Yap / taz-mir-130/301 molekulinė grandinė kontroliuoja fibrozę sisteminiu lygmeniu žmogaus ligų ir fiziologinių sąlygų tinkle | mokslinės ataskaitos

Yap / taz-mir-130/301 molekulinė grandinė kontroliuoja fibrozę sisteminiu lygmeniu žmogaus ligų ir fiziologinių sąlygų tinkle | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ligos
  • Ligos mechanizmai
  • miRNR

Anotacija

Fibrozės, paveikiančios daugybę audinių lovų, molekulinė kilmė išlieka nevisiškai apibrėžta. Anksčiau mes apibūdinome kritinės tarpląstelinės matricos (ECM), sutvirtintos mechaninio jautrumo mikroRNR-130/301 šeimoje, kurią aktyvina YAP / TAZ ko-transkripcijos veiksniai, kontrolės vaidmenį skatinant plautinę hipertenziją (PH). Mes iškėlėme hipotezę, kad panašūs mechanizmai gali diktuoti fibrozę kituose audinių sluoksniuose už plaučių kraujagyslių ribų. Naudodamiesi mikroRNR tikslo numatymo in silico deriniu, 137 žmogaus ligų ir fiziologinių būsenų transkriptine analize ir patobulintu genų tinklo modeliavimu, mes numatėme, kad „microRNA-130/301“ šeima yra pagrindinis fibrozinių kelių reguliatorius visoje atrodytų, kad skirtingos ligos ir sąlygos. Esant dviem tokioms ligoms (plaučių fibrozė ir kepenų fibrozė), mikroRNR-130/301 slopinimas užkirto kelią sukelti ECM modifikaciją, YAP / TAZ ir pasrovės audinių fibrozę. Taigi mechaninės jėgos veikia per centrinę grįžtamojo ryšio grandinę tarp mikroRNR-130/301 ir YAP / TAZ, kad palaikytų bendrą fibrozinį fenotipą žmogaus fiziologinių ir patofiziologinių būsenų tinkle. Toks sąsajų, pagrįstų bendromis ligos ir ne ligų genų tinklų sistemomis, pergalvojimas gali turėti didelę įtaką būsimoms suvienodintoms diagnostinėms ir terapinėms strategijoms.

Įvadas

Audinių standumo ir tarpląstelinės įtampos padidėjimą kontroliuoja tarpląstelinės matricos molekuliniai pokyčiai ir yra bendrieji fibrozės požymiai, kaip nustatyta sveikata ir liga 1, 2 . ECM rekonstravimas yra sudėtingas procesas, vykstantis keičiant pusiausvyrą tarp matricos nusėdimo ir matricos skilimo bei per kolageno sukryžminimo fermentus, tokius kaip lizilo oksidazė (LOX). Du susiję transkripciniai koaktyvatoriai, YAP (taip susijęs baltymas 1) ir TAZ (arba WWRT1) yra nepaprastai svarbūs mechanotransdukcijai - procesui, kuris tarpląstelinius mechaninius signalus paverčia ląstelių signalizacijos signalu 3 ir reguliuoja ląstelių proliferaciją ir išgyvenimą 4, 5 bei organų augimą 6 . Šie koaktyvatoriai buvo vis labiau vertinami kaip aktyvūs veiksniai, kontroliuojantys ECM plastiškumą 7 normalios raidos ir fiziologijos srityse bei patologinę fibrozę 8 . Neseniai aprašėme kritinį ECM, sutvirtinančio mechaniškai jautraus mikroRNR-130/301 šeimos, aktyvuotos YAP / TAZ, vaidmenį skatinant plaučių hipertenziją (PH) 9 . Identifikuojant tokią savarankiškai besiplečiančią grįžtamojo ryšio kilpą, sukeliančią perivaskulinę fibrozę, buvo sugalvota, kad panašūs molekuliniai mechanizmai, apimantys tarpląstelinius biomechaninius užuominas ir mikroRNR (miRNR) aktyvumą, vaidina svarbų vaidmenį kituose fibroziniuose kontekstuose.

Kalbant konkrečiau, atskiros miRNR šeimos dažnai kontroliuoja kelis tikslinius genus ir fenotipus, todėl jie tampa patraukliais kandidatais, kaip aukščiausio lygio „pagrindiniais“ reguliatoriais, atrodytų, įvairiais procesais, įskaitant ląstelių-ląstelių ir ląstelių-matricų sąveiką 10 . Tarp miRNR biologijos ir biomechaninių ECM savybių, esančių įvairių tipų audiniuose, nesutaptis buvo iš esmės neištyrinėtas. Neseniai mes pasinaudojome tinklo teorija, norėdami nuspėti silico vyraujančias miRNR, valdančias specifinį ligos genų tinklą 11, 12 . Atsižvelgiant į plačią žmogaus ligų, kuriose ECM plastiškumas gali būti akivaizdus, ​​spektrą, mes iškėlėme hipotezę, kad ECM rekonstravimas gali būti patogeniškas ar normalus fiziologinis požymis, pasidalijantis iš pažiūros skirtingomis sąlygomis, o miRNR gali būti šios molekulinės kaskados priešakinis reguliatorius. Siekdami išspręsti šiuos klausimus, sukūrėme pažangų tinklu pagrįstą požiūrį, kad būtų galima ieškoti visuotinio miRNR reguliatoriaus (-ų) žmogaus fibrotiniams fenotipams, esant 137 skirtingoms žmonių ligoms ir fiziologinėms sąlygoms.

Tai darydami, mes nustatėme, kad miR-130/301 yra pagrindinis ECM biologijos reguliatorius visoje fiziologinių ir patofiziologinių būsenų grupėje - visa tai susiję su bendru fibrozei svarbių genų parašu. Apskritai šie rezultatai apibūdina šią miRNR šeimą kaip esminį ryšį tarp biomechaninio streso ir fibrozės in vivo kontekste. Šie duomenys taip pat pabrėžia vis patrauklesnę miR-130/301 kandidatūrą selektyviam terapiniam taikymui tokiose susijusiose ligose.

Rezultatai

Tinklo analizė rodo, kad miR-130/301 nariai nukreipti į bendrą fibrozinių genų kohortą, susijusią su žmonių ligomis ir fiziologinėmis būsenomis, susijusiomis su PH

Atsižvelgiant į YAP / TAZ-miR-130/301 grandinės svarbą PH 9, mes postuluojame, kad ši grįžtamojo ryšio kilpa gali būti panašiai aktyvi kontroliuojant ECM plastiškumą kitose fibrozinėse būsenose. Norėdami apibrėžti miRNR, atliekančius visapusišką reguliavimo audinių fibrozės kontrolę skirtinguose kontekstuose, mes panaudojome miRNR tikslo numatymo in silico derinį, transkriptominę 137 žmogaus ligos ir fiziologinių būsenų analizę ir pažangų genų tinklo modeliavimą (1A pav.). Pirmiausia, norėdami nustatyti miRNR, turinčius visuotinį norminį poveikį tam tikroje būklėje, anksčiau aprašėme „miRNR apimantį rezultatą“ (žr. Metodus ), pagrįstą numatomų miRNR taikinių skaičiumi ir architektūriniu pasiskirstymu reprezentaciniame genų tinkle 12 . Naudodamiesi in silico „fibrozės tinklu“ 9, sudarytu iš kurtų sėklų genų, kurie, kaip žinia, yra susiję su ECM rekonstravimu, ir jų pirmojo laipsnio interakcionieriai (1 pav. B), mes nustatėme, kad numatomame baseine yra platus ir įvairus veiksnių, susijusių su ECM rekonstrukcija, faktorius. miR-130/301 tikslinių genų ir su jais susijusių tinklo kaimynų.

