Gyvybiškai svarbūs dažai padidina vidinės ribojančios membranos standumą | akis

Gyvybiškai svarbūs dažai padidina vidinės ribojančios membranos standumą | akis

Anonim

Dalykai

  • Histologija
  • Chirurgija

Anotacija

Tikslas

Įvertinti natūralios žmogaus vidinės ribojančios membranos (ILM) standumą ir įvertinti galimus mechaninių savybių pokyčius po dažymo briliantine mėlyna (BB) ir indocianino žalia (ICG).

Metodai

Neapdoroti ILM pavyzdžiai buvo gauti atliekant oftalmologines chirurgines procedūras. Nuėmus mėginius, jie buvo padalyti į penkias dalis. Du fragmentai buvo nudažyti atitinkamai BB ir ICG 1 min., Kiti du pavyzdžiai buvo nudažyti panašiai, o po to papildomai apšvietė naudojant standartinį šviesos šaltinį (PENTA LUX x 50, Ophthalmologische Systeme GmbH Fritz Ruck). Penktoji dalis tarnavo kaip neapdorota kontrolė. Tada visi bandiniai buvo analizuojami naudojant atominės jėgos mikroskopiją (AFM) kontaktiniu režimu, kurio skenavimo dažnis buvo 0, 6 Hz. Buvo pasirinkti du nuskaitymo plotai 10 × 10 μm ir standumas buvo nustatytas naudojant AFM jėgos spektroskopijos režimu. Jėgos kreivės buvo nubraižytos 5000 Hz dažniu. Visuose mėginiuose buvo analizuota tinklainės ir stiklakūnio pusės.

Rezultatai

Dėl dažymo žymiai padidėjo audinių standumas. Padidėjęs stiklakūnio (BB: P <0, 001; ICG: P <0, 01) ir tinklainės pusės (BB: P <0, 01; ICG: P <0, 01) padidėjimas, tinklainės pusė buvo žymiai stangresnė visoje kontrolėje ir dažyta. pavyzdžiai. Papildomas apšvietimas po dažymo dar labiau padidino audinių standumą daugumoje mėginių, tačiau nežymiai.

Išvados

Dažymas žymiai padidina žmogaus ILM standumą. Tai gali paaiškinti faktą, kad dažytą ILM galima lengviau pašalinti ir didesniais fragmentais atliekant stiklakūnio chirurgines procedūras, palyginti su nedažytu ILM.

Įvadas

Tarp stiklakūnio chirurgų yra plačiai pripažįstama, kad vidinės ribojančios membranos (ILM) pašalinimas atliekant traukos makulopatijų operacijas pagerina tiek funkcinę, tiek anatominę sėkmę 1, 2, 3, 4 ir gali padėti sumažinti ligos pasikartojimo dažnį. 4 ILM lupimas yra sudėtinga procedūra, reikalaujanti chirurginių įgūdžių ir patirties. Siekiant palengvinti šios skaidrios struktūros vizualizaciją ir sumažinti pernelyg ilgą bei ilgalaikį manipuliavimą tinklaine, per pastarąjį dešimtmetį buvo įvestos dažančiosios medžiagos. Pirmasis pasiūlytas dažiklis buvo cianino spalvos indocianino žaliasis (ICG) 5 2000 m. ICG tapo diskusijų objektu dėl jo galimo toksiškumo, greičiausiai susijusio su jo cheminiu nestabilumu ir eksperimentiniu būdu įrodytu šviesai jautriu poveikiu 6, 7, 8, 9, dėl kurių klinikinėje praktikoje gali atsirasti funkcinių trūkumų. 10, 11 Po kelerių metų blizgančiai mėlynasis triarilmetano dažiklis tapo prekyboje. Remiantis iki šiol paskelbtais klinikiniais ir eksperimentiniais tyrimais, atrodo, kad ryškiai mėlyna spalva yra geresnė, palyginti su ICG. 12, 13, 14, 15, 16 Visai neseniai atliktas lyginamasis tyrimas, vertinantis vidinės ir išorinės tinklainės mikrostruktūrą ir regos funkciją po geltonosios dėmės skylės operacijos, naudojant ryškiai mėlyną arba indocianino žalumą, atskleidė, kad pooperacinis regos aštrumas ir tinklainės jautrumas buvo geresni akyse po BBG. - pagalbinė vitrektomija. 17

