Arilo angliavandenilių receptorių kseno jutiklis žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių, gautų iš hepatocitų, panašiose ląstelėse | mokslinės ataskaitos

Arilo angliavandenilių receptorių kseno jutiklis žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių, gautų iš hepatocitų, panašiose ląstelėse | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Kamieninių ląstelių diferenciacija
  • Toksikologija

Anotacija

Nors į žmogaus pluripotencines kamienines ląsteles (hPSC-HLC) gaunamos į hepatocitus panašios ląstelės yra laikomos perspektyviu hepatotoksiškumo prognozavimo modeliu, jų taikymas buvo apribotas dėl mažo vaistų metabolizuojančių fermentų (DME) aktyvumo. Čia mes nustatėme, kad maža ksenobiotinių receptorių (konstitucinio androstano receptoriaus, CAR ir nėštumo X receptoriaus, PXR) ekspresija prisideda prie žemo DME aktyvumo hPSC-HLC. Dauguma CAR ir PXR reguliuojamų DME ir transporterių buvo transkripciniu būdu žemyn reguliuojami hPSC-HLC. Transkripcinė CAR ir PXR ekspresija buvo labai slopinama hPSC-HLC, tuo tarpu arilo angliavandenilių receptorių ( AHR) mRNR lygis buvo panašus į suaugusiųjų kepenų. Be to, ligando sukelta transkripcijos aktyvacija buvo pastebėta tik esant AHR hPSC-HLC. Bisulfito sekos analizė parodė, kad CAR ir PXR promotoriaus hipermetilinimas buvo susijęs su sumažėjusiu transkripcijos aktyvumu hPSC-HLC. Gydymas selektyviais AHR ligandais padidino nuo AHR priklausomų taikinių genų transkripciją, tiesiogiai pririšant AHR-DNR prie ksenobiotinio atsako elemento. Be to, AHR antagonistas reikšmingai slopino nuo AHR priklausomą tikslinio geno ekspresiją. Taigi AHR iš esmės gali veikti kaip kseno jutiklis ir nuo ligando priklausantis transkripcijos faktorius hPSC-HLC. Mūsų rezultatai rodo, kad hPSC-HLC gali būti naudojami tikrinant toksiškas medžiagas, susijusias su AHR signalizavimu, ir nustatant galimus AHR taikomus vaistus.

Įvadas

Toksikologinių tyrimų metu buvo akcentuojamas poreikis labiau prognozuoti žmogaus kepenų in vitro modelius. Tipiški hepatotoksiškumo įvertinimai, naudojant gyvūnų modelius, nepateikia patikimų duomenų apie galimą toksinį vaistų ir cheminių medžiagų poveikį žmonėms, atsirandančius dėl skirtingų vaistų metabolizmo (arba ksenobiotinio metabolizmo) ir hepatotoksinio atsako skirtumų tarp rūšių. 1, 2 . In vitro bandymų sistemos, kuriose naudojami žmogaus ląstelių modeliai, gali padėti išspręsti skirtingų rūšių skirtumų problemą, in vitro žmogaus ląstelių linijos modeliai vis dar naudojami ribotai. Šviežiai išskirti arba kriofiziškai konservuoti pirminiai žmogaus hepatocitai (PHH) laikomi idealiu modeliu in vitro . Tačiau pagrindiniai apribojimai yra šviežių išteklių trūkumas ir didžiulis bendros ląstelių kokybės kitimas skirtingose ​​ląstelių partijose ir donoruose 3, 4, 5 .

Naujausi kamieninių ląstelių technologijos pasiekimai suteikia galimybę pašalinti in vitro modelių trūkumą. In vitro diferencijuoti hepatocitai iš žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių (hPSC) pasirodė kaip patraukliausias alternatyvus hepatotoksiškumo prognozavimo šaltinis 6, 7 . Keletas neseniai atliktų tyrimų rodo, kad žmogaus embrioninės kamieninės ląstelės (hESC) ir iš žmogaus sukeltų pluripotentinių kamieninių ląstelių (hiPSC) gaunamos hepatocitų tipo ląstelės (HLC) pasižymi prognozuojamu jautrumu skiriant hepatotoksikantus nuo netoksiškų junginių ir funkciniu pajėgumu generuoti atitinkamus bioaktyvius metabolitus. iš žinomų toksiškų veiksnių 8, 9, 10 . HiPSC-HLC savybės taip pat leidžia numatyti individualius vaistų metabolizmo ir jautrumo skirtumus remiantis citochromo P450 (CYP) genų pavienių nukleotidų polimorfizmais 11 . Šie hPSC-HLC nuspėjamųjų gebėjimų atradimai visiškai priklauso nuo vaistus metabolizuojančių fermentų (DME) ir susijusių vaistų pernešėjų ekspresijos ir funkcinio aktyvumo. Iki šiol nedaug tyrimų parodė, kad hPSC-HLC yra panašūs į PHH pagal DME ir vaistų pernešėjų išraišką ir aktyvumą 12 . Tačiau tikslus mechanizmas, kuriuo grindžiamos DME indukcijos ir konstitutyvios ekspresijos in vitro diferencijuotuose HLC, yra nepakankamai suprantamas.

Kepenyse DME ir transporterių raišką ir transkripciją reguliuoja epigenetiniai veiksniai (pvz., DNR metilinimas, histono modifikacija ir miRNR), taip pat kepenyse praturtinti ligandų suaktyvinti transkripcijos faktoriai 13, 14, 15 . Daugybė ligandų suaktyvintų transkripcijos veiksnių, daugiausia branduoliniai receptoriai, pasižymi įvairiais ksenobiotinių jungčių gebėjimais ir veikia kaip endogeninių toksiškų metabolitų ir ksenobiotikų jutikliai 16, 17 . Šie receptoriai gali sužadinti daugumą ksenobiotinių medžiagų apykaitos ir transportavimo genų, atpažindami įvairius ligandus, todėl jie taip pat vadinami ksenobiotiniais receptoriais. Pagrindiniai ksenobiotiniai receptoriai, įskaitant konstitucinius androstano receptorius (CAR, NR1I3), nėštumo X receptorius (PXR, NR1I2) ir arilo angliavandenilių receptorius (AHR), reguliuoja skirtingų ir sutampančių DME ir transporterių plokščių spektro indukciją kepenyse 18., 19, 20 . Visų pirma, DME rinkinių ir nešiklių indukcijos profiliai yra stipriai susiję su šių ksenobiotinių receptorių aktyvacija. Be to, kiekvienas receptorius turi specifinių rūšių skirtumų savo tikslinio geno indukcijos reakcijose, taip pat jungimosi gebėjime (ir (arba) afinitete) prie savo ligandų 21, 22, 23. Dėl šių unikalių funkcijų įvairūs surišimo ir aktyvavimo tyrimai, naudojant CAR, PXR ir AHR, yra plačiai naudojami kaip naudingos in vitro patikros priemonės, skirtos numatyti vaistų saugumą ir ksenobiotikų sukeltą hepatotoksiškumą.

Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti CAR, PXR ir AHR, kaip ksenosensorių ir transkripcijos reguliatorių, kontroliuojančių ksenobiotikų metabolizmą hPSC-HLC, funkcinius vaidmenis. Šiuo tikslu tiek hESC, tiek hiPSC buvo diferencijuoti į hepatocitus, kuriuose įvertinome mRNR raišką ir CAR , PXR ir AHR transkripcinį aktyvumą. Mes parodėme, kad žymus CAR ir PXR transkripto lygio sumažėjimas dėl promotoriaus hipermetilinimo lėmė sumažėjusį transkripcijos aktyvumą hPSC-HLC. Priešingai, AHR transkripcinis aktyvumas buvo pakartojamas hPSC-HLC, kurį griežtai reguliavo AHR specifinės agonistinės ir antagonistinės ksenobiotikos.

Rezultatai

In vitro HESC ir hiPSC diferenciacija į HLC

Norėdami ištirti, ar ksenobiotiniai receptoriai dalyvauja reguliuojant DME ir transporterius hPSC-HLC, mes pirmiausia diferencijavome hESC ir hiPSC į HLC, laipsniškai. Tada hESC- ir hiPSC-HLC buvo apibūdinti fenotipiškai ir funkciškai. Hepatocitų žymenų genų, įskaitant AAT, ALB, AFP ir HNF4A, transkripcija buvo aiškiai sukelta hESC- ir hiPSC-HLC (1a pav.). Be to, hESC- ir hiPSC-HLC buvo teigiami AAT, ALB, AFP ir HNF4A atžvilgiu (1b pav., C). Kepenų diferenciacijos efektyvumui nustatyti buvo išmatuota ALB ir AAT teigiamų ląstelių dalis, naudojant fluorescencinę ląstelių rūšiavimą (FACS). Abiejuose hPSC-HLC tipuose buvo aptikta daugiau kaip 96% ALB teigiamų ir bent 84% AAT teigiamų ląstelių (1d pav., E). Be to, jie demonstravo įvairias kepenų funkcijas, įskaitant glikogeno sintezę, mažo tankio lipoproteinų (MTL) įsisavinimą ir albuminų sekreciją (1f – j pav.). Nors tarp hESC ir hiPSC-HLC buvo pastebėti nedideli žymenų geno ekspresijos ir albuminų sekrecijos skirtumai, bendri rezultatai rodo, kad tiek hESC, tiek hiPSC buvo efektyviai diferencijuoti į hepatocitus primenančias ląsteles.

Image

Visi paskesni eksperimentai buvo atlikti tiek su hESC-HLC, tiek su hiPSC-HLC, atitinkamai 18 dieną. ( a ) Kepenų žymenų genų, ALB , AAT , HNF4A ir AFP santykinis ekspresijos lygis diferencijuotose ląstelėse 0 ir 18 dieną bei PHH buvo išmatuotas qRT-PCR. Rezultatai rodo vidurkį ± SD (n = 3). * p <0, 05, reikšmingos vertės, palyginti su PHH; §§§ p <0, 001, reikšmingos vertės, palyginti su hESC-HLC. ( b, c ) ALB, AAT, HNF4A ir AFP imunofluorescencija hESC-HLC ( b ) ir hiPSC-HLC ( c ). Branduoliai buvo priešpriešiniai naudojant DAPI. Masto juosta = 100 μm. ( d, e ) ALB ir AAT srauto citometrijos analizė hESC-HLC ( d ) ir hiPSC-HLC ( e ). Mėlyna linija, izotipo valdymas; raudona linija, tikslinis antikūnas. ( f, g ) Periodinis dažymas rūgštimi-Schiff'u parodė hESC-HLC ( f ) ir hiPSC-HLC ( g ), rodančius citoplazminį glikogeno kaupimąsi. Branduoliai (šviesiai mėlyni) buvo išlyginti hematoksilinu. ( h, i ) HESC-HLC ( h ) ir hiPSC-HLC ( i ) buvo aptiktos acetilinto mažo tankio lipoproteinų (Ac-MTL) teigiamos ląstelės. ( j ) albumino sekrecija hPSC-HLC metodais buvo matuojama kondicionuotoje terpėje ELISA tyrimu. Vertės reiškia vidurkį ± SD (n = 3).

Visas dydis

Genų, kuriuos reguliuoja ksenobiotiniai receptoriai hPSC-HLCs, neigiamas reguliavimas