Image

( A ) Strategija, naudojama identifikuoti miRNR, kurios sistemos lygiu kontroliuoja fibrozę. ( B ) Fibrozės tinklas, sudarytas iš žinomų fibrozinių genų (sėklų genų, apskritimų) ir artimiausių jų pirmojo laipsnio interakcionierių (trikampių, žr. Papildymą). Spalvų kodavimas žymi įtraukimą į žinomus anotuotus fibrozės ir ECM kelius (iš GO, Kegg, Reactome, NCBI PID ir Biocarta duomenų bazių) ir parodo integruotų pirmojo laipsnio interakcionierių svarbą fibroziniams procesams. „miR-130/301“ pateko į penkių geriausių „miRNR“ dydį pagal apimtį šiame tinkle (taikiniai apjuosti juoda spalva), atspindintį jo tvirtą sistemos lygio fibrozės ir matricos rekonstravimo valdymą. ( C ) Remiantis transkriptiniu profiliavimu ir tinklo sudarymu (žr. Metodus), 137 tinklai, vaizduojantys įvairias ligos ir fiziologines būsenas, buvo suskirstyti į grupes pagal persidengimą su fibrozės tinklu. Tada MiRNR buvo vertinamos pagal vienpusę atvirkštinę koreliaciją (vienpusė ANOVA) iš jų vidutinio priskiriamo aprėpties balų rango grupėse. „miR-130/301“ pateko tarp penkių geriausių miRNR, pabrėždamas jo svarbą ligoms, turinčioms stiprų fibrozinį komponentą (raudoną dėžutę). ( D ) Iš 137 ligų ir fiziologinių būsenų buvo sukurtas sutrumpintas tinklas (indeksuotas S1 lentelėje). Sąlygų kraštai žymi reikšmingą sutapimą (hipergeometrinė p vertė <0, 1). Sąlygos raudonai buvo įvertintos labai gerai, atsižvelgiant į jų ryšį su fibrozės tinklu ir „miR-130/301“ šeima (25% viršuje, kaip išdėstyta S1 lentelėje), ir nustatyta, kad visos jos turi skirtingą fibrozinių genų, įterptų į sutapimą, grupę. su PH tinklu. Prognozuojamas fibrozinių būsenų paplitimas, susijęs su miR-130/301. Tai įrodo, kad pasitelkiant šią miRNR šeimą kontroliuojama bendra fibrozinė programa, turinti platų spektrą žmogaus patologijos ir sąlygų, nepriklausančių nuo plaučių kraujagyslių (žr. S3 lentelę).

Visas dydis

Norėdami nustatyti šių ECM specifinių miRNR veiksmų ryšį su kitais fiziologiniais kontekstais, iš viešai prieinamų duomenų bazių sudarėme paveikto žmogaus audinio transkriptinių duomenų rinkinių rinkinį, palyginti su įprastomis kontrolinėmis medžiagomis (n = 137), atspindinčius platų žmogaus skerspjūvį. patologija ir fiziologinės būsenos (žr. metodus ir S1 lentelę). Norint kontroliuoti statistinį triukšmą, atsirandantį dėl didelių tinklo dydžio pokyčių, buvo sukonstruoti specifiniai ligos genų tinklai, kiekviename rinkinyje parinkus 250 geriausių (keičiant raukšlę) ženkliai diferencijuotai išreikštus genus, palyginti su nepaveiktais kontroliniais elementais. Mes susiejome šiuos sėklų genus su konsoliduotu interaktomu ir įtraukėme gerai sujungtus pirmojo laipsnio interaktorius, kad „sustiprintume“ šių tariamų sistemos lygio pokyčių molekulinį signalą. Kiekvienas tinklas buvo suskirstytas į vieną iš keturių grupių, kaip apibrėžta didėjant dubliavimui su fibrozės tinklu. Kiekvieno iš 137 tinklų atveju miRNR buvo suskirstyti pagal apimtį, kaip aprašyta aukščiau. Nors paaiškėjo, kad daugelis miRNR gali turėti reikšmingų veiksmų fibrozės srityje, remdamiesi šiais duomenimis, mes nustatėme, kad miR-130/301 šeimos nariai yra aukščiausio rango miRNR (rangas # 4) su tvirta atvirkštinė atvirkštinė koreliacija (vienpusė ANOVA). tarp jų priskiriamo apimties reitingo ir fibrozinio komponento dydžio kiekvienam iš 137 tinklų (1 pav., C lentelė, S2). Kartu su šios miRNR šeimos aukščiausiu reitingu pagal apimtį tiesiogiai atsižvelgiant į fibrozės tinklą (1 pav. B), šios išvados numatė, kad miR-130/301 nariai yra neatsiejama fibrozinės programos dalis įvairiose ligose ir audinių lovose. Be to, atsižvelgiant į žinomą miR-130/301 reikšmingumą PH 12, tarp aukščiau aprašytų 137 tinklų, pogrupis, įvertintas aukštai pagal jų sąsajas su fibrozės tinklu ir miR-130/301 šeima (S1 lentelė, S3)., buvo nustatyta, kad jie dalijasi skirtinga fibrotinių genų kohorta, įterpta į persidengimą su anksčiau praneštu 12 PH ligos genų tinklu (1 pav. D, S3 lentelė). Taigi tinklo analizės derinys numatė unikalią miR-130/301 šeimos vietą fibrotinių genų programavimo sankirtoje ir šioje susijusių ligų bei fiziologinių būsenų grupėje.

