Padidėjęs citidindeaminazių aktyvumas cinko metu pabrėžia galimą alosterinį kilpos-3 vaidmenį reguliuojant apobec3 fermentus | mokslinės ataskaitos

Padidėjęs citidindeaminazių aktyvumas cinko metu pabrėžia galimą alosterinį kilpos-3 vaidmenį reguliuojant apobec3 fermentus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • DNR restrikcijos modifikavimo fermentai
  • Medicininiai tyrimai

Anotacija

Stiprus APOBEC3 citidino dezaminazių ryšys su somatinėmis mutacijomis, sukeliančiomis vėžį, pabrėžia jų griežto tarpląstelinio reguliavimo svarbą, kad būtų sumažintos ląstelių transformacijos. Mes atskleidėme naują allosterinį APOBEC3 fermentų reguliavimo mechanizmą, parodantį, kad antrinio cinko jonų APOBEC3G ir APOBEC3A koordinacija, primenanti protėvių dezoksicistidilato dezaminazes, sustiprina deaminacijos aktyvumą. Cinko surišimas yra tiksliai nurodytas prie 3 kilpos, kuri, nors ir labai kintanti, savo N gale turi kataliziškai būtiną ir erdvėje konservuotą asparaginą. Mes manome, kad kilpa-3 gali atlikti bendrą vaidmenį alosteriškai derinant nuo cinko priklausomų citidino deaminazių šeimos narių aktyvumą.

Įvadas

Biologija parašyta keturių raidžių nukleotidų abėcėle, kurią praturtina daugybė modifikacijų. Vienas tokių pakitimų yra citidino pavertimas uridinu, vykstantis nuo cinko priklausomos citidino deaminazės super šeimos, kurioje yra žmogaus apolipoproteino B mRNR, redaguojančio fermento katalitinius polipeptidus panašius (APOBEC) baltymus, reakcijos. Ląstelių DNR redagavimas, kuris yra labai svarbus mūsų sudėtingai išsivysčiusiam gyvenimui, taip pat vis labiau pripažįstamas kaip turintis didelę įtaką navikų genetiniam heterogeniškumui ir chromosomų nestabilumui. Naujausios didelio poveikio ataskaitos rodo, kad APOBEC baltymai yra pagrindinė somatinių mutacijų, sukeliančių įvairius vėžius, priežastis, 1, 2 . APOBEC šeimą, kuri dezaminuoja citadiną, įterptą į vientisą polinukleotidų grandinę, sudaro aktyvacijos sukelta citidino deaminazė (AID), veikianti antikūnų diversifikacijos procesą, APOBEC1, svarbi lipidų apykaitoje, septyni APOBEC3 baltymai, kurie vaidina įgimtą apsaugą nuo retrovirusų, ir APOBEC2 ir APOBEC4, kurių fiziologinis substratas ir vaidmuo dar turi būti išsiaiškinti 3, 4, 5 .

APOBEC baltymai nėra išskirtiniai tuo, kad gali dezaminuoti (deguonies) nukleotidus, sudarantys dalį daug platesnio nuo cinko priklausomų deaminazių šeimos, įskaitant fermentus, kurie paverčia adenoziną į inoziną ir veikia bet kurią tRNR (adenozino deaminazės, veikiančios tRNR - ADAT). arba mRNR (adenozino deaminazės, veikiančios RNR - ADAR). Be polinukleotidų substratų, į kuriuos nukreipti APOBECs, šiai superšeimai taip pat priklauso citidino deaminazės (CDA), veikiančios laisvą citidiną, ir dezoksicistidilato deaminazės (DCD), kurios dezaminuoja citidino monofosfatą (dCMP), abu fermentai dalyvauja atliekant pirimidino sintezę (sintezė). į 3, 6 ).

Konservuotas katalizinis motyvas ir mechanizmas abu buvo išsamiai aprašyti: deaminavimas vyksta hidrolizuojant substrato C4 aminą, veikiant aktyvinančiai vandens molekulei, kuri kartu su trimis Cys arba Jo liekanomis koordinuoja katalizinį cinko joną ir konservuotą glutamino rūgštį. katalizės metu veikia kaip protonų šaudyklė. Konservuota šių fermentų šerdies struktūra apima penkių β-gijų ir dviejų α-spiralių stuburą, kurie formuoja ir palaiko katalizinę kišenę, laikančią cinko, koordinuojančio histidino ir cisteino liekanas, vietą. Taigi substrato rišamosios ertmės architektūra yra labai išsaugota, o surišti substratai gali būti dedami ant paviršiaus (apžvelgta skyriuje 3, 4, 7, 8 ). Skirtingi nuo cinko priklausantys citidino deaminazių šeimos nariai išsiskyrė aplink šį branduolį, kad veiktų skirtingus substratus, skirtus skirtingiems biologiniams vaidmenims ir pagal labai skirtingas taisykles.