Tačiau nepaisant to, kokius dažus chirurgas gali pasirinkti chirurginei intervencijai, pranešta, kad dažytas ILM suteikia padidintą standumą ir gali būti nulupamas lengviau ir didesniais fragmentais, palyginti su nedažytu audiniu. 15

Atominės jėgos mikroskopija (AFM) yra nusistovėjusi tyrimo metodika, kuri buvo naudojama žmogaus akių rūsio membranų, tokių kaip neišdžiūvęs ILM, storiui ir standumui matuoti. 18, 19 Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti ir kiekybiškai įvertinti žmogaus tinklainės ILM pokyčius po dažymo ryškiai mėlyna spalva arba ICG su vėlesniu apšvietimu ir be jo, naudojant standartinę chirurginę šviesą (PENTA LUX x 50, Ophthalmologische Systeme Šaltinis: GmbH Fritz Ruck, Eschweiler, Vokietija), palyginti su nenustatytu ILM naudojant AFM.

Metodai

Tyrimą patvirtino vietos institucijų peržiūros taryba.

Audinių paruošimas ir tvarkymas

Neapdoroto žmogaus ILM pavyzdžiai buvo gauti per stiklakūnio procedūras, skirtas gydyti geltonosios dėmės skyles ir epiretininę membraną. Vitreoretinalinė chirurgija susideda iš standartinės 23 vitrektomijos, užpakalinio stiklakūnio atsiskyrimo indukcijos ir, jei yra, epiretininių membranų pašalinimo, naudojant porą galinių, sugriebiančių 23 dydžio vėžių. Po to buvo nuvalytas neišdžiūvęs ILM (chirurgas AK), kuris iškart buvo įdėtas į BSS ir perduotas technikui (RS) tolimesniam perdirbimui.

Iš karto pašalinus iš akies, ILM pavyzdys buvo padėtas ant stiklinės stiklelio ir padalintas į penkias dalis. Kiekvienas gabalas buvo įdėtas į BSS lašelio vidų ant mikroskopo stiklelio (SuperFrost Plus, Gerhard Menzel GmbH, Braunšveigas, Vokietija), kuris buvo padengtas poli-L-lizinu. LŠT buvo lėtai pašalinta, kol membrana buvo atsargiai išlyginta ant stiklo, naudojant stiklinę adatą, vengiant bandinio dehidratacijos ruošimo metu. Tada aplink kiekvieną ILM fragmentą PAP pieštuku buvo nupieštas apskritimas. Tada po du fragmentus buvo įlašintas lašas brilianto mėlynos 0, 025% (Brilliant Peel; Fluoron GmbH, Neu-Ulm, Vokietija) arba žalios spalvos indocianino 0, 05%. ICG dažai buvo paruošti taip: 25 mg sausos ICG medžiagos (Pulsion, Miunchenas, Vokietija) pirmiausia buvo ištirpinta 5 ml steriliame vandenyje, kaip rekomendavo gamintojas. Tada vienas mikrolitras šio 0, 5% tirpalo buvo praskiedžiamas 9 ml BSS ir gauta 0, 05% galutinė koncentracija. Po to per daug dažų buvo nuplauti. Tada vienas iš šių pavyzdžių dar vieną minutę buvo apšviestas naudojant standartinį šviesos šaltinį, naudojamą vitreoretinalinėms operacijoms (PENTA LUX x 50, Ophthalmologische Systeme GmbH Fritz Ruck). Likęs neišdžiūvęs fragmentas tarnavo kaip kontrolė. Todėl atominės jėgos mikroskopija galėtų būti atlikta penkiuose kiekvieno bandinio fragmentuose: neapdorotame ir neišdžiūvusiame kontroliniame bandinyje: vienas po dažymo ryškiai mėlyna spalva, kitas po dažymo ryškiai mėlyna spalva ir po to sekantis apšvietimas, vienas po dažymo ICG, kitas po dažymo ICG. ir vėlesnis apšvietimas. Iš viso buvo ištirta 20 ILM mėginių kiekvienam dažikliui, tinklainės pusėje (BBG [ n = 8]; ICG ( n = 11)) ir stiklakūnio pusėje (BBG ( n = 12); ICG ( n = 9)). ) vertinamas atskirai.

