienai persidengiančių taškų porai tiek atkarpoje (išilgai sienos), tiek atkarpoje nuo sekcijos atitikties taškai buvo rasti koreliacija (∼ 1 iš 500 000 sutampančių taškų). Tuomet buvo naudojami mažiausiai šių taškų kvadratėliai, suderinti su masteliu ir įstrižainėmis, kad būtų galima visuotinai suderinti visus pleistrus. Ištyrus klaidas iš šio tinkamo vaizdo, nustatyti automatiniai padalijimai į pataisas buvo netikslūs, ir šie padalijimai buvo ištaisyti rankiniu būdu. Gavus patenkinamą prigludimą, kiekvienas paveikslėlio pleistras buvo šiek tiek iškraipytas, kad geriausiai atitiktų kaimyną (-us), kol išliks artimas visuotiniam poelgiui. Daugiau informacijos rasite nuorodoje. 49.

Automatinis vaizdo segmentas

Kitame etape padalijome dominančią medulos sritį išlygintame pilkos spalvos vaizdų pluošte į pikselių pogrupius, priklausančius atskiriems neuronams. Atsižvelgiant į tai, kad perdavimo elektroninės mikroskopijos (TEM) duomenų rinkinys yra anizotropinis, mes sukūrėme dviejų pakopų procesą, apimantį 2D segmentus, kad būtų galima nustatyti neuronų skerspjūvius, po kurių šie segmentai susieti 3D formatu. Visiems duomenims nebuvo naudojamas vienas algoritmas, nes kartu su korektūros pastangomis buvo išbandyta daugybė skirtingų segmentavimo metodų, ir jau pataisytų dalių segmentas segmentuoti buvo neveiksmingas. Tipiškas 2D segmentacijos žingsnis apėmė ribų tikimybės žemėlapių sudarymą, naudojant morfologinius bruožus 50, 51, 52, po to padidėjusį briaunų mokymąsi 53, mitochondrijų aptikimą, kad būtų sumažintos klaidingos ribos 54, po to - baseino segmentus 55 ir aglomeracinį grupavimą 56, naudojant vidutines ir medianines ribines vertes. 2D segmentai. 3D jungties žingsnis sudarė gretimų skyrių nuoseklių 2D segmentų sujungimo grafiką. Vėlgi, buvo naudojami keli metodai, įskaitant paprastą metriką, tokią kaip persidengimas, ir kompiuterinio mokymosi metodus, pagal kuriuos iš anksčiau koreguotų duomenų buvo apskaičiuotas tinkamas funkcijų svoris. Išsamesnę informaciją apie kai kuriuos mūsų automatinio segmentavimo metodus galite rasti ankstesniuose leidiniuose 19, 57 . Atsižvelgiant į tai, kad visi segmentavimo algoritmai daro klaidas, atsirandančius dėl vaizdavimo artefaktų ir mažo z-sprendimo , ir kadangi rankiniu būdu ištaisyti per segmentus yra lengviau nei per mažus segmentus, mes suderinome savo automatinius algoritmus, kad gautume per segmentą. Be to, mes išsaugojome baseino regionus, vadinamus superpikseliais, kad būtų lengviau rankiniu būdu pataisyti per didelius segmentus kitame etape. Mes išleidome naujausią (ir mes manome, kad geriausią) segmentavimo kodo versiją, kurią mes naudojome (//bitbucket.org/shivnaga/sstem), tačiau skaitytoją perspėkite, kad net ir mūsų geriausiam automatiniam segmentavimui reikėjo išsamių rankinio koregavimo, taisymo ir komentarų. (žr. žemiau), kad gautume rezultatus, kuriuos pranešime šiame darbe.

