Wss45, sulfatinis α-d-gliukanas, stipriai įsiterpia į dengės karštligės 2 viruso infekciją in vitro acta pharmaologica sinica

Wss45, sulfatinis α-d-gliukanas, stipriai įsiterpia į dengės karštligės 2 viruso infekciją in vitro acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Norėdami ištirti WSS45, vieno α- D- gliukano sulfato darinio, gauto iš Gastrodia elata Bl, veikimą dengės karštligės viruso 2 serotipo (DV2) dauginimosi cikle, įskaitant pradinę infekciją ir ląstelių replikaciją.

Metodai:

Viruso dauginimasis BHK ląstelėse buvo stebimas naudojant qRT-PGR, plokštelių redukcijos tyrimą ir srauto citometriją. Pradinė viruso infekcija buvo padalinta į adsorbcijos ir skverbimosi veiksmus paverčiant temperatūrą ir apdorojant rūgšties glicinu. Paviršiuje surišti virusai buvo aptikti dažant imunofluorescenciniu būdu „Evelope“ baltymui.

Rezultatai:

Labai ankstyvoje viruso ciklo stadijoje WSS45 veiksmingai slopino DV2 infekciją BHK ląstelėse, kurių EC50 vertė buvo 0, 68 ± 0, 17 μg / ml, daugiausia trukdė viruso adsorbcijai. Tačiau WSS45 nepasižymėjo viricidiniu poveikiu. Be to, WSS45 gali padidinti viruso atsiribojimą nuo ląstelių paviršiaus BHK ląstelių linijoje.

Išvada:

WSS45 padarė stiprų slopinantį poveikį DV2, trukdydamas virusų ir tikslinių ląstelių sąveikai. Šis aktyvumas buvo susijęs su jo molekuliniu dydžiu.

Įvadas

Flavivirusas yra Flaviviridae šeimos gentis, kurią sudaro beveik 80 narių. Dauguma flavivirusų yra nariuotakojų platinami virusai, sukeliantys sunkias žmonių ligas, įskaitant geltonosios karštinės virusą (YFV), dengės karštligės virusą (DV), Vakarų Nilo virusą (WNV) ir japonų encefalito virusą (JEV). Tarp šių virusų DV pastaraisiais metais vėl tapo vis svarbesniu patogenu, paveikiančiu atogrąžų ir subtropikų šalis - kiekvienais metais užkrėstų beveik 50 milijonų ir daugiau kaip 2, 5 milijardo žmonių rizikuoja 1 . Gamtoje cirkuliuoja keturi serologiškai skirtingi dengės karštligės virusai, vadinami DV1 – DV4. Visi šie virusai žmonėms gali būti perduodami dviejų rūšių uodų: Aedes aegypti ir Aedes albopictus . Užsikrėtimas DV sukelia platų klinikinių ligų spektrą, pradedant tylia infekcija ir baigiant lengvu karščiavimu, savaiminiu ribotu ūmiu sindromu, vadinamu dengės karštligės karščiavimu (DF) arba sunkia ir dažnai mirtina dengės karštligės hemoragine liga (DHF) ir dengės karštligės šoko sindromu (DSS). . Nepaisant to, kad visame pasaulyje daugėja dengės karštligės infekcijų, šiuo metu nėra nei profilaktikos, nei specifinio gydymo, kad būtų galima išgydyti ligą. Taigi skubiai reikia naujų vaistų, kurie galėtų kontroliuoti ar išgydyti atsirandančią DV infekciją.

DV virionai turi apvalkalą su apvalkalu, kuriame yra vienos grandinės teigiamo pojūčio RNR, kurio ilgis yra maždaug 11 kb. Viruso genomą būtų galima paversti poliproteinu, kurį nuosekliai galėtų perdirbti virusai ir (arba) šeimininkai fermentai, kad būtų sukurti trys struktūriniai baltymai [kapsido (C), membraninis baltymas (M) ir apvalkalo (E) baltymas] ir septyni nestruktūriniai baltymai ( NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ir NS5) 2 . Tarp trijų struktūrinių baltymų E baltymas yra membrana, įtvirtinanti glikoproteiną subrendusio dengės dengės denio viriono paviršiuje, ir jis turi du numanomus glikozaminoglikano (GAG) surišimo motyvus 3 karboksilo gale. Šis E baltymas formuoja oligomerus su mažu membranos baltymu (M) ir sudaro didžiąją dalį prieinamo viriono paviršiaus.

Viruso dauginimasis prasideda viruso pritvirtinimu prie ląstelės-šeimininkės paviršiaus, po to įsiskverbimas į citoplazmą genomo perdavimui. Tyrėjai atskleidė faktą, kad E baltymas yra būtinas ląstelių prijungimui ir membranų suliejimui, kuris tarpininkauja virusinei infekcijai 4 . Virusinės infekcijos blokavimas yra vertinga antivirusinė strategija, nes ji leidžia nustatyti pirmą ir bene veiksmingiausią barjerą, siekiant užkirsti kelią dauginimuisi.

Tyrimai naudojant elektroninę mikroskopiją parodė, kad dengės karštligės viruso prijungimas yra nuo temperatūros nepriklausomas procesas, vykstantis tiek 4, tiek 37 ° C temperatūroje, tuo tarpu viruso įsiskverbimas vyksta tik esant 37 ° C 5 . Po prasiskverbimo neįsiskverbęs virusas bus inaktyvuotas apdorojant rūgšties glicino buferiu (pH 3, 0) 6 . Išgyvenę virusai sugeba sudaryti plokšteles arba ekspresuoti virusinius antigenus.