ILM mėginiai taip pat buvo dažomi laminatu po AFM matavimų, kad būtų galima nustatyti stiklinės stiklelio orientaciją (stiklakūnio ar tinklainės pusę). Tuo tikslu ILM mėginiai pirmiausia buvo tris kartus plaunami 0, 01 molinio fosfato buferiniu druskos tirpalu (PBS). Antrame etape maždaug 15 minučių ant membranos buvo padėtas 120 μl 4% paraformaldehido lašelis. Po kito plovimo etapo buvo pridėta 120 μl laminino žymėjimo antikūno 1: 100 (Polikloninis triušio antilamininas, Dako Deutschland GmbH, Hamburgas, Vokietija), ir mėginys 24 valandas buvo laikomas drėgmės dėžutėje 8 ° C temperatūroje. Po to buvo atliktas trečias skalbimo etapas, po kurio dažytas 100 μl cit3 fluorescencinių dažais sujungto antrinio antikūno 1: 100 (Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) -Cy3, Dianova GmbH, Hamburg, Germany), kuris buvo užteptas. 45 min. Visi mėginiai buvo dar kartą išplauti PBS ir 20 μl montažinės terpės (Fluorescence Mounting Medium, Dako Deutschland GmbH) užpilama ILM, po to uždengiama apvaliu dangtelio šleifu ir leista sukietėti kambario temperatūroje maždaug 3 valandas.

Visi ILM bandiniai taip pat buvo įvertinti naudojant fluorescencinį mikroskopą. Visi fluorescencinių vaizdų eksperimentai buvo atlikti naudojant „Axiovert 25“ inversijos fluorescencinį mikroskopą (Carl Zeiss AG; Oberkochen, Vokietija). Kaip šviesos šaltinis buvo naudojama gyvsidabrio garų lempa (HBO 50; Osram, Miunchenas, Vokietija). Naudojant sužadinimo filtrą ET545 / 25x (Chroma; Taoyuan Hsien, Taivanas), buvo parinkta 546 nm gyvsidabrio spektro smailė. Pro objektyvą (Fluar 10x / 0, 50; Carl Zeiss AG) šviesa atsispindėjo dichroziniame T565LP (Chroma) ant mėginio ir sužadino etiketėje naudojamą cy3 dažą. Skleidžiama šviesa praėjo pro dichroic, praleido emisijos filtrą ET605 / 70 m (Chroma) ir buvo aptinkama naudojant CCD kamerą (Infinity 2; BFI Optilas; Dietzenbach, Vokietija) ir apdorota kompiuteriu. Fotoaparatą valdė programinė įranga „Infinity Capture 5.0.0“ („Lumenera“, Leipcigas, Vokietija).