Toliau mes ištyrėme DME ir transporterių, reguliuojamų CAR, PXR ir AHR, genų ekspresijos profilius, naudodami mikrotraumos analizę. Pasirenkant tikslinius genus, mes panaudojome išradingumo kelio analizę, kad nustatytume visus genus, kuriuos tiesiogiai ir netiesiogiai reguliuoja CAR, PXR ir AHR (Ingenuity ® sistema, www.ingenuity.com). Dauguma CAR ir (arba) PXR tikslinių genų, priklausančių I fazės fermentams ir transporteriams, hESC ir hiPSC-HLC yra išreikšti mažiau nei 10% suaugusiųjų kepenų (2a pav.). Daugumos II fazės fermentų, esančių hPSC-HLC, fermentų nuorašo lygiai buvo panašūs į vaisiaus ar suaugusiųjų hepatocitų, išskyrus glutationo S-transferazės pi 1 ( GSTP1 ) geną. Garsi GSTP1 ir AFP , kurie yra vaisiaus hepatoblastų žymenys, išraiška rodo, kad tiek HLC, atskirti nuo hESC, tiek hiPSC, vis dar rodo vaisiui būdingas fenotipines savybes (2a ir 1a pav.). CAR ir PXR genų ekspresija taip pat pastebimai sumažėjo (<20 kartų) tiek hESC, tiek hiPSC-HLC (2a, b pav.). Šie duomenys rodo, kad CAR ir PXR genų nuorašo lygis yra glaudžiai susijęs su I fazės fermento ir transporterio genų ekspresija hPSC-HLC. Skirtingai nuo CAR ir PXR mRNR lygių, AHR mRNR lygiai hESC ir hiPSC-HLC buvo panašūs kaip suaugusiųjų kepenyse ir buvo šiek tiek didesni nei vaisiaus kepenyse, tuo tarpu AHR tikslinių genų ekspresijos lygis svyravo nuo 0, 0038 karto iki 21. -sulenkite (2c pav.). Norint patvirtinti CAR , PXR ir AHR genų ekspresijos profilius, šių receptorių mRNR lygis buvo išmatuotas diferencijuojant kepenis qRT-PGR. CAR ir PXR genų ekspresija buvo reikšmingai sumažinta hESC- ir hiPSC-HLC (3a, b pav.). Atvirkščiai, AHR mRNR lygis buvo žymiai padidėjęs hPSC-HLCs kepenų diferenciacijos metu ir buvo didesnis D18 kepenų diferenciacijos metu nei suaugusiųjų hepatocituose (3c pav.). Šios CAR , PXR ir AHR genų išraiškos vertės atitiko ekspresijos lygius, nustatytus atliekant mikrotraumos analizę (2 pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad CAR ir PXR genai ir jų tiksliniai genai, įskaitant I fazės fermentus ir pernešėjus, yra represuojami hESC ir hiPSC-HLC.

Image

Kiekybinis CAR ( a ), PXR ( b ) ir AHR ( c ) tikslinių genų palyginimas vaisiaus kepenyse, hESC-HLC ir hiPSC-HLC, normalizuotos žmogaus suaugusiųjų kepenims (punktyrinė linija, vertė 10 0 ). Duomenų apie suaugusiųjų ir vaisiaus kepenų mikrotrauminius duomenis vidurkis apskaičiuojamas pagal du nepriklausomus šaltinius, o hESC-HLC ir hiPSC-HLC - atitinkamai pagal du skirtingus kilmės fragmentus. Genų ekspresijos lygiai hPSC-HLC buvo nuo 0, 001 iki 100 kartų ( a, c ) ir nuo 0, 001 iki 10 kartų ( b ), palyginti su suaugusiųjų kepenų lygiais. Ph-I, I fazės fermentai; Ph-II, II fazės fermentai; DT, narkotikų pervežėjai.

Visas dydis

Image

CAR ( a ), PXR ( b ) ir AHR ( c ) mRNR raiškos lygiai diferencijuotuose HESC ir hiPSC kiekiuose 0, 5, 10 ir 18 dieną bei žmogaus suaugusiojo ir vaisiaus kepenyse buvo išmatuoti qRT-PCR. Rezultatai rodo vidurkį ± SD (n = 3). ** p <0, 01, *** p <0, 001, reikšmingos vertės, palyginti su suaugusiųjų kepenimis. AL, suaugusiųjų kepenys; FL, vaisiaus kepenys.

Visas dydis

Epigenetinis CAR, PXR ir AHR genų ekspresijos reguliavimas hPSC-HLC

Norint nustatyti, ar epigenetinės modifikacijos yra susijusios su CAR , PXR ir AHR genų reguliavimu hPSC-HLC, buvo ištirtos CpG dinukleotidų DNR metilinimo būsenos reguliavimo regionuose aplink šių receptorių genų transkripcijos pradžios vietą (TSS). Bisulfidų sekos analizė parodė CpG dinukleotidų hipermetilinimą CAR ir PXR promotoriaus regionuose hESC- ir hiPSC-HLC, bet parodė PHH demetilinimą (4a, b pav.). DNR metilinimo dažnis CAR promotoriaus regione, kuris apima 11 CpG vietų, atitinkamai buvo 98, 2%, 99% ir 10% hESC-HLC, hiPSC-HLC ir PHH (4a pav.). PXR promotoriaus sritis, turinti du atskirtus CpG turtingus regionus, buvo hipermetilinta (> 90%) tiek hESC, tiek hiPSC-HLC, bet hipometilinta (≤ 10%) PHH (4b pav.). Panašus metilinimo būdas taip pat pastebėtas PXR 3 egzono srityje (4b pav.). Be HESC, hipermetilinimas CpG dinukleotidais taip pat buvo pastebėtas CAR ir PXR promotorių srityse (papildomas 1a, b pav.). Priešingai nei CAR ir PXR genai, DNR metilinimo dažnis AHR promotoriaus regione, kuris apima 63 CpG vietas, buvo mažesnis nei 2% PHH, hESC ir hiPSC-HLC ir hESC (4c pav.; Papildomas 4 pav.). 1c). AHR nuorašai buvo praturtinti hESC ir hiPSC-HLC, palyginti su PHH, tačiau CAR ir PXR transkripcija buvo nežymiai suaktyvinta hESC ir hiPSC-HLC (4d pav.). Šie rezultatai rodo, kad DNR metilinimo laipsnis glaudžiai koreliuoja su CAR , PXR ir AHR transkripcine išraiška hPSC-HLC.

Image

DNR metilinimo būklė CAR ( a ), PXR ( b ) ir AHR ( c ) norminiuose regionuose hESC- ir hiPSC-HLC ir PHH reguliavimo regionuose buvo analizuojama bisulfito seka. Kiekviena diagrama rodo tirtas vietas, kuriose yra CpG salos promotoriaus ir geno kūno srityje. Kiekviena eilutė rodo kiekvieno CpG metilinimo būseną 9-10 bakterijų klonų serijoje. Metilinti ir nemetilinti CpG dinukleotidai pavaizduoti atitinkamai kaip užpildyti ir atviri apskritimai. ( d ) CAR, PXR ir AHR mRNR ekspresijos lygiai hESC- ir hiPSC-HLC ir PHH buvo išmatuoti qRT-PCR. Rezultatai yra ± SD vidurkis (n = 3). *** p <0, 001, reikšmingos vertės, palyginti su PHH. PHH, pirminiai žmogaus hepatocitai.