„miR-130/301“ išraiška koreliuoja su YAP / TAZ, PPARY-APOE-LRP8 ašies, aktyvavimu ir matricos sustingimu plaučių fibrozėje ir kepenų fibrozėje

Norėdami parodyti tariamą miR-130/301 biologiją šioje fiziologinių būsenų grupėje, toliau buvo atrinkta plaučių fibrozė (11 ir 19 indeksai, S1 lentelė) ir fibrozinė kepenų liga (4 indekso liga, S1 lentelė). tardymas. Pelių bleomicino sukeltos plaučių fibrozės modeliuose (2 pav.) Padidėjo miR-130/301 raiška (2A, B pav.). Atsižvelgiant į miR-130/301 indukciją mechaniškai jautrių YAP / TAZ transkripcijos veiksnių metu esant PH 9, pastebėta teigiama koreliacija tarp miR-130a ekspresijos, YAP branduolio lokalizacijos ir kolageno kryžminio sujungimo plaučių fibrozėje (2 pav. C). Be to, atsižvelgiant į tiesioginį susijusių faktorių sumažėjusį peroksisomų proliferatorių suaktyvintą gama receptorių (PPARγ), apolipoproteino E (APOE) ir apolipoproteino E receptorių LRP8 miR-130/301 PH 9, tiek Pparγ, tiek Lrp8 sumažėjo. esant plaučių fibrozei ( S1 pav. ). Norint apibrėžti tikslius ląstelių tipus, kuriuose buvo sureguliuotas miR-130/301, buvo sukurtas in situ protokolas, skirtas tuo pačiu metu nudažyti miRNR ir baltymą (žr. Metodai ). Pelių, gydytų bleomicinu, plaučiuose miR-130a ekspresija buvo sureguliuota parenchiminiuose fibroblastuose, tai parodo miR-130a lokalizacija kartu su vimentinu, fibroblastų žymekliu ir α-lygiųjų raumenų aktinu (α – SMA). tiek aktyvuotų fibroblastų, tiek lygiųjų raumenų ląstelių žymeklis (2 pav. D). Atitinkamai, kaip numatė mūsų tinklo algoritmas (Rodyklės ligos Nr. 11 ir Nr. 19, S1 lentelė), tie patys ryšiai tarp miR-130/301, YAP / TAZ ir kolageno kryžminio ryšio buvo stebimi plaučių audinyje, gautame iš sergančių pacientų grupės. nuo idiopatinės plaučių fibrozės (2E pav., F, S1 pav.). Taigi, be PH, YAP / TAZ-miR-130/301 grįžtamasis ryšys yra aktyvus plaučių fibrozėje ir ypač fibroblastų, anatomiškai nutolusių nuo pačios plaučių kraujagyslės.

Image

Buvo išanalizuotas pelių plaučių fibrozės modelis (bleomicino indukcija, n = 9–10 / grupė). miR-130/301 žymiai padidino RT-qPCR ( A ), o serijinėse plaučių ( B ) dalyse buvo padidėjęs kolagenas (Picrosirius raudona), miR-130a ir YAP, in situ hibridizavus. ( C ) Sergančiuose plaučiuose miR-130a ir YAP branduolių lokalizacija buvo teigiamai koreliuojama su kolageno sukryžiavimu. ( D ) MiR-130a ir fibroblastų žymeklių (vimentino ir α-SMA) dažymas in situ buvo atliekamas fluorescencine mikroskopija. Plaučiuose, kuriuose gydytas bleomicinas, padidėjo Vimentin / miR-130a ir α – SMA / miR-130a teigiamų ląstelių skaičius (n = 8 kiekvienoje grupėje; 5 20X laukai skaidrėje buvo kiekybiškai įvertinti). ( E, F ) Pacientų, sergančių idiopatine plaučių fibroze, plaučiuose miR-130/301 ir YAP1 padidėjo dėl RT-qPCR ( E ; [kontrolė n = 5, fibrozė n = 15]) ir in situ dėmių ( F ; [kontroliuoja n = 8, fibrozė n = 10]). (Taip pat žr. S1 pav.). Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

Panašiai, pelės anglies tetrachlorido (CCl 4 ) sukeltos kepenų fibrozės modelyje (3 pav.), MiR-130/301 padidėjo (3A pav., B), o Pparγ ir Lrp8 atitinkamai sumažėjo ( Fig. S2 ), lydimas teigiamos koreliacijos tarp kolageno sukryžiavimo, miR-130a ekspresijos ir YAP branduolio lokalizacijos (3 pav. C). Pelių, apdorotų CCl4, dėme per kepenų dėmę in situ , miR-130a ekspresija buvo lokalizuota tiek su desminu, tiek su žvaigždžių ląstelių žymekliu, tiek su α – SMA (3D pav.). Panašiai, vadovaujantis mūsų tinklo prognozėmis dėl įvairių fibrozinių kepenų ligų (pavyzdžiui, indekso liga Nr. 4, S1 lentelė), nustatyta, kad miR-130a ir YAP padidėja fibroziniame žmogaus kepenų audinyje - šiuo atveju kilusiame nuo nealkoholinio steatohepatito ( 3E pav. Pacientų demografija S4 lentelėje). Taigi, kaip nusako mūsų in silico prognozės, nesiskiriančios nuo PH, YAP / TAZ-miR-130/301 grandinė yra aktyvuota tiek plaučių, tiek kepenų ligose gyvūnams ir žmonėms.

Image

Buvo išanalizuotas pelių kepenų fibrozės modelis (CCl 4 indukcija, n = 9–10 / grupė). miR-130/301 žymiai padidino RT-qPCR ( A ), o serijinėse plaučių ( B ) dalyse buvo padidėjęs kolagenas (Picrosirius raudona), miR-130a ir YAP, in situ hibridizavus. ( C ) Sergančiuose plaučiuose miR-130a ir YAP branduolių lokalizacija buvo teigiamai koreliuojama su kolageno sukryžiavimu. ( D ) MiR-130a dažymas in situ miR-130a ir žvaigždžių ląstelių žymekliais (desminas ir α-SMA) buvo atliekamas fluorescencine mikroskopija. Desmin / miR-130a ir a – SMA / miR-130a teigiamose ląstelėse padaugėjo CCl4 apdorotų kepenų (n = 8 kiekvienoje grupėje; 5 20X laukai skaidrėje buvo kiekybiškai įvertinti). ( E ) Panašiai, in situ dažymas parodė miR-130a ir YAP padidėjimą fibroziniame kepenų audinyje pacientams (n = 4 vienai grupei), sergantiems nealkoholiniu steatohepatitu (NASH + fibrozė) (taip pat žr. S4 lentelę ir S2 pav.). . Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

Priverstinė miR-130/301 ekspresija aktyvuoja pelių ECM remodeliavimąsi ir kepenų fibrozę

Anksčiau įrodėme, kad priverstinė miR-130/301 ekspresija pelių plaučiuose yra pakankama, norint sukelti plaučių hipertenziją 12 ir plaučių kraujagyslių fibrozę 9 . Norint nustatyti, ar miR-130a pakanka kepenų fibrozei sukelti, buvo tiriama lėtinė miR-130a ekspresija kepenyse. MiRNR tiekimas buvo atliekamas serijinėmis (kas 3 dienas per 4 savaites) liposomiškai kapsuliuotų miR-130a oligonukleotidų imitacijų intraperitoninėmis injekcijomis, esant arba neoptimaliai CCl4 dozei (po 0, 1 ml 1 kg kūno per savaitę). Šis protokolas paskatino miR-130a išraišką (bet ne kitus šeimos narius) visame kepenų audinyje (4 pav. A). Toks pristatymas žemyn reguliuojamo tikslinio geno ekspresija Pparγ ir Lrp8, taip pat kukliai aktyvuota Yap1 branduolio lokalizaciją ir kolageno kryžminimą (4B pav. D). Šie efektai buvo sustiprinti tiek pateikus miR-130a, tiek sumažinus CCl 4 dozę, skatinant tvirtą Lrp8 ir Pparγ reguliavimą bei žymiai padidinus Yap1 aktyvaciją ir kolageno sukryžiavimą, palyginti su vien CCl4, CCl 4 + miR. -kontrolė (miR-NC) arba vien miR-130a (4C pav., D). Be to, pakanka priverstinio miR-130a ir padidėjusio ECM sustingimo, kad būtų galima suaktyvinti save stiprinančią grįžtamąjį ryšį ir dar labiau padidinti endogeninės miR-130/301 šeimos raišką (4A pav.). Kartu paėmus, atsižvelgiant į nuo miR-130a priklausomus veiksmus plaučių kraujagyslių erdvėje, šie rezultatai parodė, kad šios miRNR pakanka ir kepenų fibrozei sukelti.