Atominės jėgos mikroskopijos matavimai

Visi AFM vaizdavimo ir jėgos įtraukimo eksperimentai buvo atlikti naudojant „Nanowizard II“ atominės jėgos mikroskopą (JPK Instruments, Berlynas, Vokietija), kuris buvo sumontuotas ant apverstos mikroskopo. Vaizdo gavimui ir standumo matavimui naudojant „Nanowizard II AFM“, standartinius trikampio formos silicio nitrido tvirtinimo elementus (MLCT, „Veeco Instruments“, Plainview, NY, JAV) su integruotais aštriais silicio-nitrido piramidės antgaliais (vardinė spyruoklės konstanta k = 0, 1 N / m, viršūnės kampas α ∼). 35 °). Prieš kiekvieną matavimą, naudojant šiluminių svyravimų metodą, buvo nustatyta spyruoklės pastovioji vertė. Mėginiai buvo vaizduojami kontaktiniu režimu, kurio nuskaitymo dažnis buvo 0, 6 Hz, laikant PBS kambario temperatūroje. Mėginiui buvo parinkti du 10 × 10 μm nuskaitymo regionai. Standumas buvo nustatytas naudojant AFM jėgos spektroskopijos režimu. Trumpai tariant, įpjovos buvo padarytos per 8 × 8 taškų tinklelį vieno apkrovos / iškrovimo ciklo greičiu per 2, 4 s, maksimalia apkrova 5 nN. Jėgos kreivės buvo nubraižytos artėjant 3 μ m / s greičiui, įtraukimo greičiui 7 μ m / s ir duomenų perdavimo dažniui 5000 Hz. Kiekvienos jėgos įtraukimo kreivės dinaminio įdubimo modulio E įvertinimas buvo nubraižytas atsijungus, naudojant duomenų apdorojimo programinę įrangą (JPK Instruments AG). Todėl nuskaitymo sričių aukščio duomenys buvo apskaičiuoti pagal mėginio atskyrimą ir nubraižyti atsižvelgiant į įspaudimo jėgą. Pritaikius Sneddon modelį 19 duomenims, gauto elastingumo modulis buvo vidurkinamas kiekvienai skenavimo sričiai.

Elastingos medžiagos standumas apskaičiuojamas pagal Youngo modulį (tempimo modulį, elastingumo modulį, tamprumo modulį) - medžiagos savybę, naudojamą medžiagoms apibūdinti. Youngo modulio SI vienetas yra paskalis (Pa arba N m - 2 ).

ILM mėginio orientacijos nustatymas

Matavimų metu reikėjo nustatyti mėginio orientaciją ant stiklo stiklelio. Preliminarūs ILM pavyzdžių, nudažytų per vitreoretinalinę operaciją žmogaus akyje ir išimtų analizei, matavimai patvirtino, kad ILM tinklainės ir stiklakūnio pusės elastingumas skiriasi, kaip aprašyta literatūroje. 20, 21 Todėl norint gauti patikimus rezultatus, labai svarbu patikimai nustatyti ILM pavyzdžių orientaciją kiekviename matavime. Mūsų tyrime AFM vaizdavimas buvo naudojamas norint aiškiai nustatyti grubų tinklainės paviršių ir lygų stiklakūnio paviršių kaip topografinius orientyrus (1a pav.).

Image

a) AFM kontaktinio režimo vaizdai, kurių dydis yra 80 × 20 μm iš abiejų ILM pusių. Lygią stiklakūnio pusę galima aiškiai atskirti nuo šiurkščiosios ir negimdytos tinklainės pusės (tinklainės šiurkštumas: 9075 nm, stiklakmens: 2672 nm). Deformacijos signalas rodomas nm vienetais. b) ILM dažomas laminatu ir atvaizduojamas naudojant fluorescencinę mikroskopiją (padidinimas: 10). Lygią stiklakūnį ir šiurkščią tinklainės pusę galima lengvai nustatyti. ILM mėginys iš dalies apverstas, todėl galima įvertinti abiejų pusių skirtumą.

Visas dydis

Buvo atlikti papildomi teisingos audinių orientacijos testai, naudojant laminino dažymo protokolą ir po to sekančią fluorescencinę mikroskopiją (1b pav.). Tai buvo atlikta gavus AFM matavimus, siekiant pašalinti galimą mikroskopo apšvietimo poveikį rezultatui.