Šiuo metu sulfatiniai polisacharidai yra laikomi perspektyviais antivirusiniais junginiais prieš daugelį virusų in vitro 7, 8 . Šiame tyrime mes pranešame apie sulfatuotą polisacharidą WSS45, gautą iš naujo α- D- gliukano iš Gastrodia elata Bl 9, kuris yra gerai žinomas ir plačiai naudojamas tradicinis kinų žolinis augalas, kaip galimą antivirusinį agentą. Mūsų rezultatai rodo, kad WSS45 smarkiai trukdė viruso adsorbcijai šeimininko ląstelių paviršiuje. Tačiau WSS45 hidrolizatas smarkiai prarado anti-DV2 aktyvumą, o tai reiškia tinkamos molekulinės struktūros ryšį su antivirusiniu aktyvumu. Be to, WSS45 gali paveikti viruso apvalkalo baltymo ir specifinių receptorių, esančių ląstelės šeimininko paviršiuje, sąveiką, paskatindamas virusą atsiriboti nuo ląstelės paviršiaus.

medžiagos ir metodai

Ląstelės ir virusas

C 6/36 ląstelių linija iš A albopictus buvo auginama 28 ° C temperatūroje, esant 5% CO 2 minimalioje būtinoje terpėje (MEM, Gibco), turinčioje 10% RPMI 1640, papildyta 5% vaisiaus galvijų serumu (FBS, Hyclone). BHK (kūdikio žiurkėno inksto ląstelės) ląstelės buvo dauginamos MEM su nebūtina aminorūgštimi (NEAA), papildyta 10% FBS 37 ° C, 5% CO 2 . Palaikomosios terpės aukščiau minėtų ląstelių linijų koncentracija serume buvo sumažinta iki 2%.

Dengės dengės viruso viruso 2 serotipas (NGC padermė, DV2) buvo dauginamas C 6/36 ląstelėse. Norint gauti koncentruoto viruso atsargas, C6/36 ląstelės buvo užkrėstos DV2, o supernatantai buvo surinkti praėjus 6 dienoms po užkrėtimo. Po skaidrinimo mažu greičiu centrifuguojant, supernatantai buvo sukoncentruoti granuliuojant 2 valandas 100 000 x g . Tada nuosėdos buvo resuspenduotos TNE buferyje (Tris 10 mmol / L, NaCl 100 mmol / L, EDTA 1 mmol / L) ir laikomos -80 ° C temperatūroje.

Viruso atsargos buvo tirštos BHK ląstelėse 10 . Trumpai tariant, BHK ląstelės, išaugintos 6 šulinėlių plokštelėse, buvo užkrėstos DV2 serijiniu praskiedimu 10 kartų. Po viruso užkrėtimo 2 valandas BHK ląstelės buvo perdengtos perdengimo terpe, turinčia 1% metilceliuliozės ir 2% FBS. Kultūros buvo toliau inkubuojamos 4 dienas, po fiksavimo ir kristaliniu dažymu nuskaitytas viruso apnašas.

Junginiai

WSS45 yra vieno naujo α- D- gliukano sulfato darinys, išgautas iš Gastrodia elata Bl 9 . Cheminė struktūra parodyta 1 paveiksle. Junginyje buvo nustatyta viena simetriška smailė (duomenys nepateikti) atliekant aukštos kokybės gelio skvarbos chromatografiją (HPGPC). Grynumas buvo ≥95%. Junginiai buvo ištirpinti dejonizuotame vandenyje 10 mg / ml pradiniame tirpale ir laikomi –20 ° C temperatūroje.

Image

WSS45 struktūra.

Visas dydis

Mikofenolio rūgštis (MPA) buvo įsigyta iš „Sigma“ ir ištirpinta vandenyje.

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromidu; Sigma-Aldrich] metodas. Trumpai tariant, BHK ląstelės buvo kultivuojamos trimis egzemplioriais 48 valandas su skirtingomis junginių koncentracijomis. Ląstelės, auginamos vien tik terpėje, buvo naudojamos kaip kontrolė. MTT (galutinė koncentracija 2, 5 mg / ml) reagentas pridedamas 4 valandas prieš auginimo pabaigą, o tada ląstelės lizuojamos 10% natrio dodecilsulfatu (SDS), 50% N , N -dimetilformamidu, pH 7, 2. OD vertės buvo nuskaitytos ties 570 nm ir buvo apskaičiuotas ląstelių žūties procentas. 50% citotoksiškumo koncentracija (CC 50 ) buvo apskaičiuota kaip junginio koncentracija, reikalinga ląstelių gyvybingumui sumažinti 50%.