Visas dydis

Gydymo atitinkamais CAR, PXR ir AHR ligandais poveikis tikslinio geno ekspresijai hPSC-HLC

Toliau, norėdami ištirti, ar ksenobiotinių receptorių aktyvacija daro įtaką pasroviui priklausančių genų ekspresijai, hPSC-HLCs buvo kultivuojami esant atitinkamiems ligandams, būdingiems CAR, PXR ir AHR. Šie receptoriai yra ligandų suaktyvinti transkripcijos veiksniai, kurie reguliuoja jų specifinių taikinių genų ekspresiją priklausomai nuo ligando 16, 17 . Be to, 6- (4-chlorfenil) imidazo [2, 1-b] [1, 3] tiazol-5-karbaldehido-O- (3, 4-dichlorbenzil) oksimas (CITCO) ir [[3, 5-bis ( 1, 1-dimetiletil) -4-hidroksifenil] eteniliden] bis-fosfoninės rūgšties tetraetilo esteris (SR12813) yra specifiniai žmogaus CAR ir PXR agonistai, atitinkamai 21, 24, 25 . Kaip tikėtasi iš aukščiau pateiktų rezultatų (4 pav.), CITCO ir SR12813 neaktyvavo arba nežymiai suaktyvino CAR ir PXR tikslinių genų, įskaitant CYP2B6 , CYP2C9 , CYP3A4 , MDR ir UGT1A1 , transkripciją hESC ir hiPSC-HLC. (5a, b pav.). Po apdorojimo CITCO (100 nM) ir SR12813 (200 nM) CAR ir PXR tikslinių genų ekspresijos lygiai buvo mažiau nei 3 kartus didesni nei hPSC-HLC tipuose (5a, b pav.). Priešingai, AHR tiksliniai genai, tokie kaip CYP1A1 ir CYP1B1, išskyrus CYP1A2 , buvo transkripciniu būdu suaktyvinti ir patikimai išreikšti hESC- ir hiPSC-HLC, esant 2- (1H-Indol-3-ilkarbonil) -4-tiazolkarboksirūgšties metilui. esteris (ITE), kuris yra endogeninis AHR agonistas (5a, b pav.). Šie rezultatai rodo, kad AHR yra transkripciniu požiūriu aktyvus abiejų tipų hPSC-HLC 26 .

Image

CAR-, PXR- ir AHR-taikinių genų indukcijos hESC-HLC ( a ) ir hiPSC-HLC ( b ), gydomiems specifiniais receptoriaus ligandais 6 ir 24 valandas, buvo nustatomos qRT-PCR. CITCO (100 nM), SR12813 (200 nM) ir ITE (500 nM) buvo naudojami atitinkamai kaip CAR, PXR ir AHR agonistai. Rezultatai rodo vidurkį ± SD (n = 3). * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, reikšmingos vertės, palyginti su 0, 1% DMSO kontrole (Con).

Visas dydis

AHR užkrėtimas tikslinių genų promotoriuje hPSC-HLC

AHR tarpininkauja daugybei toksikologinių padarinių, pajutęs įvairius išorinius ligandus, tokius kaip benzo [a] pirenas (BaP), 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzodioxin (TCDD; taip pat žinomas kaip dioksinas) ir 3-metilcholantrenas (3-MC). 27, 28, 29 . Prijungęs ligandą, aktyvuotas AHR jungiasi prie specifinės DNR atpažinimo vietos, vadinamos ksenobiotinio atsako elementu (XRE), tokiu būdu sukeldamas tikslinio geno transkripciją 19, 30 . Norėdami nustatyti, ar BaP, TCDD ir 3-MC tarpininkauja transkripciniam CYP1A pošeimos genų reguliavimui per APS priklausomą mechanizmą hPSC-HLC, mes įvertinome tiesioginį AHR-DNR prisijungimą prie XRE chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) tyrimu (3 pav. 6). Iš ChIP tyrimų išskirti DNR fragmentai buvo analizuojami naudojant qRT-PGR, o kaip neigiama kontrolė buvo naudojami GAPDH ir imunoprecipitacija su IgG izotipu. Gydymas BaP, TCDD ir 3-MC žymiai padidino AHR praturtėjimą CYP1A1 promotoriaus regione, priklausomai nuo laiko, tiek hESC, tiek hiPSC-HLC (6a pav.). AHR praturtėjimo modeliai CYP1B1 buvo panašūs kaip ir stebint CYP1A1 (6c pav.). Priešingai, BaP, TCDD ir 3-MC turėjo mažai įtakos AHR pritraukimui į CYP1A2 promotorių hESC- ir hiPSC-HLC (6b pav.). Norėdami dar labiau išsiaiškinti, ar AHR įdarbinimas daro tiesioginę įtaką taikinio genų transkripcijai, mes išmatuojome CYP1A1 ir CYP1B1 nuorašo lygius esant AHR ligandams. Atlikus HESC- ir hiPSC-HLC, CYP1A1 ir CYP1B1 nuorašų lygis žymiai padidėjo po gydymo BaP, TCDD ir 3-MC (7 pav.). Šie ekspresijos modeliai buvo panašūs į AHR praturtėjimo modelius CYP1A1 ir CYP1B1 promotoriaus srityse (6a, c pav.). Taigi, ligandų sukeltas AHR pritraukimas lemia AHR indukuojamą CYP1A1 ir CYP1B1 indukciją hESC ir hiPSC-HLC.

Image

hESC- ir hiPSC-HLC nurodytą laiką buvo gydomi 1 μM BaP, 10 nM TCDD, 1 μM 3-MC arba DMSO (0, 1%). ChIP tyrimas buvo atliktas su pradmenų poromis, būdingomis XRE turinčioms promotoriaus sritims CAP1A1 ( a ), CYP1A2 ( b ) ir CYP1B1 ( c ) hESC-HLC (kairiajame skydelyje) ir hiPSC-HLC (dešiniame skydelyje), naudojant realias - laiko PGR. Grunto poros, kurios amplifikuoja XRE turinčius promotoriaus regionus, kaip nurodyta kiekvienoje diagramoje (viršutinės plokštės). Skaičiai nurodo nukleotidų padėtis, palyginti su transkripcijos pradžios vieta (+ 1, rodyklė). Rezultatai yra vidutiniai ± SD (n = 3) ir pateikiami atsižvelgiant į izotipo kontrolę (IgG = 1). * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, reikšmingos vertės, palyginti su DMSO.