Nors laisvieji nukidotidų citidino deaminazės buvo struktūriškai gerai apibūdintos tiek su substratu, tiek su jo nesusijusiomis formomis (apžvelgtos 9 punkte), nepaisant cinko priklausomų citidino deaminazių, surištų su polinukleotidų substratu, struktūros aprašymas išliko sunkus, nepaisant augančios ypač APOBEC baltymų bibliotekos. Be įžvalgų, gautų iš vienos TadA-tRNR surištos struktūros, atskleidžiančios išskleistą tikslinę bazę 10, mažai žinoma apie tai, kaip šie fermentai kontaktuoja su savo polinukleotidų substratais, identifikuodami ir nustatant tikslinį nukleotidą deaminacijai 5 .

Prieš neseniai įvykusį APOBEC struktūrų potvynį, buvo naudojamos deaminazių, veikiančių laisvąjį citidiną, struktūros, siekiant įžvalgos apie labiau išsivysčiusių APOBEC baltymų 3, 5 galimą konformaciją. Puikūs struktūriniai panašumai tarp šios šeimos narių jau seniai siūlo konservuotus mechanizmus, kuriais substratai, tiek laisvoje formoje, tiek polinukleotidų kontekste, yra atpažįstami ir deaminuojami. Nors su polinukleotidais sujungto APOBEC struktūrinis aprašymas išliko sunkus, manoma, kad substrato atpažinimo skirtumus tarp šeimos narių daugiausia lemia kilpų, esančių aplink katalizinę vietą, ilgis, sudėtis ir padėtis: kilpa-7 vaidina svarbus vaidmuo nustatant DNR substrato specifiškumą ir atpažinimą, o kilpa-1 yra plačiai atvira polinukleotidų dezaminazėse, leidžiančiose surišti didesnius substratus 3, 4, 5, 7, 8, 11, 12, 13 . 3 kilpos padėtis yra ypač įdomi ir, matyt, vaidina kritinį vaidmenį užtikrinant substrato prieinamumą ir rišimą. Nustatyta, kad APOBEC3A (A3A) kilpos-3 liekanų BMR rezonansai keičiasi, kai jungiasi substratas 14, pakeisdamas APOBEC3G (A3G) kilpą-3 tokiu, kuris gaunamas iš A3A sustiprinto A3G deaminavimo aktyvumo 7, ir vieną R256E mutaciją, kuri tikriausiai sutrikdo 3 kilpą. konformacija, pablogina A3G aktyvumą 12 . Pažymėtina, kad kilpa-3 yra susijusi su protėvių dezoksicistidilato dezaminazių (DCD) alosterine kontrole dezaminavimo srityje 9 . Nors APOBEC šeimos baltymų reguliavimas per senovės DCD tipišką alosterinį mechanizmą dar nebuvo praneštas, anksčiau buvo pasiūlyti konformacijos pokyčiai ir „jungikliai“, galintys paaiškinti atskirų APOBEC3 oligomero subvienetų neveiklumą 15, 16 .

Citidindeaminazių ryšys su vėžiu pabrėžia griežto jų tarpląstelinio reguliavimo svarbą, siekiant sumažinti genominės DNR mutacijų, sukeliančių ląstelių transformacijas, tikimybę. Šiems fermentams kontroliuoti buvo naudojami keli reguliavimo mechanizmai, įskaitant branduolinį citoplazminį judėjimą, genų ekspresijos reguliavimą, įdarbinimą į didelės molekulinės masės kompleksus, sąveiką su ląstelę rišančiais partneriais, galinčiais nurodyti tikslinius DNR lokusus, ir po transliacijos vykstančias modifikacijas, įskaitant fosforilinimą ir ubiquityliaciją, kontroliuojančias jų fermentus. gausumas ir deaminazių aktyvumas 1 .