Virusų RNR kiekybinis įvertinimas

Tarpląstelinė virusinė RNR buvo ekstrahuota naudojant RNR paprasto RNR ekstrahavimo rinkinį, o visa Virusinė RNR supernatante buvo ekstrahuota naudojant TIANamp viruso DNR / RNR ekstrahavimo rinkinį (Tiagen, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. RNR buvo išplauta 25 μL DEPC apdorotu vandeniu. Dalis viruso atsargų skysčio (1 × 107 PFU / ml) buvo 10 kartų serijiniu būdu praskiedžiami ir ekstrahuojami lygiagrečiai, kad tarnautų kaip RNR kontrolė. Prieš atvirkštinę transkripciją RNR tirpalas ir antisense pradmenų mišinys buvo inkubuotas 70 ° C temperatūroje 5 minutes ir atšaldytas ant ledo. 20 μL reakcijos mišinyje buvo 8 μL ekstrahuotos RNR, 1 μmol / L DV2.L1, 1 × reakcijos buferis (Promega, JAV), 2 U MMLV atvirkštinė transkriptazė (Promega, JAV), 300 μmol / l kiekvieno dezoksiribonukleozido (dNTP). ir 5 mmol / L Mg2 + . Atvirkštinė transkripcija buvo atlikta 37 ° C temperatūroje 1, 5 val., Po to 5 min. - 94 ° C, kad denatūruotų atvirkštinę transkriptazę. Dengue 2 specifinio fluorogeninio zondo (DV2.P1) ir pora jungiamųjų pradmenų (DV2.L1 ir DV2.U2) (sintezuotojo Šanchajaus „Sangon Biotechnology Co, Ltd“) sekos buvo parodytos taip: DV2.P1 (nukleotidai 10 653–3). 10 678), 5′-CTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCA-3 ′; DV2.L1 (nukleotidai 10 558–10 579), 5′-CATTCCATTTTCTGGCGTTCT-3 ′; DV2.U2 (nukleotidai 10 680–10 700), 5′-AAGGTGAGATGAAGCTGTAGTCTC-3 ′; DV2.P1 sudaro oligonukleotidų seka, parodyta naudojant dažiklį 5'-reporteris (FAM, 6-karboksi-fluoresceinas) ir pasroviui esantį 3'-gesinimo dažą (TAMRA, 6-karboksi-tetrametil-rodamiinas).

Realaus laiko PGR reakcijos buvo atliktos 20 μL tūrio, turinčio 2 μL cDNR šabloną, 1 x realaus laiko PGR buferio (TaKaRa, Japonija), 0, 05 U Ex Taq HS DNR polimerazės (TaKaRa, Japonija), 4 mmol / l Mg. 2+, 400 nmol / L dNTP, 400 nmol / L kiekviename pojūtyje ir antisense pradmuo bei 200 nmol / L fluorogeninis zondas. PGR mišiniai buvo iš anksto inkubuojami 50 ° C temperatūroje 1 min., Po to 93 ° C temperatūroje 1 min., Po to sekė 45 dviejų etapų inkubavimo ciklai 5 min. 95 ° C temperatūroje ir 1 min. 60 ° C temperatūroje. Duomenys buvo surinkti ir išanalizuoti naudojant „MJ Opticon Monitor 2“ sistemą.

Viruso RNR lygis buvo nustatytas pagal standartinę viruso subgenominės RNR praskiedimo kreivę. Norint nustatyti ląstelėje užfiksuotą virusinę RNR, tuo pačiu metu buvo įvertinta ląstelių talpinimo GAPDH mRNR, siekiant normalizuoti ląstelių viruso RNR.

Virusų užkrečiamumo tyrimas

Atliekant apnašų redukcijos testą, BHK ląstelės, užaugintos 6 šulinėlių plokštelėse, buvo užkrėstos maždaug 100 PFU / šulinio DV2, nesant serijos praskiestų junginių. Junginiai buvo dedami kartu su DV2 infekcija arba po 2 valandų (po užkrėtimo). Po dar 2 valandų inkubacijos ląstelės buvo plaunamos ir apdengtos MEM, turinčia 1% metilceliuliozės ir 2% FBS. Kultūros buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 4 dienas ir buvo suskaičiuotos virusinės plokštelės. Visi nustatymai buvo atlikti du kartus ir kiekvienas po du kartus. Slopinimas buvo apskaičiuojamas taip: slopinimas (%) = (kontrolinis skaičius - bandymo skaičius) / kontrolinis skaičius × 100%.

Atliekant viruso derlingumo slopinimą, BHK ląstelės buvo užkrėstos DV2 (MOI = 0, 1) esant skirtingoms junginių koncentracijoms. WSS45 buvo naudojamas esant 10, 1 ir 0, 1 μg / ml. Mikofenolio rūgštis, naudojama kaip auksinė kontrolė, buvo naudojama 1 μg / ml. Po 4 dienų inkubacijos 37 ° C temperatūroje ląstelių supernatantai buvo surinkti ir viruso RNR buvo kiekybiškai įvertinta realaus laiko RT-PCR (qRT-PCR). 50% slopinamoji koncentracija (IC50) buvo apskaičiuota kaip junginių koncentracija, reikalinga viruso RNR apkrovai sumažinti 50%.

Viruso ir ląstelės sąveikos trikdžiai

Viruso ir ląstelės-šeimininkės sąveiką tarpininkauja viruso paviršiaus baltymai ir ląstelių receptoriai. WSS45 įtaka viruso paviršiaus baltymams ir ląstelių receptoriams buvo nustatyta užsikimšimo tyrimais.

Virusų užsikimšimo tyrimui pirmiausia buvo inkubuotas 1 ml DV2 atsargų (1 x 106 PFU / ml) su junginiais arba be jų 30 minučių 37 ° C temperatūroje. Tada buvo pridėta WSS45, kai galutinė koncentracija buvo 10 ir 1 μg / ml. Viruso užsikimšimui kontroliuoti buvo naudojamas neutralizuojantis antikūnas prieš E baltymą (3H5 klonas), kurio koncentracija 10 μg / ml. Po to virusas buvo išgrynintas, norint pašalinti junginius per sacharozės tankio gradiento centrifugavimą 50 000 x g 2 val. 1 x 106 BHK ląstelėms užkrėsti buvo naudojamas junginiu arba pavyzdžiu apdorotas virusas.