Visas dydis

Image

Ląstelės buvo nurodytą laiką apdorotos 1 μM BaP, 10 nM TCDD, 1 μM 3-MC arba DMSO (0, 1%). Ligando sukeltos CYP1A1 ( a, c ) ir CYP1B1 ( b, d ) ekspresija hESC-HLC ( a, b ) ir hiPSC-HLC ( c, d ) buvo nustatyta qRT-PCR analize. Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SD (n = 3). * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, reikšmingos vertės, palyginti su DMSO.

Visas dydis

AHR priklausomo taikinio geno ekspresijos susilpninimas naudojant AHR antagonistą hPSC-HLC

Norint nustatyti, ar toksiškų ligandų sukelta CYP1A1 ir CYP1B1 ekspresija priklauso nuo AHR, ar ne, hPSC-HLC 6 valandas buvo kultivuojami su AHR antagonistu 6, 2 ′, 4′-trimetoksiflavonu (TMF) arba be jo, esant BaP, TCDD arba 3-MC. Tiek hESC, tiek hiPSC-HLC, TMF reikšmingai slopino BaP ir TCDD sukeltą CYP1A1 ir CYP1B1 transkripciją, tačiau reikšmingai neslopino 3-MC sukeltos CYP1A1 ir CYP1B1 transkripcijos (8b pav., C). 3-MC gydytais hESC-HLC TMF reikšmingų pokyčių nepastebėta (8b pav.). Priešingai, TMF sukėlė reikšmingą, bet nežymų CYP1A1 transkripcijos padidėjimą 3-MC gydytais hiPSC-HLC (8c pav.). Taip pat buvo tiriamas TMF slopinamasis poveikis nuo AHR priklausomo tikslinio geno indukcijai PHH. TMF reikšmingai sumažino CYP1A1 ir CYP1B1 transkripto lygius BaP ir TCDD gydytuose PHH (8a pav.), Kuris labai atitiko tuos, kurie buvo stebimi hPSC-HLC (8b pav., C). 3-MC gydomuose PHH, nors TMF sumažino CYP1A1 ir CYP1B1 transkripto lygius, jis buvo nereikšmingas ir mažiau veiksmingas prieš 3-MC nei prieš BaP ar TCDD (8a pav.). Slopinamasis TMF poveikis 3-MC sukeltai AHR-taikinio geno transkripcijai skyrėsi hESC-HLC, hiPSC-HLC ir PHH (8 pav.). Šie rezultatai rodo, kad 3-MC indukuoja CYP1A1 ir CYP1B1 transkripciją per nuo AHR nepriklausomą mechanizmą. Bendrai kalbant, mūsų duomenys rodo, kad AHR transkripcinis aktyvumas buvo atkuriamas tiek hESC-, tiek hiPSC-HLC, kuriuos griežtai reguliavo AHR specifiniai agonistai ir antagonistai.

Image

PHHs ir hESC- bei hiPSC-HLC buvo apdoroti nešikliu (DMSO), 1 μM BaP, 10 nM TCDD ir 1 μM 3-MC su arba be 10 μM TMF 6 valandas. AHR reaguojančių CYP1A1 ir CYP1B1 ekspresijos lygiai PHH ( a ), hESC-HLC ( b ) ir hiPSC-HLC ( c ) buvo nustatyti atliekant qRT-PCR analizę. Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SD (n = 3). * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, reikšmingos vertės, palyginti su ląstelėmis, apdorotomis nurodytais junginiais be TMF.

Visas dydis

Diskusija

Naujausia technologijos pažanga ir kamieninių ląstelių biologijos supratimas leido padaryti didelę pažangą kuriant alternatyvius in vitro modelius, pagrįstus hPSC-HLC, skirtus vaistų saugumui ir toksikologijai pritaikyti. 6, 31, 32 . Keletas tyrimų parodė, kad hPSC-HLC yra pritaikomi numatant cheminį toksiškumą, reagavimą į atskirus vaistus ir vaistų sukeltą kepenų pažeidimą. 8, 11, 33 . Nepaisant šių laimėjimų, keli pagrindiniai su hPSC-HLC susiję apribojimai, ypač neišsamus vaisto metabolinis aktyvumas, riboja jų taikymą farmakologinėje saugoje ir toksikologijoje. Dabartiniai kepenų diferenciacijos procesai suteikia funkciškai nesubrendusius hPSC-HLC, pasižyminčius „vaisiaus“ fenotipinėmis savybėmis ir žymiai sumažėjusia pagrindinių DME ir vaistų pernešėjų ekspresija ir aktyvumu. Hepatocitais praturtinti DME ir vaistų pernešėjai vaidina pagrindinį vaidmenį metabolizuojant endo- ir ksenobiotikus bei inicijuojant ksenobiotikų sukeltą hepatotoksiškumą. Ksenobiotikų sukeltas toksinis poveikis kepenims yra plačiai žinomas kaip susijęs su per dideliu reaktyviųjų ksenobiotinių metabolitų, katalizuojamų I fazės fermentų, dažniausiai CYP šeimos fermentų, susidarymu ir metabolitų pašalinimo, kurį sukelia II fazės fermentai ir pernešėjai, sutrikimu37. Dėl to toksikologiškai naudojant hPSC-HLC reikia patobulinti kepenų fermentų ir pernešėjų, dalyvaujančių vaistų metabolizme, ekspresiją ir aktyvumą. Tačiau vystymosi keliai, reguliuojantys DME ir transporterių indukciją, yra menkai ištirti, nors reikšmingi DME ekspresijos pokyčiai stebimi kepenų ontogenezės metu įvairiems žinduoliams ( 38, 39, 40, 41) .