Čia atskleidžiamas naujas į alosterinį panašų APOBEC3 deaminazių reguliavimą, kuriame deaminacijos aktyvumą padidina antrinio cinko jonų surišimas su 3 kilpa. Mes manome, kad antrinis cinkas gali stabilizuoti kilpą-3 konformacijoje, kuri palankiai nukreipia labai konservuotą antrinę katalitinę liekaną Asn244, esančią šios kilpos N galiniame gale, kad substratas būtų surištas. Atsižvelgiant į tai, kad kilpa-3 yra labiausiai sekos kintama ir struktūriškai elastinga kilpų, supančių konservuotos nuo cinko priklausomų citidino deaminazių katalitinės šerdies struktūrą, atveju, mes manome, kad ji gali atlikti specifinį baltymų reguliavimą, kontroliuodama allosterinę aktyvumą.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Po naujausių papildymų, įskaitant APOBEC3A (A3A) 14, 17, APOBEC3C (A3C) 18 ir APOBEC3F (A3F) 19, 20, daugiau nei 50% žinomų nuo žmogaus cinko priklausomų citidino deaminazių šeimos narių yra tipiškos struktūros baltymų duomenų banke (PDB). taip pat ilgai nemandagus dviejų sričių APOBEC3G (A3G) 21 N-galinis domenas (NTD). Šių konstrukcijų katalizinio šerdies pastolių išlyginimas išryškina 3-osios kilpos (A3G C-galinio domeno (A3G CTD ) numeravimą), kuris eina prieš α-2 ir yra C gale uždengtas (H / C) xE širdies ašimi. katalizinis motyvas, kaip kintamiausio ilgio, sekos ir struktūros (1A pav., B). Pažymėtina, kad kelios A3G CTD C-galinio domeno kristalinės struktūros (PDB kodai: 3IR2, 3V4J, 3V4K) rodo antrinio cinko jonų koordinaciją per kilpą-3, analogišką antrinio cinko jonų išdėstymui protėvių dCMP deaminazėse 16., 22 (1B pav.). Antrinis A3G cinkas, kuris erdviniu atžvilgiu yra katalitinis cinkas, perduoda dimerinę sąsają (1 pav. C) ir yra koordinuojamas H248 ir H250 ant 3 kilpos kartu su C261 iš gretimos molekulės α-2. Naujausia A3A struktūra (PDB kodas: 4XXO) atskleidė panašią baltymų ir baltymų organizaciją, kuri abiejų monomerų kilpą-3 nustato dimerio sąsajoje, kurią taip pat kritiškai tarpina du cinko jonai, kuriuos koordinuoja H11, ir kilpa-3 H56 (pav. . 1D). Nors H11A mutacija drastiškai sumažino dimerizacijos kooperatyvą ir DNR surišimo afinitetą (> 15 raukšlių), H56A mutacija sumažino tik dimerizacijos kooperatyvą 17 . Struktūrinė analizė rodo, kad dimerizacijos kooperaciją skatina cinko koordinacija per vieno monomero H56, o kito H11; tačiau, kai H56 yra mutavęs, dimerizacijos kooperatyvą vis tiek gali palengvinti cinko koordinacija tarp kiekvieno monomero H11 liekanų (1 pav. D pav., įterpta žvaigždute). Tačiau du H56 likučiai yra per daug nutolę (8, 5 Å), kad nepalaikytų panašios cinko sukeliamos dimerizacijos, kai nėra H11 (1 pav. D pav., Pilka punktyrinė linija). Nors cinko jonai kristalų struktūrose dažniausiai randami kaip kristalizacijos proceso artefaktai ir yra svarbūs užmezgant kristalų kontaktus 23, pažymėtina, kad cinkas nebuvo naudojamas šių struktūrų kristalizacijos sąlygose, nors baltymų mėginių paruošimo buferis turėjo 50 μM. cinko acetatas 16, 17 .

Image

( A ) Žmogaus, priklausančio nuo cinko priklausančio citidino deaminazių šeimos (ir pelės A3), ciklo 3 eilės suderinimas. Parodyta A3G numeracija, o katalitinės H ir E liekanos pažymėtos raudonai. Konservuotas N (ir atitinkami neveiklių fermentų likučiai) yra paryškinti ir pabraukti. B ) Atskirų šeimos narių, turinčių konservuotą katalizinį šerdį ir kilpą-3 (L3), struktūros derinimas su spalva, kaip nurodyta ( A ). Konservuoti N244, H257 ir E259 yra rodomi lazdelėmis. Kataliziniai (1 °) ir antriniai (2 °) cinko jonai rodomi rutuliais. ( C ) A3G CTD dimerinė sąsaja (2 sąsaja, 3IR2), tarpininkaujant 2 ° cinkui ir apimanti L3. ( D ) Dimerinė A3A (4XXO) sąsaja, rodanti antrinę 2 ° cinko tarpinę sąsają ir apimanti L3. Pradėjimas: A3A dimerinės sąsajos, rodančios sąveikos tinklą tarp N56, H11 ir 2 ° cinko jonų, vaizdas. Atstumai Å. Raudona žvaigždutė rodo tikėtino cinko jonų, kuriuos H56A mutante gali koordinuoti du H11, vietą.

Visas dydis

Antrinis cinko jonas, sujungtas su kilpa-3, padidina A3G ir A3A dezaminazių aktyvumą

Norėdami nustatyti biologinį svarbą antriniam cinkui, stebimam A3 struktūrose, stebėjome cinko papildymo įtaką viso ilgio dviejų domenų A3G ir vieno domeno A3A dezaminavimo veiklai. Didėjanti cinko koncentracija aiškiai koreliuoja su padidėjusiu abiejų fermentų deaminacijos aktyvumu (2A, B pav.). Nors dezaminaciją didinantis poveikis yra aiškus (160% aktyvumo jo viršūnėje), cinko papildymo poveikis A3G greičiausiai yra nepakankamas, nes žinduolių ląstelėse yra mažai baltymų, o tai reiškia, kad galutinis mėginys buvo tik vidutiniškai grynas (papildomas cinkas gali būti surištų kitų baltymų priemaišų), todėl tirpalų baltymų koncentracijos nebuvo įmanoma tiksliai nustatyti (norint pataisyti cinko kritulius). Priešingai, dėl bakterijų per didelio A3A ekspresijos buvo gaunamas labai grynas ir koncentruotas baltymų mėginys, leidžiantis papildyti cinką stechiometriniais santykiais ir taip pat pataisyti tirpių baltymų koncentracijas, atsižvelgiant į žinomą cinko nusodinimo poveikį, kaip aprašyta medžiagose ir metoduose. Iš tikrųjų šis cinko kritulių poveikis riboja matavimus, viršijančius stechiometrinius koeficientus, parodytus 2B pav.