Ląstelių receptorių užsikimšimo tyrimui BHK ląstelės buvo iš anksto apdorotos junginiais arba be jų 1 valandą 37 ° C. WSS45 buvo naudojamas esant 10 ir 1 μg / ml. Ląstelės tris kartus plaunamos PBS ir užkrėstos DV2 virusu, esant MOI 1, 2 h. Po plovimo PBS, užkrėstos ląstelės buvo inkubuojamos dar 24 valandas.

Virusinis užkrečiamumas buvo nustatytas srauto citometrijos metodu, atlikus viduląstelinį dažymą viruso NS1 baltymu. Blokavimo aktyvumas buvo nurodytas kaip sumažėjęs apdorotų grupių procentas, palyginti su kontrolinėmis grupėmis.

Gydymo laiko įtaka antivirusiniam aktyvumui

BHK ląstelėse, užkrėstose DV2, nustatyta junginio gydymo įtaka adsorbcijos, įsiskverbimo ir post-adsorbcijos laikotarpiais. Įvairių šiuose eksperimentuose naudojamų procedūrų iliustracija buvo parodyta 2 paveiksle, kad būtų lengviau suprasti.

Image

Schema, vaizduojanti metodus, naudojamus viruso infekcijos tyrimui. (A) Virusas buvo inkubuotas su ląstelėmis 37 ° C temperatūroje 2 valandas, esant arba neturint junginių. Tada ląstelės buvo plaunamos, kad būtų pašalintas junginys ir virusas. Viruso užkrėtimo lygis buvo nustatytas po 24 val., Naudojant apnašų susidarymo testą arba srauto citometriją. (B) Virusų adsorbcijos tyrimas. Ląstelės buvo inkubuotos su virusu 4 ° C temperatūroje viruso adsorbcijai esant arba neturint junginių, tada nuplaunamos. Virusinės infekcijos lygis buvo nustatytas po 24 val., Naudojant srauto citometriją. (C) Virusų skverbimosi tyrimas. Virusas buvo pridėtas prie ląstelių ir leistas adsorbuotis ląstelėse 1 valandą 4 ° C temperatūroje. Kultūros buvo plaunamos ir inkubuojamos su įvairiomis junginių koncentracijomis 37 ° C temperatūroje 2 valandas. Tarpląsteliniai virusai buvo inaktyvuoti rūgšties glicino buferiu (pH 3, 0). Virusinė infekcija buvo nustatyta per 24 valandas srauto citometrijos metodu. (D) Post-adsorbcijos tyrimas. Panašios eksperimentinės procedūros buvo naudojamos viruso adsorbcijai, o viruso perteklius buvo išplautas. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su junginiais 4 ° C temperatūroje 30 minučių ir vėl plaunamos. Viruso užkrėtimo lygis buvo nustatytas srauto citometrija ir qRT-PGR.

Visas dydis

Virusų adsorbcijos tyrimas

Slopinamasis poveikis viruso adsorbcijai buvo matuojamas srauto citometrija. BHK ląstelės buvo užkrėstos DV2 esant 1 MOI, esant arba neturint junginių. Buvo išanalizuotas WSS45 poveikis esant skirtingoms galutinėms koncentracijoms (10, 1 ir 0, 1 μg / ml). Po 1 valandos adsorbcijos 4 ° C temperatūroje ląstelės buvo plaunamos lediniu PBS, kad būtų pašalinti junginiai ir neadresoruotas virusas, ir inkubuojami palaikomojoje terpėje 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Viruso infekcija buvo nustatyta srauto citometrija, kaip aprašyta žemiau. Mažiausiai dviejų nepriklausomų eksperimentų eksperimentai buvo atlikti dviem egzemplioriais.

Viruso skvarbos tyrimas

BHK ląstelės buvo užkrėstos DV2 esant 1 MOI esant 4 ° C 1 val. Ląstelės buvo plaunamos šalta ledo terpe ir po to perkeliamos iki 37 ° C, esant arba neturint junginių. Buvo tiriamas WSS45 poveikis esant skirtingoms koncentracijoms (10, 1 ir 0, 1 μg / ml). Po 2 h viruso įsiskverbimo neįsiskverbęs virusas buvo inaktyvuotas rūgštiniu glicino buferiu 6 (8 g NaCl, 0, 38 g KCl, 0, 1 g MgCl2 · 6H 2 O, 0, 1 g CaCl2 · 2H 2 O) ir 7, 5 g glicino / L, pH sureguliuotas iki 3 HCl). Prasiskverbto viruso, kuris išgyveno apdorojant rūgštį gliciną, kiekis buvo nustatytas srauto citometrijos metodu po 24 val. Mažiausiai dviejų nepriklausomų eksperimentų eksperimentai buvo atlikti dviem egzemplioriais.

Viruso adsorbcijos tyrimas

Post-adsorbcijos etapas buvo nurodytas kaip laikotarpis po viruso adsorbcijos tikslinėje ląstelėje 4 ° C temperatūroje, tačiau prieš skverbimąsi, kuris įvyko tik esant 37 ° C temperatūrai, BHK ląstelės buvo iš anksto inkubuotos su virusu 4 ° C temperatūroje, po to nuplaunamos ledu šaltu PBS. pašalinti nesurištą virusą. Užkrėstos ląstelės buvo inkubuojamos dar 30 min. 4 ° C temperatūroje su WSS45 arba be jos (10 ir 1 μg / ml). Po to ląstelės vėl kruopščiai plaunamos, kad būtų pašalintas WSS45, ir perkeltos į 37 ° C. Galiausiai ląstelės buvo kultivuojamos palaikomojoje terpėje 24 valandas prieš srauto citometrijos analizę. Slopinimo greitis buvo pateiktas kaip sumažėjęs užkrėstų ląstelių procentas, palyginti su lygiagrečiai apdorota kontrole. Norėdami aptikti virusą, kuris adsorbuotas ląstelių membranoje, ląstelės buvo surinktos iškart po apdorojimo junginiu 30 minučių 4 ° C temperatūroje. Visa RNR buvo ekstrahuota ir kiekybiškai įvertinta realaus laiko PGR.