Korektūros ir rekonstravimas

Toliau apžiūrėjome automatinio segmentavimo rezultatus, ištaisėme likusias klaidas ir priskyrėme sinapses korektūros langelio pakaboms. Kadangi tam reikėjo laiko, paruošėme profesionalių redaktorių, vadinamų korektoriais, grupę, kurios darbą prižiūrėjo trys patyrę elektronų mikroskopistai (Sh.T., Sa.T. ir PKR) (ekspertai). Korektoriai ir ekspertai atliko savo užduotis naudodami specialų programinės įrangos įrankį „Raveler“ (DJO ir kt. , Rankraštis rengiamas). Iš viso šie korektūros veiksmai užtruko 12 940 žmogaus valandų (įskaitant 900 ekspertų valandų, kuriuos pateikė mūsų ekspertai). Rekonstrukcijos procese buvo atlikti penki pagrindiniai etapai: (1) tūrio koregavimas, (2) sinapsių anotacija, (3) sinapsės susekimas, (4) inkaro korpuso tobulinimas ir (5) selektyvus spartus sekimas, išsamiai aprašytas Papildomuose metoduose.

Laidų jungimo schemos patikimumas

Kaip aprašyta aukščiau, kiekvienai sinapsei skyrėme du korektorius, kad padidintume korektūros patikimumą. Charakteringa tai, kad 48, 2% atvejų abu korektoriai negalėjo nustatyti pirminės ląstelės arba todėl, kad negalėjo užtikrintai atsekti proceso, arba todėl, kad ji paliko dominančią medulos sritį. 44, 0% atvejų abu korektoriai atsekė PSD prie to paties inkaro korpuso, o 7, 5% atvejų vienas korektorius negalėjo nustatyti sekimo, o kitas atsekė PSD iki inkaro korpuso (skaičiai ištraukti iš 1 papildomos lentelės). Tačiau tik labai retais atvejais (0, 23 proc.) Abu korektoriai pasiekė skirtingus tvirtinimo elementus. Šie skaičiai rodo, kad didelė dalis jungčių nebus praleista po dviejų korektorių susitarimo proceso; tačiau visos nustatytos sąsajos turi labai didelę tikimybę būti teisingos.

Norėdami įvertinti savo rekonstrukcijos kokybę, iš dviejų korektorių rezultatų sugeneravome du prisijungimo būdus - įtraukiančią versiją, apimančią bet kurio korektoriaus atrastus ryšius, ir bendrą versiją, kurioje jungtys buvo priimamos tik tada, kai abu korektoriai sutiko. Šių dviejų jungčių palyginimas paprastai buvo raminantis. Nors inkliuzinis jungiklis turi ∼ 16% daugiau jungčių, visos papildomos jungtys turėjo tik vieną sinapsinį kontaktą. Visi jungtys su dviem ar daugiau sinapsių yra abiejuose junginiuose (1 papildoma lentelė). Visoms analizėms mes naudojome konsensuso jungtį. Tačiau išvados nesikeičia naudojant „inkliuzinį jungtį“.

Apskritai, aukštas praleistų sinapsinių kontaktų skaičius mūsų korektūroje buvo toleruotinas mūsų projektui, nes mūsų tikslas buvo tirti ryšius su keliais lygiagrečiais sinapsiniais kontaktais. Galėtume patvirtinti, kad connectome yra didelė dalis tokių stiprių jungčių, nubrėždami kontaktų skaičiaus pasiskirstymą tarp sujungtų ląstelių porų.

Mes nustatėme labai sunkų kiekvienos sujungtos poros kontaktų skaičiaus pasiskirstymą tiek visoje jungomoje (įterpimas 3b pav.), Tiek ir retai aptinkamų ląstelių tipų, dalyvaujančių judesio aptikime, pogrupyje (papildomas 1 pav. 3). Atsižvelgiant į tai, kad T-juostų dydžiai meduloje yra santykinai vienodi (A. McGregor ir kt. , Nepaskelbti pastebėjimai) ir, manoma, kad sinapsinių struktūrų dydis koreliuoja su jų fiziologiniu stiprumu 58, mes įvertinome lygiagrečių sinapsinių kontaktų skaičių tarp du neuronai kaip sinapsinio svorio įgaliotinis. Be to, darant prielaidą, kad sinapsinio kontakto praradimo tikrinimo metu tikimybė yra vienoda visose postsinapsinėse vietose, galime įvertinti, kad konsensuso jungtyje yra visos jungtys su> 5 sinapsėmis, kurių patikimumo lygis yra> 95% (papildomi metodai). Todėl mes tikime, kad mūsų sutarimo jungtis yra tiksli ir išsami stiprioms jungtims.