Image

Santykinis viso ilgio A3G ( A ) deaminacijos aktyvumas, atsižvelgiant į didėjančią cinko koncentraciją, ir A3A ( B ), kai didėja cinko stechiometriniai santykiai. Tipinis gelis, parodantis nedezaminuoto „ND“ ir deaminuoto „D“ substrato skiriamąją gebą A3G, parodytas ( A ). ( C ) A3G CTD wt (dryžuotos juostos) ir H248S / H250S mutanto (juodos juostos) santykinis deaminacijos aktyvumas didėjant cinko stechiometriniams santykiams. Duomenys rodo trijų biologinių pakartojimų vidurkį ± SEM. P vertės (vienpusis ANOVA), apskaičiuotas palyginus su kontroliniais mėginiais (nėra papildomo cinko). ( D ) ICP-AES duomenys (mg / L) parodo D3 kartotinių matavimų su dviem koncentracijomis (μM) A3G CTD wt ir H248S / H250S (HH / SS) matavimų vidurkius ± SEM, palyginti su ZnCl2 kaip kontroline verte.

Visas dydis

Dezaminavimo aktyvumo padidėjimas antriniu būdu sujungiant cinką buvo patikrintas ir nurodytas prie 3 kilpos, parodžius, kad stichioometrinis cinko koncentracijos padidėjimas yra susijęs su labai gryno W3 A3G CTD dezaminavimo aktyvumo padidėjimu, bet ne atitinkamam H248S / H250S. mutantas (2C pav.). Koncentracijos, didesnės už stechiometrinį cinko ir baltymo santykį 2, sąlygojo beveik bendrą baltymų kritulį, todėl negalima išmatuoti deaminacijos aktyvumo. ICP-AES matavimai, atlikti su A3G CTD wt ir H248S / H250S mutantais, patvirtino, kad prieš papildant cinku pirminis katalitinis cinkas yra visiškai užimtas, todėl sustiprintas dezaminavimo aktyvumas nėra funkcinio baltymo atstatymo artefaktas (2 pav. D).

Nors antrinio surišto cinko kristalinės struktūros, susijusios su A3G CTD ir A3A, reiškia, kad cinko surišimas sukelia dimerizaciją, mes nesugebėjome aptikti cinko sukeltos dimerizacijos naudojant homobifunkcinį (DST ir BS 3, Thermo Scientific Pierce) cheminį susiejimą (rezultatai neparodyti). Ketvirtinė struktūra yra pastebima ir labai skiriasi tarp skirtingų nuo cinko priklausomų deaminazių, kai veikiančios laisvosiomis bazėmis paprastai yra tetramerinės (arba kai yra kai kurios bakterinės dimerinės), o tos, kurios veikia dCMP, yra heksamerinės 24, 25 . A3 yra skirtingose ​​oligomerinėse būsenose ir, nors monomerinė forma yra siūloma kaip aktyviausi, nėra aiškaus sutarimo dėl jų funkcinės oligomerizacijos būklės 4, 17, 26 . Manoma, kad oligomerizacija vaidina svarbų vaidmenį keičiant aktyvią vietą supančių kilpų padėtį ir lankstumą, todėl ji taip pat gali vaidinti svarbų vaidmenį reguliuojant deaminacijos aktyvumą. Remiantis cinko titravimu kartu su BMR analize, buvo pasiūlyta, kad cinkas gali tarpininkauti oligomerų ir monomerų būsenų pusiausvyrai A3G KDD 16 . Skirtingo tyrimo, naudojant atominės jėgos mikroskopiją, metu buvo patikrintas ssDNR vaidmuo A3G oligomerizacijoje ir nustatyta, kad dvigubas mutantas H248A / H250A turėjo panašų oligomerizacijos modelį kaip ir masės baltymas, tačiau sumažėjęs DNR jungimosi stabilumas 27 . Visai neseniai buvo nustatyta, kad kooperacinis A3A dimerizavimas reguliuoja specifinį ssDNR surišimą ir šis surišimas yra didesnio laipsnio didesnis, kai yra substratas citidino17. Žymiai didesnis afinitetas substratui nei produktas gali paaiškinti sunkumus, susijusius su dimerizacijos suvokimu pusiausvyros eksperimentuose.

Naujas atradimas, kad antrinis cinko jonas gali stimuliuoti A3 deaminacijos aktyvumą, suteikia svarbų įžvalgą apie specifinę A3G ir A3A mechaniką, tačiau, dar svarbiau, šis rezultatas rodo visos šeimos potencialą atlikti citosterino deaminacijos allosterinę 3-osios grandinės valdomą potencialą, kuris gali turėti biologinių padarinių. kontroliuoti šių baltymų aktyvumą normaliose ir ligotose ląstelėse.