Srauto citometrija

Ląstelės buvo tripsinuotos ir surinktos. Ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu kambario temperatūroje 15 min., Po to permeablizuotos 0, 2% saponino. Tarpląstelinis virusinis antigenas buvo nudažytas pelės IgG1 antikūnu prieš viruso NS1 baltymą (ab41623, Abcam) 1 valandą 4 ° C temperatūroje ir FITIC konjuguotu antikūnu prieš pelės IgG ir analizuotas FACSAria srauto citometru naudojant „CellQuest“ programinę įrangą (Becton Dickinson, San). Chosė, Kalifornija, JAV).

Netiesioginis fluorescencinis paviršiaus dažymo viriono dažymas

Dėl netiesioginio imunofluorescencinio paviršiaus dažymo viriono dažymo BHK ląstelės 24 valandas buvo pasėtos ant dangtelių. Ląstelės buvo iš anksto inkubuotos su DV2 (MOI = 10) 4 ° C temperatūroje 1 valandą. Nesurištas virusas buvo pašalintas plaunant šaltą PBS, po to junginiai pridedami 30 minučių 4 ° C temperatūroje. Ląstelės vėl plaunamos ir fiksuojamos paraformaldehidu (PFA). Virusai, surišti į ląstelių paviršių, pirmiausia buvo dažomi anti-E baltymo monokloniniu antikūnu (4G2 klonu), vėliau - su fluorescinu konjuguotu antriniu antikūnu ir stebimi fluorescenciniu mikroskopu.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. Gydytųjų ir kontrolinių grupių palyginimai buvo atlikti naudojant Studentų testą. Statistinis skirtumas buvo priimtas esant P žemiau 0, 05.

Rezultatai

WSS45 efektyviai slopina Dengue 2 viruso dauginimąsi in vitro

Viruso dauginimosi ciklas apima viruso užkrėtimą tikslinėse ląstelėse, tarpląstelinį viruso dauginimąsi ir viruso išsiskyrimą. Mes ištyrėme WSS45 poveikį visam viruso dauginimosi ciklui BHK ląstelėse.

WSS45 citotoksiškumas pirmiausia buvo nustatytas žinant didžiausią toleruojamą WSS45 dozę BHK ląstelėse. Rezultatai parodė, kad WSS45 šiek tiek paveikė ląstelių gyvybingumą, kai buvo duodama 3 mg / ml (3A pav.), Taigi jo CC50 buvo didesnis nei 3 mg / ml. Tada qRT-PGR metodas buvo naudojamas analizuoti užkrėstų BHK ląstelių virusinį derlių. Rezultatai parodė, kad WSS45, priklausomai nuo dozės, stipriai slopino DV2 dauginimąsi BHK ląstelėse (3B paveikslas), kurio EC50 vertė buvo 0, 68 ± 0, 17 μg / ml, o terapinis indeksas (TI)> 1000. MPA, naudojamas kaip kontrolė, parodė stiprų viruso dauginimosi slopinimą. Taip pat sukūrėme WSS45 hidrolizatą. Tačiau šis hidrolizatas prarado antivirusinį aktyvumą, kai jo galutinė koncentracija buvo 25 μg / ml (duomenys nepateikti). Rezultatai patvirtino WSS45 antivirusinį aktyvumą prieš DV2 ir parodė, kad tinkamas molekulinis dydis yra svarbus WSS45 antivirusiniam aktyvumui.

Image

WSS45 anti-DV2 aktyvumas. (A) Citotoksinis WSS45 poveikis. Ląstelės buvo veikiamos junginiais 48 valandas, o citotoksiškumas buvo įvertintas MTT metodu. Tai parodė, kad WSS45 šiek tiek paveikė ląstelių tirpumą, kai buvo 3 mg / ml. (B) WSS45 antivirusinis aktyvumas BHK ląstelėse. DV2 (MOI = 0, 1) virusas buvo pridėtas prie sulipusių ląstelių, esant nurodytiems junginiams. Viršutinė viruso RNR buvo ekstrahuota ir kiekybiškai įvertinta qRT-PGR 48 val. Po infekcijos. WSS45 dramatiškai sumažino supernatanto viruso derlių priklausomai nuo dozės. Rezultatai buvo išreikšti trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu ± SD. b P <0, 05, palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

WSS45 neparodė jokio tiesioginio virusų ar ląstelių receptorių blokavimo

Virusinė infekcija, nukreipta į tikslines ląsteles, yra pirmasis žingsnis nustatant viruso dauginimosi ciklą. Kaip parodyta, WSS45 veiksmingai slopino viruso dauginimąsi BHK ląstelėse, mes pasiūlėme išsiaiškinti, ar WSS45 galėtų tiesiogiai surišti virusą, kad jis būtų inaktyvinamas, ar ląstelių receptorius, blokuojančius viruso infekcijos slopinimui. Buvo išanalizuotas WSS45 viruso ir ląstelių receptorių blokavimo poveikis. Atliekant viruso blokavimą, BHK ląstelėms užkrėsti buvo naudojamas virusas, iš anksto apdorotas WSS45. Virusas prarado mažiau nei 10% užkrečiamumo po 30 minučių gydymo WSS45 (4A pav.), O tai rodo, kad WSS45 neturėjo tiesioginio blokavimo poveikio DV2 virusui. Tiriant ląstelių receptorius, BHK ląstelės, iš anksto apdorotos WSS45, buvo užkrėstos DV2. Rezultatai parodė, kad pirminis gydymas WSS45 neturėjo ląstelių apsauginio poveikio nuo DV2 infekcijos (4A pav.). Remiantis šiais rezultatais, WSS45 tiesioginio viruso užsikimšimo ar ląstelių užsikimšimo nepastebėta.