Image

( A ) Kaip įvertintas RT-qPCR, serijinis intraperitoninis miR-130a mimikos oligonukleotido (miR-130a) pristatymas padidino miR-130a visose pelių kepenyse, palyginti su kontrole (miR-NC), tiek su savaitės švirkštimu, tiek be jo. neoptimali CCl 4 dozė. ( B ) Pagal Metavir rezultatą, nei optimali nei CCl4, nei miR-130a dozė nepriklausomai padidino kepenų fibrozę, o miR-130a + CCl 4 dar labiau padidino tokią fibrozę. ( C, D) miR-130a (viršutinė eilutė) hibridizavimas in situ patvirtino veiksmingą pelių patekimą į kepenis. Imunohistochemija taip pat atskleidė, kad miR-130a sumažino Lrp8 ir Pparγ, taip pat šiek tiek padidino YAP branduolio lokalizaciją ir kolageno nusėdimą bei kryžminimą. Be to, miR-130a + CCl4 stipriau sumažino Lrp8 ir Pparγ, taip pat stipriau padidino YAP branduolio lokalizaciją, kolageno nusėdimą ir kryžminimą.

Visas dydis

MiR-130/301 šeimos slopinimas užkerta kelią ECM atstatymui ir ligos progresavimui pelių plaučių fibrozės ir kepenų fibrozės modeliuose

Norint nustatyti, ar miR-130/301 šeimos nariai yra reikalingi plaučių ir kepenų fibrozės fibrozės kontrolei, pelėms buvo atliekama serijinė kontrolė, palyginti su Short-130, antisense oligonukleotidas, kuris patvirtino, kad slopina visus miR-130/301 šeimos narius auginamose ląstelėse. 12 ir in vivo pelių kepenyse (5A, B pav.) Ir pelių plaučiuose (6A, B pav.). Abiejuose plaučių (bleomicino ekspozicijos) ir kepenų (ekspozicija CCl 4 ) fibrozės modeliuose „Short-130“ slopino miR-130/301 ir panaikino miR-130/301 tikslinių genų Pparγ ir Lrp8 žemąjį reguliavimą (5 ir 6C pav.) sumažėjo Lox ekspresija, sumažėjo kolageno ekspresija ir kolageno sukryžiavimas (5C pav., E, F ir 6C, E, F pav.) ir sumažėjo Yap branduolio lokalizacija (5C ir 6C pav.) ir YAP aktyvacija, kurią atspindi CTGF ekspresija (5E pav. ir 6E). Tai darant, miR-130/301 slopinimas reikšmingai sumažino galutinės stadijos fibrozę, įvertintą Metavir (5 pav. D) ir Ashcroft balais (6 pav. D).

Image

Pagal kepenų fibrozės modelį (indukcija CCl4) pelės buvo gydomos Short-NC arba Short-130 (n = 8/10 kiekvienoje grupėje). Buvo patvirtintas trumpas 130 gimdymas (n = 8 vienai grupei; A ) ir aktyvumas (n = 5 vienai grupei; ( B ). Trumpalaikė 130 sumažėjusi fibrozė, įvertinta α – SMA ir kolageno dažymu ( C ), taip pat Metaviro balas ( D ). Dėl dėmės ( C ), „Short-130“ sumažino kraujagyslių YAP branduolio lokalizaciją ir padidino Pparγ bei Lrp8. „Short-130“ taip pat sumažino Ctgf, kolageno izoformų ir Lox ( E ) transkripcijos išraišką bei sumažino kolageno nusėdimas ir kolageno sukryžiavimas ( F ) Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

Image

Plaučių fibrozės (bleomicino indukcijos) modeliu pelės buvo gydomos kontroliniu (Short-NC) arba miR-130/301 inhibitoriumi (Short-130) (n = 8/10 kiekvienoje grupėje). Buvo patvirtintas trumpas 130 gimdymas (n = 8 vienai grupei; ( A ) ir aktyvumas (n = 5 vienai grupei; ( B )). Trumpalaikė 130 sumažėjusi fibrozė, įvertinta α – SMA ir kolageno dažymu ( C ), taip pat kaip Ashcroft balas ( D ). Dėl in situ dėmės ( C ) „Short-130“ sumažino kraujagyslių YAP branduolio lokalizaciją ir padidino Pparγ bei Lrp8. „Short-130“ taip pat sumažino Ctgf, kolageno izoformų ir Lox ( E ) transkripcijos raišką. sumažėjęs kolageno nusėdimas ir kolageno sukryžiavimas ( F ). Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

APOE farmakologinis aktyvinimas naudojant LXR agonistą GW3965 sumažina peri-arteriolarinę fibrozę ir pagerina plaučių fibrozę in vivo

Norėdami nustatyti, ar pasroviui esantis ApoE yra kritinis miR-130/301 sukeltai fibrozei, mes bandėme išvengti bleomicino paveiktų pelių plaučių fibrozės, gydydami ApoE 13, kepenų X branduolinio hormono receptorių agonisto GW3965, farmakologiniu aktyvatoriu (pav. 7). Kai GW3965 buvo švirkščiamas nuosekliai po bleomicino ekspozicijos, kryžminio kolageno susiejimas (7A pav.) Buvo slopinamas, dėl to sumažėjo plaučių fibrozės rodikliai, kuriuos atspindi Ashcroft balas (7B pav.). Remiantis ankstesniais teiginiais apie teigiamą grįžtamąjį ryšį su PH, apimančiu YAP / TAZ-miR-130/301, kurie inicijuoja ir sukelia ECM sustandinimą 9, GW3965 gydymas taip pat sumažino YAP branduolio lokalizaciją (7A pav.) Ir YAP aktyvaciją, kaip atsispindi. sumažėjusia Ctgf išraiška (7 pav. C), taip pat atvirkščiai sumažėjęs Pparγ ir Lrp8 reguliavimas (7 pav. A). Taigi galime daryti išvadą, kad YAP-TAZ-miR-130/301 grandinė veikia kaip pagrindinis fibrotinių genų programavimo ir ECM rekonstravimo reguliatorius įvairiuose patobiologiniuose kontekstuose in vivo . Be to, pateikdami įrodymus apie mūsų in silico prognozes, šie radiniai identifikuoja miR-130/301 šeimos fibrotinius veiksmus kaip vienijantį molekulinį pagrindą, atrodo, skirtingoms, atrodo, skirtingoms ligoms (7 pav. D).