„Loop-3“ vaidina vaidmenį teisingai orientuojant antrinį katalizinį Asn deaminacijos veiklai

Kontūro 3 sekos ir konformacinio kintamumo priešingybė yra asparagino liekana (Asn244 A3G), esanti 3 kilpos N-gale, kuri yra visiškai erdvėje išsaugota, kaip pranešama, aktyviuose Zn domenuose. visa šeima (1A pav.) 13 . Nors Asn244 buvo pripažintas kaip būtinas A3G, A3A ir AID 12, 28, 29 mažinantis aktyvumas, pakeičiantis alanino pakaitalą, jis neseniai buvo pasiūlytas kaip antrinė katalizinė liekana APOBEC3 baltymuose 13 .

Norėdami išsiaiškinti azoto dalies svarbumą ir šio Asn šoninės grandinės ilgio vaidmenį svarbiai optimizuojant veiklą, sukūrėme įvairius A3G CTD N244 mutantus ir įvertinome poveikį deaminacijos veiklai. Asn244 mutacija Ala, Gly, Leu ar Asp panaikino aktyvumą, tuo tarpu mutacija Gln išsaugojo 3% masės aktyvumo (3A pav.). Šie rezultatai patvirtina teiginį, kad deoksicitidino (dC) karbonilo grupė būtinai stabilizuojama jungiantis vandeniliu su Asn 13 amidų grupe, sąveika, stebima substrate surištose laisvųjų nukleotidų struktūrose 9, taip pat tRNR rišamose TadA struktūrose 10 . Asn mutacija panašaus dydžio Asp panaikino aktyvumą praradus amido grupę, tačiau ilgesnis amidas, turintis Gln, išlaikė minimalų aktyvumą (3A pav.), Kas rodo, kad nors amido grupė yra esminė, šoninės grandinės ilgis yra labai kritiškas.

Image

( A ) A3G CTD wt ir N244 mutantų santykinis deaminacijos aktyvumas. Klaidų juostos žymi 3 biologinius pakartojimus ir parodytas tipinis gelis, išskiriantis nedezaminuotą „ND“ ir deaminuotą „D“ substratą. ( B ) A3G CTD (kairėje) ir A3A (dešinėje) struktūrinis suderinimas. A3G CTD surištas (mėlynas: 3IR2) arba nesaistomas (rausvai raudonas: 2JYW, žalsvai mėlynas: 2KEM) iki 2 ° Zn. Parodytas geltonai yra dCMP deaminazė (4P9C), sujungta su dUMP ligandu. Palyginamos A3A monomerinės (pilkos spalvos: 2M65) ir dimerinės (purpurinės: 4XXO) struktūros. A3G CTD ir dCMP deaminazės parodyti atitinkamai mėlynai ir geltonai. Konservuoti N244 ir E259 yra rodomi lazdelėmis. Kataliziniai (1 °) ir 2 ° cinko jonai rodomi rutuliais. Juoda punktyrine linija vaizduoja vandenilio ryšį tarp N43 ir dUMP ligando. ( C ) A3G likučiai, kuriems labiausiai paveiktas cinko titravimas (mėlynos / geltonos spalvos likučiai iš 16 ) yra pateikiami lazdelėmis ir pilka spalva. lazdelėse esantis dUMP pavaizduoti substrato surišimo vietą. Y315 ir katalizinis E259 magenta lazdelėse. ( D ) santykinis A3G CTD wt ir Y315 mutantų deaminacijos aktyvumas. Klaidų juostos žymi 3 biologinius pasikartojimus.