Image

WSS45 veikė viruso infekcijos metu į šeimininko ląsteles. (A) Virusų blokavimas ir ląstelių receptorių blokavimo tyrimas. Virusų užsikimšimo tyrimas: BHK ląstelėms užkrėsti buvo naudojamas virusas (1 × 106 PFU / ml), iš anksto apdorotas junginiais. Viruso užkrečiamumo lygis buvo nustatytas srauto citometrijos metodu. Kaip teigiama kontrolė buvo naudojamas E baltymui neutralizuojantis antikūnas (3H5 klonas). Užblokuoto aktyvumo procentas buvo parodytas kaip užkrėstų ląstelių sumažėjimas, palyginti su kontroline. Ląstelių užsikimšimo tyrimas: Ląstelės, iš anksto apdorotos junginiu, buvo užkrėstos DV2 (MOI = 1). Po infekcijos praėjus 2 valandoms, ląstelės buvo apdorotos rūgšties glicino buferiu, kad būtų suaktyvintas tarpląstelinis virusas, ir kultivuojamos 24 valandas. Viruso užkrečiamumo lygis buvo nustatytas srauto citometrijos metodu. Abu eksperimentai parodė, kad WSS45 neturėjo jokio poveikio viruso blokavimui ar ląstelių receptorių blokavimui, tuo tarpu neutralizuojantis antikūnas prieš viruso E baltymą parodė viruso blokavimo aktyvumą. Rezultatai parodomi kaip užkrėstų ląstelių procentinio dydžio pokytis, palyginti su kontrolinėmis. Parodytas dviejų eksperimentų vidurkis ± SD. (B) Pirminės viruso infekcijos slopinimas WSS45. WSS45 buvo įvertintas antivirusinis užkrečiamumas infekcijos laikotarpiu, pridedant kartu su virusu (100 PFU), arba po užkrėtimo, pridedant po 2 val. Po užkrėtimo ir po 2 valandų nuplaunamas. Plazmos mažinimo tyrimas buvo atliktas siekiant nustatyti slopinantį WSS45 poveikį. Rezultatai parodyti kaip apnašų susidarymo procentas, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis, kuriose terpė buvo pakeista junginiais. Rezultatai atskleidė, kad WSS45 stipriai slopino viruso infekciją, kai jis buvo pridėtas pradinės virusinės infekcijos laikotarpiu. Rezultatai buvo išreikšti trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu ± SD.

Visas dydis

Tada mes ištyrėme WSS45 poveikį viruso ląstelių replikacijos procesui, naudodamiesi apnašų mažinimo tyrimu. Rezultatai parodė, kad WSS45 smarkiai trukdė pradiniam viruso užkrėtimo procesui (4B pav.). Tačiau gydymas WSS45 po virusinės infekcijos etapų neparodė jokio aktyvumo prieš DV2 infekciją. Šie rezultatai rodo, kad WSS45 turėjo antivirusinį poveikį ankstyvoje viruso dauginimosi ciklo stadijoje.

WSS45 daugiausia trukdo DV2 adsorbcijai

Pradinis viruso užkrėtimo procesas gali būti išskaidytas į adsorbcijos ir skverbimosi etapus keičiant temperatūrą ir apdorojant rūgštimi glicinu 6 . Tada mes bandėme išsiaiškinti WSS45 veikimo būdą prieš DV2 pradinėse infekcijos stadijose atlikdami 1 paveiksle pavaizduotas eksperimentines procedūras. Pirmiausia buvo atliktas laiko kurso tyrimas, skirtas WSS45 pridėjimo laiko (10 ir 1) įtakos analizei. μg / ml) viruso dauginimosi ciklo metu. Užkrėstos ląstelės buvo aptiktos praėjus 24 val. Po užkrėtimo, naudojant srauto citometriją. Šis laikas pasirinktas siekiant užtikrinti vieno viruso baltymo ekspresijos raundą, nes palikuonių virusas yra aptinkamas jau po 20 valandų BHK ląstelėse (duomenys nepateikti).

Rezultatai parodė, kad WSS45, esant 10 ir 1 μg / ml, žymiai sumažino NS1 teigiamų ląstelių procentą BHK ląstelėse (5 pav.), Pateikiant viruso adsorbcijos ir skverbimosi metu. Tyrimai su išpjaustytomis viruso infekcijos pakopomis parodė, kad WSS45 turėjo maksimalų slopinantį viruso adsorbciją, o taip pat parodė vidutinį slopinantį poveikį viruso įsiskverbimui.

Image

WSS45 stipriai slopino viruso adsorbciją BHK ląstelėse. Pradinė virusinė infekcija buvo padalyta į adsorbcijos ir skverbimosi etapus, naudojant temperatūros ir rūgštinio glicino buferio tirpalą, kaip parodyta 1 paveiksle. Infekcinis lygis buvo išmatuotas srauto citometrijos metodu po viruso NS1 baltymo dažymo. Rezultatai parodė, kad WSS45 daugiausia slopina viruso adsorbciją, o silpnai slopina viruso įsiskverbimą. Gydymas WSS45 po viruso įsiskverbimo nedarė jokio poveikio viruso tarpląstelinei replikacijai. Čia pateikti rezultatai atspindi tris atskirus eksperimentus.