Rezultatai

ILM mėginių dažymas sąlygojo statistiškai reikšmingą audinių tvirtumo padidėjimą, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis (2 paveikslas). Pažymėtina, kad visų mėginių, tiek kontrolinio, tiek dažyto audinio, tinklainės paviršius buvo maždaug penkis kartus tvirtesnis nei stiklakūnio. Palyginti su nenustatytais ILM kontroliais, audinio standumas žymiai padidėjo, naudojant dažymą briliantiniu mėlynu arba ICG. Tai buvo teisinga tiek stiklakūnio paviršiui (BBG: P <0, 001; ICG: P <0, 01), tiek tinklainės paviršiui (BBG: P <0, 01; ICG: P <0, 01). Standumo skirtumas, palyginti su tinklaine ir stiklakmens paviršiumi, lyginant su kontrolinėmis medžiagomis, išliko nepakitęs po audinio dažymo ir vėlesnio apšvietimo. Apskaičiavus kiekvieną dažiklį, pastebima tendencija, kad apšviesdamas dažytą audinį dar labiau padidėja standumas, tačiau šis poveikis nepasiekė statistiškai reikšmingo lygio (2 paveikslas, 1 lentelė). Palyginus du dažus po apšvietimo, buvo pastebėti statistiniai skirtumai priklausomai nuo to, kuri pusė buvo matuojama (BBL, palyginti su ICGL, matuojamu stiklakūnio pusėje, 1 lentelė).

Image

Visų ILM žemėlapio rezultatų vidurkiai yra nubraižyti išmatuotosios pusės atžvilgiu (stiklakūnis: mėlynas; tinklainė: raudona), su klaidų juostomis parodyta vidurkio SE. Nurodytos P vertės turi reikšmingą 5% lygį ir yra apskaičiuojamos pagal t- testą. BB, ryškiai mėlyna; BBL, ryškiai mėlynas ir apšvietimas; ICG, žalias indocianino; ICGL, žalia indocianino spalva ir apšvietimas; WT, valdymas. Skirtumai tarp kontrolinės (WT) ir BBL bei ICGL taip pat buvo reikšmingi tiek tinklainei, tiek stiklakūnio paviršiui.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Santykiniai elastingumo pokyčiai ir apšvietimo poveikis

Palygindami Youngo modulius atitinkamo kontrolinio mėginio atžvilgiu, mes pastebėjome, kad, išskyrus ILM pavyzdžius po ryškiai mėlyno dažymo ir apšvietimo (BBL), stiklakūnio pusės santykinis elastingumo pokytis buvo ryškesnis, palyginti su tinklainės puse (3 paveikslas, 2 lentelė). ). Pažymėtina, kad ICG vertės su apšvietimu ir be jo buvo didesnės, palyginti su ryškiai mėlyna spalva ILM bandiniuose. Be to, išskyrus BB / BBL, dažytų bandinių santykinis elastingumas padidėjo 1, 2 karto po apšvietimo (tinklainės paviršius: 1, 18 ± 0, 02 BB / BBL, 1, 23 ± 0, 04, kai naudojama ICG / ICGL; stiklakūnio pusė: 0, 69 ± 0, 05, jei buvo BB) / BBL ir 1, 21 ± 0, 01, naudojant ICG / ICGL). Tai reiškia papildomą audinio sustingimą po apšvietimo, kuris nebuvo statistiškai reikšmingas. Visų dažų ir audinių (išskyrus stiklakūnio BBL) gradientas buvo maždaug 1, 2 (3 lentelė).