Priešingai, ksenobiotikų sukeltas DME ir transporterių transkripcijos reguliavimas hepatocituose yra gana gerai išaiškintas. Įvairių DME ir pernešėjų indukciją reguliuoja keli ligandų suaktyvinti transkripcijos veiksniai, būtent, ksenobiotiniai receptoriai, reaguodami į nesąmoningus ksenobiotikus 16, 20, 37 . Nepaisant reikšmingumo ksenobiotikų metabolizme ir ksenobiotikų sukelto hepatotoksiškumo, ksenobiotinių receptorių funkcija hPSC-HLC nebuvo išsamiai ištirta. Šiame tyrime mes ištyrėme trijų ksenobiotinių receptorių, CAR, PXR ir AHR, funkciją reguliuojant DME ir transporterio išraišką hPSC-HLC. Genų ekspresijos analizė atskleidė pastebimą daugumos I fazės fermentų ir transporterių, reguliuojamų CAR ir PXR, transkripcijos lygį tiek hESC, tiek hiPSC-HLC (2a, b pav.). CAR mRNR lygis buvo daug mažesnis tiek hESC, tiek hiPSC-HLC, nei vaisiaus ir suaugusiųjų kepenyse (3a pav.), O PXR mRNR buvo vos aptinkama (3b pav.). Šie rezultatai rodo, kad žymiai mažesnį DME ir transporterio ekspresijos lygį gali lemti minimali CAR ir PXR ekspresija. Iš tikrųjų naujagimio aktyvinimas CAR sukelia ilgalaikę epigenetinę atmintį ir nuolatinę CAR tikslinių genų indukciją pelių kepenyse 42 . Be to, PXR aktyvinimas pagal mikrobų šalutinius produktus skatina metabolinį hPSC-HLC ir vaisiaus hepatocitų brendimą 43 .

CAR ir PXR transkripcijos reguliavimo mechanizmai buvo išsamiai ištirti; tačiau apie jų išraišką mažai žinoma. Neseniai buvo įrodyta, kad epigenetinė modifikacija, pavyzdžiui, DNR metilinimas ir histono modifikacija, yra susijusi su PXR 44, 45 ekspresijos ir aktyvumo reguliavimu . Bonder ir kt. Atlikta epigenomų lyginamoji analizė . parodė, kad su vaisiaus kepenų metabolizmu susijusių genų skirtingi DNR metilinimo modeliai tarp žmogaus vaisiaus ir suaugusiojo kepenų buvo glaudžiai susiję su raidos pokyčiais jų ekspresijoje 46 . Taigi mes ištyrėme ryšį tarp DNR metilinimo ir CAR ir PXR transkripcinio aktyvumo hPSC-HLC. Bisulfito sekos analizė atskleidė, kad promotoriaus hipermetilinimas sąlygojo CAR ir PXR raiškos slopinimą (4a, b, d pav.), Kuris greičiausiai buvo susijęs su sumažėjusiu transkripcijos aktyvumu (5 pav.). Tiek žmogaus CAR, tiek PXR geba reguliuoti įvairių DME (pvz., CYP2B6, CYP2C9, CYP3A4 ir UGT1A1) ir vaistų pernešėjų, tokių kaip MDR1, 47 ekspresiją. Nors PXR aktyvacija gali neselektyviai sukelti CYP2B6 ir CYP3A4 ekspresiją, CAR pirmiausia indukuoja CYP2B6 ekspresiją 48 . Pabrėžtina, kad hESC ir hiPSC-HLC, apdoroti CITCO ir SR12813, selektyviais žmogaus CAR ir PXR agonistais 21, 24, parodė tik subtilius CAR ir PXR tikslinių genų ekspresijos lygio pokyčius (5a, b pav.). Rezultatai parodė, kad CAR ir PXR neveikė kaip ksenosensoriai ar transkripcijos reguliatoriai nei hESC, nei hiPSC-HLC. Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad nesubrendęs vaistų metabolizmas hPSC-HLCs bent iš dalies gali būti susijęs su CAR ir PXR transkripcinio aktyvumo stoka dėl promotoriaus hipermetilinimo.

AHR yra HLH (spiralės-kilpos-spiralės) -PER-ARNT-SIM (bHLH-PAS) baltymų šeimos heterodimerinių transkripcijos veiksnių, veikiančių kaip tarpląstelinių signalų jutikliai ir aplinkos įtempiai, narys 19, 49 . Šis ksenobiotinis receptorius gali palaikyti hiperaktyvaciją per daugelį policiklinių aromatinių angliavandenilių (pvz., BaP), plokštuminių halogenintų aromatinių angliavandenilių (pvz., Dioksinų) ir endogeninių cheminių medžiagų, kurios sukelia įvairius toksikologinius atsakus 27 . AHR aktyvavimo svarba kritinėse navikogenezės stadijose yra didelis akademinių tyrimų dėmesys 28, 29 . Nors išsamūs graužikų tyrimai in vivo suteikė vertingų įžvalgų apie AHR sąlygotą toksiškumą, AHR ligandų surišimo afiniteto tarp žmonių ir graužikų rūšių skirtumai sukūrė patikimų žmogaus ląstelių modelių poreikį 28, 50, 51 .

Šiame tyrime mes parodėme, kad vidinė AHR, kaip ksenobiotinio jutiklio, funkcija, taip pat kaip ligando aktyvuotas transkripcijos faktorius, yra atkuriama hPSC-HLC. AHR mRNR ekspresijos lygiai hESC ir hiPSC-HLC buvo panašūs į PHH, taip pat ir suaugusiųjų kepenų (2c ir 3c pav.), O AHR promotoriaus DNR metilinimo schema buvo panaši į PHH (4c pav.). AHR suaktyvinimas endogeniniu agonistu ir keliomis toksiškomis medžiagomis, įskaitant BaP, TCDD ir 3-MC, sąlygojo žymius tikslinių genų, įskaitant CYP1A1 ir CYP1B1 , indukciją hPSC-HLC (5 ir 7 pav.). Be to, ChIP tyrimai aiškiai parodė tiesioginį AHR-DNR jungimąsi prie XRE motyvo CYP1A1 ir CYP1B1 promotoriuose, reaguojant į BaP, TCDD ir 3-MC gydymą (6a, c pav.). Priešingai nei CYP1A1 ir CYP1B1 , konstitucinė CYP1A2 mRNR raiška buvo vos aptinkama hESC ir hiPSC-HLC (2c pav.). AHR agonistai, įskaitant BaP, 3-MC ir TCDD, reikšmingai nesukėlė AHR įsitraukimo į CYP1A2 promotorių (6b pav.). Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad žema CYP1A2 ekspresija hESC-HLC yra susijusi su CpG vietų hipermetilavimu ir histonų modifikacijomis, tokiomis kaip represyvaus histono žymėjimas histono H3, trimetilinto lizine 27 52 . Todėl ji siūlo manyti, kad šios epigenetinės moduliacijos slopina AHR įsitraukimą į CYP1A2 promotorių hPSC-HLC.