Visas dydis

WSS45 gali sukelti DV2 viriono atsiribojimą nuo ląstelių-šeimininkų

Gydymas po adsorbcijos yra įprastas žingsnis prieš įsiskverbimo bandymą, siekiant užtikrinti, kad apdorojant ląstelę virionas neprarastų, o tai galėtų apsunkinti įsiskverbimo tyrimo rezultatą. Keista, bet mes nustatėme, kad trumpas post-adsorbcijos inkubavimas su WSS45 esant 4 ° C gali dramatiškai sumažinti viruso infekciją (6A ir B pav.). Šis reiškinys buvo negrįžtamas, nes pakeitimas šviežia terpe ir tolesnis inkubavimas 4 ° C temperatūroje neišgelbėjo viruso užkrečiamumo (duomenys nepateikti).

Image

WSS45 gydymas po adsorbcijos slopino DV2 infekciją. (A) WSS45 poveikis po adsorbcijos viruso infekcijai BHK ląstelėse. Procedūra parodyta 1D paveiksle. Ląstelės buvo inkubuotos su virusu (MOI = 1) 4 ° C temperatūroje viruso adsorbcijai. Po plovimo, kad būtų pašalintas virusas, ląstelės buvo inkubuojamos su WSS45 30 minučių 4 ° C temperatūroje ir plaunamos. Užkrėstos ląstelės buvo nustatytos srauto citometrija. Inhibicija buvo parodyta užkrėstų ląstelių greičiu, palyginti su kontrolinėmis, kurios buvo inkubuotos su šviežia terpe. Po WS45 pridėjimo po adsorbcijos slopinama viruso infekcija nuo dozės priklausančiame mannaryje. Slopinamasis aktyvumas buvo proporcingas anti-adsorbcijos aktyvumui. (B) Parodytas trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatas (vidurkis ± SD). b P <0, 05 palyginti su vidutine kontroline grupe.

Visas dydis

Norėdami užtikrinti šį neįprastą stebėjimą, mes išmatuojome adsorbuotos virusinės RNR ant BHK ląstelių paviršiaus, atlikę gydymą po adsorbcijos WSS45 (7A pav.). 30 minučių inkubuojant su WSS45 ir plaunant terpe, likusi viruso RNR BHK ląstelės paviršiuje buvo žymiai sumažinta maždaug 10 kartų (7A pav.). Viruso užkrečiamumo sumažėjimas BHK ląstelėse (6A pav.) Atitinka viruso RNR lygio pokyčius ląstelės paviršiuje. Todėl šis WSS45 slopinimas po adsorbcijos daugiausia galėjo būti susijęs su virionų, atsiribojančių nuo BHK ląstelių, sužadinimu, bet ne dėl skverbimosi slopinimo. Norėdami dar labiau patvirtinti šį WSS45 poveikį, virusai BHK ląstelių paviršiuje buvo tiesiogiai stebimi dengės karštligės viruso E baltymo imunofluorescenciniu dažymu. Virusinio E baltymo fluorescencinių dėmių intensyvumas buvo sumažintas apdorojant WSS45 po adsorbcijos (7B paveikslas). Be to, heparinas, kurio antivirusinis aktyvumas buvo gerai dokumentuotas, turėjo panašų poveikį kaip WSS45. Įrodyta, kad WSS45 sutrikdė viruso ir ląstelės sąveiką viruso adsorbcijos metu, kad sukeltų viruso atsiribojimą BHK ląstelėse.

Image

WSS45 sukėlė virusą, atsiribojantį nuo BHK ląstelių paviršiaus. (A) WSS45 poveikis po adsorbcijos periodo adsorbuotos virusinės RNR BHK ląstelėse. Po viruso adsorbcijos, ląstelės 30 minučių buvo apdorojamos WSS45, kaip parodyta 1D paveiksle. Ląstelinė RNR buvo nedelsiant išgauta, kiekybiškai įvertinta qRT-PGR metodu ir normalizuota iki ląstelių GAPDH RNR lygio. Tai rodo, kad inkubavimas su WSS45 po viruso adsorbcijos gali sumažinti adsorbuotos viruso RNR lygį, o tai reiškia, kad sumažėja virusų, prisijungiančių prie ląstelių membranų. Rezultatai buvo išreikšti trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiu ± SD. b P <0, 05, palyginti su kontroline grupe. (B) WSS45 apdorojimo po adsorbcijos poveikis virionams, sujungtiems su BHK ląstelėmis. BHK ląstelės buvo auginamos ant dangtelių ir apdorotos taip, kaip aprašyta posadorbcijos eksperimente. Po inkubacijos su WSS45 ir heparinu po adsorbcijos ląstelės buvo nuplautos ir pritvirtintos PFA ir paveiktos imunofluorescenciniu viruso E baltymu. Nuotraukos buvo kuriamos naudojant fluorescencinį mikroskopą. WSS45 inkubacija po viruso adsorbcijos prarado fluorescencines dėmes. Šis rezultatas atitiko adsorbuoto viriono RNR lygį. Čia pateiktas rezultatas atspindi tris atskirus eksperimentus.

Visas dydis

Diskusija

Ankstesniame tyrime 9 mes pranešėme apie WSS45 - vieną gliukano sulfato darinį iš Gastrodia elata Bl, kuris slopino DV2 dauginimąsi C 6/36 ląstelėse, kurių EC50 vertė buvo 10, 7 ± 7, 3 μg / ml (TI> 1000). RNR viruso krūvio ir apnašų tyrimo rezultatų pagrindas.