Sujungimo modulio konstravimas

Sudarant pasikartojantį modulį medulinės jungties srityje, buvo identifikuoti visi kiekvienos etaloninės skilties neuronų klasės nariai, o sinapsių skaičius iš tų neuronų į visus kitus postsinapsinės klasės neuronus buvo vidutinis per presinapsines ląsteles. Ultraperiodinių elementų tipams, pavyzdžiui, Tm3, gali atsirasti trupmeninis svoris. Be to, kadangi vienoje kolonoje yra vidutiniškai 1, 5 Tm3 ląstelių, mes apskaičiavome sinapsių svorį padauginę iš 1, 5. Šie trupmeniniai svoriai suteikia vidutinį sujungimo stiprumą skirtingose ​​kolonose, nes kai kurie stulpeliai turi tik vieną Tm3, o kiti - du.

Čia pasirinkta kryptinė sumavimas, nes rekonstruodami mes stengėmės perskaityti kiekvieną postsinapsinį elementą į susijusį neuroną. Tačiau mes nebandėme koreguoti kiekvienos presinapsinės vietos atgal į pirminį neuroną (nes kai kurie tokie elementai gali kilti iš referencinių stulpelių, kurie nebuvo tankiai rekonstruoti).

Šis metodas buvo modifikuotas keturioms judesio aptikimo grandinės jungtims: L1 - Mi1, L1 - Tm3, Mi1 - T4 ir Tm3 - T4. Tokiais atvejais iš tankiai rekonstruotos medulinės jungomos sinapsinių kontaktų skaičius buvo pakeistas sinapsinių kontaktų skaičiumi, nustatytu atliekant nedidelį šių specifinių jungčių sekimą (3 papildomoji lentelė).

Mi1 ir Tm3 priėmimo lauko komponentų skaičiavimas

Mes apskaičiavome kiekvieno T4 receptorių lauko Mi1 ir Tm3 komponentus, padauginę sinapsinių kontaktų skaičių iš kiekvieno L1 neurono į vieną tarpinį Mi1 ar Tm3 neuroną iš kontaktų iš tos tarpinės ląstelės į T4 skaičių ir tada sumuodami. per visus Mi1 ir Tm3 neuronus, gaunančius duomenis iš to paties L1 (4e pav.). Šis dauginimas yra lygus nepriklausomų sinapsinių maršrutų skaičiavimui iš kiekvieno L1 į kiekvieną T4, kuriame kiekvienas maršrutas turi naudoti skirtingas sinapsinių kontaktų poras tarp L1 ir tarpinių taikinių ląstelių bei tarpinių taikinių ir T4.