Visas dydis

Asno amido liekanos ir šoninės grandinės ilgio svarba nestebina. Tai taip pat parodo labai tikslus ir konservuotas jo išdėstymas substratu surištuose dariniuose 9 . Apo struktūrose šis Asn užima kintamą orientaciją. A3G CTD ir A3A kristalų struktūros rodo, kad ten, kur yra prijungtas antrinis cinko jonas, šis Asn įgauna substrato jungtį (3B pav.). Mes spėjame, kad 3 kilpos konformacija gali palankiai orientuoti šį Asn ir kitus likučius, supančius katalizinę vietą, kad būtų galima tinkamai sujungti surištą substratą tiksliais kulono atstumais, pradedant baltymą produktyviajai katalizei. Buvo pasiūlyta, kad A3 kilpų kintamumas, atsižvelgiant į lankstumą, ilgį ir sudėtį, turi įtakos katalizinei vietai, moduliuodamas likučių, pamušančių šias katalizines kišenes, padėtis ir konformacijas 13 . Naujausios A3G CTD kristalų struktūros (PDB kodai: 4ROV ir 4ROW), dokumentuojančios naują orientaciją nuo galvos iki uodegos 8, atskleidė H248 / H250 3 kilpos tarpininkavimą, nors ir be cinko, silpnos hidrofobinės sąveikos su P210 sąsaja. W211 apie kito monomero 1 kilpą ir toliau pabrėžė 3 kilpos svarbą stabilizuojant katalizinę šerdį. P210 mutacija Gly arba Ala, siekiant nutraukti šią sąveiką, beveik panaikino katalizinį aktyvumą. Panašiai didindami 3 kilpos lankstumą D264A (kuris pašalina D264 / R256 druskos tiltelį), F252A (kuris stabilizuoja R256 hidrofobinės sąveikos būdu), Q245A (greta N244 ties 3 kilpos N galo galu) ir R256A (greta H257 katalitinės šerdies C-galo kilpos-3) mutacijos destabilizavo katalitinį centrą ir sumažino arba panaikino deaminazių aktyvumą 8 . Viena galimybė yra tai, kad cinko surišimas gali stabilizuoti 3 kilpos konformaciją, palankią šiam padėties nustatymui ir taip sustiprinantį aktyvumą. Įdomu tai, kad fermentai, kurie naudoja kofaktorinius baltymus, akivaizdžiai gali išlaikyti funkcinį stabilumą ir minimalų aktyvumo lygį, kai Asn nėra. Pavyzdžiui, pakeisdamas Asn triušyje APOBEC1, kuriame yra AKF kofaktorius, panaikina Ala aktyvumą ssDNR, jis tik 80% sumažina biologinio substrato apoB 100 mRNR 30 aktyvumą. Panašiai, ADAR2 neapima Asn244, bet yra aktyvus tik esant kofaktoriui IP 3 31 .

Be Asn244, cinko titravimo NMR analizė išplečia cinko poveikį likučiams, daugiausia vykstantiems ant 3 kilpų, α-2 ir liekanoms, esančioms aplink katalizinę kišenę 16 (3 pav. C). Šios liekanos apima H257 (koordinuoja katalitinį cinką), R215, W285, S286 ir T218, kurios visos anksčiau buvo pripažintos esminėmis deaminacijos veiklai 8, 13, 32, 33 . Neseniai atitinkami AID likučiai buvo pavadinti „antriniais kataliziniais likučiais“, nes, nors ir nedalyvaujantys tiesiogiai deaminacijos reakcijoje, jie, matyt, vaidina lemiamą vaidmenį sujungiant ir stabilizuojant pagrindą kataliziniame griovelyje 13 . Būtinybė tiksliai susieti substratą taip pat gali paaiškinti, kaip A3G yra slopinamas deaminavimas, kai T218 (ir AID T27) fosforilinamas arba mutavo Glu, nepaveikdamas DNR jungties 33 . Ilgesnė šoninė grandinė, esanti šioje vietoje, būtų nesuderinama su substratu, užkertant kelią tinkamam išlyginimui, reikalingam deaminavimui, arba užkertant kelią prielaidai, kad tikslinė nuolatinės srovės bazė gali įkristi į katalizinę vietą. Panašiai du aromatiniai likučiai W285 (AID W84) ir Y315 (AID Y114) yra labai svarbūs, norint sukrauti pagrindą substratu dC katalizinėje kišenėje 13 . Nors, titruojant 16 cinko, Y315 neparodė BMR cheminių poslinkių, tačiau Y315 įrodyta, kad būtina deaminuoti A3G Y315A mutaciją, pašalinant 12 aktyvumą. Analogiškas pakaitalas A3A ne tik pašalina deaminazių aktyvumą, bet ir slopina DNR prisijungimą 34 . Šioje vietoje A3DE turi Cys liekaną, o jo pakeitimas Tyr padidina antivirusinį aktyvumą daugiau nei 20 kartų 35 . Atrodo, kad Y315 vaidmuo stabilizuojant substratą apima būtiną bazės kaupimą ir pageidautiną vandenilio ir elektrostatinę sąveiką. Mes nustatėme, kad šioje vietoje išlaikant tik krūvį (Y315E), panaikinamas krūvis, o pašalinus krūvį ir išlaikant aromatinį žiedą (Y315F), aktyvumas sumažėja iki ~ 60% (3D pav.).

Efektyvus deaminavimas priklauso nuo tikslaus funkcinių likučių, kurių padėtį gali lemti 3 kilpos konformacija, orientacijos. Šios kilpos stabilizavimas ir svyravimų sumažinimas, matyt, padidina aktyvumą. Matyt, sąveika, panašiai laikanti 3 kilpą nepalankioje padėtyje, kliudytų deaminacijos veiklai.