Image

Plaučių fibrozės (bleomicino ekspozicijos) modeliu pelės buvo gydomos LXR agonistu GW3965 arba kontrole (n = 6 vienai grupei), vartojant maistą (100 mg / kg). GW3965 pagerino plaučių fibrozės laipsnį, kiekybiškai įvertindamas α-SMA žymėjimą ( A ) ir Aschcroft balą ( B ). „Picrosirius“ raudonasis dažymas ir in situ pelės plaučių dažymas ( A ) parodė, kad GW3965 sulėtino bleomicino sąlygotą kolageno skersinio susiejimo ir YAP padidėjimą, taip pat sumažėjo Lrp8 ir Ppar γ ekspresija. C) Dėl RT-qPCR, Ctgf, kolageno izoformų ir Lox padidėjo sergančiuose plaučiuose (bleomicinas), tačiau GW3965 sumažino tokį padidėjusį raišką. ( D ) Vieningas YAP / TAZ-miR-130/301 grandinės vaidmens modelis kontroliuojant ECM plastiškumą tarp susijusių ligų. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

Diskusija

Naudodamiesi tinkliniu skaičiavimo modeliavimu ir in vivo eksperimentais, mes apibrėžėme YAP / TAZ-miR-130/301 molekulinę grandinę ir jos paskesnį ECM rekonstravimo valdymą kaip bendrą ir vienijantį žmogaus ligų tinklo ir fiziologinio tinklo pradą. sąlygos (7D pav.). Toks „tinklu pagrįstų“ reguliatorių identifikavimas daro didelę įtaką pagrindinei ECM plastiškumo reikšmei bendrose fibrozinėse kilmėse, siejančiose tariamai skirtingus fenotipus ir patofenotipus. Tai rodo ne tik susijusių farmakologinių strategijų ( ty , miR-130/301 inhibitorių) naudą tokioms susijusioms ligoms, bet ir selektyvaus vartojimo svarbą, siekiant išvengti netyčinių žalingų padarinių, susijusių su manipuliavimo tokiu būdu, kuris plačiai paplitęs tarp fibrozinių procesų, padariniais. Galiausiai, šio metodo sėkmė suteikia daug lauktų eksperimentinių įrodymų, kad kliniškai naudinga iš naujo apibrėžti ligas, remiantis bendrų genų tinklų sistemomis ir jų molekuliniais reguliatoriais 14 .

Mūsų rezultatai rodo pažangių genų tinklo architektūros analizės galią ne tik numatyti atitinkamą fibrozinių genų „programą“, pasidalijamą tarp susijusių žmonių ligų ir fiziologinių būsenų, bet ir identifikuoti jos svarbiausius reguliatorius, pavyzdžiui, „miR-130/301“ šeimą. tos sąlygos (1 ir 7D pav.). Šiuo metu eksperimentiniai įrodymai ir patirtis tik atsiranda, kad būtų galima naudoti tinklo teoriją žmogaus ligų analizei atlikti. Vis labiau suprantama, kad „tarpiniai“ fenotipai, tokie kaip audinių fibrozė, yra paplitę tarp žmonių ligų, kurios, kaip manoma, vystosi savarankiškai. Molekulinis sudėtingų žmonių ligos būsenų sutapimas pradėtas tardyti visos sistemos lygmeniu 15, 16, tačiau mūsų galimybės pastebėti visa apimančius „tinklu pagrįstus“ reguliatorius egzistuoja patologinėmis sąlygomis. Šiuo aspektu mūsų tinklo analizė taip pat atskleidė bendrus miR-130/301 specifinius skirtumus tarp ligų, kurios retai, jei kada nors, buvo kliniškai susijusios su fibroze ( ty , Ebolos infekcija, šizofrenija, be kita ko; S1 lentelė). Tariamas miR-130/301 ir ECM biologinis ryšys su šizofrenija yra ypač intriguojantis, nes tai yra sutrikimas, kai įtariama, kad ECM rekonstravimas perineuroniniuose tinkluose kontroliuoja galutines psichines apraiškas 17 . Be to, įmanoma, kad tarp miR-130/301 egzistuoja dar sudėtingesnis ir platesnis interaktomas ir numatoma, kad papildomos miRNR atpažįsta dideles to paties fibrozinės ligos tinklo dalis (1 pav., S2 lentelė). Išsamesnė to interaktomo architektūros analizė galėtų dar atskleisti dar neaprašytus mechanistinius ryšius tarp šios miRNR šeimos, ECM biologijos ir, atrodo, nesusijusių biologinių procesų. Būsimas eksperimentinis šių principų patvirtinimas in vivo paskatintų ligų klasifikavimo koncepciją remiantis vis labiau prieinamais duomenimis apie molekulinius parašus, kurie lemia ligos kilmę 14 .

Tokio tinklinio modeliavimo susiejimas su eksperimentiniu patvirtinimu taip pat palengvino YAP / TAZ-miR-130/301 grandinės, kaip plataus tarpininko, mechaninio virsmo tarp įvairių audinių lovų ir ligos aplinkybių, identifikavimą. Atskiri veiksniai, tokie kaip PPARγ 18, 19, 20 ir ApoE 21, 22, 23, taip pat jų pasroviui skirti efektoriai CTGF 24 ir lizilo oksidazės šeima 25, 26, 27, anksčiau buvo susiję su įvairiomis fibrozės formomis. Tačiau jų molekulinius ryšius su aukščiau esančiais reguliatoriais buvo sunku apibrėžti. Atskirai pastebimas YAP / TAZ ir apskritai mikroRNR aktyvumas reguliuojant ECM biologiją. Pavyzdžiui, YAP / TAZ gali skatinti fibrogenezę ir navikogenezę transformuotų audinių, esančių 28, 29, 30, tokių kaip kepenys 31, ir ne transformuoto audinio, įskaitant plaučius, rinkinyje . Be to, apibrėžta vadinamųjų „fibromiR“ grupė specifinėms vėžinėms ir su vėžiu nesusijusioms fibrozinėms ligoms, įskaitant miR-155 32, let-7 33, miR-29 34, 35, 36, miR- Be kita ko, 21 37, 38, 39 ir miR-199 40, 41 . Tačiau tik unikalios miRNR, tokios kaip miR-29 42 ir miR-18 43, buvo jautrios YAP aktyvumui ir audinių mechanikai 43, 44 specifinėse situacijose, tokiose kaip krūties vėžys. Skirtingai nuo ankstesnių „miR-130/301“ šeimos narių tyrimų, kuriuose pagrindinis dėmesys buvo skiriamas tokioms specifinėms būklėms kaip kepenų vėžys 45, 46, krūties vėžys 47, 48, sklerodermija 49, mūsų išvados pabrėžia visuotinį „miR-130/301“ šeimos ir jos neįveikiamo reguliavimo sutrikimus. jungtys su fibroblastų molekuline fibrozine mašina. Dėl miR-130/301-YAP / TAZ grandinės, priklausomai nuo reguliuojamos savybės, ji gali būti atsakinga iš dalies už individualizuotą ECM rekonstravimo „derinimą“, stebimą tarp skirtingų fibrozinių sutrikimų. Atsižvelgiant į tai, kad vis labiau vertiname YAP / TAZ aktyvumą, atsirandantį dėl fizinių dirgiklių, tokių kaip šlyties įtempis 50, taip pat įmanoma, kad miR-130/301 ir kitos su YAP / TAZ susijusios miRNR gali sudaryti iš naujo apibrėžtą veiksnių rinkinį, reaguojantį į platų diapazoną. fizikiniai mikroaplinkos pokyčiai (ty kraujagyslių hemodinamika) be vien standumo. Šių tarpusavio ryšių identifikavimas parodo naują fibrozinių ligų sudėtingumą ir pabrėžia patrauklų YAP / TAZ 51 ir miR-130/301 12, 52, 53 pritaikymą terapiniam taikymui.