Image

Santykiniai ILM elastingumo pokyčiai, išmatuoti stiklakūnio ir tinklainės audinio pusėje. BB, ryškiai mėlyna; BBL, ryškiai mėlynas ir apšvietimas; ICG, žalias indocianino; ICGL, žalia indocianino spalva ir apšvietimas; WT, valdymas.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Tinklainės ILM yra daugiasluoksnė struktūra, daugiausia susidedanti iš IV tipo kolageno, laminino ir fibronektino ir iš esmės atspindi Miulerio ląstelių bazinę membraną. Nors vidinis ILM stiklakūnio paviršius atrodo lygus, ILM išorinis tinklainės paviršius yra grubus, negultas, o pastebėjimas labiausiai pastebimas užpakaliniame poliuje. Šis morfologinis skirtumas padeda nustatyti atitinkamą ILM pusę histologiniuose mėginiuose, kaip buvo atlikta šiame tyrime, ir padeda koreliuoti ILM pavyzdžius atsižvelgiant į jų lokalizaciją. ILM yra prigludęs prie stiklakūnio žievės II tipo kolageno skaidulų, padedančių stiklakūnio traukos jėgoms perduoti į tinklainės paviršių, prisidedant prie kelių traukiamųjų makulopatijų, tokių kaip geltonosios dėmės, geltonosios dėmės ar vitreoretininės traukos sindromas, patogenezės. Todėl ILM pašalinimas laikomas svarbiu žingsniu sėkmingai gydyti šias ligas ir užkirsti kelią pasikartojimams, kad būtų pašalintos visos su ILM susijusios traukos jėgos.

Pažymėtina, kad ILM yra labai subtili, įvairaus storio struktūra, užpakalinė (0, 5–3, 2 μm ) ir plonesnė fovea ir diske (0, 01–0, 10 μ m). 23 ILM yra stebėtinai nelanksti struktūra. Ankstesni AFM tyrimai parodė, kad mechaninis stiprumas yra mPa diapazone, labai panašus į sąnario kremzlę ir maždaug 1000 kartų stipresnis nei ląstelių sluoksniai. 18, 24, 25 Mūsų rezultatai pabrėžia ankstesnes ataskaitas 20, kuriose aprašyta, kad vidutinis ILM standumas tinklainės pusėje yra daugiau nei penkis kartus didesnis, palyginti su stiklakūnio puse. Šis skirtumas gražiai paaiškina tai, kad ILM lupdamasi kreivėja link stiklakūnio. Didelis natūralaus, nedažyto ILM mechaninis stiprumas suteikia galimybę sugriebti ILM, naudojant galinius griebtuvus, ir mechaniškai nuimti ILM nuo apatinio nervų pluošto sluoksnio.

Kaip nepadorus, neišdildytas ILM lupimas reikalauja didelių chirurginių įgūdžių. Pastaruosius metus buvo įvestos dažančiosios medžiagos, kurios labai palengvina ILM vizualizaciją ir pašalinimą per stiklakūnio operacijas. Abu klinikiniai dažai, ICG ir BBG, suteikia selektyvių dažymo savybių ir pakankamai gerą kontrastą ILM atpažinti ir nulupti. ILM dažymo pranašumas yra akivaizdus. Manoma, kad geresnis vizualizavimas palengvins pašalinimą nepažeidžiant apatinio nervų pluošto sluoksnio, o pooperaciniai rezultatai bus geresni.

Tačiau tai, kaip dažnai pranešama apie intraoperacinį stebėjimą, yra tas, kad dažytą ILM galima nulupti lengviau ir didesniuose fragmentuose, palyginti su nedažytu ILM. Remdamiesi šiuo tyrimu mes iškėlėme hipotezę, kad egzistuoja specifinė audinių dažų sąveika, padidinanti ILM standumą, ir darome išvadą, kad pastebėtas standumo pokytis yra labai tikėtinas paaiškinimas palengvinančiam ILM pašalinimą po dažymo. Vartojant ICG, poveikis atrodo ryškesnis, palyginti su BBG. Įdomu tai, kad apšvietimas naudojant standartinį chirurginį šviesos šaltinį nepadarė reikšmingo efekto dar labiau padidindamas audinio standumą. Tačiau, išskyrus ryškiai mėlyną, apšvietimas padidino standumą visuose tirtuose audiniuose ir nepriklausomai nuo išmatuoto paviršiaus labai nuosekliai 1, 2 karto. Įdomu tai, kad elastingumo pokytis buvo ryškesnis stiklakūnio pusėje, palyginti su tinklainės puse. Tai galima paaiškinti tuo, kad ant mėginio stiklakūnio pusės yra lipni kolageno likučiai, kurie po dažymo dažikliu dar labiau padidina standinimo efektą.