G56N mutacija A3G neaktyviame NTD 3 kilpos N-galo gale nesukelia deaminacijos aktyvumo

Neaktyvios nuo cinko priklausančių citidindeaminazių sritys, kuriose kitu atveju yra katalizinis motyvas, paprastai užima Gly vietoje Asn244 (1 pav. A). Atsižvelgiant į Asn svarbą aktyvumui ir tai, kad N244G panaikino A3G CTD aktyvumą (3A pav.), Mes ištyrėme, ar atvirkštinė mutacija gali atkurti neaktyvaus A3G E259Q mutanto NTD aktyvumą NTD. G56N pakaitalui nepavyko atkurti neaktyvaus viso ilgio A3G E259Q dezaminavimo aktyvumo pageidaujamame CC substrate (4 pav.). Be to, kadangi A3G NTD kilpa-7, diktuojanti substrato specifiškumą, turi panašią seką kaip ir A3F (4 pav.), Kurie palaiko TC motyvo deamizavimą, įvertinome TC arba AID pageidaujamų TWC substratų dezaminavimą, iš kurių nė vienas nebuvo dezaminuotas. dvigubo mutanto A3G G56N / E259Q. Pažymėtina, kad dvigubas mutantas buvo pakartotinai ekspresuojamas daug mažesniame lygyje nei bet kuris iš atitinkamų pavienių mutantų arba wt baltymo, todėl deaminacijos reakcijoms atlikti reikėjo naudoti daug daugiau ląstelių, kad būtų galima gauti palyginamus baltymų kiekius (4 pav., Α -miko lizatas).

Image

Santykinis viso ilgio A3G svorio ir mutantų deaminacijos aktyvumas: G56N, E259Q ir dvigubo mutanto G56N / E259Q (GN / EQ). Klaidų juostos (SEM) žymi tris biologinius pasikartojimus. Baltymų koncentracijos buvo normalizuotos prieš įvertinant deaminacijos aktyvumą, o standartizavimas įrodytas išgrynintų mėginių α-myc (normalizuotas α-myc). α-myc ant lizato rodo reikšmingai sumažėjusią A3G G56N / E259Q mutanto ekspresiją panašiame α-aktino fone. Parodytas 7-ojo ciklo eiliškumas iš A3G CTD, A3G NTD ir A3F CTD .

Visas dydis

Matyt, A3G NTD turi papildomų, dar neišaiškintų apribojimų, kurie trukdo atlikti deaminacijos veiklą. Naujausia ištirpinto A3G NTD (PBD kodas: 2MZZ) 21 BMR struktūra rodo, kad dėl α-2 aberacijų, daugiausia dėl katalizinio Glu padėties ir pakreipimo α-3 21 C-galo atžvilgiu, aktyvumo stoka atsiranda dėl aberacijų. Tačiau, atsižvelgiant į tai, kad ši struktūra buvo gauta mutuojant 20% masės likučių, reikia analizuoti smulkius struktūrinius vaizdus. Taip pat buvo pasiūlyta, kad katalizinės ertmės tūris teigiamai atitiktų aktyvumą (A3G NTD, turintis mažiausią kišenę) 36 . Tiesą sakant, vien tik prieinamumas prie katalizinės kišenės yra esminis dalykas diktuojant A3 / AID deaminazių aktyvumą 13 .

Nors negalima visiškai atmesti sterilių kliūčių, atsirandančių dėl santykinio NTD ir CTD orientacijos, tokį paaiškinimą susilpnina tai, kad pelėms yra aktyvus A3 NTD37. Norint išnagrinėti šią galimybę, reikės atlikti specialų tyrimą, naudojant viso ilgio A3G domenų mainų variantus.

Apibendrinant, šie radiniai rodo, kad 3 kilpa gali allosteriškai sureguliuoti A3 citidino dezaminazės aktyvumą, kuris paprastai priskiriamas dCMP deaminazių unikalumui. In vitro buvo įrodytas allosterinis A3G ir A3A dezaminavimo aktyvumo padidėjimas jungiant antrinį cinko joną prie kilpos-3. Tačiau mes prognozuojame, kad in vivo skirtingi jonai, kofaktoriai ar baltymai gali panašiai sąveikauti su A3A, A3G ir kitais A3 šeimos nariais, kad sustiprintų ar net sumažintų citidino deaminacijos aktyvumą. Cinko priklausomų citidindeaminazių vaidmuo yra įvairus ir jos turi atlikti konservuotą cheminę reakciją tinkamu laiku ir vietoje, nukrypdamos nuo šių paskirtų funkcijų, kurios, kaip jau įrodyta, turi pražūtingą patogeninį poveikį 2 . Bus įdomu ištirti kilpos-3 vaidmenį būsimuose tyrimuose, kurių tikslas - ištirti nuo cinko priklausomų citidino likučių sureguliavimą, ypač jei ląstelių keliai ir infekciniai patogenai gali išnaudoti į allosterinius panašius norminius A3 požymius. Pvz., Ar alosterinė 3 kilpos kontrolė galėtų paaiškinti APOBEC3 / AID slopinamąjį kelią, kurį skelbia Vif 38, 39 ?

Metodai

Eilės ir struktūros derinimas

„Loop-3“ sekos buvo rankiniu būdu identifikuojamos pagal kiekvieno fermento struktūras (arba homologinius modelius) ir vėliau buvo sulygiuotos naudojant „T-Coffee 40“ . Konstrukcijų suderinimas ir iliustracijos buvo sukurtos PyMOL molekulinės grafikos sistemoje (Schrödinger, LLC).