Naujausi pranešimai išryškino daugybę AHR fiziologinių funkcijų, išskyrus ksenobiotikų jutiklį ir transkripcinį reguliatorių, kontroliuojantį ksenobiotikų metabolizmą. Šie naujai nustatyti AHR funkciniai vaidmenys vėžiui, uždegimui ir adaptaciniam imunitetui 28, 53, 54 rodo, kad AHR antagonizmas gali būti naujas terapinis taikinys vėžiui ir imuninei ligai gydyti. Mes parodėme, kad TMF veiksmingai slopino AHR tarpininkaujantį endogeninių tikslinių genų, neatsižvelgiant į ląstelės tipą, transkripciją, net esant BaP ir TCDD (8 pav.). Priešingai, TMF parodė skirtingą slopinamąjį poveikį 3-MC tarp PHH, hESC-HLC ir hiPSC-HLC, tai galima paaiškinti 3-MC sukeltomis CYP1A1 ir CYP1B1 transkripcijomis per AHR nepriklausomą mechanizmą. Neseniai keli tyrimai parodė, kad 3-MC tiesiogiai aktyvuoja α estrogeno receptorius, gebančius moduliuoti AHR tarpininkaujamą taikinio geno transkripciją 55, 56, 57 . Apibendrinant, mūsų AHR agonistų ir antagonistų poveikio tyrimai parodė, kad hPSC-HLCs gali atkurti vidines AHR funkcijas. Be to, mūsų duomenys neparodė reikšmingų skirtumų tarp hESC ir hiPSC-HLC, kalbant apie AHR ksenosensorinį ir transkripcinį aktyvumą. Taigi, išvestiniai HLC iš hESC ir hiPSC gali būti naudingas alternatyvus modelis numatant AHR sukeltą toksiškumą ir nustatant galimus AHR taikomus vaistus.

Medžiagos ir metodai

Etikos pareiškimas

Šiame tyrime naudojamus hESC ir hiPSC patvirtino Korėjos toksikologijos instituto etikos komitetas (patvirtinimo numeris: 2013-001), o apie šio tyrimo patvirtinimą pranešta Korėjos ligų kontrolės ir prevencijos centrams. Metodai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių.

Kepenų diferenciacija

HESC (CHA-hES15 ląstelių linija) ir hiPSC buvo palaikomos, kaip aprašyta anksčiau 58 . Be to, hESC ir hiPSC buvo diferencijuoti į hepatocitus, kaip buvo aprašyta anksčiau su kai kuriais pakeitimais 59 . Trumpai tariant, hESCs ir hiPSCs 4 dienas buvo auginami Matrigel (Corning, Tewksbury, MA, JAV) mTeSR1 (Stem Cell Technologies, Vankuveris, Kanada). Po to hESC buvo inkubuojami RPMI-1640 (Lonza, Baltimorė, MD, JAV), kuriuose yra 0, 5 mg / ml galvijų serumo albumino (BSA, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), 1 × B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV), 50 ng / ml aktyvino A (Peprotech, Rocky Hill, NJ, JAV) ir 0, 5 mM natrio butirato (Sigma-Aldrich) 1 dieną, o po to dar 4 dienas auginami toje pačioje terpėje, išskyrus tai, kad natrio butirato koncentracija buvo sumažinta iki 0, 1 mM. Po apdorojimo aktyvino A ląstelės buvo kultivuojamos RPMI-1640, turinčiose 0, 5 mg / ml BSA, 1 × B27, 10 ng / ml 4 fibroblastų augimo faktoriaus (FGF4, Peprotech) ir 10 ng / ml hepatocitų augimo faktoriaus (HGF, Peprotech). ) 5 dienas. Kepenų brendimas buvo skatinamas auginant ląsteles hepatocitų auginimo terpėje (HCM, Lonza), papildytas 10 ng / ml FGF4, 10 ng / ml HGF, 10 ng / ml onkostatino M (Peprotech) ir 0, 1 μM deksametazono (Sigma-Aldrich). 7 dienos. Kultūros terpė buvo keičiama kasdien.

HESC ir hiPSC-HLC apibūdinimas

FACS, imunocitochemija ir funkciniai tyrimai buvo atlikti, kaip aprašyta papildomose medžiagose ir metoduose.

Žmogaus kepenų mėginiai, pirminė hepatocitų kultūra ir dozavimas

Bendra RNR, gauta iš žmogaus vaisiaus ir suaugusiųjų kepenų, buvo atitinkamai nupirkta iš „Clontech Laboratories“ (Palo Alto, CA) ir „Agilent Technologies“ (Palo Alto, CA). Pirminiai žmogaus hepatocitai (BD Gentest ™ Cryo žmogaus hepatocitai, BD Biosciences, donoro Nr. HFC 476 ir 261) buvo dedami į kolagenu I dengtas kultūros plokšteles (Corning), naudojant „Gentest TM“ didelio gyvybingumo CryoHepatocitų atkūrimo rinkinį (Corning) pagal gamintojo instrukcijas. . Eksperimentai buvo atlikti po 24 valandų. Cheminės medžiagos buvo įsigytos iš „Sigma-Aldrich“, „Cayman Chemicals“ (Ann Arbor, MI) arba „Tocris Bioscience“ (Ellisville, MO). Norint aktyvuoti CAR, PXR ir AHR, hESC- ir hiPSC-HLC buvo apdoroti HCM (Lonza) su 100 nM CITCO, 200 nM SR12813, 500 nM ITE arba 0, 1% tūrio / tūrio DMSO (kaip kontroline medžiaga), ištirpinto kultūroje. terpė 6 ir 24 h. Norėdami suaktyvinti ir slopinti AHR, hESC- ir hiPSC-HLC buvo apdoroti HCM (Lonza) su 1 μM BaP, 10 nM TCDD, 1 μM 3-MC arba 0, 1% tūrio / tūrio DMSO su ištirpintu 10 μM TMF arba be jo. auginimo terpėje 6 val.