Galima teigti, kad lengvesnis pašalinimas po dažymo yra susijęs tik su geresniu ILM vizualizavimu. Geresnis vizualizavimas, be abejo, padeda nustatyti ILM ir inicijuoti lupimą teisingoje dissekcijos plokštumoje, tačiau nepaaiškina pakitusių mechaninių savybių. Kaip alternatyva, galima manyti, kad sumažėjęs dažyto ILM sukibimas, tai reiškia, kad dėl naudojamo dažiklio pasikeičia skilimo plokštuma arba ILM atsipalaiduoja nuo apatinio nervų pluošto sluoksnio. Kaip galimas su ICG susijusio fototoksiškumo poveikis skilimo plokštumos pakeitimo klausimas buvo išsamiai aptariamas literatūroje. 10, 26 Atsižvelgiant į šį tyrimą ir jo rezultatus, šią hipotezę reikia paneigti, nes BB ir ICG atskleidžia gana panašius pokyčius, susijusius su jų mechaninėmis savybėmis, ir BB fototoksiškumas nežinomas (žr. Toliau).

Tačiau šiame tyrime aprašytas stebėjimų mechanizmas išlieka hipotetinis. Pažvelgus į paskelbtą literatūrą, yra keletas tyrimų, apibūdinančių ILM mechaninių savybių pasikeitimą po dažymo: Dėl ICG, Wollensak ir kt. 27, 28 pranešė apie padidėjusį ICG dažyto ILM standumą po 3 minučių apšviestos dažytos pomirtinės kiaulės tinklainės apšvietimo, parodydamos, kad reikšminga galutinės jėgos padidėjimas - 45%, o maksimalus pailgėjimas - 24%. Įdomu tai, kad tokio efekto nebuvo galima pamatyti be vėlesnio apšvietimo, o tai rodo, kad procesas priklauso nuo šviesos. Todėl jie padarė išvadą, kad stiprėjantis ICG poveikis kartu su šviesa yra susijęs su fotojautrinančiu ICG efektu, nes susidaro ICG molekulės trigubos būsenos ir reaguojančios deguonies rūšys (I tipo fotooksidacijos reakcija). 27, 29 reaktyviosios deguonies rūšys lemia ląstelių fotooksidacinę žalą ir kolageno skaidulų, tokių kaip ILM IV tipo kolagenas, fizinį kryžminimą. 27, 28, 30 Tačiau mūsų pačių eksperimentuose naudojant AFM šviežiame žmogaus audinyje, padidėjo standumas ir ICG be vėlesnio apšvietimo, galbūt todėl, kad bandiniai nebuvo laikomi tamsoje, kaip aprašyta Wollensako eksperimentinėje aplinkoje. 27 Visuotinai pripažįstama, kad galimas toksinis ICG 10, 11, 31, 32 poveikis, kaip aprašyta kliniškai, yra labai tikėtinas dėl anksčiau aprašytų ICG fotosensibilizuojančių savybių ir ICG molekulės skilimo produktų po apšvietimo. 7, 8, 33