Norint geriau suprasti WSS45 molekulinio dydžio ir struktūros įtaką antivirusiniam aktyvumui, WSS45 buvo hidrolizuotas, kad gautų mažesnės molekulinės masės WSS45 hidrolizatą. Tačiau hidrolizatas visiškai prarado antivirusinį poveikį DV2 (duomenys nepateikti). Pasiūlyta, kad mažiausias heparino dydis, reikalingas pakankamam prisijungimui prie numanomų glikozaminoglikano surišimo motyvų, esančių DV2 3 E baltyme, buvo dekazaharidas. WSS45 hidrolizato aktyvumo praradimas dar kartą patvirtino tinkamo molekulinio dydžio svarbą sulfatinių polisacharidų antivirusiniam aktyvumui. Kadangi WSS45 šakos taip pat gali būti pašalintos po hidrolizės, todėl mes padarėme išvadą, kad šakota WSS45 struktūra taip pat gali prisidėti prie jo antivirusinio aktyvumo. Be to, atlikus viruso blokavimą, buvo įrodyta, kad WSS45 antivirusinis aktyvumas nebuvo tiesiogiai ar konkrečiai blokuojamas tariamų E baltymo glikozaminoglikano surišimo motyvų atžvilgiu. Labiau tikėtina, kad WSS45 antivirusinį aktyvumą galėtų žymiai padidinti lanksti ir šakota struktūra.

Mūsų rezultatai atskleidė, kad WSS45 antivirusinis poveikis pasireiškė labai ankstyvoje DV2 ciklo stadijoje, būtent adsorbcijos ir įsiskverbimo stadijoje. Šis poveikis yra panašus į heparino. Įdomiau, kad WSS45 specifiškai sukėlė viruso atsiribojimą nuo BHK ląstelių paviršiaus, o to nebuvo pastebėta HepG2 ląstelėse (duomenys nepateikti). Šis netikėtas poveikis suteikia mums dar vieną užuominą, kad virusas naudoja skirtingus receptorius ar būdus nuosekliai infekcijai skirtingose 11, 12, 13, 14 ląstelėse. GAG grandinės yra sudėtingi, linijiniai, neigiamai įkrauti sulfatiniai polisacharidai, gausiai randami ląstelių paviršiuose ir tarpląstelinėje daugumos ląstelių organizmų tarpląstelėje 15 . Nustatyta, kad GAG grandinės BHK ląstelėse sąveikauja su DV2 virusu in vitro 3 . Iki šiol nenustatytas joks specifinis DV2 viruso baltymo receptorius BHK ląstelėse. Kadangi WSS45 yra GAG mimetikas, todėl jis galėtų konkurencingai slopinti viruso adsorbciją, trukdydamas sąveikai tarp GAG grandinės BHK ląstelėse ir jos ligando DV2 viruso paviršiuje. Įrodyta, kad baltymų receptorius GRP78 (dar žinomas kaip BiP) HepG2 ląstelėse 11 turi specifinę sąveiką su DV2 E baltymu. Nors glikozaminoglikano grandinės HepG2 ląstelių paviršiuje taip pat gali palengvinti DV2 virionų 16 jungimąsi, mes manome, kad E baltymo prisijungimas prie jo specifinio receptoriaus GRP78 gali būti stabilesnis, norint išgyventi WSS45 trukdžius, palyginti su GAG grandinėmis. Apibendrinant, antivirusinis WSS45 aktyvumas BHK ląstelėse turėtų būti vertinamas kaip jo slopinamojo poveikio adsorbcijai ir atskyrimo poveikis derinyje po adsorbcijos. Be to, tokį aktyvumą darė ir heparinas, kurį mes naudojome kaip etaloninį junginį. Tai reiškia, kad sulfatiniai polisacharidai gali turėti panašias savybes, sukeldami viruso atsiribojimą nuo tam tikro tipo ląstelių.

Dengue Dengue viruso E baltymas, kaip ir kiti Flavivirus apvalkalo baltymai, patiria konformacinius pokyčius ir atskleidžia jo sulietą peptidą esant žemam pH 17, 18 . Šis pakeitimas tikriausiai sąlygoja papildomą WSS45 sąveikos vietą, kad būtų užkirstas kelias sintezės procesui, nes buvo pastebėtas silpnas viruso įsiskverbimo slopinimas. Pranešama, kad E baltymo liekanų protonacija yra svarbi jo sintezės aktyvumui 19 . Lieka neaišku, ar yra galimybė, kad WSS45 galėtų apsunkinti šį procesą dėl savo neigiamo krūvio.

Šis tyrimas atskleidė WSS45 mechanizmą, kuris trukdo dengės karštligės viruso ir tikslinių ląstelių sąveikai. WSS45 veikimo būdas gali būti bendra antivirusinį poveikį turinčių sulfatų polisacharidų savybė.

Autoriaus indėlis

Xian-kun TONG, Wei TANG sukūrė ir atliko tyrimus; Hong QIU pateikė polisacharidų junginius; Xin ZHANG maloniai teikia viruso padermes; Li-ping SHI pateikė reagentus ir padėjo nustatyti PGR ir srauto citometrijos metodus; Gui-feng WANG, Fei-hong JI ir Hui-yong DING padėjo naudingų patarimų ir diskusijų. Xian-kun TONG parašė rankraštį. Kan DING ir Jian-Ping ZUO vadovavosi visais eksperimentais ir peržiūrėjo tekstą.