Baltymų išraiška ir gryninimas

Laukinio tipo (wt) ir mutantiniai A3G CTD (liekanos 191–384) ir w3 A3A subklonuoti į pET28b (Novagen) ir ekspresuoti ArcticExpress ląstelėse (Agilent Technologies Genomics) su 0, 5 mM IPTG indukcija per naktį 16 ° C temperatūroje (papildyta 50 μM cinko acetatas). His pažymėti A3A ir A3G CTD buvo išgryninti naudojant HisPur kobalto dervą („Thermo Fisher Scientific“) buferyje, kuriame yra 500 mM NaCl, 50 mM kalio fosfato (pH 7, 5) ir 5 mM β-merkaptoetanolio, ir dializuojami į galutinį buferį, kuriame yra 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7, 0, ir 1 mM tris (2-karboksietil) fosfino (TCEP). A3G CTD buvo toliau išgrynintas atliekant dydžio išskyrimo chromatografiją.

Viso ilgio A3G buvo subklonuotas į pcDNA3.1 („Thermo Fisher Scientific Invitrogen“) ir ekspresuotas C-galo Myc / His žyme žmogaus embrioninio inksto (HEK) 293 T ląstelėse, surinktas 48 valandas po transfekcijos ir išgrynintas, kaip aprašyta anksčiau 26 . Ląstelės suskaidomos 3 šaldymo-atšildymo ciklais lizės buferyje (50 mM Tris, pH 8, 0, 1 mM PMSF, 10% (v / v) glicerolio ir 0, 8% (v / v) NP-40) ir tirpioji frakcija sureguliuojama. iki 0, 8 M NaCl ir prieš valymą naudojant Ni-NTA (Thermo Fisher Scientific) paveiktas 50 μg / ml RNaseA (30 min. 37 ° C). Eluavimo buferyje buvo 50 mM Tris, pH 8, 0, 0, 3 M NaCl, 10% (v / v) glicerolio, 250 mM imidazolo, ir vėliau dializuotas į galutinį buferį, kuriame yra 50 mM Tris, pH 8, 0, 3 M NaCl, 1 mM DTT.

Citidino deaminacijos tyrimas

Citidino dezaminavimo poveikis ssDNR buvo įvertintas naudojant nustatytą PGR pagrįstą testą, kurio baltymų koncentracija buvo pakoreguota pagal bendrą produkto susidarymą ~ 10%, kad būtų užtikrintas tyrimo jautrumas, kaip aprašyta anksčiau 26 . Dezaminavimo reakcijos (37 ° C) buvo atliktos iš viso 10 μl tūrio 25 mM Tris, pH 7, 0, 1 ul baltymo, 0, 1 μg / μl BSA ir 1 pmol / μl ssDNR substrato, turinčio CCC, TTC ar TGC deaminacijos motyvus. Deaminavimo reakcijos mišinys (1 ul) buvo amplifikuotas PGR, inkubuotas (1 val. 37 ° C temperatūroje) atitinkamai su StuI, DraI arba XbaI restrikcijos fermentais (New England Biolabs), kad būtų galima suskaidyti deaminuotą produktą, kuris buvo atskirtas nuo nedezinfekuoto (neišvalyto). ) substratas ant poliakrilamido gelio.

Cinko papildymas deaminacijos tyrimams

Cinko acetatas buvo inkubuotas su išgrynintais baltymais, esant stechiometriniams santykiams, centrifuguotas, o paskesnis deaminacijos aktyvumas buvo apskaičiuotas atlikus tirpių baltymų koncentracijos pataisą, siekiant atsižvelgti į žinomą cinko 41 nusodinantį poveikį. Tačiau dėl mažesnio iš žinduolių ląstelių gaminamo A3G grynumo, kuris trukdė tiksliai nustatyti baltymų koncentraciją, nebuvo įmanoma atsižvelgti į stechiometrinius koeficientus (kaip 2B pav., C), o į molines koncentracijas (2 pav. 2A) papildyto cinko acetato. Visiškas katalizinio Zn 2+ užimtumas buvo išmatuotas naudojant ICP-AES (ICP spektrometras, „iCap 6000“ serija, „Thermo Scientific“) afinitetu išgrynintiems mėginiams, kurie du kartus buvo dializuojami naudojant buferį, kuriame yra 20 mM Hepes, pH 7, 0, 150 mM NaCl ir 1. mM EDTA, skirtas pašalinti nespecifiškai surištus metalo jonus. Pakartotiniai ICP-AES matavimai, atlikti naudojant dvi skirtingas masės (~ 0, 48 ir ~ 3, 8 μM) masės ir H248S / H250S mutanto koncentracijas (atitinkamas cinko acetato koncentracijas).

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Marx, A. et al. Citidindeaminazių aktyvumo padidėjimas cinko metu pabrėžia galimą alosterinį kilpos-3 vaidmenį reguliuojant APOBEC3 fermentus. Mokslas. Rep. 5, 18191; „doi“: 10.1038 / srep18191 (2015).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.