Genų ekspresijos profiliavimas

Visa RNR iš ląstelių buvo išskirta naudojant „PureLink RNA Mini Kit“ (Life Technologies) pagal gamintojo instrukcijas. RNR vientisumas buvo nustatytas naudojant 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Mikro matricos analizei buvo naudojamas „GeneChip“ žmogaus genomas U133 plius 2.0 masyvas (Affymetrix, Santa Clara, CA). Visi cDNR sintezės, biotino žymėjimo, suskaidymo, hibridizacijos, dažymo, plovimo ir nuskaitymo etapai buvo atlikti pagal gamintojo instrukcijas. Neapdorotos intensyvumo vertės mikrotraumuose buvo normalizuotos atliekant patikimą daugiamatricinę analizę (RMA) ir anotuotos naudojant „GeneSpring GX“ programinę įrangą, 13.0 versiją (Agilent Technologies). Ksenobiotinių receptorių žinomi ir numanomi taikiniai buvo identifikuoti ir parinkti naudojant išradingumo kelio analizę („Ingenuity ® System“, www.ingenuity.com).

Kiekybinis realaus laiko PGR (qRT-PGR)

Visa RNR iš ląstelių buvo išskirta naudojant „PureLink RNA Mini Kit“ (Life Technologies) ir atvirkščiai perrašyta naudojant SuperScript II atvirkštinę transkriptazę (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą. Genų ekspresijos lygiai buvo išmatuoti realaus laiko RT-PGR naudojant „Power SYBR Green PCR Master Mix“ (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Santykiniai išraiškos lygiai buvo analizuojami naudojant „StepOnePlus“ realaus laiko PGR sistemą („Applied Biosystems“) pagal gamintojo instrukcijas. Kiekvienam mėginiui buvo atliktos trigubos PGR reakcijos. Genų ekspresijos analizei naudojami pradmenys yra išvardyti 1 papildomoje lentelėje. Palyginamai kiekybiškai įvertinti realaus laiko PGR rezultatai buvo išreikšti santykiniu raukšlės pokyčiu, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, normalizavus glicerraldehido-3-fosfato dehidrogenazei ( GAPDH ). ΔCt (SΔCt) vertės buvo apskaičiuotos kaip skirtumas tarp GAPDH Ct verčių ir taikinio. Kontrolinių ląstelių ΔCt vertė buvo naudojama kaip kontrolinė ΔCt (CΔCt) vertė. Santykiniai genų ekspresijos lygiai buvo nustatyti naudojant formulę 2 - (SΔCt – CΔCt) .

Bisulfito sekos nustatymas

Genomo DNR iš ląstelių buvo išskirta naudojant „G-DEX IIc“ genominės DNR ekstrakcijos rinkinį („iNtRON Biotechnology“, Gyeonggi-do, Korėja) pagal gamintojo protokolą. Bisulfito konversija buvo atlikta naudojant EZ DNR metilinimo-aukso rinkinį (ZYMO RESEARCH, Orange, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Bisulfitui specifinės PGR reakcijos buvo atliktos naudojant „GeneAmp PCR System 9700“ (Applied Biosystems), naudojant šį protokolą: 95 ° C 15 minučių, 50 ciklų 95 ° C 20 s, 55 ° C 40 s, 72 ° C. 30 s ir pratęsimas 72 ° C temperatūroje 10 min. PGR panaudotos pradmenų sekos yra išvardytos 2 papildomoje lentelėje. PGR produktai buvo išgryninti naudojant MEGAquick-spin viso fragmento DNR gryninimo rinkinį (iNtRON Biotechnology), klonuoti į pGEM T vektorių (Promega, Madison, WI, JAV) ir sekuojami naudojant kapiliarų DNR sekos „ABI 3730XL“ (Applied Biosystems). CpG vietų metilinimo būsena buvo nustatyta iš sekos duomenų, naudojant programinę įrangą QUMA (QUantification tool for Methylation Analysis) 60 .

Chromatino imuninis nusėdimas

ChIP eksperimentai buvo atlikti naudojant EZ ChIP TM chromatino imunoprecipitacijos rinkinį (Millipore) pagal gamintojo protokolą. Imuninis nusodinimas buvo atliktas naudojant AHR antikūną (Thermo Fisher Scientific Pierce, PA5-29642). Triušio IgG antikūnas (Abcam, ab37415) buvo naudojamas kaip izotipo kontrolė. Išgryninta DNR buvo analizuojama realaus laiko PGR. Kiekybinė PGR buvo atlikta naudojant „StepOnePlus“ realaus laiko PGR sistemą („Applied Biosystems“) pagal gamintojo instrukcijas. PGR panaudotos pradmenų sekos yra išvardytos 3 papildomoje lentelėje. Kiekvienam mėginiui buvo atliktos trigubos PGR reakcijos. ChIP kiekybiniai PGR rezultatai buvo apskaičiuoti naudojant ΔΔCt metodą. Atitinkamos ChIP frakcijos Ct vertė buvo normalizuota atsižvelgiant į įvestos DNR frakcijos Ct vertę (ΔCt). Tada ChIP frakcijos Ct vertė buvo normalizuota iki IgG kontrolės Ct vertės (ΔΔCt). Imunoprecipitacijos praturtėjimas raukšlėmis buvo apskaičiuotas naudojant 2 -Ct .

Statistinė analizė

Duomenys, gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų, buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD) ir statistiškai analizuojami atliekant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), naudojant Bonferroni daugkartinį palyginimo testą ir t-testą su Mann-Whitney bandymu, naudojant „GraphPad Prism“ programinę įrangą (San Diego, CA, JAV). P reikšmė <0, 05 buvo laikoma reikšminga.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Kim, H.-M. et al. Arilinių angliavandenilių receptorių kseno jautrumas žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių, gautų iš hepatocitų, tipo ląstelėms. Mokslas. Rep. 6, 21684; „doi“: 10.1038 / srep21684 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.