Atsižvelgiant į šios ligos tinklo ryšį su PH, YAP / TAZ-miR-130/301 grandinės centrumo identifikavimas taip pat suteikia molekulinę įžvalgą apie heterogenines antrinių ligų, susijusių su šia mįslinga kraujagyslių liga, klinikinius ryšius 54 . Pavyzdžiui, Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) I grupės plaučių arterinė hipertenzija (PAH) yra sunki PH forma, kai skirtingos antrinės ligos yra suskaičiuotos remiantis histopatologinėmis paralelėmis, o ne molekuliniais panašumais (įskaitant kepenų ligą ir, be kita ko, portopulmoninę hipertenziją). Kaip alternatyva, PSO III grupės PH aprašuose yra įvairių plaučių ligų, įskaitant idiopatinę plaučių fibrozę (IPF), kai hipoksija buvo apibūdinta kaip aplinkos veiksnys, siejantis plaučių patologiją su PH. Tačiau su PH susijusi liga, tokia kaip idiopatinė plaučių fibrozė (IPF), akivaizdžiai rodo kitus vienijančius, tačiau dar neidentifikuotus molekulinius veiksnius ir (arba) ląstelių patofenotipus, kurie yra ne tik hipoksija. Mūsų duomenys, darantys prielaidą, kad šio ligų tinklo ECM yra rekonstruojamas, sudaro dviejų neatsiejamų modelių, kaip tokios ligos, kaip plaučių fibrozė ir fibrozinės kepenų ligos, gali keistis PH, pagrindą. Pirma, šios ligos gali išsivystyti savarankiškai ląstelėje, kurias lemia atskiri sužalojimai [tokie kaip hipoksija, uždegimas ir specifinės genetinės mutacijos, susijusios su PH 12 ], sukeliančios miR-130/301 atskirose audinių lovose. Taigi kyla pagunda spėlioti, kad genetinės mutacijos, susijusios su PH ir miR-130/301 9, taip pat gali prisidėti prie atskirų fibrozinių plaučių ir kepenų ligų. Antrasis modelis apima ne ląstelių autonominius šios molekulinės grįžtamojo ryšio aktyvavimo metodus tarp skirtingų anatominių audinių lovų. Pavyzdžiui, PSO III grupės PH, susijusios su plaučių fibroze, mūsų rezultatai rodo, kad nepriklausomai nuo hipoksijos, parenchiminė fibrozė gali suaktyvinti YAP / TAZ-miR-130/301 grandinę adventininiuose fibroblastuose ir galbūt kitose susijusiose mezenchiminėse kamieninėse ląstelėse 55, taigi, 55 pagreitėja kraujagyslių standumas. Be to, atsižvelgiant į padidėjusį 12, 56 miR-130/301 miR-130/301 lygį plazmoje, patogeninis miR-130/301 pernešimas ir endokrininis signalas tarp plaučių ir kepenų yra intriguojanti galimybė. Abu modeliai gali būti aktyvūs, o centrinių veiksnių, bendrų visoms ligoms, nustatymas yra labai reikalingas molekulinis orientyras, leidžiantis iššifruoti papildomus ligos sujungimo sudėtingumus.

Fibrotinės nuo miRNR priklausančios genų programos, susijusios su keliomis ligomis, identifikavimas sukelia platų klinikinį pobūdį, peržengiant ligos klasifikaciją. Diagnostikos lygmeniu molekulinė šio fibrozinio parašo patikra galėtų padėti identifikuoti asmenis, kuriems gresia tokio giminingo ligų „sindromas“. Arba, jei egzistuoja tam tikros fibrozinės ligos būsenos ( ty , galbūt ankstesniais ligos progresavimo momentais ar specifiniais klinikiniais potipiais), kai atskiros molekulės yra aktyvinamos izoliuotai, pavyzdžiui, miR-130/301 ar ApoE, gali būti bandoma labiau pritaikyta terapija, kuri gali būti veiksmingas tais atvejais. Išankstinio apdorojimo biopsijos gali būti naudingos, nors įvertinimui prireiks vienu metu atliekamų RNR ir baltymų tyrimų - protokolų, kurie dar nėra plačiai paplitę klinikinėje praktikoje. Nepaisant šių iššūkių, būtų galima numatyti individualizuotos terapijos ir diagnozavimo kelią.

Terapinio lygio individualių fibrotinių fermentų, tokių kaip matricinės metaloproteinazės (MMP), efektyvumas nebuvo optimalus, ypač kai jis buvo išbandytas klinikinėje stadijoje 57, 58 . Ypač todėl, kad atrodo, kad YAP / TAZ ir miR-130/301 suaktyvina teigiamo grįžtamojo ryšio kilpą tvirtam ECM sukietėjimui bent jau PH 9, miR-130/301 slopinimo farmakologiniu deriniu per trumpiklius 59 ir manipuliavimo pasroviui miR-130 / 301 priklausomi keliai, tokie kaip LXR / APOE aktyvumas (7 pav.), Suteikia racionalų kelią terapiniam fibrozės taikymui. Tačiau dėl miR-130/301 veikimo sisteminiu lygmeniu daugialypiams kraujagyslių fenotipams 9, 12, 52, tinkamam klinikiniam miR-130/301 inhibitorių vartojimui gali būti būdingi įspėjimai. Pirma, kadangi fibrozė ir matricos susidarymas taip pat turi teigiamų ir adaptacinių savybių tam tikromis sąlygomis ( ty normaliam žaizdų gijimui ir organų vystymuisi), miR-130/301 slopinimas gali turėti didelių trūkumų, jei jis naudojamas neselektyviame kontekste. Antra, tokias spragas gali perdėti dėl šios miRNR šeimos plačiai paplitusios, bet specifinės ląstelių funkcijos, esančios už fibroblastų ribų, kurias, ko gero, lemia ne identiška miR-130/301 specifinių tikslinių genų kohorta, veikianti skirtinguose ląstelių tipuose 9 . Nepaisant to, selektyvus farmakologinis fibroblastų taikymas tam tikromis ligos sąlygomis yra žadamas, o būsimas biologinis miR-130/301 šeimos platesnių, tinklu pagrįstų veiksmų biologinis patvirtinimas galėtų papildyti gaires tokiu sistemos farmakologiniu metodu kovojant su fibroze, kurios dar nebuvo. vykdomas labai giliai.