Monte Karlo klaidų įvertinimas

Mūsų korektūros metodika lemia labai mažai klaidingų teigiamų klaidų, bet daug klaidingų neigiamų klaidų tarp neuronų porų (žr. Anksčiau). Todėl labai tikėtina, kad stebimas sinapsinių kontaktų skaičius ( m ) yra didesnio, tikrojo, dviejų neuronų sinapsinių kontaktų skaičiaus pogrupis ( n ). Darant prielaidą, kad kiekvienoje sujungtoje neuronų poroje kiekvienas sinapsinis kontaktas turėjo vienodą klaidingą neigiamą tikimybę, ir naudojant šią tikimybę binominiame pasiskirstyme, mūsų tikslas buvo įvertinti užpakalinę tikimybę P ( n | m ) (tai yra tikroji n, atsižvelgiant į stebimą m ), esant skirtingoms n reikšmėms. Norėdami tai padaryti, nes ankstesnis paskirstymas per n nėra žinomas, šią užpakalinę tikimybę aproksimavome pagal tikimybę P ( m | n ) (tai yra, stebėjimo m tikimybę, atsižvelgiant į tam tikrą tikrosios n reikšmę), esant skirtingoms n reikšmėms. . Iš kiekvienos sujungtos neuronų poros sukūrėme 1000 skirtingų tikrosios jungties svorio įvertinimų, imdami iš galimų n verčių rinkinio su apskaičiuota tikimybe, atsižvelgiant į kiekvieną n vertę. Neuronų poroms, kurios buvo atjungtos dėl didelio klaidingai neigiamų klaidų lygio, taip pat buvo leista prisijungti, jei jų neuritų profiliai sutapo 3D formatu. Kontaktų skaičius buvo apskaičiuotas naudojant tą patį mėginių ėmimo metodą kaip ir anksčiau (bet su m lygus nuliui). Tokiu būdu mes sukūrėme 1000 skirtingų sujungimo matricų. Tada buvo apskaičiuotas kiekvienos matricos poslinkis. Apskaičiuoti visų poslinkių vektorių kovariacijos matricos savivaliosios vertės ir savivektoriai, naudojami elipsės schemai išilgai savivektoriaus ašių su 2 σ patikimumo intervalais (5a pav.). Norint išplėsti šią konstrukciją iki neuronų grupės vidutinio poslinkio, buvo apskaičiuota 1 000 vidurkio variacijų, pirmiausia imant mėginius iš kiekvienam neuronui sukeltų poslinkių, o paskui apskaičiuojant kiekvieno mėginių rinkinio vidurkį. Tada elipsės buvo apskaičiuotos tokiu pačiu būdu kaip ir anksčiau, naudojant šį 1 000 vidutinių verčių rinkinį (5b pav., Viršuje).

Riboto rekonstravimo dydžio poveikis

Kadangi Tm3 ląstelių, sujungtų su tam tikru T4, dendritinių apvalkalų pasiskirstymas yra didesnis nei Mi1 elementų, Tm3 ląstelės yra labiau tikėtinos iš dalies rekonstruotos, taigi trūksta L1 įėjimų šalia mūsų 19 kolonų rekonstrukcijos kraštų. . Norėdami įvertinti šios ribos poveikį kiekvienam T4, pirmiausia apžiūrėjome kiekvieną Tm3 neuroną ir suskirstėme jį į vieną iš keturių klasių, atsižvelgiant į pavėsinės procentinę dalį, kurios trūko atliekant 19 kolonų rekonstrukciją. Rekonstruotos Tm3 ląstelės pilnai priėmė vidutiniškai iš šešių L1 neuronų. Ketvirtosios klasės Tm3 ląstelės, kurių didžioji dalis pavėsinės buvo už mūsų dominančio regiono ribų, vidutiniškai gaudavo tik du L1 neuronus. Susumavus trūkstamų L1 įėjimų dalį, pasvertą kiekvienai Tm3 klasei pateiktai T4 įvesties daliai, gauta kiekvienos T4 ( x x ) trūkstamos L1 įvesties (per Tm3 kanalą) svertinė dalis. ašis 5b pav., apačia). Mes taip pat panaudojome šią metriką, kad pateisintume T4 ląstelių pašalinimą, kai trūksta> 15% jų svertinių L1 įėjimų (per Tm3 kanalą), konstruodami vidutinius T4 ląstelių atsakymus su tomis pačiomis išvesties krypties nuostatomis (5b pav., Viršuje).