Svarbu tai, kad kitos papildomos susijusios audinių ir dažų sąveikos, atrodo, turi priežastinį poveikį padidėjusiam audinių standumui, nes padidėjęs standumas BBG buvo pastebėtas ir mūsų eksperimentuose. Priešingai nei ICG, triarilmetano dažiklis BBG neturi šviesą jautrinančių savybių. Šis pastebėjimas yra svarbus, nes atliekant geltonosios dėmės skylės operaciją gautus ICG dažytų ILM pavyzdžių histologinius vertinimus paaiškėjo, kad akivaizdus tinklainės nuosėdų ir didelių ląstelių fragmentų, prilipusių prie ILM tinklainės paviršiaus, buvimas. 10 Kadangi tokių plačių ląstelių komponentų nebuvo pastebėta prieš naudojant ICG geltonosios dėmės chirurgijoje, buvo iškelta hipotezė, kad ląstelinės medžiagos buvimas įvyko dėl ICG sukeltos skilimo plokštumos nuo ILM tinklainės paviršiaus pokyčio į vidiniai tinklainės sluoksniai. 26 Nors po ICG dažymo buvo pastebėti dideli tinklainės ląstelių fragmentai, mažesnio laipsnio ląstelių tinklainės fragmentai taip pat buvo pastebėti, kai ICG nebuvo naudojamas dažymui, o fragmentai pasirodė tik sulankstyto ILM vietose pavyzdžiuose, gautuose atliekant epimakulinės membranos operaciją. Buvo pasiūlyta, kad šis pastebėjimas gali būti susijęs su padidėjusiu daugiasluoksnės struktūros, tokios kaip epimakulinė membrana, tvirtumu, palyginti su pliku ILM, o tinklainės nuolaužos buvo aiškinamos kaip mechaninės traumos lupimo metu rezultatas. 34 Sub-ILM pokyčius ląstelių fragmentų atžvilgiu patvirtino neseniai atliktas Hiscott ir jo kolegų tyrimas 35, kuriame teigiama, kad atskyrimo plokštuma ILM lupimo metu gali būti pakeista epiretinalinės membranos chirurgijos metu. Jie padarė išvadą, kad šis pokytis nėra susijęs su dažų naudojimu, bet turėtų būti aiškinamas kaip ERM susidarymas ar ERM sukelianti patologija, tokia kaip GFAP moduliacija Miulerio ląstelėse ar tęstinumas tarp epimakulinių membranų komponentų. ir tinklainė per ILM poras, kurios gali padidinti sukibimo jėgas tarp šių ląstelių ir ILM. 35, 36 Be to, galima kelti hipotezę, kad epiretininė membrana, kuri yra nulupta kartu su pamatiniu ILM, yra standesnė, palyginti su vien ILM, kuri pašalinama atliekant geltonosios dėmės operaciją. Vis dėlto, kartu sudėjus aprašytą ląstelių sąveiką ir padidėjusio dažyto ILM standumo pastebėjimus, nesvarbu, kuris dažiklis yra naudojamas, yra visiškai suprantama, kad padidėja tikimybė pakeisti skilimo plokštumą per stiklakūnio operacijas tiek epimakulinėms membranoms, tiek geltonosios dėmės skylių vidiniams tinklainės sluoksniams, nes standumą keičia arba epimakulinis audinys, arba naudojant tam tikrus gyvybiškai svarbius dažus.

Šis tyrimas turi tam tikrų trūkumų. Reikia atsižvelgti į tai, kad AFM suteikia audinio paviršiaus matavimus, kurių skvarba yra ribota. Yra žinoma, kad tiek ICG, tiek BB neprasiskverbia į ILM, dažymo poveikis yra tik audinio paviršiuje. Todėl standinantis poveikis, matuojamas AFM, gali būti ryškesnis dažyto audinio paviršiuje. Be to, čia atlikti AFM matavimai neatspindi tiesioginių ILM tempiamojo stiprio pokyčių matavimų. Nepaisant to, kadangi ILM parodo netaisyklingo struktūros įvairių pluoštų tinklelį, galima perkelti mūsų išvadas ir daryti išvadą, kad paviršiaus išmatuotas standumo padidėjimas yra susijęs su tempimo stiprio padidėjimu, kuris neatlaikytų reguliariai struktūruotų audinių.

Atsižvelgiant į šį tyrimą, bus įdomu įvertinti galimą skirtingų dažų koncentracijų ir poveikio trukmių įtaką. Be to, galimas pacientų amžiaus ar lyties, taip pat kitų pagrindinių ligų poveikis gali būti įvertintas didesniu imties dydžiu.