Kartu čia pateikti rezultatai apibūdina fibrotinių genų programos valdymą YAP / TAZ-miR-130/301 grandine, pasidalijama tarp susijusių ligų tinklo. Šie atradimai iš naujo apibūdina mūsų suvokimą apie nelengvą šių ligų molekulinę kilmę, taip suteikdami labai reikalingas molekulinės diagnostikos ir gydymo galimybes. Be to, derindami pažangias tinklo analizes su eksperimentiniu tardymu, mūsų rezultatai pateikia gaires, kaip ištirti miRNR ir žmogaus ligų tinklo sistemos sistemų bendradarbiavimą. Toks būsimas darbas gali atskleisti papildomus paslėptus, tačiau esminius ryšius, esančius iš pažiūros nesusijusiose patologijose.

Metodai

Išraiškos masyvo duomenų rinkimas ir analizė

Norėdami įtraukti transkriptominius duomenis į statistinį miRNR aktyvumo fibrotinėse būsenose vertinimą, mes sudarėme 137 ekspresijos matricų rinkinį, analizuojantį žmogaus audinį įvairiomis ligos ir fiziologinėmis sąlygomis (taip pat žr. S1 lentelę). Viešai prieinami rinkiniai buvo rasti „Gene Expression Omnibus“ (GEO) duomenų bazėje, išfiltruoti, kad būtų įtrauktos tik neapdoroto, paveikto žmogaus audinio ir paimto kraujo analizės (palyginti su suderintais, nepažeistais to paties audinio tipo kontroliniais mėginiais), su viena. masyvas pagal audinių tipą, pagal ligą ar fiziologinę būklę. Jei įmanoma, atrinkome tyrimus, kuriuose buvo prieinami gyvų, su amžiumi susijusių pacientų sveiki audiniai, tačiau mėginio dydžio tikslais taip pat pasinaudojome tyrimais, kuriuose buvo naudojamos pomirtinės biopsijos, jei nebuvo kitų duomenų. Nebuvo įtrauktos sąlygos, kurioms esant vieninteliai turimi audinių mėginiai nebuvo tiesiogiai susiję su nagrinėjama fiziologija, pavyzdžiui, plaučių hipertenzijos (PH) atveju, kai buvo analizuojami tik PH pacientų periferinio kraujo mėginiai, o ne labiau svarbūs ligai. kietas audinys iš plaučių. Galutinis duomenų rinkinys sudarė 137 išraiškos matricų rinkinius, atspindinčius 105 skirtingas sąlygas, ir apėmė platų žmogaus patologijos pjūvį. Kiekviename masyvo rinkinyje mes atrinkome tuos genus, kurių raukšlės pokytis> ± 2, 0 ir p vertė <0, 05, ir gautą genų rinkinį susiejome su konsoliduotu interaktomu, kad sudarytume unikalų genų tinklą.

Buvo atrinkti tik 250 geriausių genų (keičiant raukšlę) tais atvejais, kai reikšmingai diferencijuotai išreikštų genų skaičius viršijo šį ribą. Šie tinklai buvo išplėsti, kad apimtų gerai sujungtus pirmojo laipsnio interakcionierius, kaip aprašyta aukščiau. Toks apipjaustymas buvo būtinas, norint optimizuoti mūsų sugebėjimą pastebėti biologiškai reikšmingą molekulių persidengimą dėl būdingo triukšmo ir efekto prisotinimo, lyginant per didelius genų rinkinius. Pirma, kadangi išraiškos matricų analizė yra jautri triukšmui, mes sumažinome klaidingų teigiamų teigiamų mūsų tinkle skaičių, įtraukdami tik tuos genus, kurie tam tikroje būsenoje rodo didžiausią moduliacijos kiekį. Antra, kadangi tokie rodikliai, kaip apimantis balas, didžiąja dalimi grindžiami „miRNA“ tikslinių grupių sutapimu su aptariamu tinklu, pernelyg didelis genų tinklas sudarytų situaciją, kai balas spektro viršutinis galas gali būti sotus, taigi padidės sunku atskirti santykinę aukščiausią balų skaičių gaunančių miRNR įtaką viena nuo kitos. Nors dėl tokio apipjaustymo gali būti prarasta tam tikra informacija (dėl to padidėja klaidingai neigiamas dažnis), mes postuluojame, kad sutelkimas dėmesį į genus, kuriuose didžiausias išraiškos pokytis yra, pagrįstai atspindės pagrindinius, sistemos lygio pokyčius kiekviename pažeistame audinyje. Be to, pirmojo slenksčio nustatymo ir tada tinklo išplėtimo procesas, pridedant gerai sujungtus pirmojo laipsnio interakcionus, suteikė papildomą metodą (kartu su aukščiau aprašytais standartiniais raukšlės keitimo ir p vertės atjungimais), skirtus molekuliniam signalui atskirti ir sustiprinti. šie spėjami sistemos lygio pokyčiai. Taigi iš esmės mes sukūrėme konservatyvų turimų išraiškos duomenų vaizdavimą, teikdami pirmenybę tikslesniems tinklams, kuriuose yra nedaug klaidingų teigiamų, o ne visapusiškuose tinkluose.

Kiekvienam iš 137 tinklų mes nustatėme (a) tinklo dalį, kuri sutapo su fibrozės parašu, ir (b) miRNR sąrašą (pagal apimtį), kurie turėjo įtakos tinklui. In order to isolate miRNAs that are specifically relevant to fibrosis (and not simply influential across all networks by virtue of having a large and well-connected target pool), we grouped networks into four cohorts according to the size of their overlap with the fibrosis signature. We then ranked miRNAs based on a one-way ANOVA means comparison test for their assigned spanning score rank for the networks in each cohort. miRNAs that scored well by this metric had higher average spanning scores in strongly fibrotic disease groups, relative to their performance overall. Because miRNA-target predictions were generated based on seed sequence matching 60, our spanning scores group individual miRNAs into families with identical seed regions.

Upon identifying the miR-130/301 family as a critical regulator of fibrosis across contexts, we ranked each of the 137 networks according to (a) its overlap with the fibrosis network and (b) the spanning score rank assigned to miR-130/301 in that context. This was quantified as the average of two values: (1) the fraction of network genes that were shared with the fibrosis network and (2) the fraction of the highest possible rank achieved by miR-130/301 [1 – rank 130 /rank MAX ]. This ranking identified networks that contained significant fibrotic components and were heavily influenced by this miRNA family.