Dendrito orientacija

Po korektūros T4 arborizacijos M10 viduje buvo skeletuotos, pradedant nuo storiausios šakos centro, pritaikant ref. 59 su modifikuota svorio funkcija. Aksono šakos tašką nustatė Sh.T. kad būtų galima tiksliai nustatyti dendritinę medulos arborizacijos dalį. Buvo apskaičiuota vietinė orientacija aplink kiekvieną dendritinį mazgą (naudojant tris mazgus abiem kryptimis aplink kiekvieną mazgą ir ignoruojant visus mazgus, turinčius mažiau nei tris gretimus mazgus į abi puses). Kiekvieno T4 (6b pav.) Vyraujanti dendritinė šakos orientacija buvo apskaičiuota imant greitą Furjė (MATLAB ir statistikos priemonių rinkinys, R2012b versija) paskirstymą orientacijų pasiskirstymą mazguose ir apibrėžta kaip pagrindinio režimo fazė. transformacijos komponentas. Darant prielaidą, kad normalus ląstelių, priskirtų sluoksniui, pasiskirstymas (atsižvelgiant į jų aksonų apvalkalo gylį), mes apskaičiavome kiekvieno neišmatuoto T4, esančio kiekvienoje ląstelių grupėje, tikimybę, atsižvelgiant į jo išmatuotą dominuojančią orientaciją. Ląstelės T4-4 priskyrimas 1 sluoksniui buvo reikšmingas ( P <0, 05), tačiau kitų dviejų ląstelių priskyrimas nebuvo. Dendrinių pavėsinių (6a pav. Ir papildomas 5 pav.) Spalvų žemėlapis buvo parinktas susitelkiant spalvas į kiekvienos grupės dendrito šakos orientacijos vidurkį (6b pav.) Ir nuolat keičiant spalvas tarp grupių.

Prieiga prie duomenų

Paskelbdami visų langelių skeletai bus įkelti į //neuromorpho.org. Mes priimsime svetainę (//openwiki.janelia.org/wiki/display/flyem/Medulla+TEM+Reconstruction), kuri leis žiūrovui ieškoti konsensuso jungties, susijusios su prijungtomis neuronų poromis. Mes taip pat pateiksime visą segmentą su sinapsių komentarais, kartu su „Raveler“ norėdami atidaryti duomenų rinkinį, paprašius. Prašančioji šalis turės pateikti kietąjį diską.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Šioje rinkmenoje yra papildomi 1-6 paveikslai, papildomi metodai, 1-3 lentelės, visa legenda, pridedama prie papildomų duomenų bylos, visa vaizdo legenda ir papildomos nuorodos.

  2. 2.

    Papildomas paveikslas

    Šiame faile yra visa 1 papildomo paveikslo versija (visos legendos ieškokite papildomos informacijos faile, p. 1).

„Excel“ failai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

    Šiame faile yra visa 1 papildomos lentelės versija (paaiškinimą žr. Papildomos informacijos failo p. 16).

ZIP failai

  1. 1.

    Papildomi duomenys

    Šiame suarchyvuotame faile yra 1 papildomi duomenys - paaiškinimą skaitykite papildomos informacijos faile, p. 23).

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    Neurono rekonstrukcija

    Šis vaizdo įrašas rodo dominančios medulos srities EM vaizdų krūvą (1c pav.). Vaizdai iš kamino laipsniškai pašalinami (nukreipiami į gilesnius sluoksnius), o iš eilės pridedamos 379 neuronų rekonstrukcijos atsitiktinai parinktomis spalvomis. Neuronai yra suskirstyti į šešias klases, o tekstas, apibūdinantis klasę, pridedamas kartu su kiekvienos klasės neuronais: (1) fotoreceptorių gnybtai iš tinklainės ir laminatų neuronai, kurie inervuoja atskaitos stulpelį medulėje. (2) Neuronai, tiesiogiai gaunami iš tinklainės ir laminos neuronų. (3) Neuronai, tiesiogiai gaunantys iš (2) klasės neuronų. (4) Neuronai, kurie susiformuoja atskaitos stulpelyje, bet pasiskirsto keliose kolonose. (5) Tangencialiniai neuronai, iš kurių dažnai rekonstruojamas tik fragmentas, einantis per dominantį regioną. (6) Papildomi neuronai, dažnai tos pačios klasės kaip 1–5 klasių neuronai, bet iš gretimų kolonų.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.