Hibridizacija in situ

The protocol for in situ hybridization for miRNA detection was based on a prior report 12 . Specifically, 5 μm tissues sections were probed using a 3′ fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled miRCURY LNA hsa-miR-130a detection probe (Exiqon; 5′-ATGCCCTTTTAACATTGCACTG-3′). The miRCURY LNA scramble-miR probe was used as negative control. Following re-hydration (Sigma) tissues were formaldehyde-fixed (4% formaldehyde, Sigma) before inactivation of endogenous enzymes by acetylation buffer [873 uL of triethanolamine (Sigma) and 375 uL acetic anhydride (Fisher) in 75 ml distilled water]. Probe annealing (25 nM LNA probe) was performed in hybridization buffer (Sigma, H7782) for 16 hours at RNA-Tm-22 °C (62 o C). Following serial washes with 2X SSC, 1X SSC, and 0.5X SSC (Sigma) at 62 o C, immunolabeling was performed with an anti-FITC biotinconjugated antibody for overnight at 4 o C (1:400; Sigma-Aldrich). For detection, development was achieved by adding streptavidin-biotinylated alkaline phosphatase complex (Vector Labs) followed by Nitro blue tetrazolium chloride/5-Bromo–4-chloro–3–indolyl phosphate substrate solution (NBT/BCIP, Roche), and positive staining was evident by a blue color. MiR-130a expression was quantified in the vascular wall of 15–20 pulmonary arteries or for liver tissue in 10 random 20x fields per animal using ImageJ software (NIH).

For co-detection of proteins and miRNA, after probe hybridization and following serial washes with SCC immunolabeling was performed with anti-α–SMA (1/500; Sigma-Aldrich), anti-vimentin (1/250; Abcam) and/or anti-Desmin (1/1000; Abcam) antibody for overnight at 4 o C. After 3 washes in TBS Tween 0.1% slides were incubated with donkey anti-mouse and donkey anti-rabbit Alexa-conjugated antibody (Alexa 568 and Alexa 647) for 1 hour at room temperature. After 3 washes in TBS/Tween 0.1%, slides were mounted with anti-fading medium with DAPI (Vectashields, Vector).

Gyvūnai

All animal treatments and analyses were conducted in a controlled and non-blinded manner.

Lung fibrosis model

Age-matched male C57BL/6 mice (7–8 weeks old, substrain N) were exposed to 0.035 U of bleomycin via oropharyngeal route. In the control group, saline (PBS) was administered via the same route. Mice were euthanized 14 days or 21 days after bleomycin administration.

Liver fibrosis model

For chronic CCl 4 –induced liver fibrosis, age matched male C57BL/6 mice (7–8 weeks old, substrain N) were injected (intra-peritoneal) with 1 mL per kg body weight sterile CCl 4 in a 1:5 ratio in corn oil or corn oil alone (control) every 5 days for 4–6 weeks. Livers were harvested 72 h after the last injection.

Inhibition of miR-130/301 in a mouse model of pulmonary fibrosis

Eight-week-old mice (C57Bl6) were injected with bleomycin (1.5U/kg Sigma Aldrich) followed by 10 intraperitoneal injections (every 2 days) of control or miR-130/301 shortmer oligonucleotides, designed as antisense inhibitors recognizing the seed sequence of this miRNA family (20 mg/kg/dose; Regulus). Shortmer generation was previously described 12 . Two days after the last injection, lung tissue was harvested for RNA extraction or paraffin embedding.

Forced expression of miR-130a in liver tissue of mice

Eight-week-old mice (C57BL/6) were injected by intraperitoneal route every 3 days during 6 weeks with 1 nmol of miR-control (pre-miR-NC) or miR-130a (pre-miR-130a) (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies) mixed in 100 μl PBS solution containing 5% Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies). These injections were accompanied by 6 intraperitoneal injections (once every seven days) of suboptimal dose of CCl4 (0.1mg/kg body weight) or vehicle (Corn oil, Sigma-Aldrich). Two days after the last injection, liver, lung and kidney tissues were harvested for RNA extraction or paraffin embedding.

Inhibition of miR-130/301 in a mouse model of liver fibrosis

Eight-week-old mice (C57Bl6) were injected with CCl 4 (1mL per kg of body weight) every 5 days accompanied by intraperitoneal injections (every 2 days) of control or miR-130/301 shortmer oligonucleotides (20mg/kg/dose; Regulus). Two days after the last injection, liver tissue was harvested for RNA extraction or paraffin embedding.

Treatment of mice with oral ingestion of the liver-X nuclear hormone receptor (LXR) agonist GW3965

To determine the effects of the LXR agonist GW3965 (Sigma-Aldrich) and consequent APOE induction on lung fibrosis, as previously described 13, mice were exposed to bleomycin (as described above) and simultaneously assigned to control chow or chow supplemented with GW3965 (Research Diets, Inc .) at doses of 100 mg of drug per kilogram of mouse per day (based on average daily intake of 3.5 gm of chow). After two weeks, harvest of lung tissue was performed for RNA/protein extraction or paraffin embedding.

Study approval and ethics statement

All human and animal experiments were carried out in accordance with the approved guidelines listed below. Specifically, all animal experiments were approved by the Harvard Center for Comparative Medicine. All experimental procedures involving the use of human tissue were approved by Institutional Review Boards at Partners Healthcare, Boston Children's Hospital, National Institutes of Health, as well as the New England Organ Bank. Ethical approval for this study conformed to the standards of the Declaration of Helsinki. For formalin-fixed paraffin embedded lung samples and flash frozen samples, human idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) specimens were collected from discarded surgical samples following lung transplantation. Control lung samples were collected in cases where non-IPF donor lungs were declined for transplantation. All subjects provided informed consent prior to tissue procurement. No additional clinical data were available. As previously described 61, explant lung tissue samples were procured within one hour of the transplant procedure, tissue slides were obtained from paraffin-embedded blocks of explants fixed in 4% paraformaldehyde, snap frozen or stored in RNA preservative. For formalin-fixed paraffin embedded liver samples, informed consent was obtained for standard-of-care wedge liver biopsy samples, collected from patients (Massachusetts General Hospital) undergoing weight loss surgery for the purpose of evaluating for nonalcoholic steatohepatitis (NASH). For this study, specimens were analyzed from unused surgical specimens that had previously been evaluated by a pathologist blinded to clinical data and scored as previously described 62, 63 .

Statistika.

The number of animals in each group was calculated to measure at least a 20% difference between the means of experimental and control groups with a power of 80% and standard deviation of 10%. The number of unique patient samples for this study was determined primarily by clinical availability. In situ expression/histologic analyses of both rodent and human tissue, and pulmonary vascular hemodynamics in mice and rats were performed in a blinded fashion. Numerical quantifications for physiologic experiments using rodents or human reagents represent mean ± standard error of the mean (SEM). Paired samples were compared by a 2-tailed student's t test. A P-value less than 0.05 was considered significant. Correlation analyses were performed by Pearson correlation coefficient calculation.

Papildoma informacija

How to cite this article : Bertero, T. et al. A YAP/TAZ-miR-130/301 molecular circuit exerts systems-level control of fibrosis in a network of human diseases and physiologic conditions. Mokslas. Rep. 5, 18277; doi: 10.1038/srep18277 (2015).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.